DE10119005A1

DE10119005A1 - Verfahren zur Proteinexpression ausgehend von stabilisierter linearer kurzer DNA in zellfreien in vitro-Transkription/Translations-Systemen mit Exonuklease-haltigen Lysaten oder in einem zellulären System enthaltend Exonukleasen

Info

Publication number: DE10119005A1
Application number: DE10119005A
Authority: DE
Inventors: Manfred Watzele; Thomas Hoffmann; Cordula Nemetz; Dieter Heindl; Thomas Metzler; Wolfgang Mutter
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2001-04-18
Filing date: 2001-04-18
Publication date: 2002-10-24
Also published as: EP1251179A3; JP2002320497A; EP1251179A2; US20040259081A1

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Proteinexpression, umfassend die Schritte Transkription von stabilisierter linearer kurzer DNA in zellfreien in vitro-Transkription/Translations-Systemen mit Exonuklease-haltigen Lysaten oder in einem zellulären System, enthaltend Exonukleasen und anschließender Translation, wobei die Verbesserung der Stabilität der linearen kurzen DNA durch eine oder mehrere der folgenden Maßnahmen zum Schutz der doppelsträngigen DNA gegenüber Exonukleasen erzielt wird: DOLLAR A a) Einbau von Exonuklease resistenten Nukleotidanaloga oder anderen Molekülen am 3'-Ende des Templates, DOLLAR A b) Verwendung von PCR-Primerpaaren, die Exonuklease resistente Nukleotide enthalten, zur Herstellung einer linearen kurzen DNA, DOLLAR A c) Schutz eines über die PCR Reaktion hergestellten Templates durch Verbinden des 5'-Primers mit dem 3'-Ende des Gegenstranges DOLLAR A d) Schutz des Templates durch große Moleküle, welche an die beiden Enden des linearen Templates binden, DOLLAR A e) Inaktivierung der Exonukleasen durch die Zugabe von kompetitiven oder nicht-kompetitiven Inhibitoren, DOLLAR A f) Zirkularisierung des Templates, so daß ein ringförmig geschlossenes Templat entsteht.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Proteinexpression umfassend die Schritte Transkription von stabilisierter linearer kurzer DNA in zellfreien in vitro-Transkription /Translations-Systemen mit Exonuklease-haltigen Lysaten oder in einem zellulären System enthal tend Exonukleasen und anschließender Translation, wobei die Verbesserung der Stabilität der linea ren kurzen DNA durch eine oder mehrere der folgenden Maßnahmen zum Schutz der doppelsträn gigen DNA gegenüber Exonukleasen erzielt wird:

a) Einbau von Exonuklease resistenten Nukleotidanaloga oder anderen Exonuklease resistenten Molekülen am 3'Ende des Templates,
b) Verwendung von PCR-Primerpaaren, die Exonuklease resistente Nukleotide enthalten, zur Herstellung einer linearen kurzen DNA,
c) Schutz eines über die PCR Reaktion hergestellten Templates durch Verbinden des 5'- Endes mit dem 3'-Ende des Gegenstranges
d) Schutz des Templates durch große Moleküle, welche an die beiden Enden des linearen Templats binden,
e) Inaktivierung der Exonukleasen durch die Zugabe von kompetitiven, oder nicht-kom petitiven Inhibitoren
f) Zirkularisierung des Templates, so daß ein ringförmig geschlossenes Templat entsteht.

Die zellfreie DNA-abhängige in vitro Transkription/Translation funktioniert in der Praxis recht gut in Verbindung mit der Expression zirkulärer Doppel-Helix DNA und in Verbindung mit der Expres sion langer linearer DNA. Versuche zur Expression von kürzeren linearen DNA-Stücken waren nur sehr begrenzt erfolgreich. Je kleiner die eingesetzte DNA desto schwieriger ist es, nennenswerte Men gen Genprodukt zu erhalten. Es konnte nachgewiesen werden, daß diese Schwierigkeiten durch die Anwesenheit von Exonukleasen bedingt waren. So wurde gezeigt, daß bei der in vitro Transkription und Translation mit S30 Lysaten von E. coli die Exonuklease V für den Abbau linearer DNA verantwortlich ist. Die Exonuklease V besteht aus drei Untereinheiten (den Genprodukten recB, recC, recD). Diese Exonuklease spaltet dabei die lineare DNA von Ihrem 3'Ende her.

Es wurde versucht, diese Schwierigkeit zu beseitigen, indem die Untereinheiten dieser Exonuklease mutiert wurden, um die lytische Aktivität zu beseitigen. Yang et al., (1980) PNAS Vol. 77, No. 12, pp 7029-7033 beschreiben eine verbesserte Proteinsynthese ausgehend von linearen DNA-Templaten mit dem E. coli Stamm CF300 nach Deletion der Exonuklease V (Elimination der Gene recB recC; Stamm recB21).

Leavel Basset et al., 1983 haben den recB21 Stamm zusätzlich in RNase- und Polynukleotid-Phos phorylasegenen (rna-19 pnp-7) mutiert (Stamm CLB7) und mit linearen DNA-Templaten nach 1 h Inkubationszeit eine signifikant höhere Proteinexpression erzielt.

Lesley et al., 1991 arbeiten mit einem Exonuklease V defizienten recD BL21 Stamm, der als SL119 Stamm bezeichnet wird und beschreiben erstmals die Methode der in vitro Proteinsynthese ausge hend von PCR-generierten Templaten. Lysate des Stamms SL119 werden kommerziell zur in vitro Transkription/Translation mit linearen Templaten angeboten (Promega).

Der Nachteil der oben beschriebenen Maßnahmen ist jedoch, daß all diese Mutanten langsamer wachsen und auch die aus diesen Stämmen gewonnenen Lysate eine signifikant schlechtere Synthe seleistung aufweisen. Anscheinend spielt diese Exonuklease im Stoffwechsel der Bakterien eine wich tige Rolle. Daher scheint es wichtig, Lysate zu verwenden oder Zellkulturen, in denen Exonukleasen anwesend sind.

Einzelsträngige Nukleinsäuren wurden vor exonukleolytischen Abbau geschützt durch Modifizierung der Nukleinsäuren entweder durch Schutz der beiden Enden, oder über modifizierte Nukleotidbau steine, wie es in der Literatur für Nukleinsäuren auf dem Antisense-Gebiet beschrieben ist und in den folgenden Zitaten ausgeführt wird.

Einzelsträngige DNA/RNA-Moleküle können durch Endschutz mit Alkylgruppen und Modifizierung der Basen geschützt werden; Pandolfi et al., (1999) Nucleosides & Nucleotides. 18(9), 2051-2069. Verheijen et al. (2000) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 10, 801-804, zeigen eine erhöhte Stabilität von einzelsträngigen DNA-Molekülen durch Endschutz mit 4-hydroxy-N-acetylprolinol, L- serinol, oder durch 3'-3'-Phosphodieseter Bindungen. Pure oder gemischte Phosphorothioatbindun gen, sowie chemisch modifizierte Oligonukleotide z. B. Methylphosphonate und Phosphoramidate sind stabiler und werden langsamer durch Exonukleasen abgebaut Kandimalla et al., NAR (1997) Vol. 25. No. 2, pp 370-378. Tohda et al. (1994) Journal of Biotechnology 34 (1994) 61-69 zeigen, daß Phosphorothioate-haltige RNA stabiler gegen Nukleasen ist und deshalb eine höhere Translationsef fizienz aufweist. Es konnten jedoch insgesamt nur geringe Mengen an Protein hergestellt werden. Tang et al. (1993) NAR, Vol. 21, No. 11, pp 2279-2735 zeigen, daß Hairpin-Loop-Strukturen das 3'- Ende von einzelsträngigen DNA's vor exonukleolytischem Abbau schützen. Hirao et al., (1993) FEBS, Vol. 321, No. 2, 3, 169-172 zeigen, daß der Hairpin, den das DNA-Fragment d(GCGAAGC) bildet, extrem gegenüber Nukleasen aus E. coli-Extrakten resistent ist. Yoshizawa et al., (1994) NAR, Vol. 22, No. 12, pp 2217-2221 beschreiben, daß eine Stabilisierung des 3'Endes von mRNA durch Hybridisie rung mit demselben Hairpin eine 200-fache Effizienzsteigerung der in vitro Translation mit E. coli- Extrakten bewirkt. Good und Nielsen (1998) PNAS USA 95, 2073-6 zeigen, daß synthetische Mole küle mit Basen, die an ein Peptidrückgrat gekoppelt sind (peptide nudeic acid, PNA) gegenüber hy drolytischer Spaltung in E. coli-Extrakten resistent sind und als anti-sense Molekül eingesetzt werden können. Burdick und Emlen (1985) J. Immunology 135, 2593-7 beschreiben, daß in DNA anti-DNA- Immunkomplexen IgG Moleküle die von ihnen gebundene DNA vor nukleolytischen Abbau schützen.

In EP 0 967 274 A2 sind Verfahren zur Herstellung von hantelförmigen linear doppelsträngigen DNA Molekülen beschrieben. Dabei wird ein Plasmid mit Restriktionsenzymen geschnitten wobei die ent stehende doppelsträngigen, nicht kovalent-geschlossenen Moleküle dann durch Verdau der Enden mit einer Einzelstrang-Überhänge-bildenden Restriktionsendonuklease und anschließender Ligation von auf die entstandenen einzelsträngigen Überhänge passenden Haarnadel-Oligomeren zu hantel förmigen Konstrukten modifiziert werden. Dieses Konstrukt weist gegenüber der Exonukleasen der T7 DNA-Polymerase eine erhöhte Stabilität auf.

Im Stand Technik sind weiterhin zellfreie Expressionssysteme ohne Schutzstrategien beschrieben: In US 5571690 stellt Hecht eine Methode zur zellfreien Synthese eines Proteins ausgehend von einem Templat, welches in einer PCR Reaktion erzeugt wurde dar. Er amplifiziert dabei die gesamte Gense quenz inklusive der Phagen-Promotorregion aus einem Plasmid heraus. Nach einer in vitro Trans kription setzte er für die Translation ein Lysat aus Kaninchen Retikulozyten ein. Hierbei konnten mit mRNA, welche nach der Transkription mit einem 5'CAP modifiziert wurde, 57 µg/ml eines Proteins erzeugt werden. Martemyanov et al. (1997) FEBS Lett. 414, 268-270 zeigt mit einem S30 Extrakt aus E. coli eine zellfreie Synthese eines Proteins ausgehend von einem Templat, welches in einer 2-stufi gen PCR Reaktion erzeugt wurde. Dabei wird zunächst das Zielgen mit Hilfe von 2 genspezifischen Oligonukleotid-Primern in einer PCR Reaktion amplifiziert und anschließend einer 2. PCR Reaktion unterzogen, in der mit einem sogenannten Megaprimer der T7 Promotor und die Ribosomen Bindungsstelle an das amplifizierte Gen anfusioniert wird. Es konnten dabei nur radioaktiv nachweisbare Mengen an Protein hergestellt werden. Yang et al. (2000) J. Bacteriol. 182, 295-302 zeigen mit einem S30 Extrakt aus E. coli eine zellfreie Synthese eines Proteins ausgehend von einem Templat, welches in einer PCR Reaktion erzeugt wurde. Es konnten dabei nur radioaktiv nachweisbare Mengen an Protein hergestellt werden. Nakano et al. (1999) Biotechnol. & Bioeng. 64, 194-199 zeigen mit einem S30 Extrakt aus E. coli in einem Hohlfaserreaktor die Herstellung von immerhin 80 µg/ml Reak tionsansatz eines Proteins ausgehend von einem Templat, welches in einer PCR Reaktion erzeugt wurde. In US 6027913 zeigt Sommer mit einem Extrakt aus Retikulozyten eine zellfreie Synthese eines Proteins ausgehend von einem Templat, welches in einer einstufigen PCR Reaktion erzeugt wurde. Dabei wird der T7 Promotor und die Ribosomen Bindungsstelle an das Zielgen anfusioniert wird. Auch mit dieser Methode wurden nur geringe Mengen an Protein hergestellt.

Doch die oben beschriebenen Methoden sind nicht zufriedenstellend. Eukaryontische Lysate aus Ka ninchenretikulozyten sind zwar relativ Nuclease-arm, es ist jedoch nachteilig, daß sich diese Lysate nicht wirtschaftlich in großen Mengen herstellen lassen. Sie ermöglichen nur sehr geringe Proteinaus beuten. Das gleiche gilt für Lysate aus Weizenkeimen, die entweder sehr aufwendig präpariert werden müssen, oder ansonsten von dem umgebenden Gewebe stark mit Translations-inhibierenden Fakto ren kontaminiert sind JP 236 896.

E. coli Lysate hingegen liefern bisher die weitaus größten Proteinmengen. Die beschriebenen Me thoden zur Herstellung von Lysaten aus E. coli erlauben mit linearen DNA-Templaten jedoch nur relativ kurze Reaktionszeiten bis zu etwa einer Stunde, da danach diese DNA Matrizen von den im Lysat enthaltenen Exonuklease völlig abgebaut wird. Die aus E. coli Exonuklease-Mutan ten gewonnenen Lysate (d. h. Exonuklease-defiziente Stämme) haben eine signifikant schlechtere Syntheseleistung als die vergleichbaren Wildtypstämme wie beispielsweise der A19 Stamm.

Die Methoden zum Schutz der mRNA haben den Nachteil, daß zuerst eine in vitro Transkription durchgeführt werden muß, bevor die geschützte mRNA zum Lysat gegeben werden kann. Dies wiederum schließt eine gekoppelte Reaktion und eine kontinuierliche RNA-Synthese aus. Metho den zum Schutz der RNA werden beschrieben in Tohda et al. (1994) Journal of Biotechnology 34 (1994) 61-69, Yoshizawa et al., (1994) NAR, Vol. 22, No. 12, pp 2217-2221.

Somit ist im Stand der Technik niemals eine Methode zur Verfügung gestellt worden, bei der eine doppelsträngige DNA durch eine Modifikation oder Behandlung mit geeigneten Reagenzien gegen Exonukleasen geschützt wird, um sie in einem zellfreien Exonuklease-haltigen Lysat oder in zellulären Systemen enthaltend Exonukleasen zur Protein-Expression zu verwenden. Die Aufgabe besteht also insbesondere darin, ein Verfahren zum Schutz doppelsträngiger DNA zu entwickeln, welches trotz der schützenden Maßnahmen zum Schutz der DNA eine Proteinexpression möglich macht und die Proteinexpression nicht inhibiert oder stört.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher ein Verfahren, bei der eine doppelsträngige DNA durch eine Modifikation oder Behandlung mit geeigneten Reagenzien gegen Exonukleasen ge schützt wird, um sie zur Protein-Expression in zellfreien DNA-abhängigen in vitro Transkrip tions/Translations-Systemen mit Exonuklease-haltigen Lysaten oder in zellulären Systemen ent haltend Exonukleasen zu verwenden.

Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Proteinexpression umfas send die Schritte Transkription von stabilisierter linearer kurzer DNA in zellfreien in vitro Trans kription/Translations-Systemen mit Exonuklease-haltigen Lysaten oder in einem zellulären System enthaltend Exonukleasen und anschließender Translation, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbesserung der Stabilität der linearen kurzen DNA durch eine oder mehrere der folgenden Maßnahmen zum Schutz der doppelsträngigen DNA gegenüber Exonukleasen erzielt wird:

a) Einbau von Exonuklease resistenten Nukleotidanaloga oder anderen Exonuklease resistenten Molekülen am 3'Ende des Templates,
b) Verwendung von PCR-Primerpaaren, die Exonuklease resistente Nukleotide enthalten, zur Herstellung einer linearen kurzen DNA,
c) Schutz des Templates durch Verbinden des 5'-Primers mit dem 3'-Ende des Gegen stranges
d) Schutz des Templates durch große Moleküle, welche an die beiden Enden des linearen Templates binden,
e) Inaktivierung der Exonukleasen durch die Zugabe von kompetitiven, oder nicht-kom petitiven Inhibitoren
f) Zirkularisierung des Templates, so daß ein ringförmig geschlossenes Templat entsteht.

Der Einbau von Exonuklease resistenten Nukleotidanalogen am 3'Ende des Templates gemäß der Maßnahme a) kann erfolgen durch den Einbau von didesoxy-Nukleosidtriphosphaten eingebaut wird. Alternative können beispielsweise 5'-Phosphothioat geschützte-Nukleosidtriphosphate oder Desoxy-Nukleosidtriphosphate eingebaut werden. Bei einem enzymatischen Einbau mit Hilfe der Terminalen Transferase können aber auch andere Moleküle wie beispielsweise para nitro-Phenylphosphat eingebaut werden, welche ebenfalls resistent gegenüber Exonukleasen wären. Ebenso könnten diese Moleküle auch über eine chemische Reaktion eingebaut werden.

Bei Verwendung von PCR-Primerpaaren, die Exonuklease resistente Nukleotide enthalten gemäß der Maßnahme b) können 5'-Phosphothioat geschützte Nukleosidtriphosphate oder Desoxy- Nukleosidtriphosphate eingebaut werden. Denkbar sind auch alle Analoga von Nukleosid-Basen der Phosphate und der Desoxy-Ribosen, die bei einer chemischen Oligonukleotidsynthese einge baut werden können und welche nach Einbau in ein Oligonukleotid bei einer anschließenden PCR-Reaktion einer dem Fachmann bekannten thermostabilen DNA-Polymerasen als Primer dienen können.

Das Verbinden des 5'-Endes mit dem 3'-Ende des Gegenstranges gemäß der Maßnahme c) kann durch Anligieren zweier Hairpin-bildender Oligonukleotidadaptoren an die freien Enden des Templates erfolgen. Oligonukleotidadaptoren im Sinne der vorliegenden Erfindung sind bei spielsweise SEQ ID NO.: 10: 5'-PO₄-C GCA CGC GTT TTC GCG TGC G-OH-3'.

Das Anligieren der Oligonukleotidadaptoren erfolgt über Ligation beispielsweise mit der T4 DNA Ligase.

Das Verbinden des 5'-Endes mit dem 3'-Ende des Gegenstranges gemäß der Maßnahme c) kann auch dadurch erreicht werden, daß in der Primer-Sequenz ein oder mehrere Nukleosidmono mereinheiten durch ein oder mehrere Desoxyribosephosphate oder entsprechende abasische Analoga wie beispielsweise (1-phospho-(3,4)hydroxy butandiol) bei der chemischen Synthese der Primer ersetzt werden und diese PCR-Primer in der PCR eingesetzt werden. Dabei führen diese Desoxyribosephosphate oder abasischen Analoga zum Abbruch der Polymerase-Reaktion und damit zu einem einzelsträngigen DNA-Ende am 5'Ende des Templates. Dieses freie 5'-Ende bildet mit sich selbst eine haarnadelförmige Schleife aus und wird mit dem 5'-Ende an das 3'-Ende des Gegenstranges beispielsweise mit Hilfe der T4 DNA-Ligase ligiert. Vorstellbar ist auch ein ana loges Verfahren, wobei alternativ zu den abasische Linkem in den Primern Nukleotidanaloga eingebaut werden, die an der Base oder an der Ribose beispielsweise durch Silylgruppen modi fiziert sind und dadurch die Extension durch die Polymerase verhindern.

Das Verbinden des 5'-Primers mit dem 3'-Ende des Gegenstranges gemäß der Maßnahme c) kann dadurch erfolgten daß am 5'Ende der beiden PCR-Primer ein chemischer Crosslinker wie beispielsweise Psoralen eingebaut ist und nach der PCR-Reaktion die chemische Verbindung durchgeführt wird wie beispielsweise durch eine Reaktion unter starker Lichteinwirkung wie im Falle von Psoralen.

Das Verbinden des 5-Endes mit dem 3'-Ende des Gegenstranges gemäß der Maßnahme c) kann auch dadurch erfolgen, daß in den PCR-Primer ein oder mehrere Nukleotide oder Nukleotid analoge wie beispielsweise Uridin eingebaut werden, die durch eine anschließende chemische Reaktion durch Basen oder enzymatische Reaktion mit Uracil N-Glycosylase nach der PCR Reaktion wieder entfernt werden, so daß ein 3'-Überhang entsteht und dieser 3-Überhang nun erfindungsgemäß so aufgebaut ist, daß er mit sich selbst eine Haarnadel-förmige Schleife aus bildet und mit dem 3'-Ende genau dem 5'-Ende des Gegenstranges gegenüberliegt und durch anschließende Ligation beispielsweise mit T4 DNA-Ligase die DNA-Lücke geschlossen wird, so daß sich ein hantelförmiger interner Ringschluß ergibt. Als Sense Primer kann dazu beispiels weise folgendes Oligonukleotid eingesetzt werden (x₁-x_n sind Nukleotide, die zu der zu amplifi zierenden Zielsequenz homolog sind):

Wird nun mit Base oder Uracil-N-Glycosylase gespalten und der Doppelstrang durch Erhitzen aufgeschmolzen, so fällt der 5' Primer bis zu den Nukleotiden x₁-x_n ab (2.) und das bei der vor hergegangenen PCR gebildete 3'-Ende kann mit sich selbst hybridisieren.

Das Verbinden des 5'-Primers mit dem 3'-Ende des Gegenstranges gemäß der Maßnahme c) kann weiterhin dadurch erfolgen, daß am 5'Ende der beiden PCR-Primer ein Molekül eingebaut wird und ebenso am 3'Ende des Templates ein mit diesem oder einem anderen Molekül modifi ziertes Nukleotid eingebaut wird und ein Protein diese beiden Moleküle am 3'Ende und am 5'Ende in einer nicht-kovalenten Art verbindet. Beispielsweise können die beiden Moleküle Bio tin sein und das Protein Avidin oder Streptavidin. Biotin wird dabei am 5-Ende über ein biotin yliertes Nukleotid über das chemisch synthetisierte Oligonukleotid eingebaut und wird am 3'Ende mit der Terminalen Transferase über ein biotinyliertes Nukleotidtriphosphat eingeführt. Da Biotin eine große Affinität zu Avidin oder Streptavidin hat, und Avidin bzw. Streptavidin bis zu 4 Moleküle Biotin binden kann, kann Avidin oder Streptavidin die beiden gegenüberliegenden Biotinreste der beiden Stränge verbinden. Die beiden Moleküle können auch Digoxygenin sein und das Protein ein gegen Digoxygenin gerichteter Antikörper oder der Digoxygenin bindende Teil eines Antikörpers ist. Die Vorgehensweise ist hier analog zum Einsatz von Avidin/Strepta vidin und Biotin.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren wobei gemäß der Maßnahme d) PCR-Primerpaare verwendet werden, die am 5'-Ende biotinyliert sind und wobei die großen Moleküle, welche an die beiden Enden des linearen Templates binden Avidin oder Streptavidin sind.

Gemäß der Maßnahme d) können auch PCR-Primerpaare verwendet werden, die am 5-Ende digoxygenyliert sind und wobei die großen Moleküle, welche an die beiden Enden des linearen Templates binden, ein gegen Digoxygenin gerichteter Antikörper oder der Digoxygenin bindende Teil eines Antikörpers ist.

Vorstellbar ist gemäß der Maßnahme d), daß das große Molekül, welches an die beiden Enden des linearen Templates jeweils bindet, ein gegen diese DNA Sequenz gerichteter Antikörper oder der DNA bindende Teil eines Antikörpers ist.

Erfindungsgemäß kann gemäß der Maßnahme d) das große Molekül, welches an die beiden Enden des linearen Templates bindet, ein PNA Molekül oder mehrere PNA Moleküle sein, die mit dem fertigen Template an den 3'- und/oder 5-Enden hybridisieren.

Die Inaktivierung der Exonukleasen gemäß Maßnahme e) kann dadurch erreicht werden, daß unspezifische DNA, welche die Aktivität der Exonukleasen kompetitiv inhibiert, zugegeben wird.

Die Inaktivierung der Exonukleasen gemäß Maßnahme e) kann dadurch erreicht werden, daß inaktivierende Anikörper, welche die Aktivität der Exonukleasen ausschalten zugegeben werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch das erfindungsgemäße Verfahren gemäß An spruch 1, wobei gemäß der Maßnahme f) die beiden Enden des linearen Templates über ein DNA-Molekül und eine anschließende enzymatische oder chemische Ligation zirkularisiert wer den. Eine direkte Ligation der beiden Enden z. B. mit T4-DNA Ligase wäre thermodynamisch be nachteiligt und würde nur sehr ineffizient verlaufen, so daß der Hauptanteil unligiert und somit Angriffspunkt für die Exonukleasen bliebe. Es ist deshalb erforderlich sehr lange Überhänge an den Enden der DNA zu erzeugen, welche bei der Paarung mit einem komplementären DNA- Stück in einen thermodynamisch bevorzugte Zustand übergehen und dadurch eine effiziente Ligation erlauben.

Dazu wird über eine PCR Reaktion ein Templat hergestellt, bei welcher beispielsweise wie in An spruch 6, 7 oder 8 Primer eingesetzt werden, die zu einem Abbruch der PCR Reaktion und so zu 5'-Überhängen führen. Alternativ können für die PCR auch Primer eingesetzt werden, welche an schließend wieder ganz oder teilweise entfernt werden können analog zu Anspruch 10. Dieses PCR Produkt, welches nun entweder 5'- oder 3'-Überhänge an seinen Enden aufweist, kann über eine Ligation mit einem anderen DNA Stück zirkularisiert werden, wenn dieses entsprechend zu dem Templat komplementäre Überhänge aufweist. Diese DNA-Stücke können chemisch synthe tisiert werden, oder ebenfalls über die gleiche PCR-Methode mit den entsprechenden Überhän gen. Besonders bevorzugt ist das letztgenannte Verfahren, wenn die Ligation mit einem DNA- Molekül dadurch erfolgt, daß in dem Templat und in dem DNA-Molekül überstehende 5'-Enden bzw. 3'-Enden erzeugt werden, die zueinander komplementär sind. Die Herstellung der überhän genden 3'-Enden wird erreicht durch den Einbau von ein oder mehreren Nukleotiden oder Nu kleotidanaloga, die durch eine anschließende chemische oder enzymatische Reaktion nach der PCR Reaktion wieder entfernt werden, so daß ein 3'-Überhang entsteht. Die Herstellung der überhängenden 5'-Enden wird erreicht durch den Einbau von ein oder mehreren modifizierten Monomereinheiten, welche die Extension eines Templates durch eine Polymerase verhindern. Anschließend wird eine PCR Reaktion durchgeführt. Durch den Abbruch der Polymerase- Reaktion an den modifizierten Stellen entsteht ein freies einzelsträngiges DNA-Ende am 5'Ende des Templates. Die modifizierten Monomereinheiten können auch Desoxyribosephosphate oder abasischen Analoga sein. Die modifizierten Monomereinheiten können auch Nukleotidanaloga sein, die an der Base oder an der Ribose modifiziert sind und dadurch die Extension durch die Polymerase verhindern.

Eine Voraussetzung für die in vitro Proteinsynthese ist die Herstellung eines DNA-Templates. Dieses Templat muß folgende Elemente enthalten: Einen Promotor für die eingesetzte RNA- Polymerase, eine Ribosomen Bindungsstelle und das zu exprimierende Zielgen. Prinzipiell kann hierbei ein lineares oder ein zirkulär geschlossenes Templat eingesetzt werden. Ein lineares Tem plat kann auf verschiedene Methoden erzeugt werden, beispielsweise durch Linearisierung eines Plasmides mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen. Sehr einfach läßt sich ein lineares Templat auch über die PCR Methode erzeugen. Während man eine in vitro Transkription mit einer ge reinigten RNA-Polymerase mit linearen Templaten sehr einfach durchführen kann, sind lineare DNA Template jedoch in einem in einem gekoppelten in vitro Transkription-Translationsansatz der Angriffspunkt für Exonukleasen: Da die für die Translation benötigten Ribosomen, Amino acyl tRNA-Synthasen, Initiations, Elongations und Terminationsfaktoren bei der Präparation von Lysaten nur als Mischung gemeinsam mit Exonukleasen präpariert werden können ist es nötig lineare Template gegen den exonukleolytischen Angriff zu schützen.

Dies kann durch Modifikationen der Enden des Templates, oder durch eine Inaktivierung der Exonukleasen durch Inhibitoren wie in Anspruch 1e erreicht werden. Wichtig dabei ist jedoch, daß weder die Transkription, noch die einzelnen Schritte der Translation inhibiert werden. So ist beispielsweise EDTA als wirksames Mittel gegen eine Reihe von Nukleasen bekannt, gleichzeitig wird jedoch durch EDTA sowohl die Transkription, als auch die Translation gestört.

Von einem derartig geschützten DNA-Templat kann nun die RNA-Polymerase, die entweder im Lysat vorhanden ist, oder extra zugesetzt wird die mRNA transkribieren. Diese mRNA wird nun an den Ribosomen translatiert. Damit die in den Ansprüchen angegebenen Maßnahmen die Transkription nicht stören ist darauf zu achten, daß die Modifikationen der Enden nicht direkt an der Promotorregion eingefügt werden, sondern bereits vor dem Promotor. Bei der Verwen dung von Avidin oder Strepavidin ist es entscheidend, daß man einen Überschuß Von Avidin bzw. Streptavidin gegenüber den Biotinresten an der DNA einsetzt, damit nicht eine Aggregation der gesamten DNA eintritt. Außerdem müssen daraufhin die verbliebenen freien Bindungsstellen des Avidin oder Streptavidin mit Biotin abgesättigt werden, bevor man das Templat in die Reak tion einsetzt. Es kommt sonst überraschenderweise zu einer völligen Inhibition der Proteinsyn these. Bei der Verwendung von Antikörpern ist darauf zu achten, daß diese nicht unspezifisch mit DNA oder anderen essentiellen Proteinen aus dem Lysat reagieren.

Abbildungen

Fig. 1a Zeigt die Stabilität eines unmodifizierten Templates. Bereits nach 5 Minuten ist in diesem Ansatz keine lineare DNA mehr erkennbar.
Spur 1 Standard,
Spur 2-6 lineare DNA nach 5, 15, 30, 45 und 60 Minuten Inkubation im in vitro Transkriptions- Translationsansatz

Fig. 1b Zeigt die Stabilität eines Templates welches an den 3'-Enden mit didesoxy-ATP mit Hilfe von Terminaler Transferase modifiziert wurde. Auch nach 10 Minuten ist in diesem Ansatz noch die lineare DNA erkennbar.

Fig. 2 Zeigt eine Verbesserung der Proteinsyntheseleistung durch die Modifikation der 3'-Enden der linearen DNA-Template mit didesoxy-ATP, bzw. mit Phosphothioat-ATP gegenüber den nicht modifizierten Templaten. Es wurden wie angegeben 1 µg bzw. 2 µg DNA eingesetzt.

Fig. 3a Zeigt die Stabilität eines Templates mit überhängenden 5'-Enden vor der Ligation. Anders als bei dem unmodifizierten Templat Fig. 1a ist hier erst nach 10 Minuten in diesem Ansatz keine lineare DNA mehr erkennbar.

Fig. 3b Zeigt die Stabilität eines Templates mit überhängenden 5'-Enden nach der Ligation. Nach der Ligation ist das Templat über den gesamten Synthesezeitraum von 120 Minuten vorhanden. Der Abbau der linearen DNA konnte stark eingeschränkt werden.

Fig. 4 Zeigt eine Verbesserung der Proteinsyntheseleistung durch die Modifikation der 3'-Enden der linearen DNA-Template. Bereits durch das Umklappen der 5'-Enden erreicht man eine höhere Synthese des Proteins. Erst durch die Ligation der beiden Enden jedoch wird die größte Stabilität des Templates erreicht und die größte Menge an Protein gebildet. Es wurden wie angegeben 1 µg bzw. 2 µg DNA eingesetzt.

Fig. 5 Zeigt die Stabilität der Template gegenüber der Exonuklease III. Während die unmodifizierte DNA bereits mit 10 U Exonuklease III abgebaut wird, ist die über Psoralen ligierte DNA auch gegenüber 100 U Exonuklease III stabil.
Spur 1-3 Psoralen ligierte DNA, Spur 4-6 unmodifizierte DNA. Spur 1,4 ohne Exonuklease III, Spur 2,5 mit 10 U ohne Exonuklease III, Spur 3,6 mit 100 U Exonuklease III.

Fig. 6 Zeigt eine Verbesserung der Proteinsyntheseleistung durch die Psoralen Verknüpfung der 3'- Enden der linearen DNA-Template.

Fig. 7 Zeigt eine Verbesserung der Proteinsyntheseleistung durch die Modifikation der Primer mit Biotin und anschließender Konjugation mit Strepavidin.

Beispiel 1

Schutz vor 3' Exonukleasen durch den Einbau von nicht hydrolysierbaren Nukleotiden am 3'- Ende des Templats mit terminaler Transferase. Hier wurden didesoxy-Nukleotidtriphosphate oder Phosphothioat-ATP eingebaut. Der Abbau des Templats konnte durch diese Modifika tionen stark vermindert werden und die Ausbeute in der Proteinexpression konnte um ein mehr faches gesteigert werden.

PCR Reaktion

Zur in vitro-Expression ausgehend von PCR-Fragmenten wurde ein 1115 bp-Fragment mit dem Expand High Fidelity PCR Kit (Roche Diagnostics GmbH) amplifiziert. Als Template wurden 50 ng pIVEX2.1 GFP verwendet. Plasmid pIVEX2.1 GFP enthält die Sequenz für das Green Fluor escent Protein aus Aequorea victoria in Form einer Mutante GFPcycle3 (Nature Biotechnology (1996) 14, 315-319) mit den für die in vitro-Expression wichtigen Kontrollelementen T7-Pro motor, Ribosomenbindestelle und T7-Terminator. Das PCR-Produkt begann 30 bp upstream vom T7-Promotor und enthielt die GFP-codierende Sequenz bis zum Ende vom T7-Terminator. Zur Amplifikation wurden folgende Primer eingesetzt:

Sense-Primer

Der PCR-Zyklus 1 Minute 94°C, 1 Minute 60°C, 1 Minute 72°C wurde 30 mal wiederholt. Die Konzentration des Produktes wurde über ein Agarosegel abgeschätzt. Das PCR-Produkt wurde dann mit Ethanol gefällt und in DNAse und RNAse-freiem Wasser aufgenommen.

Modifikation der 3'-Enden mit didesoxy-ATP mit Hilfe von Terminaler Transferase

45 µg PCR-Produkt wurden mit 250 U terminaler Transferase (Roche Diagnostics GmbH) und 30 nmol didesoxy-ATP (Roche Diagnostics GmbH) mit 100 µl 5 × Reaktionspuffer für Terminale Transferase (Roche Diagnostics GmbH) 2,5 mM CoCl₂ in 500 µl Gesamtvolumen 40 min bei 37°C inkubiert und dann mit Ethanol gefällt und in 20 µl DNAse und RNAse-freiem Wasser aufgenommen.

Modifikation der 3'-Enden mit Phosphothioat-ATP mit Hilfe von Terminaler Transferase

10 µg PCR-Produkt wurden mit 75 U terminaler Transferase (Roche Diagnostics GmbH) und 47 nmol Phosphothioat-ATP (Adenosin 5'-O-(1-thiotriphosphat) Firma NAPS, Göttingen, Ger many # 39565 N) mit 10 µl 5 × Reaktionspuffer für Terminale Transferase (Roche Diagnostics GmbH) 2,5 mM CoCl₂ in 50 µl Gesamtvolumen 40 min bei 37°C inkubiert und dann mit Etha nol gefällt und in 10 µl DNAse und RNAse-freiem Wasser aufgenommen.

Gekoppelte in vitro Transkriptions-/Translationsreaktion

Trankriptions-/Translationsreaktionen wurden in einem Volumen von 50 µl 2 h bei 30°C durch geführt. Die Reaktionslösung enthielt 80,5 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 35 mM Ammoniumchlorid, 4 mM Magnesiumchlorid, 4% Polyethylenglycol 2000, 1 mM ATP, 0,5 mM CTP, 1 mM GTP, 0,5 mM UTP, 30 mM Phosphoenolpyruvat, 8 µg/ml Pyruvatkinase, 400 µM pro Aminosäure (alle 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren), 0,1 mM Folinsäure, 0,1 mM EDTA, 50 mM HEPES-KOH pH 7,6/30°C, 20 µg/ml Rifampicin, 0,03% Natriumazid, 2 µg/ml Aprotintin, 1 mg/ml Leupeptin, 1 µg/ml Pepstatin A, 10 mM Acetylphosphat, 100 µg/ml tRNA aus E. coli MRE600, 8 mM Dithiothreitol, 100 U/ml Rnase-Inhibitor, 15 µl E. coli Lysat, 0,5 U/µl T7-RNA Polymerase. Das E. coli Lysat wurde von dem Stamm A19 nach dem Verfahren von Zu bay (Annu. Rev. Genet. (1973) 7, 267) präpariert. Zu dem Ansatz wurden, soweit nicht anders angegeben, jeweils 1 µg Templat, welches nach den in den jeweiligen Beispielen erwähnten Me thoden hergestellt wurde, zugesetzt.

Exonuklease Assay

Aus einer gekoppelten in vitro Transkriptions-/Translationsreaktion (200 µl Gesamtreaktion) wurden nach den angegebenen Zeitpunkten in Minuten jeweils 13 µl Probe entnommen und für 15 min bei 65°C erhitzt. Nach abkühlen auf Eis 15 min wurden 107 µl H₂O und 3 µl RNAse (Roche # 119915) zugegeben und 30 min bei 37°C inkubiert. Dann wurde 12 µl 5% SDS und 3 µl Proteinase K (Roche #1413783) zugegeben und 30 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde mit 13 µl 3 M NaAc (pH 4.8) und 400 µl eiskaltem ETOH für 30 min bei -20°C gefällt und nach waschen mit 200 µl eiskaltem 70% ETOH und Trocknen die gesamte Menge auf ein 1% TBE-Gel aufgetragen.

Beispiel 2 Schutz vor 5'und 3'Exonukleasen durch Verbinden des 5'-Primers mit dem 3'-Ende des Gegen stranges

PCR-Primer, bei denen in der Sequenz zwei Nukleosidmonomereinheiten durch zwei abasische Linker (hier einfach Desoxyribosen) ersetzt sind, wurden in einer PCR eingesetzt. Diese Stellen führten wie in EP 0 416817 B1 beschrieben zum Abbruch der Polymerase-Reaktion und damit zu einem einzelsträngigen DNA-Ende am 5'-Ende des Templats. Dieses freie 5'-Ende war nun so aufgebaut, daß es mit sich selbst eine haarnadelförmige Schleife ausbildete und mit dem 5'-Ende genau dem 3'-Ende des Gegenstranges gegenüberlag. Durch anschließende Ligation wurde die DNA-Lücke geschlossen, so daß sich ein hantelförmiger interner Ringschluß ergab. Siehe Skizze

Skizze

Oligonucleotid

PCR-Produkt mit Überhang des 3'-Endes

Nach Umklappen des Überhanges

Nach Ligation

Der Abbau des Templats konnte durch diese Modifikationen stark vermindert werden und die Ausbeute in der Proteinexpression konnte um ein mehrfaches gesteigert werden.

PCR Reaktion

Zur in vitro-Expression ausgehend von PCR-Fragmenten wurde ein 1115 bp-Fragment mit dem Expand High Fidelity PCR Kit (Roche Diagnostics GmbH) amplifiziert. Als Template wurde Das PCR-Produkt begann 25 bp upstream vom T7-Promotor und enthielt die GFP-codierende Se quenz bis zum Ende vom T7-Terminator. Zur Amplifikation wurden folgende Primer eingesetzt (Ribose bezeichnet eine β-2'-Desoxy-D-ribofuranose; P bezeichnet eine Phosphatgruppe).

Sense-Primer

Antisense-Primer

Als Template wurden 300 ng pIVEX2.1 GFP verwendet. Plasmid pIVEX2.1 GFP enthält die Se quenz für das Green Fluorescent Protein aus Aequorea victoria in Form einer Mutante GFPcycle3 (Nature Biotechnology (1996) 14, 315-319 mit den für die in vitro-Expression wichtigen Kon trollelementen T7-Promotor, Ribosomenbindestelle und T7-Terminator.

Der PCR-Zyklus 1 Minute 94°C, 1 Minute 60°C, 1 Minute 72°C wurde 24 mal wiederholt. Die Konzentration des Produktes wurde über ein Agarosegel abgeschätzt. Das PCR-Produkt wurde dann mit Ethanol gefällt und in DNAse und RNAse-freiem Wasser aufgenommen.

Ligation der 5'-Enden mit dem 3'-Ende des Gegenstranges

15 µg DNA aus der vorangegangenen PCR Reaktion wurden mit wurden mit 30 units T4 DNA Ligase in 180 µl Ligasepuffer für 18 h bei 16°C ligiert anschließend mit Ethanol gefällt und in 20 µl DNAse und RNAse-freiem Wasser aufgenommen.

PCR und Ligation bilden das in der vorher angegebenen Skizze abgebildete haarnadelförmig ge schlossene Ende des linearen Templates aus.

Exonuklease Assay

Der Exonuklease Assay wurde analog zu Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 3

Am 5'-Ende der beiden PCR-Primer wurde ein chemischer crosslinker (z. B. Psoralen) eingebaut, der mit einer Base des Gegenstranges nach entsprechender Aktivierung durch Licht eine kova lente Bindung mit dem 3'-Ende des komplementären Gegenstranges ausbildete. Dadurch konnte eine hohe Resistenz gegen Exonukleasen erzielt werden. Von diesem so modifiziertem Templat konnte analog zu Beispiel 1 erfolgreich in vitro Protein synthetisiert werden.

PCR Reaktion

Die PCR-Reaktion wurde wie in Beispiel 1 mit folgenden Primern durchgeführt:
Psoralen-C-2'-Phosphoramidit wurde von der Firma Glen Research Ltd. Virginia USA bezogen.

Sense-Primer

Antisense-Primer

Als Template wurden 300 ng pIVEX2.1 GFP verwendet. Der PCR-Zyklus 1 Minute 94°C, 1 Mi nute 50°C, 1 Minute 72°C wurde 25 mal wiederholt. Die Konzentration des Produktes wurde über ein Agarosegel abgeschätzt. Das PCR-Produkt wurde dann mit Ethanol gefällt und in DNAse und RNAse-freiem Wasser aufgenommen.

Photochemische Ligation der 5'-Enden mit dem 3'-Ende des Gegenstranges

Das Verknüpfen des Psoralens mit dem Thymidin des Gegenstranges erfolgte über eine 5 mi nütige Bestrahlung des PCR Produktes mit einer Quecksilberdampflampe und einem vorgesetz ten Pyrex Filter

Exonuklease Assay

Je 400 ng Psoralen-modifizierter DNA wurde nach Photochemische Ligation in 20 µl Gesamt volumen mit 10 U bzw. 100 U Exonuklease III (Roche-Diagnostics GmbH) für eine Stunde bei 37°C inkubiert.

Beispiel 4

Schutz vor 5' und 3' Exonukleasen durch Verwendung von PCR-Primerpaaren, die am 5'-Ende biotinyliert sind. Streptavidin bindet nun an den 5-Enden des amplifizierten Templats und schützt so durch seine Größe das 5' und das 3'-Ende.

Am 5'-Ende der beiden PCR-Primer wurde ein biotinyliertes Nukleotid eingebaut. Dann wurde das PCR amplifizierte Templat mit Streptavidin inkubiert welches durch seine Größe das 5' und das 3'-Ende des Templates gegen exonukleolytischen Abbau schützt. Von diesem so modifizier tem Templat konnte erfolgreich Protein synthetisiert werden.

PCR Reaktion

Die PCR-Reaktion wurde wie in Beispiel 1 mit folgenden Primern durchgeführt:

Sense-Primer

Antisense-Primer

Die biotinylierten Primer wurde von der Firma Metablon, Martinsried, Deutschland bezogen.

Inkubation mit Streptavidin

1,5 µg PCR Produkt wurden in einem Gesamtvolumen von 10 µl mit 10 µg Streptavidin versetzt. Anschließend wurden die freien Biotin Bindungsstellen mit 10 µg Biotin abgesättigt.

In vitro Expression

Je 1 µg Biotin/Streptavidin-modifizierter DNA wurde in die in vitro Expression wie in Beispiel 1 angegeben eingesetzt.

Claims

1. Verfahren zur Proteinexpression umfassend die Schritte Transkription von stabilisierter linearer kurzer DNA in zellfreien in vitro-Transkription/Translations-Systemen mit Exo nuklease-haltigen Lysaten oder in einem zellulären System enthaltend Exonukleasen und an schließender Translation, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbesserung der Stabilität der linearen kurzen DNA durch eine oder mehrere der folgenden Maßnahmen zum Schutz der doppelsträngigen DNA gegenüber Exonukleasen erzielt wird:

a) Einbau von Exonuklease resistenten Nukleotidanaloga oder anderen Molekülen am 3'Ende des Templates,
b) Verwendung von PCR-Primerpaaren, die Exonuklease resistente Nukleotide enthalten, zur Herstellung einer linearen kurzen DNA,
c) Schutz eines über die PCR Reaktion hergestellten Templates durch Verbinden des 5'- Endes mit dem 3'-Ende des Gegenstranges
d) Schutz des Templates durch große Moleküle, welche an die beiden Enden des linearen Templates binden,
e) Inaktivierung der Exonukleasen durch die Zugabe von kompetitiven, oder nicht-kom petitiven Inhibitoren,
f) Zirkularisierung des Templates, so daß ein ringförmig geschlossenes Templat entsteht.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei als Exonuklease resistentes Nukleotid gemäß der Maß nahme a) didesoxy-Nukleosidtriphosphate eingebaut wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei als Exonuklease resistentes Nukleotid gemäß der Maß nahme a) 5'-Phosphothioat geschützte-Nukleosidtriphosphate oder Desoxy-Nukleosidtri phosphate eingebaut werden.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei als Exonuklease resistentes Nukleotid gemäß der Maß nahme b) 5'Phosphothioat geschützte-Nukleosidtriphosphate oder Desoxy-Nukleosidtri phosphate eingebaut werden.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verbinden des 5'-Primers mit dem 3'-Ende des Ge genstranges gemäß der Maßnahme c) durch Anligieren zweier Hairpin-bildender Oligonu kleotidadaptoren an die freien Enden des Templates erfolgt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verbinden des 5'-Primers mit dem 3'-Ende des Gegenstranges gemäß der Maßnahme c) dadurch erreicht wird, daß
in der Primer-Sequenz ein oder mehrere modifizierte Monomereinheiten eingeführt werden, welche die Extension eines Templates durch eine Polymerase verhindern,
eine PCR Reaktion durchgeführt wird mit diesen PCR-Primern enthaltend ein oder mehrere modifizierte Monomereinheiten
Abbruch der Polymerase-Reaktion an den modifizierten Stellen und Entstehen eines freien einzelsträngigen DNA-Endes am 5'Ende des Templates und wobei weiterhin dieses freie 5'-Ende mit sich selbst eine haarnadelförmige Schleife ausbildet und mit seinem 5'-Ende an das 3'-Ende des Gegenstranges ligiert wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6 wobei die modifizierten Monomereinheiten Desoxyribose phosphate oder abasischen Analoga sind.

8. Verfahren gemäß Anspruch 6 wobei die modifizierten Monomereinheiten Nukleotidanaloga sind, die an der Base oder an der Ribose modifiziert sind und dadurch die Extension durch die Polymerase verhindern.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verbinden des 5'-Primers mit dem 3'-Ende des Gegenstranges gemäß der Maßnahme c) dadurch erfolgt, daß am 5'Ende der beiden PCR- Primer ein chemischer Crosslinker eingebaut ist und nach der PCR-Reaktion die chemische Verbindung durchgeführt wird.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verbinden des 5'-Primers mit dem 3'-Ende des Gegenstranges gemäß der Maßnahme c) dadurch erfolgt, daß in den PCR-Primer ein oder mehrere Nukleotide oder Nukleotidanaloge eingebaut werden, die durch eine anschließende chemische oder enzymatische Reaktion nach der PCR Reaktion wieder entfernt werden, so daß ein 3'-Überhang entsteht und dieser 3'-Überhang mit sich selbst eine haarnadelförmige Schleife ausbildet und mit dem 3'-Ende genau dem 5'-Ende des Gegenstranges gegenüberliegt und durch anschließende Ligation die DNA-Lücke geschlossen wird, so daß sich ein hantelförmiger interner Ringschluß ergibt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Verbinden des 5'-Primers mit dem 3'-Ende des Gegenstranges gemäß der Maßnahme c) dadurch erfolgt, daß am 5'Ende der beiden PCR- Primer ein Molekül eingebaut wird und ebenso am 3'Ende des Templates ein mit diesem oder einem anderen Molekül modifiziertes Nukleotid eingebaut wird und ein Protein diese beiden Moleküle am 3'Ende und am 5'Ende in einer nicht-kovalent Art verbindet.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die beiden Moleküle Biotin sind und das Protein Avidin oder Streptavidin.

13. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die beiden Moleküle Digoxygenin sind und das Protein ein gegen Digoxygenin gerichteter Antikörper oder der Digoxygenin bindende Teil eines Antikörpers ist.

14. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei gemäß der Maßnahme d) PCR-Primerpaare verwendet werden, die am 5'-Ende biotinyliert sind und die großen Moleküle, welche an die beiden En den des linearen Templates binden, Avidin oder Streptavidin sind.

15. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei gemäß der Maßnahme d) PCR-Primerpaare verwendet werden, die am 5'-Ende digoxygeniliert sind und das große Molekül, welches an die beiden Enden des linearen Templates bindet, ein gegen Digoxygenin gerichteter Antikörper oder der Digoxygenin bindende Teil eines Antikörpers ist.

16. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei gemäß der Maßnahme d) das große Molekül, welches jeweils an die beiden Enden des linearen Templates bindet, ein gegen diese DNA Sequenz gerichteter Antikörper oder der DNA bindende Teil eines Antikörpers ist.

17. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei gemäß der Maßnahme d) das große Molekül, welches jeweils an die beiden Enden des linearen Templates bindet, eine oder mehrere PNA Mole küle sind, die mit dem fertigen Template an den 3'- und/oder 5'-Enden hybridisieren.

18. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Inaktivierung der Exonukleasen gemäß Maßnahme e) dadurch erreicht wird, daß unspezifische DNA, welche die Aktivität der Exonukleasen kompetitiv inhibiert, zugegeben wird.

19. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Inaktivierung der Exonukleasen gemäß Maßnahme e) dadurch erreicht wird, daß inaktivierende Antikörper, welche die Aktivität der Exonu kleasen ausschalten, zugegeben werden.

20. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei gemäß der Maßnahme f) die beiden Enden des linearen Templates über ein DNA-Molekül und eine anschließende enzymatische oder chemische Ligation zirkularisiert werden.

21. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die Ligation mit einem DNA-Molekül dadurch be vorzugt erfolgt, daß in dem Templat und in dem DNA-Molekül überstehende 5'-Enden oder 3'-Enden erzeugt werden, die zueinander komplementär sind und zur Herstellung der über hängenden 3'-Enden die in Anspruch 10 genannte Methode eingesetzt wird und zur Her stellung der überhängenden 5'-Enden die in Anspruch 6, 7 oder 8 genannte Methode einge setzt wird.