CN102165489B - 生物标志物表达的可再现量化 - Google Patents

Abstract

本发明方法涉及生物标志物表达的可再现量化，包括组织试样中的生物标志物表达。本发明描述了方法和***，其中生物标志物表达的可再现得分独立于仪器、其位置或操作员获得。

Description

生物标志物表达的可再现量化

相关申请交叉引用

本申请要求2008年9月16日申请的美国专利申请61/097,415的优先权权益，其公开内容通过引用全部组合于此。

背景技术

本发明涉及使用算法自动进行生物标志物表达分析的领域，以增强独立于操作员的分析和化验结果再现性从而在诊断化验中更好地预测值。

迄今为止，组织切片的生物标志物评估依赖于传统的细胞化学和免疫组织化学(IHC)技术，这些技术在大规模和大量化验存在之前已得到大量发展。传统方法的重大缺陷在于测试的主观性质及缺乏标准化。尽管IHC测试已展现了临床实用性(如Her2/HercepTest)，但这些测试的值最近已表明受到进行测试的地点的影响。检验Her2测试的再现性的两个最近的研究已表明在本地和中央实验室测试之间可能有多达20％的误差(Perezetal.J.Clinic.Onc.(2006)24：3032-8；PaikSetal.BenefitfromadjuvanttrastuzumabmaynotbeconfinedtopatientswithIHC3+and/orFISHpositivetumors：CentraltestingresultsfromNSABPB-31(2007)25：511-22)。

组织微阵列技术为组织试样的大量分析提供机会(Konen，J.etal.，Nat.Med.4：844-7(1998)；Kallioniemi，O.P.etal.，Hum.Mol.Genet.10：657-62(2001)；Rimm，D.L.etal.，CancerJ.7：24-31(2001))。例如，使用组织微阵列快速进行大规模研究的能力可为识别和确认药品靶点、预断标志(如***受体(ER)和HER2/神经鞘)及候选疗法提供关键信息。

本发明首次实现了原地生物标志物量化的全自动标准化，使得实验室之间、机器之间、操作员之间及不同日期之间的染色变化最小。

发明内容

本发明涉及组织试样、整个组织切片(WTS)及组织微阵列(TMA)的生物标志物表达的可再现量化，以减小多次试验或多批之间因操作员、设备、设施及其它因素的差异引起的变化性。在此描述的***和方法用得分的归一化实现生物标志物的自动定位和量化从而在多次试验之间具有更大的再现性，而与位置、操作员或仪器的变化无关。

本发明的一实施例涉及在制作在载玻片上的组织试样中可再现量化生物标志物表达的方法，包括：(a)获取制作在载玻片上的组织试样，其已被染色以使能定位至少一细胞区室和至少一生物标志物；(b)使用包括光源的标准化光学***获取已染色组织试样的一个或多个包含像素的图像；(c)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分数据信号和噪声；(d)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号；(e)可选地，自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号；(f)量化表达在至少一细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量；藉此制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达可再现地量化。

在一实施例中，标准化光学***包括其强度和光通路变化性已归一化的光源。在另一实施例中，标准化光学***允许自动调节曝光时间以优化在图像像素中捕获的动态数据范围。

在一实施例中，每一自动分析步骤以无人监督的方式进行。

在一实施例中，对归属于两个以上细胞区室的数据信号进行区分。

在一实施例中，对表达在两个以上细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量进行量化。

在一实施例中，以约95％的置信区间区分归属于两个以上细胞区室的数据信号。

在一实施例中，本发明方法还包括评估一个或多个制作在载玻片上的组织试样或一个或多个包含像素的图像或其一个或多个放大部分的质量。

在一实施例中，本发明方法实现可再现割点确定。

在一实施例中，对于每一试样，本发明方法在批次之间实现85％以上的试样分类一致性。在另一实施例中，对于每一试样，本发明方法在批次之间实现90％以上的试样分类一致性。

在一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的再现性水平高于80％。在另一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的再现性水平高于90％。在另一实施例中，本发明方法实现生物标志物蛋白质的量化测量的再现性水平高于95％。

在一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的再现性水平落在约90％到约97％的范围中。

在一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数(％CV)低于20％。在另一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数(％CV)低于10％。在另一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数(％CV)低于5％。在另一实施例中，本发明方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数(％CV)落在约4％到约7％的范围中。

在一实施例中，制作在载玻片上的组织试样已用一种或多种试剂的最佳稀释进行染色。在另一实施例中，最佳稀释产生具有最佳动态范围度量的一个或多个包含像素的图像。

在一实施例中，本发明方法由计算机实施。在另一实施例中，本发明致力于一种计算机可读介质，该介质包括存储于其上的、由处理器运行以执行在此所述的方法的计算机可读指令。在另一实施例中，本发明致力于携载用于实施在此所述的方法的计算机可读指令的电磁信号。本发明还致力于具有存储于其上的计算机可读指令的计算机可读介质，计算机可读指令由处理器运行以执行可再现量化制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达的方法，该方法包括：(a)获取制作在载玻片上的组织试样的一个或多个包含像素的图像，前述组织试样已被染色以使能使用包括光源的标准化光学***定位至少一细胞区室和至少一生物标志物；(b)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分数据信号和噪声；(c)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号；及(d)量化表达在至少一细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量；藉此制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达可再现地量化。在计算机可读介质的优选实施例中，存储于其上并由处理器运行的计算机可读指令还包括执行在所述量化步骤之前具有下述可选步骤的方法的指令：自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号。在本发明的又一实施例中，用于可再现量化制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达的***包括：(a)配置成至少放大制作在载玻片上的组织试样的一部分的一个或多个透镜，所述组织试样已被染色以使能定位至少一细胞区室和至少一生物标志物；(b)标准化光学***，包括与一个或多个透镜光通信的光源和图像传感器，标准化光学***获取已染色组织试样的一个或多个包含像素的图像；(c)与标准化光学***通信的处理器模块，该处理器模块配置成：(i)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分数据信号和噪声；(ii)自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号；及(iii)量化表达在至少一细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量；藉此制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达可再现地量化。在该***的优选实施例中，处理器模块还配置成可选地自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号。该分析优选在量化步骤(iii)之前进行。

本发明的其它特征、目标和优点可从下述附图、详细描述和强烈要求明显看出。

附图说明

图1示出了可再现量化表达在制作在载玻片上的包含细胞的生物试样如病人的组织试样的一个或多个细胞组成的每一细胞组成中的生物标志物的量的过程。

图2示出了可再现量化表达在制作在载玻片上的包含细胞的生物试样的一个或多个细胞组成的每一细胞组成中的生物标志物的量的图像处理步骤的过程。

图3为按传统IHC得分(x轴)对543种情形分类的Log₂变换的HER2得分(y轴)的框式图表，其中兼有和IHC得分信息。用于跨所有类进行均值比较的单向ANOVA分析很有意义(P＜0.001)。在此之后，对于多个比较使用Tamhane的T2统计量的分析表明每一类之间具有明显差异(所有P值＜0.05)。

图4A-C示出了对于583种情形比较跨仪器(A)、操作员(B)和染色批次(C)的归一化Log₂变换的HER2得分的框式图表，其中指出了所有情形的平均％CV。

图5A-C示出了Kaplan-Meier5年特定疾病的生存分析图表，对于将簇群分为HER2低(84.5％)和HER2高(15.5％)的仪器1HER2得分(A)的X-tile确定的割点，表明了累计生存17.8％的明显降低[MonteCarloP＜0.001；培训/确认P＝0.002]，即从75.7降低到57.9％。该割点应用于仪器2(B)和仪器3(C)，具有显著性(分别为P＜0.001和P＝0.004)及等效曲线形状和组成，对于仪器2[HER2低(83.6％)；HER2高(16.4％)；累计生存降低15.4％，即从75.5降低到60.1％]，及对于仪器3[HER2低(84.9％)；HER2高(14.1％)；累计生存降低13.5％，即从74.9降低到61.4％]。

图6A-F示出了对于每一指出的仪器组(A、B)、操作员组(C、D)和批次组(E、F)，基于为参考目的产生的X-tile割点(如仪器1)比较阳性(POS)和阴性(NEG)簇群分离的2×2列联表。还示出了95％置信区间的总体一致性、阳性一致率和阴性一致率。

图7A-C为分为阴性一致、阳性一致和不一致情形的频率分布，以表明不一致出现在乳腺癌病例簇群内的哪里，其中(A)仪器2(得分)对仪器1(割点)；(B)操作员2(得分)对操作员1(割点)；及(C)批次2(得分)对批次1(割点)。不一致的病例位于指出的割点中及附近，并不跨越整个分布。

图8A-D示出了分析和EGFR化验的分析性能。(A)对于748个病例，跨3天染色天数(D)、机器(M)和操作员(O)的HER2的log(2)变换的得分的框式图表，其中指出了％CV。(B)对跨3个载玻片和3天染色天数的乳腺肿瘤、正常和细胞系控制(n＝152)的测试阵列产生的EGFR得分的线性回归分析，其中指出了平均R值和斜率。(C)来自(B)的40个肿瘤的EGFR的log₂变换的得分的框式图表，其中指出了％CV。(D)来自(B)的35个细胞系(2倍冗余)的EGFR的log₂变换的得分的框式图表，其中指出了％CV。

图9A-D示出了下面例4的结果。图9A-C为来自三个病理学家的Allred得分相较于针对相同试样产生的得分的框式图表。图9D为表明每一病理学家的Allred和得分之间的关联的表。

图10A-B示出了(A)基于得分的病人分群；及(B)群组的生存，如例4中所述。

图11A-B使用Allred得分(A)和得分(B)比较特定疾病的五年生存。

图12A-B示出了由3位病理学家使用Allred计分方法读同一TMA载玻片确定的ER表达得分的比较(A)，及由3台PM-2000仪器读同一TMA载玻片确定的ER表达AQUA得分的比较(B)。

具体实施方式

除非另外定义，在此使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属技术领域的一般技术人员通常理解一样的含义。如本说明书及所附权利要求中使用的，单数形式“一”及“该”包括多于一个的所提及对象，除非内容明确指示不同于此的含义。例如，提及“细胞”时包括两个以上细胞的组合等。通常，在此使用的命名法及下述细胞生物学、免疫组织化学及成像(如细胞和组织)中的实验室程序均众所周知并在本领域普遍采用。

应意识到，在此所示和描述的具体实施均为本发明的例子，并不意于以任何方式限制本发明的范围。此外，这些技术适合远程会议、机器人视觉、无人驾驶车辆中的应用或任何其它类似的应用。

适合在本发明中使用的技术也可在下述申请中找到：2008年5月14日申请的12/153,171、2008年6月13日申请的12/139,370、2008年8月5日申请的12/186,294、2008年8月7日申请的12/188,133、及2008年8月29日申请的12/201,753，每一这些申请通过引用全部组合于此。

图1示出了可再现量化表达在制作在载玻片上的包含细胞的生物试样如病人的组织试样的一个或多个细胞组成的每一细胞组成中的生物标志物的量的过程。过程100开始步骤105为获取已染色、制作在载玻片上的包含细胞的生物试样，其中染色剂以使能定位至少一细胞区室和至少一生物标志物的方式施加。至少一细胞区室包括但不限于细胞质、细胞核和细胞壁。至少一生物标志物可包括经CY5荧光信号标记或检测的生物标志物，用于检测肿瘤细胞。例子包括但不限于HER2、ER、PR、EGFR、ERCC1、TS等。

过程100继续即步骤110，获取已染色组织试样的包含像素的图像或一组图像。包含像素的图像或一组图像可使用包括光源的标准化光学***获取，如光学显微镜***。包含像素的图像可通过使用数字图像传感器的标准化光学***获得，如数码照相机。在一些实施例中，数字图像可通过模拟照相机取得，其中所得到的模拟图像或胶卷通过数字扫描仪或等效装置数字化。在至少部分实施例中，照相机可直接或间接安装到显微镜上以获取显微照片形式的包含像素的图像。作为备选或除此之外，照相机可依赖于到现有成像***上的视频输出线的直接连接。在一些实施例中，光源包括具有可见光谱、红外(IR)光谱和紫外(UV)光谱中的一个或多个的波长的光。照相机可以是视频摄像机或延时摄影序列，提供包含动态细胞活动的实时及消逝时间的图像。

由过程100获得的包含像素的图像接着在步骤115进行分析以从图像像素导出一个或多个数据集以区分数据信号和噪声。该分析可自动进行，例如使用处理器进行。处理器可包括一个或多个计算机处理器，可根据预编程的指令集进行控制。在一些实施例中，区分数据信号和噪声包括信号的统计分析，例如导致具有信号的像素与具有归属于噪声的信号的像素分离的无人监督的聚类分析。在一些实施例中，区分数据信号和噪声可包括将制作在载玻片上的组织试样的聚焦图像从制作在载玻片上的组织试样的散焦图像减去而实现。在一些实施例中，散焦图像可包括刚好在制作在载玻片上的组织试样下面聚焦的图像。通常，使图像散焦相当于空间低通滤波器，使能进行数据信号可与其比较的背景测量。

接下来，由过程100获得的包含像素的图像在步骤120进行分析以从图像像素导出一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号。该分析也可自动进行，例如使用预编程的计算机或专用特殊用途处理器。在一些实施例中，分化可能取决于归属于施加到制作在载玻片上的试样的标志物或染色剂的荧光。在一些实施例中，致力于至少一细胞区室的染色剂的荧光的波长变化。在一些实施例中，蓝色荧光可与细胞核受体(DAPI)相关联，绿色荧光可与细胞质受体(细胞角蛋白)相关联，及红色荧光可与细胞膜受体(α-连结蛋白)相关联。

优选地，染色剂按使能定位至少一细胞区室和至少一生物标志物的方式施加。在一些实施例中，前面在步骤105中描述的至少一生物标志物用于检测肿瘤细胞或目标蛋白质或目标抗原并可以是制作在载玻片上的组织试样中的肿瘤细胞的指示。过程100包括使先前分化的归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号与所检测的肿瘤细胞或肿瘤罩相关联的步骤。这样，在步骤125，自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号。在过程100的步骤130，可再现地量化表达在制作在载玻片上的组织试样的至少一细胞区室中的生物标志物的量。

图2示出了可再现量化表达在制作在载玻片上的试样的一个或多个细胞组成的每一细胞组成中的生物标志物的量的图像处理步骤的详细过程200。过程200以步骤205开始，获取已染色组织试样的数字图像。数字图像按与方法100中步骤105、110中所描述类似的方式获取。接着，过程200进行步骤210、215和220，测试在信号完整性、试样完整性和图像完整性方面的图像质量。如果信号完整性、试样完整性和图像完整性中的任一或多个图像质量测试失败，则分析时去除该数字图像，或作上标记以由操作员在步骤225人工查看该数字图像并决定在分析时接受该数字图像或在步骤226去除该数字图像。

通过信号完整性、试样完整性和图像完整性的图像质量测试或通过数字图像的人工查看将数字图像确定为候选图像以进一步在过程200中进行图像处理。未能通过信号完整性、试样完整性和图像完整性中的任一或多个的图像质量测试或未能通过数字图像的人工查看将数字图像确定为低质量，并拒绝该数字图像。简言之，信号完整性包括细胞区域化、荧光强度和饱和像素百分比估计。饱和可通过确定包含像素的图像中的预定数量的像素由包括最大或接近最大的值的数据和数据结构表示进行估计。试样完整性包括确定存在足够的感兴趣试样(如肿瘤组织)用于分析。图像完整性包括检测任何散焦图像，在TMA的情形下，分析和检测任何裂开图像。

在本发明已结合其具体实施例进行描述的同时，应当理解，其能够进行进一步的修改。此外，本申请意于覆盖本发明的任何变化、使用或调整，包括落在本发明所属技术领域的已知或通常实践内及落在所附权利要求的范围内的本发明派生技术方案。

在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用组合于此，就像特别及个别指出每一个别出版物、专利或专利申请以通过引用进行组合一样。

1、试样

任何包含细胞的试样均可由本发明方法进行分析。例如，试样可从病人收集的组织准备。作为备选，试样可以是包含细胞的生物试样如血液试样、骨髓试样或细胞系。试样可以是整个组织或显微镜载玻片上的TMA切片。具体地，当使用组织微阵列(TMA)时，试样可在载玻片上排列为“斑”或“组织斑”，每一组织斑对应于特定试样。这些准备制作在载玻片上的组织试样的方法在本领域众所周知并适合在本发明中使用。

2、生物标志物

如在此使用的，生物标志物是可在生物试样中进行测量的分子，其为组织类型、正常或病原过程、或对治疗干预的反应的指示。在特定实施例中，生物标志物选自下组：蛋白质、肽、核酸、脂质及碳水化合物。更具体地，生物标志物可以是蛋白质。某些标志物为特定细胞的性状，同时其它标志物已确定与特定疾病或情况相关联。已知预断标志物的例子包括生化酶标志物，例如半乳糖基转移酶II、神经元特异性烯醇化酶、质子ATP酶、及酸性磷酸酶。激素或激素受体标志物包括人绒毛膜***(HCG)、促肾上腺皮质激素、癌胚抗原(CEA)、***特异性抗原(PSA)、***受体、孕酮受体、雄激素受体、gC1q-R/p33补体受体、IL-2受体、p75神经营养蛋白受体、PTH受体、甲状腺激素受体、及胰岛素受体。

淋巴标志物包括α-1-抗胰糜蛋白酶、α-1-抗胰蛋白酶、B细胞标志物、bcl-2、bcl-6、B淋巴细胞抗原36kD、BM1(骨髓标志物)、BM2(骨髓标志物)、半乳糖凝集素-3、颗粒酶B、HLAI类抗原、HLAII类(DP)抗原、HLAII类(DQ)抗原、HLAII类(DR)抗原、人中性粒细胞防御素、免疫球蛋白A、免疫球蛋白D、免疫球蛋白G、免疫球蛋白M、κ轻链、λ轻链、淋巴细胞/组织细胞抗原、巨噬细胞标志物、胞壁质酶(溶菌酶)、p80间变型淋巴瘤激酶、浆细胞标志物、分泌性白细胞蛋白酶抑制因子、T细胞抗原受体(JOVI1)、T细胞抗原受体(JOVI3)、末端脱氧核苷酸转移酶、未分类B细胞标志物。

肿瘤标志物包括α胎蛋白、载脂蛋白D、BAG-1(RAP46蛋白)、CA19-9(唾液酸路易士)、CA50(癌相关的粘蛋白抗原)、CA125(卵巢癌抗原)、CA242(肿瘤相关的粘蛋白抗原)、嗜铬粒蛋白A、簇蛋白(载脂蛋白J)、上皮膜抗原、上皮相关的抗原、上皮特异性抗原、表皮生长因子受体、***受体(ER)、大囊肿病液体蛋白-15、肝细胞特异性抗原、HER2、heregulin、人胃粘蛋白、人乳脂肪球、MAGE-1、基质金属蛋白酶、黑色素A、黑色素瘤标志物(HMB45)、间皮蛋白、金属硫蛋白、小眼转录因子(MITF)、Muc-1核糖蛋白、Muc-1糖蛋白、Muc-2糖蛋白、Muc-5AC糖蛋白、Muc-6糖蛋白、髓过氧物酶、Myf-3(横纹肌肉瘤标志物)、Myf-4(横纹肌肉瘤标志物)、MyoD1(横纹肌肉瘤标志物)、肌红蛋白、nm23蛋白、胎盘碱性磷酸酶、前清蛋白、孕酮受体、***特异性抗原、***酸性磷酸酶、***抑制肽、PTEN、肾细胞癌标志物、小肠粘蛋白抗原、四联凝集素、甲状腺转录因子-1、基质金属蛋白酶1的组织抑制因子、基质金属蛋白酶2的组织抑制因子、酪氨酸酶、酪氨酸酶有关的蛋白-1、绒毛蛋白、血管性血友病因子、CD34、CD34、II类，CD51Ab-1、CD63、CD69、Chk1、Chk2、claspinC-met、COX6C、CREB、细胞周期蛋白D1、细胞角蛋白、细胞角蛋白8、DAPI、结蛋白、DHP(1，6-二苯基-1，3，5-己三烯)、上皮钙粘蛋白、EEA1、EGFR、EGFRvIII、EMA(上皮膜抗原)、ER、ERB3、ERCC1、ERK、E-选择蛋白，FAK、纤连蛋白、FOXP3、γ-H2AX、GB3、GFAP、穿膜蛋白、GM130、外周蛋白97、GRB2、GRP78BiP、GSK3β、HER-2、组蛋白3、组蛋白3_K14-Ace[乙酰化组蛋白H3(赖氨酸14)抗体]、组蛋白3_K18-Ace[组蛋白H3-赖氨酸乙酰化18]、组蛋白3_K27-TriMe[组蛋白H3(三甲基K27)]、组蛋白3_K4-diMe[二甲基组蛋白H3(赖氨酸4)抗体]、组蛋白3_K9-Ace[乙酰化组蛋白H3(赖氨酸9)]、组蛋白3_K9-triMe[组蛋白3-三甲基赖氨酸9]、组蛋白3_S10-Phos[组蛋白H3磷酸化(Ser10)抗体，有丝***标志物]、组蛋白4、组蛋白H2A.X_S139-Phos[组蛋白H2A.X磷酸化(Ser139)抗体]、组蛋白H2B、二甲基组蛋白H3(K4)、三甲基组蛋白H4(K20-Chip级)、HSP70、尿激酶、VEGFR1、ICAM-1、IGF-1、IGF-1R、IGF-1受体β、IGF-II、IGF-IIR、IKB-αIKKE、IL6、IL8、整联蛋白αVβ3、整联蛋白αVβ6、整联蛋白αV/CD51、整联蛋白B5、整联蛋白B6、整联蛋白B8、整联蛋白β1(CD29)、整联蛋白β3、整联蛋白β5整联蛋白B6、IRS-1、Jagged1、蛋白激酶Cβ2抗体、LAMP-1、轻链Ab-4(鸡尾酒)、λ轻链、κ轻链、M6P、Mach2、MAPKAPK-2、MEK1、MEK1/2(Ps222)、MEK2、MEK1/2(47E6)、MEK1/2封闭肽、MET/HGFR、MGMT、线粒体抗原、Mitotracker绿FM、MMP-2、MMP9、E-钙粘附蛋白、mTOR、ATP酶，N-钙粘附蛋白、肾病蛋白、NFKB、NFKBp105/p50、NF-KBP65、Notch1、Notch2、Notch3、OxPhos络合物IV、p130Cas、p38MAPK、p44/42MAPK抗体、P504S、P53、P70、P70S6K、广谱钙粘附蛋白、桩蛋白、P-钙粘附蛋白、PDI、pEGFR、磷酸化AKT、磷酸化CREB、磷酸化EGF受体、磷酸化GSK3β、磷酸化H3、磷酸化HSP-70、磷酸化MAPKAPK-2、磷酸化MEK1/2、磷酸化p38MAP激酶、磷酸化p44/42MAPK、磷酸化p53、磷酸化PKC、磷酸化S6核糖蛋白、磷酸化Src、磷酸化Akt、磷酸化Bad、磷酸化IKB-a、磷酸化mTOR、磷酸化NF-κBp65、磷酸化p38、磷酸化p44/42MAPK、磷酸化p70S6激酶、磷酸化Rb、磷酸化Smad2、PIM1、PIM2、PKCβ、足细胞标志蛋白、PR、PTEN、R1、Rb4H1、R-钙粘附蛋白、核糖核苷酸还原酶、RRM1、RRM11、SLC7A5、NDRG、HTF9C、HTF9C、CEACAM、p33、S6核糖蛋白、Src、存活素、突触足蛋白、多配体聚糖4、踝蛋白、Tensin、胸苷酸合酶、Tuberlin、VCAM-1、VEGF、波形蛋白、凝集素、YES、ZAP-70及ZEB。

细胞周期相关的标志物包括凋亡蛋白酶活化因子-1、bcl-w、bcl-x、溴脱氧尿苷、CAK(cdk活化激酶)、细胞凋亡敏感性蛋白(CAS)、半胱氨酸蛋白酶2、半胱氨酸蛋白酶8、CPP32(半胱氨酸蛋白酶3)、细胞周期蛋白依赖激酶、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D2、细胞周期蛋白D3、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白G、DNA片段裂解因子(N-末端)、Fas(CD95)、Fas相关的死亡结构域蛋白、Fas配体、Fen-1、IPO-38、Mcl-1、微小染色体维持蛋白、错配修复蛋白(MSH2)、聚(ADP核糖)聚合酶、增生细胞核抗原、p16蛋白、p27蛋白、p34cdc2、p57蛋白(Kip2)、p105蛋白、Stat1alpha、拓扑异构酶I、拓扑异构酶IIα、拓扑异构酶IIIα、拓扑异构酶IIβ。

神经***组织和肿瘤标志物包括αB晶体蛋白、α介连蛋白、α核突触蛋白、淀粉样前体蛋白、β淀粉样蛋白、钙结合蛋白、胆碱乙酰转移酶、谷氨酸转运蛋白1、GAP43、神经胶质纤维酸性蛋白、谷氨酸受体2、髓磷脂碱性蛋白、神经生长因子受体(gp75)、成神经细胞瘤标志物、神经丝68kD、神经丝160kD、神经丝200kD、神经特异性烯醇化酶、烟碱型乙酰胆碱受体α4、烟碱型乙酰胆碱受体β2、外周蛋白、蛋白基因产品9、S-100蛋白、5-羟色胺、SNAP-25、突触蛋白I、突触素τ、色氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶、泛素。

簇群区分标志物包括CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8α、CD8β、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16a、CD16b、CDw17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD44R、CD45、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CDw93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CD109、CD114、CD115、CD116、CD117、CDw119、CD120a、CD120b、CD121a、CDw121b、CD122、CD123、CD124、CDw125、CD126、CD127、CDw128a、CDw128b、CD130、CDw131、CD132、CD134、CD135、CDw136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CDw150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166、及TCR-ζ。

其它细胞标志物包括着丝粒蛋白F(CENP-F)、巨蛋白、内皮蛋白、核纤层蛋白A&C[XB10]、LAP-70、粘蛋白、核孔复合蛋白、p180片状体蛋白、ran、r、组织蛋白酶D、Ps2蛋白、Her2-神经鞘、P53、S100、上皮标志物抗原(EMA)、TdT、MB2、MB3、PCNA和Ki67。

3、组织染色

包含细胞的试样可使用任何试剂或生物标志物标签进行染色，如与特定生物标志物或与各种类型的细胞或细胞区室直接反应的染料或染色剂、组织化学制品、或免疫组织化学制品。并非所有染色剂/试剂均适合。因此，采用的染色剂的类型及其施加顺序应进行适当考虑，但本领域技术人员可容易地确定。前述组织化学制品可以是可由透射显微镜法检测的生色团或可由荧光显微镜法检测的荧光团。总的来说，包含试样的细胞可用包括至少一组织化学制品的溶液孵育，其将与目标的化学基直接反应或结合。一些组织化学制品必须用媒染剂或金属共同孵育以使能染色。包含细胞的试样可用对感兴趣成分染色的至少一组织化学制品和用作复染剂并结合感兴趣成分外面区域的另一组织化学制品的混合物进行孵育。作为备选，多个探针的混合物可在染色时使用，并提供识别特定探针的位置的方式。对包含细胞的试样进行染色的过程在本领域众所周知。

下述非限制性的列表提供可用作组织学成像剂(染色剂或复染剂)的示例性生色团及其目标细胞、细胞区室或细胞组分：曙红(碱性细胞组分、细胞质)、苏木精(核酸)、橘黄G(红色血液、胰、及垂体细胞)、亮绿SF(胶原)、Romanowsky-Giemsa(整体细胞形态)、May-Grunwald(血液细胞)、蓝色复染剂(Trevigen)、乙基绿(CAS)(淀粉样蛋白)、福尔根-萘酚黄S(DNA)、Giemsa(对不同细胞区室进行差异着色)、甲基绿(淀粉样蛋白)、派洛宁(核酸)、萘酚黄(红血细胞)、中性红(核)、巴氏(Papanicolaou)染色剂(通常包括苏木精、曙红Y、橘黄G和Bismarck褐的混合物)(整体细胞形态)、红色复染剂B(Trevigen)、红色复染剂C(Trevigen)、天狼星红(淀粉样蛋白)、福尔根试剂(对品红)(DNA)、倍花青铬明矾(DNA)、倍花青铬明矾和萘酚黄S(DNA)、甲基绿-派洛宁Y(DNA)、硫堇-福尔根试剂(DNA)、吖啶橘黄(DNA)、亚甲基蓝(RNA和DNA)、甲苯胺蓝(RNA和DNA)、阿尔新蓝(碳水化合物)、钌红(碳水化合物)、苏丹黑(类脂)、苏丹IV(类脂)、油红-O(类脂)、VanGieson三色染色剂(酸性品红和苦味酸混合物)(肌肉细胞)、Masson三色染色剂(苏木精、酸性品红和浅绿混合)(对胶原、细胞质、细胞核进行不同地着色)、醛品红(弹性蛋白纤维)、及Weigert染色剂(区分网状和胶原纤维)。前述染色剂的综合列表、其描述及一般用途在R.D.Lillie，“Conn’sBiologicalStains”，8thed.，WilliamsandWilkinsCompany，Baltimore，Md.(1969)中给出。前述适当的媒染剂及成分为本领域技术人员众所周知。

下述非限制性列表提供了示例性的荧光组织染色剂及其适用的目标细胞、细胞区室或细胞组分：4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(核酸)、曙红(碱性细胞组分、细胞质)、Hoechst33258和Hoechst33342(两种双苯甲亚胺)(核酸)、碘化丙啶(核酸)、光谱橘黄(核酸)、光谱绿(核酸)、喹吖因(核酸)、荧光素-鬼笔环肽(肌动蛋白纤维)、色霉素A3(核酸)、吖啶黄素-福尔根反应(核酸)、金胺O-福尔根反应(核酸)、溴化乙啶(核酸)、Nissl染色剂(神经元)、高亲和力DNA荧光团如POPO、BOBO、YOYO和TOTO等、熔合到结合蛋白的绿色荧光蛋白，如组蛋白、ACMA、喹吖因和吖啶橘黄。

大量专有荧光细胞器专用探针可通过商业途径获得，并包括线粒体专用探针(MitoFluor和MitoTracker染料)、内质网胃(ER)和Golgi探针(ER-Tracker及各种神经酰胺共轭物)、及溶酶体探针(LysoTracker染料)。这些探针及许多非专有的荧光组织化学制品在可从俄勒冈州Eugene的MolecularProbes获得的HandbookofFluorescentProbesandResearchProducts8^thEd.(2001)中描述。

每一包含细胞的试样可用适当的酶培养基共同孵育，其为感兴趣的细胞组分及在酶活动场所产生彩色沉淀物的适当试剂。前述酶组织化学染色剂专用于特定目标酶。用酶组织化学染色剂染色可用于确定细胞组分或特定类型的细胞。作为备选，酶组织化学染色剂可在诊断上用于测细胞中酶活性的量。多种酶培养基和检测化验在本领域众所周知。

酸性磷酸酶可通过几种方法进行检测。在用于酸性磷酸酶的Gomori方法中，细胞制备用甘油磷酸盐和硝酸铅孵育。酶使磷酸盐游离，其与铅结合以产生磷酸铅，一种无色沉淀物。之后，将组织浸入硫化铵溶液中，其与磷酸铅反应以形成硫化铅，一种黑色沉淀物。作为备选，细胞可用包括pararosanilin-HCl、亚硝酸钠、萘酚ASB1磷酸盐(培养基)及醋酸佛罗那缓冲液的溶液孵育。该方法在酸性磷酸酶活动区域产生红色沉淀物。由于酸性磷酸酶的特性含量，溶酶体可通过使用该化验与其它细胞质颗粒和细胞器区分开。

脱氢酶可通过用适于脱氢酶和四唑的种的培养基孵育细胞而进行定位。酶将氢离子从培养基转移到四唑，将四唑还原为甲臢，一种黑色沉淀物。例如，NADH脱氢酶是呼吸链的络合物I的组分并主要定位到线粒体。

针对其已开发众所周知的染色技术的其它酶及其主要细胞位置或活动包括但不限于：ATP酶(肌纤维)、琥珀酸盐脱氢酶(线粒体)、细胞色素c氧化酶(线粒体)、磷酸化酶(线粒体)、磷酸果糖激酶(线粒体)、乙酰胆碱酯酶(神经细胞)、乳糖分解酵素(小肠)、白氨酸氨肽酶(肝细胞)、myodenylate脱氨酶(肌细胞)、NADH心肌黄酶(红细胞)、及蔗糖酶(小肠)。

免疫组织化学是最敏感和特殊的组织化学技术之一。每一试样t可与包括特别结合的探针的示踪结合成分组合。可采用多种标记，如荧光团、或产生吸收光或发荧光产物的酶。大量标记已知可用于与单一结合事件有关的强信号。在染色时使用的多个探针可用一个以上可区别的荧光标记进行标记。这些颜色区别提供识别特定探针的位置的方式。制备荧光团和蛋白质的共轭物如抗体的方法在文献中广泛描述，因而不需要在此进行例证。

尽管有至少120,000种商用抗体，示例性的主要抗体，其已知特别结合细胞组成且目前用为用于研究的免疫组织化学染色剂中的组分及在有限情形下用于诊断各种疾病，包括：***受体抗体(乳腺癌)、孕酮受体抗体(乳腺癌)、p53抗体(多种癌)、Her-2/neu抗体(多种癌)、EGFR抗体(上皮生长因子，多种癌)、组织蛋白酶D抗体(乳腺及其它癌)、Bcl-2抗体(凋亡细胞)、E-钙粘蛋白抗体、CA125抗体(卵巢及其它癌)、CA15-3抗体(乳腺癌)、CA19-9抗体(结肠癌)、c-erbB-2抗体、P-糖蛋白抗体(MDR，多抗药性)、CEA抗体(癌胚抗原)、视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)抗体、rasoneoprotein(p21)抗体、LewisX(也称为CD15)抗体、Ki-67抗体(细胞增殖)、PCNA(多种癌)抗体、CD3抗体(T细胞)、CD4抗体(协助T细胞)、CD5抗体(T细胞)、CD7抗体(胸腺细胞、未成熟的T细胞、NK杀伤细胞)、CD8抗体(抑制基因T细胞)、CD9/p24抗体(ALL)、CD10(也称为CALLA)抗体(急性淋巴细胞白血病)、CD11c抗体(单核细胞、粒细胞、AML)、CD13抗体(髓样单核细胞、AML)、CD14抗体(成熟的单核细胞、粒细胞)、CD15抗体(Hodgkin病)、CD19抗体(B细胞)、CD20抗体(B细胞)、CD22抗体(B细胞)、CD23抗体(活性B细胞、CLL)、CD30抗体(活性T和B细胞、Hodgkin病)、CD31抗体(血管发生标志物)、CD33抗体(骨髓细胞、AML)、CD34抗体(内皮干细胞、间质瘤)、CD35抗体(树突细胞)、CD38抗体(浆细胞、活性T、B和骨髓细胞)、CD41抗体(血小板、巨核细胞)、LCA/CD45抗体(白细胞通用抗原)、CD45RO抗体(协助、诱导T细胞)、CD45RA抗体(B细胞)、CD39，CD100抗体、CD95/Fas抗体(细胞凋亡)、CD99抗体(Ewings肉瘤标志物、MIC2基因产品)、CD106抗体(VCAM-1、活性内皮细胞)、泛素蛋白抗体(Alzheimer病)、CD71(运铁蛋白受体)抗体、c-myc(肿瘤蛋白和半抗原)抗体、细胞角蛋白(运铁蛋白受体)抗体、波形蛋白(内皮细胞)抗体(B和T细胞)、HPV蛋白(人***状瘤病毒)抗体、κ轻链抗体(B细胞)、λ轻链抗体(B细胞)、黑素体(HMB45)抗体(黑素瘤)、***特异性抗原(PSA)抗体(***癌)、S-100抗体(黑素瘤、salvary、神经胶质细胞)、τ抗原抗体(Alzheimer病)、纤维蛋白抗体(上皮细胞)、角蛋白抗体、细胞角蛋白抗体(肿瘤)、α-连环蛋白抗体(细胞膜)、Tn-抗原抗体(结肠癌、腺癌和胰腺癌)、1，8-ANS(1-苯胺萘-8-磺酸)抗体、C4抗体、2C4CASP级抗体、2C4CASPα抗体、HER-2抗体、αB晶体蛋白抗体、α半乳糖苷酶A抗体、α-连环蛋白抗体、人VEGFR1(Flt-1)抗体、整联蛋白B5抗体、整联蛋白β6抗体、磷酸化SRC原癌基因抗体、Bak抗体、BCL-2抗体、BCL-6抗体、β-Catanin抗体、β-连环蛋白抗体、整联蛋白αVβ3抗体、cErbB-2Ab-12抗体、钙连蛋白抗体、钙网蛋白抗体、CAM5.2(低摩尔重量细胞角蛋白抗体)抗体、Cardiotin(R2G)抗体、组织蛋白酶D抗体、鸡多克隆半乳糖苷酶α抗体、c-Met抗体、CREB抗体、COX6C抗体、细胞周期蛋白D1Ab-4抗体、细胞角蛋白抗体、结蛋白抗体、DHP(1-6二苯基-1，3，5-己三烯)抗体；DSB-X生物素化羊抗鸡抗体、E-钙粘蛋白抗体、EEA1抗体、EGFR抗体、EMA(上皮膜抗原)抗体、ER(***受体)抗体、ERB3抗体、ERCC1ERK(PanERK)抗体、E-选择蛋白抗体、FAK抗体、纤连蛋白抗体；FITC-羊抗鼠IgM抗体、FOXP3抗体、GB3抗体、GFAP(胶质纤维酸性蛋白)抗体、巨蛋白抗体、GM130抗体、羊ahMet抗体、高尔基体蛋白97抗体、GRB2抗体、GRP78BiP抗体、GSK-3β抗体、肝细胞抗体、HER-2抗体、HER-3抗体、组蛋白3抗体、组蛋白4抗体、组蛋白H2AX抗体、组蛋白H2B抗体、HSP70抗体、ICAM-1抗体、IGF-1抗体、IGF-1受体抗体、IGF-1受体β抗体、IGF-II抗体、IKB-α抗体、IL6抗体、IL8抗体、整联蛋白β3抗体、整联蛋白β5抗体、整联蛋白b8抗体、Jagged1抗体、蛋白激酶Cβ2抗体、LAMP-1抗体、M6P(甘露糖6-磷酸盐受体)抗体、MAPKAPK-2抗体、MEK1抗体、MEK2抗体、线粒体抗原抗体、线粒体标志物抗体、Mitotracker绿FM抗体、MMP-2抗体、MMP9抗体、Na+/KATP酶抗体、Na+/KATP酶α1抗体、Na⁺/KATP酶α3抗体、N-钙粘蛋白抗体、去氧肾上腺素抗体、NF-p50抗体、NF-P65抗体、Notch1抗体、OxPhos络合物IV-Alexa488偶联抗体、p130Cas抗体、P38MAPK抗体、p44/42MAPK抗体、P504SClone13H4抗体、P53抗体、P70S6K抗体、P70磷酸化激酶封闭肽抗体、广谱钙粘蛋白抗体、桩蛋白抗体、P-钙粘蛋白抗体、PDI抗体、磷酸化AKT抗体、磷酸化CREB抗体、磷酸化GSK-3-β抗体、磷酸化H3抗体、磷酸化MAPKAPK-2抗体、磷酸化MEK抗体、磷酸化p44/42MAPK抗体、磷酸化p53抗体、磷酸化NF-p65抗体、磷酸化p70S6激酶抗体、磷酸化PKC(广谱)抗体、磷酸化S6核糖体蛋白抗体、磷酸化Src抗体、磷酸化Bad抗体、磷酸化HSP27抗体、磷酸化IKB-a抗体、磷酸化p44/42MAPK抗体、磷酸化p70S6激酶抗体、磷酸化Rb(Ser807/811)(视网膜母细胞瘤)抗体、磷酸化HSP-7抗体、磷酸化p38抗体、Pim-1抗体、Pim-2抗体、PKCβ抗体、PKCβ11抗体、足细胞标志蛋白抗体、PR抗体、PTEN抗体、R1抗体、Rb4H1(视网膜母细胞瘤)抗体、R-钙粘蛋白抗体、RRM1抗体、S6核糖体蛋白抗体、S-100抗体、足细胞骨架蛋白抗体、多配体蛋白聚糖4抗体、Talin抗体、Tensin抗体、Tuberlin抗体、尿激酶抗体、VCAM-1抗体、VEGF抗体、波形蛋白抗体、ZAP-70抗体、及ZEB。

可与主要抗体偶联的荧光团包括但不限于荧光素、罗丹明、德克萨斯红、Cy2、Cy3、Cy5、VECTOR红、ELF^TM(酶标记的荧光)、Cy0、Cy0.5、Cy1、Cy1.5、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy7、FluorX、钙黄绿素、钙黄绿素-AM、CRYPTOFLUOR^TM、橘黄(42kDa)、橘红(35kDa)、金(31kDa)、红(42kDa)、深红(40kDa)、BHMP、BHDMAP、Br-Oregon、Lucifer黄、Alexa染料系列、N-[6-(7-硝基苯-2-草酸-1，3-重氮-4-基)氨基]己酰](NBD)、BODIPY^TM、氟化硼络合二吡咯甲川、Oregon绿、MITOTRACKER^TM红、DiOC₇(3)、DiIC₁₈、藻红蛋白、藻胆蛋白、BPE(240kDa)、RPE(240kDa)、CPC(264kDa)、APC(104kDa)、光谱蓝、光谱浅绿、光谱绿、光谱金、光谱橘黄、光谱红、NADH、NADPH、FAD、红外(IR)染料、环状GDP核糖(cGDPR)、Calcofluor白、丽丝胺、伞形酮、酪氨酸和色氨酸。多种其它荧光探针可从俄勒冈州Eugene的MolecularProbes及许多其它制造商获得和/或在HandbookofFluorescentProbesandResearchProducts8^thEd.(2001)中广泛描述。

信号的进一步修改可通过使用可通过使用特定结合成员的组合实现，如抗体和抗抗体，其中抗抗体结合到目标抗体探针的保存区域，尤其是其中抗体来自不同的种。作为备选，可使用特定结合的配体-受体对，如生物素-抗生蛋白链菌素，其中主要抗体与该对的一个成员偶联，及另一成员用可检测的探针标记。因此，有效地建立了结合成员的夹合，其中第一结合成员结合到细胞组成并用于为辅助结合作准备，其中辅助结合成员可以也可不包括标记，其可进一步为第三次结合作准备，其中第三结合成员将提供标记。

辅助抗体、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或生物素中的每一个用可检测的基团单独标记，其可以是引导具有实质上不可溶颜色反应产物的底物、荧光染料(染色剂)、发光染料或非荧光染料的比色反应的酶。包含每一这些选择的例子在下面列出。

原则上，可使用符合下述情形的任何酶：(i)可与主要抗体偶联或间接结合(如经偶联的抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、生物素、辅助抗体)；及(ii)使用可溶底物提供不可溶产物(沉淀)。

例如，采用的酶可以是碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和/或葡萄糖氧化酶；及底物可相应为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶底物。

碱性磷酸酶(AP)底物包括但不限于AP蓝底物(蓝色沉淀，Zymed目录p.61)、AP橘黄底物(橘黄、沉淀、Zymed)、AP红底物(红、红色沉淀、Zymed)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP底物、青绿色沉淀)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四唑/碘硝基四唑(BCIP/INT底物、黄-棕沉淀、Biomeda)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四唑(BCIP/NBT底物、蓝/紫)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/硝基蓝四唑/碘硝基四唑(BCIP/NBT/INT、棕色沉淀、DAKO)、固红(红)、洋红-光(洋红)、萘酚AS-BI磷酸酯(NABP)/固红TR(红)、萘酚AS-BI磷酸酯(NABP)/新品红(红)、萘酚AS-MX磷酸酯(NABP)/新品红(红)、新品红AP底物(红)、对硝基苯磷酸酯(PNPP、黄、可水溶)、VECTOR^TM黑(黑)、VECTOR^TM蓝(蓝)、VECTOR^TM红(红)、Vega红(树莓红色)。

辣根过氧化物酶(HRP，有时缩写为PO)底物包括但不限于2，2’-连氮基-双-3-乙基苯-二氢噻唑磺酸酯(ABTS、绿、可水溶)、氨乙基咔唑、3-氨基-9-乙基咔唑AEC(3A9EC、红)、α-萘酚派洛宁(红)、4-氯-1-萘酚(4C1N、蓝、蓝-黑)、3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB、棕)、邻二茴香胺(绿)、邻苯二胺(OPD、棕、可水溶)、TACS蓝(蓝)、TACS红(红)、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB、绿或绿/蓝)、TRUEBLUE^TM(蓝)、VECTOR^TMVIP(紫)、VECTOR^TMSG(烟蓝-灰)、及Zymed蓝HRP底物(鲜艳蓝)。

葡萄糖氧化酶(GO)底物包括但不限于硝基蓝四唑(NBT、紫色沉淀)、四硝基蓝四唑(TNBT、黑色沉淀)、2-(4-碘苯基)-5-(4-硝基苯基)-3-苯基氯化四唑(INT、红或橘黄色沉淀)、四唑蓝(蓝)、硝基四唑紫(紫)、及溴化-3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四唑(MTT、紫)。所有四唑底物均需要葡萄糖作为共同底物。葡萄糖氧化及四唑盐还原并形成不可溶甲臜，甲臜形成彩色沉淀。

β-半乳糖苷酶底物包括但不限于5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(X-gal、蓝色沉淀)。与每一所列出的底物相关联的沉淀具有独一无二的可检测的光谱特征(组分)。

酶也可在催化底物的发光反应时进行引导，例如但不限于荧光素酶和发光蛋白质，具有能够发光或引导第二底物的第二反应的实质上不可溶的反应产物，例如但不限于荧光素和ATP或腔肠素和Ca.²⁺，具有发光产物。

下述整体组合于此的文献提供另外的例子：J.MElias(1990)Immunohistopathology：Apracticalapproachtodiagnosis.ASCPPress(AmericanSocietyofClinicalPathologists)，Chicago；J.F.McGinty，F.E.Bloom(1983)Doubleimmunostainingrevealsdistinctionsamongopioidpeptidergicneuronsinthemedialbasalhypothalamus.BrainRes.278：145-153；及T.Jowett(1997)TissueInsituHybridization：MethodsinAnimalDevelopment.JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork；JHistochemCytochem1997December45(12)：1629-1641。

核酸生物标志物可使用原位杂交(ISH)进行检测。总的来说，核酸序列探针用荧光探针或配体：受体对如生物素/抗生物素蛋白的一成员合成和标记，其用可检测的基团标记。示例性的探针和基团在前面部分中描述。序列探针与细胞中的目标核苷酸序列互补。包含目标核苷酸序列的每一细胞或细胞区室可结合标记的探针。在分析时使用的探针可以是DNA或RNA寡核苷酸或多核苷酸，及不仅可包含自然出现的核苷酸而且还可包含其类似物如dioxygenindCTP、生物素dcTP7-氮杂鸟嘌呤核苷、叠氮胸苷、肌苷或尿苷。其它有用的探针包括肽探针及其类似物、分支基因DNA、拟肽类、肽核酸和/或抗体。探针与感兴趣的目标核酸序列应具有足够的互补性，使得在目标核酸序列和探针之间出现稳定和特定的结合。稳定杂交所需要的同源度随杂交的严格性变化。传统的ISH、杂交和探针选择方法在下述文献中描述：Leitch，etal.InSituHybridization：apracticalguide，OxfordBIOSScientificPublishers，MicroscopyHandbooksv.27(1994)；及Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPress(1989)。

在一实施例中，在这里描述的当前化验中使用的试剂如染色或IHC试剂的最佳稀释可在数量上自动确定。在一实施例中，对多个稀释组进行成像，其中每一稀释组包括不同的相应稀释值和免疫测定染色强度值的相应排列。对多个稀释组中的每一组，相对于免疫测定染色强度值的相应排列确定相应的动态范围度量。已发现相应的动态范围度量，选择具有数字上最佳动态范围度量的稀释组，及该稀释组的稀释值选择为在本发明中使用的试剂的最佳稀释水平的表示。

例如，制作在载玻片上的组织试样利用上述普通免疫组织化学技术用主要抗体的稀释系列之一染色。所得到的已染色试样中的每一个使用用于查看可检测的信号并获得图像的***成像，前述图像如数字染色图像。获取图像的方法在下面更详细地描述。因此，所获得的图像之后由本发明方法使用从而用于在数量上确定本发明中使用的试剂的最佳浓度。每一组组织试样包括多个不同的、用相应滴定量稀释准备的组织试样，使得不同的组织试样组具有不同的相应滴定量稀释。对多组组织试样的像素化图像进行量化分析。

对于多个稀释组中的每一稀释组，计算动态范围度量及染色特异性。在本发明的一实施例中，动态范围度量为平均绝对偏差。在本发明的另一实施例中，对该数据进行log变换，及动态范围度量为标准偏差、方差和摆幅比的加权组合。计算染色的特异性以在使噪声最小的同时使特定信号最大化。染色的特异性可这样计算：将与染色特异性区室相关联的一组免疫测定染色强度值求和然后计算该染色特异性区室的染色特异性平均值；也将与非染色特异性区室相关联的一组免疫测定染色强度值求和然后计算非染色特异性平均值。在计算这两个平均值之后，染色特异性平均值除以非染色特异性平均值以产生染色的特异性，或信噪度量。在这样的实施例中，数字上大灵敏度的染色值为最佳。在另一实施例中，非染色特异性平均值除以染色特异性平均值以产生染色的灵敏度。在前述实施例中，数字上小灵敏度的染色值为最佳。在计算每一稀释组的动态范围度量和染色灵敏度之后，动态范围度量和染色灵敏度可相互组合以产生每一稀释组的组合值。所得到的组合值用于选择具有数字上最佳组合值的稀释组。与所选稀释组相关联的是试剂的最佳稀释的稀释值表示。可选地，该方法执行多个比较以试图识别多个染色特异性和非染色特异性区室。

4、仪器标准化和图像收集

一旦试样已被染色，任何光学或非光学成像装置可用于检测染色剂或生物标志物标记，例如竖立或倒置光学显微镜、扫描共焦显微镜、摄像机、扫描或隧穿电子显微镜、扫描探针显微镜、及成像红外检测器等。

在一实施例中，成像装置为显微镜***，其包括配置成照射目标试样的照明源、配置成产生所照射目标试样的放大图像的光学器件、及配置成捕获所放大图像的数字图像的检测器如数码相机。量化结果可通过处理所捕获的数字图像获得。前述图像处理可包括本领域技术人员已知的图像处理技术。在至少部分实施例中，前述图像捕获和图像处理中的一个或多个在处理器的帮助下完成。处理器可包括实施预编程的指令的计算机。

例如，组织试样或组织微阵列可按如下所述成像：用户将微阵列放在试样台上。用户调节试样台使得感兴趣的第一区域或第一组织斑位于视场中心并由CCD照相机聚焦。物镜应调节到适当的分辨率，例如0.6毫米试样可以10倍放大率进行查看。如果有石蜡，试样通常对应于光强度比周围石蜡高的区域，与通过各种手段评估的一样，包括源自已染色组织的可见光散射、组织自身荧光或荧光标签的信号。计算机使用计算机软件(Softworx2.5，AppliedPrecision，Issaquah，WA)和成像平台(如Deltavision)可获得低分辨率图像(如具有16位分辨率的64像素×64像素)。计算机自动将试样台平移约等于视场的量。之后，计算机获得第二低分辨率图像。该过程重复直到计算机已获得整个组织试样或微阵列的图像为止。之后，计算机使用商用软件产生整个组织试样或微阵列的合成图像。

可选地，为标准化使用特定***获得的量化结果，可确定***内在因素以考虑例如沿光通路的激发源的强度变异性和设备变异性。为此，激发光源的强度的度量也可通过使用内嵌灯强度测量工具获得。同样，标准或校准试样如校准显微镜载玻片的测量可使用特定***获得以确定一个或多个光通路因素。使用前述校准载玻片对于基于荧光的IHC应用特别有用，其中校准载玻片的试样荧光区在相应带宽内发出辐射。荧光发射使能以一个或多个相应波长中的每一波长表征光通路。这些测量可同时或分别获得。

可选地，本发明***还包括构造成将照明源的标准化试样重定向到检测器的校准装置，尽管已发现本发明方法不需要使用这样的装置。在至少部分实施例中，***处理器配置成确定特定显微镜的校正因子。校正因子可从使用校准装置获得的照明源的标准化试样的测量结果确定。校正因子可(由处理器)用于校正目标试样的所检测图像的任何强度变化。例如，校准块因子(CC)通过与通用标准块比较进行确定。光源因子(LS)通过对捕获的校准表面图像的像素强度求和进行确定。光通路因子(OP)是对每一块/试样组合取的16个图像的平均总光强度的商。CC和OP因子对于进行研究的特定硬件***是固有的，因而仅需要校准一次或在怀疑光学***中已发生某些类型的修改时进行校准。

标准化得分如下所示：

标准化得分＝原始得分*CC因子*LS因子*OP因子

其中，CC和OP因子在***安装/构造时确定，LS因子同时进行测量。

在一些实施例中，***处理器配置以用于获得校准因子的指令(如软件)。作为备选或另外，***处理器配置以使用校正因子校正所检测的图像的指令。前述校准用于降低同一显微镜***内照明源强度随着时间的过去可能出现的变化性，及降低使用不同显微镜***和/或不同照明源获得的量化结果之间的变化性。

5、图像优化

a、曝光时间

可选地，可对来自所收集图像的像素强度数据的动态范围进行优化以进一步降低批次之间的变化，尤其降低因染色强度和影响曝光时间的设备差异引起的变化。该过程包括在第一曝光时间捕获照相机视场内的对象的图像，使得所捕获的图像包括预定数量的像素，其中每一像素具有强度值。查询所捕获图像的像素强度的频率分布以确定频率分布的像素强度的最高出现频率的区域。然后，自第一曝光时间调节曝光时间以将该最高频率分布区域移向强度值范围的中间。换言之，确定直方图的质心(COM)或频率分布，从其计算调节的曝光时间以获得像素强度的优化动态范围。之后，在调节后的曝光时间捕获该对象的第二图像，从而使得图像具有最佳动态范围。

有多种方式可校正在此描述的方法中的曝光。一种校正技术为以比先前图像更长或更短的曝光时间迭代获取新的图像，直到饱和像素最小化且获得最佳动态范围为止。该迭代过程使能快速调节曝光时间以在检测范围内减低像素强度从而优化曝光和动态范围。然而，该过分简单化的方法可能导致***饱和像素过校正并将新的曝光时间设置得太低。因此，希望将曝光时间校正的攻击性修改为与先前图像中有多少像素饱和成正比。

为此，新的曝光时间可计算为：

E＝E’x(1-(0.5)^(1+S))，

其中

$S=A\frac{{\mathrm{CCD}}_x{\mathrm{CCD}}_y\mathrm{SL}}{P}$

其中E为新的曝光时间，E’为当前设置的曝光时间，A为攻击水平，SL为饱和极限，CCD_x和CCD_y表示所捕获图像的像素尺寸，及P为最大强度的像素计数。攻击水平A可变化，但通常想要选择的值取决于图像趋于过饱和的量。对于A，零(0)值表示曝光时间应减半的最小值。A的实践最大值约为10，其后，对于有用的算法，曝光时间将不会足够改变。在本发明的优选实施例中，A的值可落在0≤A≤4.5的范围中。更具体地，A设定为约3.5。

降低曝光时间以确保图像不被曝光过度的程序通常为多步骤过程。在示例性实施例中，首先对在当前曝光时间E’从照相机获得的8位每像素图像产生256bin直方图。确定饱和像素的数量并与预定的饱和阈值比较。之后，如果图像处于或低于饱和极限，退出过度曝光程序。然而，如果图像过度曝光，则减少曝光时间。新的减少的曝光时间可基于当前过度曝光的像素的数量改变。在示例性实施例中，值S可确定为

$S=A\frac{{0.0002\×2048}^2}{M},$

其中A为当前定义在3.5的“攻击水平”，及M为最大强度的像素的计数。之后，下一曝光时间E推导如下：

E＝E′-E′0.5^1+S

当过度曝光的像素的数量远大于饱和极限时，E≈E′-0.5E′(例如，曝光时间应减半)。当过饱和像素的数量非常接近等于饱和极限时，对当前曝光时间出现最小变化量，在该情形下E≈E′-0.088E′。因此，由于当图像处于或低于饱和极限时退出算法，饱和像素的数量将永不等于饱和极限。减少曝光时间的程序可以迭代的方式重复，直到过度曝光的量在所选阈值内为止，或直到已达到最大迭代次数为止。在任一情形下，之后退出过度曝光校正例程。

备选及同等可行的用于校正过度曝光的方法是在最小曝光时间获取新的图像，之后通过计算COM并使之在中点的范围之内而继续优化曝光时间，如上所述。

b、图像确认

图像质量可自动进行评估和优化以减小因选自下组的一个或多个因素引起的变化：染色均匀性、染色质量、组织充足、组织试样位置、信号饱和、焦点和信号强度。因此，图像可被校正以避免因没有试样、试样太小、死细胞、多个试样或“拆分图像”(在TMA分析的情形下)及聚焦不足引起的误读，使得无效图像可从随后的数据分析排除。每一染色剂可独立于同一或不同图像上的其它染色剂进行确认。这些评估和优化可通过图像处理程序自动执行，特定阈值固化在程序中或由用户提供。

可选地，为确定跨载玻片或至少跨载玻片的成像部分的染色均匀性，图像像素的纵向列的强度值沿相应列组合并跨x轴绘图。组合可以是沿该列的像素强度值的直接相加。作为备选或另外，组合可以是统计得到的值，如该列中所有像素的平均强度值。例如，对于使用8位表示强度的图像，对于每一像素有256个可能的像素强度值。这些像素强度值跨越从黑(如“0”)到白(如“255”)的范围。在黑和白之间的值与变化的灰颜色深浅相关联。相对最大的强度值或峰值可在图像的不同区域之间比较以确定染色均匀性和位置偏离。如果发现偏离，则该图像可在进一步分析时排除。

可选地，为确定染色质量，区室内区室特异性染色的染色强度通过分析确定为区室的一部分的数字图像的像素强度进行测量。例如，为测量核染色剂的染色质量，核细胞区室内的总染色强度可用公式表示为一组合，如确定为表示细胞核的像素的强度的和。核细胞区室外面的总染色强度可类似地用公式表示为确定为不是核的像素的强度的和。对细胞核和非核的两个值进行比较。例如，两个值可按比例组合，即比较的比例指示的单一值。例如，组合的细胞核强度可通过图像处理程序除以组合的非核强度以提供组织染色质量比。低的比例如接近1的比例为染色质量差或组织完整性差的指示。可接受的最小染色质量阈值可固定或由用户设置。前述确定为不满足最小染色阈值的试样可通过确认算法从数据集及在进一步分析时排除。

组织充足可通过对信号强度高于阈值强度的图像像素计数然后确定正像素的总数是否满足充足组织的最低条件而进行分析。同样，正像素与总像素的百分比可用作前述条件。

当分析组织微阵列时，组织试样位置可通过计算视场内识别的多个不同切片中的每一切片的平均像素强度进行评估。必须识别各个试样或组织斑以确定位置，其可在比较试样的边缘位置和试样的中心时使用。试样边缘基于矩形区的像素强度确定以评估是否适当居中，及测量中央像素强度以确定边缘是否对一个以上试样不当。试样边缘检测可使用分立的区别执行机构进行，如Sobel边缘检测器，或本领域众所周知的任何其它数量的边缘检测器。之后，可识别未正确定位的试样或包含一个以上目标的拆分斑并在进一步分析时排除。

试样的焦点可进行评估，如通过确定图像的像素强度的峰度值进行。数字化图像中的像素的染色强度值可绘成直方图。该分布可分析为焦点的指示。相较于焦点没对准的图像，焦点对准的图像的像素强度分布通常具有相对陡轮廓的峰(更高的峰度)，而前者的像素强度分布具有变平的峰(更低的峰度)。前述分布的锐度或平直度可用单一值表示，如峰度值。较高的峰度值是相对陡轮廓的峰的指示；而较低的峰度值是变平的峰的指示。

峰度是数据相当于正常分布是尖还是平的度量。也就是说，具有高峰度的数据集趋于具有靠近中间值的明显尖峰、下降相当快、及具有巨大的尾部。具有低峰度的数据集趋于在中间值附近具有平顶而不是陡峭的尖峰。对于单变量数据Y₁，Y₂，...，Y_N，峰度的公式为：

其中为平均值，s为标准偏差，及N为数据点的数量。过大峰度可定义为

使得标准正常分布具有为零的峰度。正峰度指“尖”分布，及负峰度指“平”分布。之后，具有负峰度的图像可在进一步分析时排除。

信号强度可通过对从每一组织斑的每一有关通道中获得的图像测量的信号强度数据进行分类并确定具有低染色强度的试样数量而进行评估。这些试样可在进一步分析时排除。

6、计分

一旦图像得以优化和确认，排除任何无效的组织斑或图像，则该图像实质上被掩蔽，可产生试样中的细胞的三维近似值，及生物标志物与各个细胞的亚细胞区室相关联。一种用于自动执行这些任务的算法为自动化定量分析平台(平台)。该技术也在美国专利7,219,016和Camp等在2002NatureMedicine8(11)1323-1327的文章中描述，这些文献通过引用而全部特别组合于此。然而，对于第一次，每一步骤的自动化在此进行描述，从而增加该分析的简易性和再现性。

在一实施例中，组织试样用分辨感兴趣细胞区室和研究的特定目标的标志物染色。表达区域化的基于像素的局部分配(PLACE)是用于为表达区域化目的对图像像素有效分段的关键算法。该算法中的关键步骤为设置用于将背景或非特定像素与信号特异性像素分开的强度阈值。已按这样“掩蔽”的图像随后按互斥的方式组合使得高于阈值的像素分配给特定细胞区室。一旦像素已分配给每一区室，则目标标志物的信号可基于分配给特定区室的所有像素求平均，这是该试样的得分。

例如，肿瘤特异性掩蔽可通过人工设定标志物(细胞角蛋白)的图像的区分肿瘤和周围的间质和/或白细胞的阈值而产生。这产生二元掩蔽(每一像素为“开”或“关”)。验证阈值水平并在必要时调整，其通过检验少量试样图像及其余图像使用单一确定的阈值自动掩蔽进行。所有随后的图像处理仅涉及来自掩蔽区的图像信息。非目标特异性图像可被聚群以迭代调节非标准掩蔽目标的像素强度。膨胀图像处理技术使空间低通滤波器能填充由掩蔽中包括的像素包围的最近邻像素。侵蚀图像处理技术使空间高通滤波器能去除不与掩蔽邻接或形成与特定制作在载玻片上的组织试样的预期结构相反的结构的像素。前述调节使能包括有效但非一致的试样，要不然这样的试样可能在进一步分析时排除。

接下来，信噪比可通过背景噪声校正进行增强。例如，取属于区室特异性标签和目标标志物的两个图像(一图像焦点对准，一图像焦点未对准，例如深入试样6μm取图像)。焦点未对准的图像用作提供背景值的空间低通滤波器。例如，焦点未对准的图像的百分比从焦点对准的图像减去，基于两个图像的逐像素分析，如通过使用称为RESA(快速指数减法算法)的算法。RESA算法增强较高强度染色区域和相邻的较低强度染色区域之间的界面，使能更容易将像素分配给背景和相邻区室。最后，PLACE算法将图像中的每一像素分配给特定细胞区室。在用户定义的置信度内不能准确分配给区室的像素则被放弃。例如，其中核和细胞质像素强度太近似以至于不能准确分配的像素则被否定(例如，包括总像素的＜8％)。一旦每一像素被分配给细胞区室(或按如上所述排除)，对每一位置中的信号求和以产生该试样的得分，如下面的等式所示：

$\mathrm{AQ}=\left(\frac{1}{\mathrm{\Σ}{C}_i}\right)\left(\mathrm{\Σ}{T}_i{C}_i\right)$

其中AQ为原始得分，T_i为i^th目标强度，也称为功率密度，及C_i为i^th细胞区室概率。保存这些数据且随后可表示为总信号的百分比或每区室区域的平均信号强度。

优选地，得分例如可通过聚类而自动归一化以基于强度数据将像素分配给特定细胞区室。该聚类使能进一步去除背景噪声、将特定像素分配给特定区室、及在可能有重叠信号的情形下将像素按概率分配给每一区室。一旦像素分配给每一区室(或在噪声情形下放弃)，可测量相关目标信号，例如求和及计算得分。

分配在逐图像的基础上优先确定，而不是设置通用条件。此外，像素分配(Cy3/细胞角蛋白像素分配给细胞质)还是其它区室图像的函数，使得对其它区室图像中的像素的状态给予考虑。在一实施例中，一图像属于特别标记第一区室的第一染色(如Cy3/细胞角蛋白图像，表示细胞质区室)及第二图像属于特别标记第二区室的第二染色(如DAPI图像，表示核区室)，及像素分配基于四个条件：

1)第一和第二图像(如DAPI和Cy3)中均为低强度：背景：去除

2)相对于第一染色(Cy3)强度，高第二染色(如DAPI)强度：第二区室(如核)

3)相对于第二染色(如DAPI)强度，高第一染色(如Cy3)强度：第一区室(如细胞质)

4)高第二染色和第一染色(如DAPI和Cy3)强度：不能判定：去除

聚类是数学算法函数，其中数据集内的形心由每一数据点彼此之间的相对距离确定，例如由欧几里得或对数似然距离确定。在不希望受理论约束的同时，相信来自至少两个图像(如DAPI和Cy3)的聚类像素强度可导致按所述至少通过上面的条件确定像素的形心。由于聚类很客观且可对每一图像个别执行，聚类是独立于操作员干预将像素分配给区室的可靠方法。

在另一实施例中，包含第一和第二染色的信号指示的像素通过下述方法分配给区室。所获得图像中的每一像素具有三个属性，即来自区室标志物A的强度成分、来自区室标志物B的强度成分和来自感兴趣的目标或生物标志物的强度成分。这些强度经实验配置在其相应荧光通道中进行测量。为避免实验偏离，目标强度不按该当前方法进行处理。因此，两个区室属性的数据可示意性图示在二维绘图中。

具有朝向任一轴的强偏离的像素可分配给该区室(例如，区域A和B中的像素可分别绝对分配给区室A和B)。靠近原点的像素表示对于两个通道均为低强度，并可连同具有高强度但具有类似值的离群像素一起作为背景放弃。之后，保留在区域A/B中的像素可基于概率分配给每一区室。该分配使那些像素中的目标信号能基于概率特征跨两个区室分布。

为定义上面描述的区域，例如对于每一图像，聚类用于确定数据中的三个形心。该方法完全自动化且不需要任何操作员决定是否继续。该分析通过使用欧几里得距离对三个形心执行k-均值聚类而完成。

之后，按如下所述分析数据：(i)背景和离群像素在进一步计算时放弃。如果其到原点的距离小于背景形心到原点的距离的两倍，则该像素定义为背景。如果其强度超出最远形心确定的线或面定义的值，则该像素定义为离群像素。(ii)区域A和B中的像素排他地分配给那两个区室。(iii)三角形区域A/B中的像素被分配一使它们能实质上分布在多个区室中的概率值。该概率值可基于到两个区域A和B的距离计算，或使用形状函数，其通过检查每一像素到形心给定的三个顶点的距离分配具有背景区域成分的每一像素的概率。(iv)对于分配的所有像素，可对每一区室的相关目标得分求和并使用标准方法计算得分：

其中Int为像素的强度，P为分配给特定区室的像素的概率(范围在0-1之间)。

使用算法建立割点以将试样分为具有特定特征的组，如包含组织的试样对一个或多个生物标志物具有不同的生物标志物表达水平，如McCabe等，J.Natl.Canc.Inst.(2005)97(24)：1808-1815中更详细所述，该文通过引用全部组合于此。通过使用本发明方法减少试样生物标志物量化结果，组内变化得以最小化，而组之间的差异最大化从而更容易识别。例如，生物标志物的高表达水平，由高得分表示，可与侵占型疾病和减少的生存更紧密地关联；而更低的得分不是这样。通过可靠地区分两个组，生物标志物和疾病之间的关联变得更清楚。因此，使用本发明方法产生的得分为比较试样组提供可靠的化验，使得生物标志物可更特定地与特定特征相关联，从而使得基于个别试样实现更可靠的诊断和预后估计。

7、再现性

由于通过自动仪器标准化如曝光优化、通过聚类而使原始得分归一化、及通过可选地改善图像确认而使得分的变化性降低，化验的灵敏度和再现性得以增强。例如，在一实施例中，属于两个以上细胞区室的数据信号可更可靠地区分。在另一实施例中，数据信号可以至少约90％的置信区间进行区分。在另一实施例中，数据信号可以约95％的置信区间进行区分。在另一实施例中，数据信号可以约99％的置信区间进行区分。

归一化得分实现更加可再现的割点确定，从而在批次之间导致更大的试样分类一致。在一实施例中，对于每一试样，该化验在批次之间提供大于85％的试样分类一致。在另一实施例中，对于每一试样，该化验在批次之间提供大于90％的试样分类一致。在另一实施例中，对于每一试样，该化验在批次之间提供大于95％的试样分类一致。在另一实施例中，对于每一试样，该化验在批次之间提供大于99％的试样分类一致。

归一化得分实现生物标志物表达的更加可再现的量化测量。在一实施例中，生物标志物表达水平的量化测量具有高于80％的再现性。在另一实施例中，生物标志物表达水平的量化测量具有高于90％的再现性。在另一实施例中，生物标志物表达水平的量化测量具有高于95％的再现性。在另一实施例中，生物标志物表达水平的量化测量具有高于99％的再现性。在另一实施例中，生物标志物表达水平的量化测量具有从约85％到约99％的再现性。在另一实施例中，生物标志物表达水平的量化测量具有从约90％到约99％的再现性。在另一实施例中，生物标志物表达水平的量化测量具有从约90％到约97％的再现性。

在一实施例中，归一化得分使生物标志物表达的量化测量具有低于20％的变化系数(％CV)。在另一实施例中，归一化得分使生物标志物表达的量化测量具有低于10％的变化系数(％CV)。在另一实施例中，归一化得分使生物标志物表达的量化测量具有低于5％的变化系数(％CV)。在另一实施例中，归一化得分使生物标志物表达的量化测量具有从约1％到约20％的变化系数(％CV)。在另一实施例中，归一化得分使生物标志物表达的量化测量具有从约5％到约15％的变化系数(％CV)。在另一实施例中，归一化得分使生物标志物表达的量化测量具有从约4％到约7％的变化系数(％CV)。

因此，归一化得分为比较试样组提供可靠的化验，使得生物标志物可更特定地与特定特征相关联，从而实现更可靠的诊断和预后估计。

例子

例1：使用自动技术实现HER2分析的标准化

材料和方法

队列描述和TMA构建

在这些研究中采用组织微阵列(TMA)形式的大乳腺癌队列以测试标准化技术。该来自耶鲁组织微阵列设施(YTMA49)的队列先前已进行详细描述(Dolled-FilhartM，etal.CancerRes.(2006)66：5487-94)。简要地，在1961到1983年间耶鲁大学病理学系连续收集浸润性导管癌的乳腺队列(n＝669)。同样基于该阵列选择正常组织和进行细胞系控制。平均跟踪时间为12.8年，平均诊断年龄为58.1岁。该队列包含约一半节点阳性样本和一半节点阴性样本。详细治疗信息不可从该队列得到。

免疫组织化学/免疫荧光组织染色

对于YTMA49中的情形，按先前所述(CampRL，etal.CancerRes.(2003)63：1445-1448，其通过引用全部组合于此)进行基于Chromagen的免疫组织化学染色和计分。YTMA49使用修改的间接免疫荧光协议(CampRL，etal.Nat.Med.(2002)8：1323-1327，其通过引用全部组合于此)进行染色。简要地说，对预切涂有石蜡的组织微阵列载玻片脱蜡并通过在10mMTris(pH9.0)中进行热引导抗原决定簇修复而修复抗原。使用自动染色剂(LabVision，Fremont，CA)，载玻片用BackgroundSniper预孵育(BioCareMedical，Concord，CA)。之后，载玻片用针对HER2的主要抗体(Dako(Carpinteria，California)，兔多克隆，1∶8000稀释)和在DaVinciGreen(BioCareMedical，Concord，CA)中在RT稀释1小时的广谱细胞角蛋白抗体(兔多克隆，1∶200稀释，DAKO，Carpinteria，CA)孵育。

载玻片用包含0.05％吐温-20的1XTBS冲洗3x5min。对应的辅助抗体在DaVinciGreen中稀释并在室温孵育30分钟。这些包括直接与细胞角蛋白抗体的荧光团偶联的抗体(Alexa555偶联的羊抗兔；1∶100，MolecularProbes，Eugene，Oregon)，和/或经抗鼠或抗兔Envision与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗体(Dako，Carpinteria，California)。载玻片再次用包含0.05％吐温-20的TBS冲洗3x5min。载玻片用荧光chromagen放大***(Cy-5-tyramide，NENLifeScienceProducts，Boston，Massachusetts)孵育，其与DAB类似，由HRP活化并导致众多共价关联的Cy-5染料直接邻近HRP偶联的辅助抗体沉积。之所以使用Cy-5(红)是因为其发射峰值在组织自动荧光的绿-橙光谱的外面。用于自动分析的载玻片用抗荧光淬灭含DAPI的封片介质作盖片(ProLongGold，MolecularProbes，Eugene，OR)。

显微镜***和图像获取

由HistoRx，Inc.(NewHaven，CT)商业化的PM2000^TM***基于先前描述的***(Campetal.，2002，在前提及)。简要地，其包括OlympusBX51落射荧光显微镜(OlympusAmerica，Inc.，CenterValley，PA)，该显微镜装备有机动鼻形件以控制物镜的选择(如4X、10X、20X、40X和60X)；机动滤色片转盘以控制不同滤色块的选择(如DAPI、Cy2、Cy3、Cy5和Cy7或相当波长)；机动台以控制台移动(PriorScientificInc.，Rockland，MA)；X-Cite120汞/金属卤化物光源(EXFOLifeSciences&IndustrialDivision，Ontario，Candada)；及QUANTFIRE单色数码相机(Optronics，Inc.，Goleta，CA)。

自动图像捕获由使用软件包完成。对阵列上的每一组织斑捕获用Cy3、DAPI显现的细胞角蛋白染色和用Cy5显现的目标(HER2)染色的高分辨率、8位(导致所获得的图像每像素256个离散的强度值)数字图像并保存。像素作为功率(功率(P)＝(像素强度/256)/曝光时间)的函数写入图像文件，以帮助补偿染色强度和曝光时间的实验差异。

得分产生

针对肿瘤面积百分比(肿瘤表明＜5％面积/场被编辑)、焦点未对准、及死细胞确认图像。在YTMA49的669个肿瘤试样中，86个试样被编辑(12.8％)，剩下583个试样用于随后的计分和分析。对于每一组织斑，基于先前所述(Campetal.，2002，之前提及)的PLACE(表达区域化的基于像素的场所分配算法)算法产生HER2的区室特异性得分。为消除操作员间的阈值设置偏离，如本说明书别处所述，在PLACE算法中使用无人监督的用于最佳图像分割的基于像素的聚类算法。

仪器标准化

为针对仪器变化性进行得分标准化，开发三个校准因子：校准块因子(CC因子)、光源因子(LS因子)和Cy5光通路因子(OP因子)。这些因子的计算基于在所述条件下获得的图像给出的像素强度测量值。所有因子依赖于设计的专用滤色块(校准块)，其中光经附着到滤色块的物镜端的白色滤纸从光源直接反射到照相机。为考虑不同块结构的变化，每一机器的校准块通过计算平均总光强度相较于“黄金标准”校准块的平均总光强度的百分比(产生CC因子)进行标准化。这是对每一块计算和保存的恒定不变的因子，因而为安装该块的每一显微镜***的常量。对所获得的每一组织斑计算光源因子，且其为校准块测量的总光强度除以常数(100,000)。光通路因子考虑相对于测得的入射光强度通过特定显微镜物镜/滤色片组合的光量。对于这些测量，需要标准试样，其可在不同机器之间传递并保持其构造的再现性。为该目的，选择商用蓝色荧光标准载玻片(OmegaOpticalInc.，Brattleboro，VT)。标准化按本说明书先前所述进行。

统计分析

为了分析，对得分进行Log₂变换。统计分析和输出使用SPSS15.0(SPSSInc，Chicago，Il.)进行，除非另外说明。5年特定疾病死亡的连续HER2数据的最佳割点使用先前所述的软件包X-Tile(CampRL等，Clin.CancerRes.(2004)10：7252-7259，其通过引用全部组合于此)产生为生存的函数。X-Tile执行MonteCarlo模拟(例如交互证实(RaesideDE.PhysMedBiol.(1976)21：181-97，其通过引用组合于此))以产生校正的P值从而评估多个割点产生的数据的统计有效性。该软件还产生培训/确认子集以用于另外的P值估计。使用基于环球网的工具、JavaStat进行双向偶然性表分析从而确定2x2偶然性表具有95％置信区间的一致百分比。

结果

HER2免疫荧光染色

多路传输荧光染色剂以区域化和测量特定生物标志物的表达。对于HER2，只有从其得到细胞角蛋白(上皮特异性)的区室(Cy3)内的像素(Cy5)被考虑用于分析，因而区分肿瘤和间质HER2信号及区分膜/细胞质和细胞核HER2信号。如上所述，只有与细胞角蛋白像素一致的HER2像素用于产生得分。

得分与传统IHC计分方法关联

HER2得分表明与分类IHC计分方法(0、+1、+2和+3)的适中但高度重要的关联，Spearman的ρ值为0.46(P＜0.001)。多项式回归分析(用于分类和连续数据的比较)表明与0.56的伪R值高度重要的关联(P＜0.001)。图3使用框式图表将HER2得分分类为IHC得分的函数。尽管在总体均值方面有高度明显的差异(ANOVAP＜0.001)，但由于提供连续的表达得分，得分的明显重叠可跨传统分类计分的范围观察到。

归一化HER2表达得分

浸润性乳腺癌队列(n＝669)的三个连续切片按针对HER2所述的材料和方法进行荧光染色。第一连续切片用于跨三个不同仪器和三个不同操作员的得分产生。第二和第三连续切片在不同的日子染色以评估批次间的变化性。图4给出了表明每一指出的采集参数(仪器(图4A)、操作员(图4B)、和独立的染色批次(图4C))的归一化得分分布的框式图表。对于583个病人试样，跨仪器的平均变化系数百分比(％CV)为1.8％(min＝0.04％；max＝10.7％)，跨操作员的为2.0％(min＝0.06％；max＝15.6％)，及跨独立的染色批次的为5.1％(min＝0.12％；max＝29.7％)。这些％CV可与vitro免疫测定法如ELISA(Butleretal.JImmunoassay.(2000)21：165-209)的相比。

阳性/阴性一致

在临床实验室中HER2测试的关键参数为可再现地将病人分为阳性或阴性的能力。使用生存作为阳性/阴性分类22的替代标志物，使用X-tile19对仪器1、操作员1和染色批次1产生的归一化HER2得分建立最佳得分割点。图5A示出了仪器1的阳性/阴性HER2分类的Kaplan-Meier生存分析。如材料和方法中所述，割点用MonteCarlo模拟(P＜0.001)和培训/确认子集(P＝0.002)进行有效性确认。该确认的割点有效应用于在仪器2和3上产生的得分，P分别为P＜0.001和P＝0.004(图5B和5C)。跨独立的操作员和染色批次采集可观察到类似的再现性，所有P值≤0.01(数据未示出)。

目前的ASCO-CAP指导方针提出，对于目前的HER2化验方法学，实验室实现95％阳性/阴性一致(WolffACetal，ArchPatholLabMed.(2007)131：18)。最近的研究表明，对于基于HER2IHC的计分，观察者之间的一致性在54-85％范围中，没有达到这些指导方针(Hameedetal；inpress；directcommunication)。对于归一化计分的跨仪器、操作员和染色天数的阳性/阴性一致性使用上面建立的割点进行检验。如图6中所示，总体一致性在从94.5％(仪器1到仪器3；图6B)到99.3％(操作员1到操作员2；图6C)的范围中。这些分析包括所有情形，包括那些被认为模棱两可的情形。

为评估差别分类出现在归一化得分分布中的何处，产生面板化频率直方图以检查差别分类的情形出现在何处。如图7中所示，对于仪器间、操作员间和批次间，差别分类的情形出现在割点处而不是整个分布。这些数据表明，分类误差涉及割点选择，而不是归一化HER2得分的产生和再现性。综合在一起，这些数据表明，对于使用计分的HER2表达的仪器间、操作员间和批次间评估，病人的分类高度可再现，一致率接近ASCO/CAP所提出的(如果未超出的话)。

例2：EGFR的分析：分析性能数据

本发明方法应用于评价乳腺癌组织切片中的生物标志物EGFR。如图8A中所示，通过跨三个仪器、3个操作员和3个分开的染色批次的归一化分析而分析748个样本的TMA队列的HER2表达，平均％CV为4.3％。初步分析性能评估用EGFRPharmDx(Dako)进行。如图8B-D所示，对由乳腺肿瘤和细胞系(n＝152)组成的TMA进行的跨3个载玻片和3个染色日的EGFR表达的分析表明载玻片间和不同日间的高精确度，平均斜率为1.00047，平均PearsonR为0.95，肿瘤组织的平均％CV为3.3％，及细胞系的平均％CV为4.7％。综合在一起，这些数据证明分析使EGFR化验能具有高精确度，与仪器和软件控制结合，鲁棒的临床生物标志物化验的开发成为可能。

例3：ER表达的分析：再现性

为用另一生物标志物证明AQUAnalysis^TM的再现性，获取代表***受体(ER)表达的范围(如Allred计分判断的)的四个乳腺组织块。之后，取这些组织块的切片以产生H&E载玻片，委员会认证的病理学者在其上圈出肿瘤区域以用于所有随后的分析。一组连续切片用单克隆鼠抗人***受体α、克隆1D5抗体进行DAB染色及由同一病理学者进行Allred计分评价。例如参见HarveyJM，etal.，(1999)J.Clin.Oncol.12：1474，其通过引用全部组合于此。

之后，连续切片使用上述免疫荧光染色协议进行染色。图像在HistoRxPM-2000^TM显微镜平台上收集并进而传给AQUAnalysis^TM进行计分。所有得分变换在log2比例尺上。

获得四个载玻片的图像文件并进而由同一操作员使之通过AQUAnalysis^TM软件包n＝10次以证明总体软件再现性。对于所有文件，％CV实质上为0(小于1E-7)。

之后，同样的四个图像文件连同软件操作指令提供给三个不同的操作员。在此，操作员按为技术员评审图像质量概括的方法编辑图像，这反映典型使用。表1中所示的结果证明，即使在进行计分的多个图像的变化性大于30％的情形下(载玻片#3和#4)，总得分的％CV仍在1％级或更小。

表1：操作员间再现性

为证明独立场所处的性能及使用备选硬件***用于图像获取，基于满足所要求的硬件规约(在操作员手册中描述)的三个不同平台评价AQUAnalysis^TM软件。这些***在下表2中描述。

表2：用于再现性测试的硬件***

为确保统一测试，确保在每一***上采样同样的组织区域非常关键，因为并非所有列出的平台均要求自动图像采集或必然能这样做。为此，从先前再现性测试中描述的相同四个试样构建TMA，使用来自四个组织块(总共20个斑)中的每一组织块的5个得分。之后，对该微阵列进行免疫荧光染色，及在三个分开的硬件***上连续获取同样的单一TMA。在接收软件操作的培训之后，由操作员在安装硬件***的实验室中获取图像。对于所有外部测试，结果按隐蔽方式保存并提供在下表3中。

表3：场所间/硬件间测试的结果

每一“试样”指从先前测试中使用的相关整个组织切片试样取出的五倍冗余TMA斑的平均得分(具有Allred得分范围)。

总体上，得分均值的％CV值在4-6.5％范围中，且不跨ER表达范围明显改变。在单一场所在单一试样内观察到的％CV变化为该试样内的标志物非均匀性的指示的结果，而不是测量误差。ANOVA分析表明，在试样得分之间如预期一样有明显变化的同时(p＜0.001)，在场所之间没有明显差异(p＝0.58)。

例4：ER表达的分析：与Allred计分关联

为证明得分的实用性，进行比较研究以检验乳腺组织免疫荧光染色然后使用AQUAnalysis^TM计分及乳腺组织显色染色然后使用Allred方法计分之间的关系。如例1中所述，669个病人的组织微阵列队列从耶鲁大学组织微阵列设施获得，包括耶鲁大学病理学系在1961和1983年之间收集的组织档案中的试样。

两个连续切片使用鼠单克隆1D5抗体染色。一个切片使用DAB染色，及第二切片使用上述免疫荧光方法染色。之后，DAB染色的载玻片提供给三位委员会认证的病理学者进行Allred计分。每一病理学者对其他病理学者的结果(及荧光染色结果)不知情，且除了进行计分的组织性质和生物标志物(ER)之外，不给予任何进一步的信息。同时，TMA的荧光染色的连续切片通过AQUAnalysis^TM软件并产生得分。如下面(图9A-C)所有病理学者证明的，在Allred计分和计分之间有确定的趋势。所有病理学者进行的非参数关联分析(Spearmanρ，图9D)表明Allred计分和计分高度关联(p＜0.001)。所有病理学者进行的多项式逻辑回归分析证明在Allred计分和计分之间有明显(p＜0.001)和直接(伪R²)的关系(参见图9)。

尽管病理学者提供的个别得分有偏差，但在典型实践中，割点应用于数据。对于Allred计分方法，使用为3的割点，使得得分＜3(0或2)时考虑为阴性，及得分≥3时考虑为阳性。例如参见Harvey等，在上提及。该割点应用于每一人工计分的病理学者数据集的各个结果，并产生一致得分。至少一病理学者不能提供得分的试样从多数人的意见中排除。如果得分不一致，使用主要得分。由此，对于523个病例，可观察到，病理学者证明阳性/阴性分类在91％的时间普遍一致。

为确定得分数据的割点，使用商用软件程序SPSS(SPSS，Inc.Chicago，Il)应用基于对数似然距离的无人监督的聚类算法。对于该算法，病人基于得分的簇群成员进行分组。当进行聚类时，四个簇群出现在数据中(参见图10A)。与Allred计分类似，生存用于确定表达组之间的阳性和阴性分类。如图10B中所示，三个(簇群2-4)表明提高的生存，而簇群1表明降低的生存。因此，簇群1中的病人被认为ER阴性，所有其它为ER阳性。

对于数据确定的阳性/阴性分类，产生一致性矩阵以将AQUAnalysis^TM软件的结果与源自人工Allred计分的计分一致结果进行比较。这些结果表明方法之间的总体一致性为94.9％，阳性一致百分比为96.0％，及阴性一致百分比为92.5％，如下表4中所示。

表4：计分与人工IHCAllred计分的一致

随着ER得分的阳性/阴性分类的确认，比较Allred计分和计分之间的总生存，如图11中所示。两种方法均预测有意义的五年疾病特异性生存，并展现类似的阳性/阴性分类累计生存率。

例5：计分和Allred计分的再现性

在例3和4中描述的单一TMA载玻片使用如前所述的传统显色免疫组织化学技术进行ER表达染色并由三位病理学者使用光显微镜独立评价及用Allred方法计分(图12A)。第二，连续切片，TMA载玻片被染色以进行ER表达的分析(荧光免疫组织化学)，及同一载玻片在三个独立的仪器上通过分析进行分析(图12B)。由示作散点图(图12A)的每一病理学者获得的结果对每一其它病理学者的检验表明在总一致性高的同时，有被一病理学者认为是阳性而被另一病理学者认为是阴性的试样。这些病人将根据哪一病理学者读他们的ER结果而接受不同的治疗(荷尔蒙治疗)。

跨Allred得分分布的κ值(从0到1的范围，表5)表明相应病理学者人工计分确定存在大量偏差。

表5：病理学者计分的κ结果

对PM2000仪器的每一组合获得的结果的总回归分析如图12B中所示。有极高的关联(在所有情形下R2＞0.99，表6)，具有强一致性(与回归线的斜率类似，回归系数均为～1.0)。此外，数据集的ANOVA分析产生p＞0.05，表明这些数据集统计上不能区别。与图12A比较，AQUA分析获得的结果高度可再现，平均CV为1.35％。因此，无论试样在哪一仪器上(因而在哪一位置)进行分析，本发明方法提供一致的结果。

表6：通过AQUA分析在三个仪器上获得的结果的比较

比较	R2	回归系数(95％CI；p值)
			仪器1对2	0.996	1.003(0.99-1.01；＜0.001)
仪器1对3	0.995	1.01(1.00-1.02；＜0.001)
			仪器2对3	0.996	1.003(0.99-1.01；＜0.001)

这些例子仅用于说明的目的，而不应用于限制本发明的范围。基于本发明的内容和教导，本发明的许多其它实施方式对本领域的一般技术人员显而易见。

Claims (20)

1.使用标准化光学***在制作在载玻片上的组织试样中可再现量化生物标志物表达的方法，所述标准化光学***包括照明源，所述标准化光学***与处理器模块通信，所述方法包括：

(a)获取制作在载玻片上的组织试样，其已被染色以使能定位至少一细胞区室和至少一生物标志物；

(b)使用所述标准化光学***获取已染色组织试样的一个或多个包含像素的图像，其中所述照明源的强度和光通路变化性已归一化；

(c)使用无人监督的聚类分析自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分数据信号和噪声；

(d)使用无人监督的基于像素的聚类算法自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号；

(e)使用无人监督的基于像素的聚类算法自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号；

(f)量化表达在至少一细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量以确定标准得分，所述标准得分是原始得分与校准块因子，光源因子，和光通路因子的乘积；

藉此，一批次包括步骤(a)-(f)，及制作在载玻片上相同的组织试样中的生物标志物表达以在批次间再现性水平高于80％的方式量化。

2.根据权利要求1的方法，其中使用指令配置所述处理器模块以获得校正因子，其用于降低所述照明源的强度随着时间的过去可能出现的变化性。

3.根据权利要求1的方法，其中所述标准化光学***允许自动调节曝光时间以优化在图像像素中捕获的动态数据范围。

4.根据权利要求1的方法，其中对归属于两个以上细胞区室的数据信号进行区分。

5.根据权利要求1的方法，其中对表达在两个以上细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量进行量化。

6.根据权利要求1的方法，其中以95％的置信区间区分归属于两个以上细胞区室的数据信号。

7.根据权利要求1的方法，还包括：通过测试信号完整性、试样完整性和制作在载玻片上的试样的图像的图像完整性中的一个或多个并在信号完整性、试样完整性和图像完整性中的一个或多个失败时在分析时去除该图像而评估一个或多个制作在载玻片上的组织试样、一个或多个包含像素的图像或其一个或多个放大部分的质量。

8.根据权利要求1的方法，对于每一试样，所述方法在批次之间实现85％以上的试样分类一致性。

9.根据权利要求1的方法，对于每一试样，所述方法在批次之间实现90％以上的试样分类一致性。

10.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的再现性水平高于90％。

11.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物蛋白质的量化测量的再现性水平高于95％。

12.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的再现性水平落在90％到97％的范围中。

13.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数％CV低于20％。

14.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数％CV低于10％。

15.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数％CV低于5％。

16.根据权利要求1的方法，所述方法实现生物标志物表达的量化测量的变化系数％CV落在4％到7％的范围中。

17.根据权利要求1的方法，其中制作在载玻片上的组织试样已用一种或多种试剂的最佳稀释进行染色。

18.根据权利要求17的方法，其中所述最佳稀释产生具有最佳动态范围度量的一个或多个包含像素的图像。

19.用于可再现量化制作在载玻片上的组织试样中的生物标志物表达的***，包括：

(a)配置成至少放大制作在载玻片上的组织试样的一部分的一个或多个透镜，所述组织试样已被染色以使能定位至少一细胞区室和至少一生物标志物；

(b)标准化光学***，包括与一个或多个透镜光通信的照明源和图像传感器，标准化光学***获取已染色组织试样的一个或多个包含像素的图像；

(c)与标准化光学***通信的处理器，该处理器配置成：(i)使用无人监督的聚类分析自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分数据信号和噪声；(ii)使用无人监督的基于像素的聚类算法自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于至少一细胞区室中的每一细胞区室的数据信号；及(iii)使用无人监督的基于像素的聚类算法确定标准得分量化表达在至少一细胞区室的每一细胞区室中的生物标志物的量，所述标准得分是原始得分与校准块因子，光源因子，和光通路因子的乘积；藉此，一批次包括(i)-(iii)，及制作在载玻片上相同的组织试样中的生物标志物表达以在批次间再现性水平高于80％的方式量化。

20.根据权利要求19的***，其中所述处理器还配置成自动分析源自图像像素的一个或多个数据集以区分归属于用于至少一细胞区室中的每一细胞区室的至少一生物标志物的数据信号。