CN113652434B

CN113652434B - 一种具有促进水稻籽粒增大作用的芡实dna分子及其应用

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Publication number: CN113652434B
Application number: CN202010396877.2A
Authority: CN
Inventors: 吴啟南; 周婧; 乐巍; 刘潺潺; 黄志恒
Original assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Current assignee: Nanjing University of Chinese Medicine
Priority date: 2020-05-12
Filing date: 2020-05-12
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2040-05-12
Also published as: CN113652434A

Abstract

本发明涉及一种具有促进水稻籽粒增大作用的芡实DNA分子及其应用，属于基因工程技术领域。该DNA分子容易获取，分子序列确切，分子克隆后经过简单的侵染步骤，即可得到所产籽粒较大的水稻植株。本发明首次证实了EuSAUR基因为芡植物生长过程中调控种子大小的一个关键基因；同时，基于异源表达的方法进一步证实了EuSAUR基因促进水稻籽粒增大的功能。本发明在一定程度上促进了芡实资源产业化的发展；同时也为粮食领域提供一种提高水稻籽粒大小的DNA分子。

Description

一种具有促进水稻籽粒增大作用的芡实DNA分子及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有促进水稻籽粒增大作用的芡实DNA分子及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

芡实为睡莲科一年水生草本植物芡(Euryale ferox Salisb.)的成熟种仁，为药食同源之品。芡与水稻的食用部位均为种仁，且都属于水生作物，生长过程较为相似。所以，对水稻和芡生长和产量的调控方法也较相似。

遗传背景是调控植物生长的决定性因素之一。随着研究的深入，近年来越来越多的功能基因被挖掘出来，应用于提高作物的产量。例如：江西省农业科学院水稻研究所发现水稻中Os10g37880基因能够通过增加小穗的穗粒数增加水稻产量(CN110923245A)；武汉生物工程学院发现OsNPF5.11基因能够增加水稻的分蘖数及每株灌浆粒数，提高水稻产量(CN107056909B)；中国科学院遗传与发育生物学研究所发现了一种能够控制水稻粒长、粒重、产量和籽粒外观的基因LGY3，可以实现水稻产量和稻米品质的协同改良(CN107384937B)；中国科学院上海生命科学研究院获得一种能够促进一级分支数、穗二级分枝数、每穗小穗数等增加的核苷酸，并且发现其能够促进禾本科植物的产量增加(CN105695478B)。

在植物中，SAUR基因家族被报道具有调控生长素合成及运输的相关功能，但是SAUR基因家族对作物籽粒大小的影响还未明确。同时，SAUR基因家族普遍存在序列较短、几乎无内含子等特点，无论从基因获取上或是应用上都更加容易。此外，控制芡实籽粒大小的基因从未报道，严重限制了芡实产业的发展。因此，从芡中挖掘具有促进籽粒增大的功能基因并在作物上进行应用能够推动芡实的产业化发展及粮食问题的解决。

发明内容

本发明解决的技术问题是：提供一种具有促进水稻籽粒增大作用的芡实DNA分子。该DNA分子容易获取，分子序列确切，分子克隆后经过简单的侵染步骤，即可得到所产籽粒较大的水稻植株。目前，芡植物中SAUR家族基因的序列及功能不明确，也尚未开发出此家族中具有调控种子大小功能DNA分子的获取方法。

为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案是：一种具有促进水稻籽粒增大作用的芡实DNA分子，其核苷酸序列是序列表中的序列1。

为了解决上述技术问题，本发明提出的另一技术方案是：所述的具有促进水稻籽粒增大作用的芡实DNA分子的获得方法，具体制备步骤如下：

(1)称取新鲜幼嫩的芡植物样本，按照生工生物工程有限公司的Ezup柱式植物组织基因组DNA抽提试剂盒说明书对芡的DNA进行提取，具体步骤如下：

a)将样本置于液氮中充分研磨成粉末，取适量混匀的粉末于1.5mL离心管中；

b)加入600μL预热的PCB Buffer和12μL的β-巯基乙醇，震荡混匀，置于65℃水浴25min，混匀；

c)加入600μL的三氯甲烷，震荡混匀，12000rpm离心1min，将上层水相转移至新的1.5mL离心管中；

d)加入适量体积的BD Buffer，混匀后加入适量体积的无水乙醇，充分混匀，用移液器全部转移入吸附柱中，室温静置2min，待充分吸附后，12000rpm离心10min，倾去废液；

e)向吸附柱中加入500μL的PW Solution，12000rpm离心1min，倾去废液；

f)向吸附柱中加入500μL的Wash Solution，12000rpm离心1min，倾去废液；

g)将吸附柱12000rpm离心2min，置于通风橱内吹干乙醇；

h)将吸附柱转移入新的离心管中，加入适量TE Buffer，静置5min，可适当加热，12000rpm离心10min，收集滤液；

i)分光光度计检测浓度和纯度，取1μL检OD值，OD 260/280在1.7-2.0，说明DNA质量较好，小于1.7有蛋白污染，大于2.0有RNA污染；

(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，根据设计的引物对(引物F₁为序列2，引物R₁为序列3)进行PCR扩增，扩增程序如下；取5μL的PCR产物，采用1％琼脂糖凝胶，经过150V恒压电泳20min，于凝胶成像仪上对照DNA marker进行观察；

反应体系和反应程序：

(3)按照生工生物工程有限公司的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒对PCR扩增得到的产物进行回收，具体步骤如下：

a)用干净的手术刀尽可能将琼脂糖凝胶上的目的DNA片段切下，放入1.5mL离心管中，称重；

b)按照每100mg琼脂糖加入500μL的B2 Buffer，置于55℃水浴中充分混匀10min，使胶块完全融化；

c)用移液枪将完全溶解的胶溶液全部吸入吸附柱中，12000rpm离心1min，倾去废液；

d)吸取300μL的B2 Buffer加入吸附柱中，12000rpm离心1min，倾去废液；

e)加入500μL的Wash Solution于吸附柱中，12000rpm离心1min，倾去废液，重复该步骤1次，通风厨内常温吹干吸附柱；

f)吸取适量Elution Buffer加入吸附柱中，55℃水浴温育5min，12000rpm离心10min，收集滤液；

g)分光光度计检测浓度和纯度，取1μL检OD值，OD 260/280在1.7-2.0，说明DNA质量较好，小于1.7有蛋白污染，大于2.0有RNA污染；

(4)经过测序，该PCR产物具有序列表序列1所示的核苷酸，将其命名为EuSAUR。

为了解决上述技术问题，本发明提出的另一技术方案是：所述的具有促进水稻籽粒增大作用的芡实DNA分子的应用，还包括具体步骤如下：

取经过步骤4测序确认后的步骤3的PCR产物，分别用KpnI/XbaI双酶切目的基因片段和pCambia1301载体，将目的片段的3’端融合GFP并构建到表达载体上，转化农杆菌GV3101，得到表达载体pCambia1301-EuSAUR和克隆农杆菌GV3101-EuSAUR。

为了解决上述技术问题，本发明提出的另一技术方案是：含有所述的DNA分子的重组表达载体,所述的出发载体为pCambia1301。

为了解决上述技术问题，本发明提出的另一技术方案是：根据上述方法获得的重组表达载体的克隆农杆菌GV3101-EuSAUR。

为了解决上述技术问题，本发明提出的另一技术方案是：一种培育转基因植物的方法，是将含有所述的DNA分子的重组表达载体导入植物细胞或组织中获得转基因植物。

优选的，所述的植物为水稻。

为了解决上述技术问题，本发明提出的另一技术方案是：所述的DNA分子、所述的重组表达载体或所述的克隆农杆菌在培育转基因植物中的应用。

本发明提供一种具有促进水稻籽粒增大作用的芡实DNA分子，包括此DNA片段的表达载体和克隆农杆菌。

(1)将幼嫩芡植物组织的基因组DNA进行提取，得到芡基因组DNA；

(2)利用设计的特异性引物，将得到的基因组DNA进行PCR扩增，产物保存备用；

步骤(2)中所述PCR反应所用的引物对中的一条引物的序列为序列2，另一条引物的序列为序列3.

(3)将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对照DNA marker切取条带进行纯化，并且测序验证。所得纯化产物为EuSAUR基因开放阅读框的DNA片段，如序列1所示；

(4)将所得DNA片段和pCambia1301载体用KpnI/XbaI进行双酶切，将目的片段构建到表达载体上，并转化农杆菌GV3101。得到表达载体pCambia1301-EuSAUR和克隆农杆菌GV3101-EuSAUR。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次证实了植物芡中EuSAUR基因是控制芡实大小的关键产量基因，并且提供了一种能够提高水稻产量的基因。在粳稻品种水稻日本晴(Oryza sativassp.Japonica cv.Nipponbare)中过表达该基因，能够显著加速水稻的生长，促进水稻产量相关的优势性状形成，主要体现在株高增高明显加快和株型明显更加分散。并且，在水稻中过量表达该基因能够显著增加所产籽粒的大小。通过进一步观察，发现该基因通过促进细胞伸长促使水稻优势性状的形成，最终导致水稻产量的提高。

(2)本发明促进了作物产量和经济价值的提升，缓解了老百姓生活中粮食问题所带来的压力；同时也促进了芡实产业化发展和资源合理利用，相对减少了芡实的药用和食用成本，让每个老百姓都用吃上芡实、用上芡实。

附图说明

下面结合附图对本发明的作进一步说明。

图1是刺芡和杂交芡的种子大小对比。

图2是刺芡和杂交芡繁育器官的显微观察。

图3是刺芡和杂交芡子房附近细胞的长度对比。

图4是刺芡和杂交芡繁育器官的转录组分析。

图5是转EuSAUR基因水稻的PCR检测结果。

图6是转基因和对照株水稻生长过程中株高观察情况。

图7是生长第10天转基因和对照株水稻叶片泡状细胞长度。

图8是生长第60天转基因和对照株水稻株型及叶夹角观察情况。

图9是生长第60天转基因和对照株水稻叶枕细胞长度。

图10是转基因和对照株水稻籽粒大小观察。

具体实施方式

实施例1

1.仪器与材料

1.1仪器

表1仪器

1.2试剂

表2试剂

2.实验方法

2.1不同栽培种芡品质差异观察

2.1.1三个栽培种芡的种子大小对比

取保存于-20℃冰箱的芡种子，拍照记录三个栽培种芡的种子直径、种仁直径、种皮厚度。采用ImageJ1.52软件对不同栽培种芡的种子直径、种仁直径及种子厚度进行测量。

2.1.2刺芡和杂交芡繁育器官显微观察

a)取不同生长时期的杂交芡繁育器官样本，观察并记录其生长过程中的形态学及解剖学特征。

b)石蜡切片：

固定与脱水取不同生长时期的刺芡和杂交芡的繁育器官样本，徒手切块并放入组织包埋盒中，编号后置于组织脱水机中,使用设定的程序进行梯度脱水(50％乙醇浸泡10min→70％乙醇浸泡10min→90％乙醇浸泡10min→100％乙醇浸泡10min→50％乙醇+50％二甲苯浸泡10min→100％二甲苯浸泡10min)，脱水过程需保持植物样本中的气体排尽。

浸蜡用二甲苯浸透植物样本后，将样本浸泡于融化的石蜡中，每隔2h更换一次石蜡，总共更换3次石蜡。

包埋将石蜡包埋机中的石蜡加热溶解，滴加入放置好植物组织的模具中，连同模具一起至于预冷的工作台上，使石蜡快速凝固，包埋植物组织。

切片将包埋样品的石蜡块置于石蜡切片机的载物台上，调整好切片角度，切除多余蜡块，进行切片，切片厚度为35μm。

贴片将烘片机的水浴温度调节至42℃，将切片小心放置在水面上，利用温度使切片展开。随后，用干净的载玻片捞出水面上的切片，并调整切片至合适位置。

烤片将烘片机的烘干槽温度调至60℃，将贴片后的载玻片插在烘片机的烘干槽中，烘干2h以上，但不可烤片过久，以防样本被破坏。

染色将烤片完成的载玻片***载玻片架上，置于自动染色仪中，使用设定程序进行染色(100％二甲苯浸泡20min→50％乙醇+50％二甲苯浸泡10min→100％乙醇浸泡10min→90％乙醇浸泡10min→70％乙醇浸泡10min→50％乙醇10min→50％番红溶液浸泡4h→50％乙醇浸泡10min→70％乙醇浸泡10min→90％乙醇浸泡10min→100％乙醇浸泡10min→50％乙醇+50％二甲苯浸泡10min→100％二甲苯浸泡10min)。

封片从二甲苯中取出染色完成的载玻片，快速滴加含有30％中性树胶的二甲苯溶液，盖上盖玻片。封片过程应除尽气泡。

观察将载玻片放置于体式显微镜或荧光显微镜下，对植物切片进行观察。

2.2刺芡和杂交芡繁育器官的转录组学分析

2.2.1总RNA的提取与QC

将芡样本液氮研磨，均匀混合后取适量组织匀浆加入TRI Reagent进行震荡提取。用三氯甲烷萃取，离心，取上层清液，加入异丙醇沉淀总RNA，离心后用75％乙醇洗涤沉淀，干燥沉淀后用buffer溶解沉淀。通过Agilent 2100BioAnalyzer检测，选择质量合格(RIN≥7且28S和18S比值≥1.5)的Total RNA作为mRNA测序的建库样品，并用QUBIT RNA ASSAYKIT对RNA进行定量。

2.2.2文库建立

a)mRNA纯化和片段化利用带有Oligod(T)的Beads纯化得到总RNA中的mRNA。用以下反应体系进行mRNA片段化(表3)。

表3片段化体系及反应程序

b)1st Strand cDNA与2^nd Strand cDNA合成用以下反应体系进行1st StrandcDNA的合成(表4)。

表4 1st Strand cDNA的合成体系及反应程序

随后用以下反应体系进行2^nd Strand cDNA的合成，并用144μL的AMPure XP Beads进行纯化，最后用60mL的Nuclease free water进行重悬，取出适量备用(表5)。

表5 2nd Strand cDNA的合成体系及反应程序

c)末端修复和链接接头用以下反应体系进行End Repair/dA-tail(表6)。

表6 End Repair/dA-tail反应体系及反应程序

用以下反应体系进行Adaptor Ligation(表7)。

表7 Adaptor Ligation反应体系及反应程序

随后，向产物加入3μL(red)USER Enzyme于37℃反应15min。加入Nuclease-freeWater使总体积为100μL，用AMPure XP Beads进行纯化。

d)PCR扩增根据以下反应体系进行PCR扩增(表8)。

表8转录组PCR扩增体系及反应程序

用适量AMPure XP Beads进行纯化，最后用Resuspension Buffer进行重悬，保存备用。

e)混合文库根据文库结果，调整每个library的摩尔浓度至2nM。根据实验分组等量混合library，并保证混合后的终浓度为2nM，且体积≥10μL，保存于-80℃冰箱。

2.2.3测序

a)样品处理取NaOH与文库震荡混合，室温放置5min后转移入预冷的Hybridization buffer中，调节终浓度为20pM，并根据需要适当稀释。

b)簇生成将Flowcell和处理好的文库样本在cBot上进行簇生成，使文库中的分子与Flowcell上固定的引物结合，进行桥式PCR反应，最后在测序平台上测序。

c)边合成边测序选择合适的Recipe对簇生成产物进行测序，根据First BaseReport判断每条lane上A/T/C/G碱基信号是否正常，确定引物结合无误；并根据cluster数量估测生成数据能够满足测序要求。

2.2.4 cDNA合成

采用TaKaRa公司的逆转录试剂盒进行cDNA合成，反应体系如表9。

表9 cDNA合成体系及反应程序

2.2.5实时定量PCR检测

设计特异性引物对(引物F₂为序列4，引物R₂为序列5)，采用NovoStart的SYBR qPCRSupermix Plus试剂盒于荧光定量PCR仪上进行qRT-PCR检测，反应体系如表10。

表10 qRT-PCR反应体系及反应程序

2.3芡EuSAUR基因的扩增

2.3.1 DNA提取

按照Ezup柱式植物组织基因组DNA抽提试剂盒说明书对芡的DNA进行提取：

a)将样本置于液氮中充分研磨成粉末，取适量混匀的粉末于1.5mL离心管中。

b)加入600μL预热的PCB Buffer和12μL的β-巯基乙醇，震荡混匀，置于65℃水浴25min，混匀。

c)加入600μL的三氯甲烷，震荡混匀，12000rpm离心1min，将上层水相转移至新的1.5mL离心管中。

d)加入适量体积的BD Buffer，混匀后加入适量体积的无水乙醇，充分混匀。用移液器全部转移入吸附柱中，室温静置2min，待充分吸附后，12000rpm离心10min，倾去废液。

e)向吸附柱中加入500μL的PW Solution，12000rpm离心1min，倾去废液。

f)向吸附柱中加入500μL的Wash Solution，12000rpm离心1min，倾去废液。

g)将吸附柱12000rpm离心2min，置于通风橱内吹干乙醇。

h)将吸附柱转移入新的离心管中，加入适量TE Buffer，静置5min，可适当加热，12000rpm离心10min，收集滤液。

i)分光光度计检测浓度和纯度，取1μL检OD值，OD 260/280在1.7-2.0，说明DNA质量较好，小于1.7有蛋白污染，大于2.0有RNA污染。

2.3.2 PCR反应

a)按照序列2和序列3设计引物F₁及引物R₁，进行PCR扩增，扩增体系及反应程序如表11。

表11.反应体系和反应程序：

b)电泳检测条带取5μL的PCR产物，采用1％琼脂糖凝胶，经过150V恒压电泳20min，于凝胶成像仪上对照DNA marker进行观察。

2.3.3PCR产物回收

a)用干净的手术刀尽可能将琼脂糖凝胶上的目的DNA片段切下，放入1.5mL离心管中，称重。

b)按照每100mg琼脂糖加入500μL的B2 Buffer，置于55℃水浴中充分混匀10min，使胶块完全融化。

c)用移液枪将完全溶解的胶溶液全部吸入吸附柱中，12000rpm离心1min，倾去废液。

d)吸取300μL的B2 Buffer加入吸附柱中，12000rpm离心1min，倾去废液。

e)加入500μL的Wash Solution于吸附柱中，12000rpm离心1min，倾去废液，重复该步骤1次，通风厨内常温吹干吸附柱。

f)吸取适量Elution Buffer加入吸附柱中，55℃水浴温育5min，12000rpm离心10min，收集滤液。

g)分光光度计检测浓度和纯度，取1μL检OD值，OD 260/280在1.7-2.0，说明DNA质量较好，小于1.7有蛋白污染，大于2.0有RNA污染。

2.3.4测序检验

向96孔板中依次加入2μL的125mM EDTA和2μL的3M NaAc，再加入50μL无水乙醇，盖好，室温震荡15min，3000g低温离心30min。加入70μL的70％乙醇，3000g低温离心15min。置于通风橱内，室温吹干乙醇，加入10μL的Hi-Di Formamide溶解DNA。在PCR仪上95℃变性4min。利用3730XL测序仪对样品进行测序，得到结果后用Sequence Analysis软件进行分析。

2.4芡EuSAUR基因的功能验证

2.4.1过表达EuSAUR基因水稻建立

a)水稻表达载体的构建分别用KpnI/XbaI双酶切目的基因片段和pCambia1301载体，将目的片段构建到表达载体上，转化农杆菌GV3101。

b)农杆菌的转化及培养构建农杆菌GV3101感受态细胞，采用冻融法将载体质粒转化农杆菌感受态细胞中(同时转化pCambia1301空载体作为阴性对照)，将转化好的农杆菌涂布含25mg/L Rif+50mg/L Kana+25mg/L Gen的YEP抗性培养基平板，挑取单克隆于YEB液体培养基中28℃摇床内小摇，PCR鉴定目的基因条带正确，再继续大摇培养2d，菌体4000rpm离心4min，去上清后菌体用用10mM的MgCl2(含120uM的AS)悬浮液重悬菌体，调整OD600至0.5左右。

c)水稻愈伤组织培养取籽粒饱满的水稻种子，去壳并用75％乙醇浸洗灭菌三次，每次30s，再用10％次氯酸钠溶液浸洗种子10min，用无菌水冲洗10次，置于无菌滤纸吸干，将种子接种于NBD愈伤组织诱导培养基上26℃培养15d左右，待愈伤组织长出，用无菌刀剥离，转移至新的NBD培养基上进行培养；挑选少量致密、长势较好的愈伤组织接种到继代培养基上26℃培养15d；切取适量愈伤组织，接种到培养基上避光培养3d。

d)农杆菌介导转化水稻取预培养的愈伤组织置于锥形瓶中，加入适量转化成功的农杆菌菌液，振摇培养使愈伤组织被充分侵染，静置；倾去菌液，置于无菌滤纸上吸干，转移至新的培养基上，避光26℃培养3d；随后将侵染的愈伤组织置于含潮霉素抗性的培养基上进行抗性筛选。选取未黑化的愈伤组织于新的预培养基上26℃培养10d进行预分化；选取致密的愈伤组织转入分化培养基培养，直至愈伤组织分化为小苗。

e)转基因水稻炼苗将分化的小苗取出，切除周边的愈伤组织，转移至生根培养基培养10d。待植物生长10-15cm时，打开瓶盖，往培养瓶中加入3mL无菌水敞口培养48h，随后进行移栽入无肥料的土，加纯水略过土面，置于光照培养箱中培养，培养条件：16h光照，光强100％，温度28℃，湿度60％；8h黑暗，温度24℃，湿度50％，培养20d后每周添加适量复合肥。

2.4.2转基因水稻的鉴定

a)DNA提取取转基因水稻叶片，按照“2.3.1DNA提取”的方法对转基因水稻的叶片DNA进行提取。

b)PCR扩增以水稻叶片DNA为模板，按照“2.3.2PCR反应”的方法对转基因水稻中的EuSAUR基因序列进行扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在凝胶成像仪中观察，根据显示的条带对阳性水稻株进行鉴定，引物F₃为序列6，引物R₃为序列7。

2.4.3过表达EuSAUR基因水稻的表型观察

炼苗移栽后，水稻苗的株高均为10-15cm，每2d拍照记录，使用ImageJ 1.52软件进行转基因水稻的株高、叶夹角表型的测量。

2.4.4过表达EuSAUR基因对水稻细胞的影响

取水稻叶片及叶鞘样品，纵切后浸泡于4％(w/v)多聚甲醛溶液中，4℃过夜。取出样本，用10mM的PBS缓冲液漂洗3次，每次5min，随后用蒸馏水冲洗。将样品置于样品支撑器上，用OCT包埋剂包埋样品并置于-20℃凝固20min。待包埋剂完全凝固，迅速转移至预冷的载物台上进行切片，切片厚度为60μm。将切片放置在载玻片的合适位置，通过手指温度融化OCT包埋剂，使切片展开。用清水冲洗至OCT包埋剂洗脱完全，水装片进行观察。

3.实验结果

3.1不同栽培种芡种子大小观察

杂交芡产量较高，其优势性状从选育开始逐年凸显，2018年于江苏高邮界首镇进行区域试验亩产可达355kg。同年，于江苏泗阳和安徽淮南进行的生产试验亩产可达330kg，相比刺芡的亩产量250kg，产量提高约35％。通过观察刺芡和杂交芡的种子，发现杂交芡种子直径约1.4cm，刺芡种子直径1.0cm；对种皮厚度进行测量，杂交芡1.8mm，刺芡0.7mm；杂交芡的种仁直径为1.1cm，明显大于刺芡。而杂交芡与刺芡每个芡果中的种子数目没有明显差异，所以杂交芡种子较大是导致其产量高的主要原因。(图1)

3.2刺芡与杂交芡的显微观察

通过显微观察并对比第12周和第13周采集的刺芡和杂交芡的繁育器官纵切，发现在相同的生长时期，杂交芡的子房发育明显早于刺芡的子房发育。而且，由于两个栽培种芡在每颗芡果所包含的种子数目上没有明显差异，表明了杂交芡的种子较大可能是由于其子房发育较早，发育时期较长，胚乳能够充分充盈所导致的。(图2)

植物子房附近细胞的生长情况直接影响了子房的大小和发育速度，于是本实验开展了对杂交芡和刺芡子房附近细胞的显微观察。通过观察样本切片的红色自发荧光，发现刺芡子房附近细胞长度约16-18μm，杂交芡子房附近细胞长度集中于18-22μm，证明相同时期杂交芡子房周围的细胞长度明显长于刺芡子房周围的细胞。因此，得出结论：杂交芡的子房生长较快是由其子房附近的细胞伸长较快导致的，因为细胞的伸长有助于植物器官的发育。(图3)

3.3刺芡与杂交芡繁育器官的转录组分析

通过对刺芡和杂交芡繁育器官间差异基因进行KEGGPathway分析，发现两个栽培种芡繁育器官在植物激素信号传导通路上的差异基因主要富集于SAUR家族基因中。通过本地blast方法对比模式植物的SAUR基因序列，鉴定芡中的SAUR基因，并且结合转录组测序得到的基因表达量，筛选其中关键基因进行研究。筛选e-value<10-10且bit score>100的结果，并使用CD-Hit去冗余，最终鉴定得到31个芡的SAURs。其中，筛选到一条序列在两个栽培种芡的生长过程中中有明显的表达差异，在杂交芡中表达较高，而在刺芡中几乎不表达，命名此基因为EuSAUR基因。(图4)

3.4 EuSAUR基因的扩增

采用序列2和序列3的引物对，通过PCR扩增得到EuSAUR基因的开放阅读框全长。通过测序得到了EuSAUR基因的开放阅读框序列(432bp)；利用NCBI的Blastx进行序列对比，结果发现EuSAUR基因属于生长素诱导的超家族。(序列1)

3.5 EuSAUR基因的功能验证

3.5.1过表达EuSAUR基因对水稻株高及叶泡状细胞的影响

通过观察过表达EuSAUR基因的水稻株高性状，发现移栽后生长10d、20d的阳性水稻株高均高于野生型水稻，但是生长至30d两者的株高无明显差异；直至移栽后30d，分蘖数和节间距均在过表达EuSAUR基因的植株中具有明显优势，但是叶片数和节数上并没有明显差异。结果表明，EuSAUR基因能够快速提高水稻的株高。(图5、6)

本实验通过显微观察移栽后10d水稻叶片切片，利用红色自发荧光测算叶片中泡状细胞的长度。结果显示，过表达EuSAUR基因的水稻叶片中泡状细胞明显增长。通过测量泡状细胞长度，发现野生型的泡状细胞长度集中于22μm左右，而阳性苗的泡状细胞长度多分布为34-42μm。结果表明，EuSAUR基因可以通过促进转基因水稻叶片泡状细胞的伸长，最终导致水稻的早期的快速拔高。(图7)

3.5.2过表达EuSAUR基因对水稻株型及叶枕细胞的影响

通过对转基因水稻的表型观察，发现过表达EuSAUR基因的水稻株型较为松散，认为可能由于叶夹角增大导致的。水稻的叶夹角是指叶片与直立茎之间的夹角角度，是单子叶植物的重要农艺性状，与植物的阳光捕捉效率有关。本实验通过观察叶夹角发现，过表达EuSAUR基因的水稻移栽后生长60d，倒一叶的叶夹角显著增大。(图8)

控制水稻夹角处的叶枕细胞的伸长能够调控水稻叶夹角的大小。本实验通过冰冻切片的方法制备水稻倒一叶夹角处叶枕的切片，并进行显微观察，采用ImageJ1.52软件测量叶枕细胞的长度。分别通过100倍和400倍镜下观察细胞的红色自发荧光，结果发现过表达EuSAUR基因水稻的叶枕细胞明显长于野生型水稻的叶枕细胞，野生型水稻的叶枕细胞长度集中于16μm左右，而过表达EuSAUR基因的水稻叶枕细胞长度多分布在19-25μm的范围内。结果表明，EuSAUR基因能够促进水稻叶枕细胞的伸长，并导致水稻叶夹角增大，使株型变得松散。(图9)

3.5.3过表达EuSAUR基因对水稻籽粒大小的影响

水稻的籽粒大小直接影响了水稻的产量，本实验通过对转基因水稻的籽粒表型观察，发现过表达EuSAUR基因的水稻籽粒明显大于野生型水稻的籽粒。结果证明在水稻中过表达EuSAUR基因能够显著提高水稻籽粒的大小，同时也揭示EuSAUR基因在芡中对芡种子大小起重要的调控作用。(图10)

本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京中医药大学

<120> 一种具有具有促进水稻籽粒增大作用的芡实DNA分子及其应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 432

<212> DNA

<213> 芡实(Euryale ferox Salisb.)

<400> 1

atgatcagca caacgagagt agtggagatg gccagaaaat ggaagaagat ggccgccatg 60

ggaagaagaa gaatctcact aggcaaagtg gtgcaaagga gcaacagcag aaaggcagtg 120

gcagtggcag ataaggggca ttttgtggct tatgcggcag acggcaagag gtttatgctt 180

cctctggctt acctccaatt gcccatcttc caacagctgc taatgatggc agaggaagag 240

ttcgggttaa acatagaggg agcgattact tttccttgtg attcttcatt cgttgagcat 300

gtggtggcat tgctgaagaa gggagcagta gaaaatttat tggtggtcat gttagctagc 360

aagggatgct tgccatcttc ttcactgcct ccaagccatc ccttccgtca ctcgctccac 420

agtgtggttt aa 432

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggggtaccat gatcagcaca acgagagt 28

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gctctagaaa ccacactgtg gagcgagt 28

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttcagcaatg ccaccacatg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

attgcccatc ttccaacagc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgatcagca caacgagagt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aaccacactg tggagcgagt 20

Claims

1.一种具有促进水稻籽粒增大作用的芡实DNA分子，其特征在于:其核苷酸序列是SEQID N0:1。

2.根据权利要求1所述的具有促进水稻籽粒增大作用的芡实DNA分子的获得方法，其特征在于：具体制备步骤如下：

g)将吸附柱12000rpm离心2min，置于通风橱内吹干乙醇；

(2)以步骤(1)中提取的1-2μL DNA为模板，根据设计的引物对引物F₁为SEQ ID N0:2，引物R₁为SEQ ID N0:3，取正、反向引物各2μL，5μL含MgCl₂Taq Buffer，2μL dNTP，0.5μL Taq酶，加纯水至总体系为50μL，进行PCR扩增，扩增条件为：95℃5min，94℃30s，适当的退火温度30s，72℃50s，35个循环，72℃终延伸8min；取5μL的PCR产物，采用1％琼脂糖凝胶，经过150V恒压电泳20min，于凝胶成像仪上对照DNA marker进行观察；

(4)经过测序，该PCR产物具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸，将其命名为EuSAUR。

3.根据权利要求2所述的具有促进水稻籽粒增大作用的芡实DNA分子的方法，其特征在于：还包括具体步骤如下：

取经过步骤(4)测序确认后的步骤(3)的PCR产物，分别用KpnI/XbaI双酶切目的基因片段和pCambia1301载体，将目的片段的3’端融合GFP并构建到表达载体上，转化农杆菌GV3101，得到表达载体pCambia1301-EuSAUR和克隆农杆菌GV3101-EuSAUR。

4.含有权利要求1所述的DNA分子的重组表达载体,其特征在于：出发载体为pCambia1301。

5.根据权利要求3方法获得的重组表达载体的克隆农杆菌GV3101-EuSAUR。

6.一种培育转基因植物的方法，是将含有权利要求1所述的DNA分子的重组表达载体导入植物细胞或组织中获得转基因植物。

7.根据权利要求6所述的培育转基因植物的方法，其特征在于：所述的植物为水稻。

8.权利要求1所述的DNA分子、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的克隆农杆菌在培育转基因植物中的应用。