CN102164959A - 针对人il17的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种结合IL-17的抗体，其特征在于该抗体与单克隆抗体3C1结合相同的IL-17表位，并且该抗体是人IgG1同种型，该人IgG1同种型是在CH1和CH2之间的铰链区氨基酸位置216-240，优选在氨基酸位置220-240，和/或在CH2和CH3之间第二结构域间区域的氨基酸位置327-331被修饰的人IgG1同种型，该抗体具有治疗炎症疾病的有益性质。

Description

针对人IL17的抗体及其应用
本发明涉及针对人IL17A的抗体(IL17抗体)，其产生方法，含有所述抗体的药物组合物，及其用途。
发明背景
人IL-17A(CTLA-8，Swiss Prot Q16552，下文称为IL-17)是促炎性细胞因子，由一亚群参与MS的发病机理的记忆T细胞(称为Th17)产生。IL-17A在诱导其他炎性细胞因子、趋化因子和粘附分子中发挥作用。通过IL-17A中和抗体治疗动物在自身免疫性脑脊髓炎(autoimmune encephalomyelitis)中降低疾病发病率和严重性(Komiyama，Y.等，免疫学杂志(J.Immunol.)177(2006)566-573)。IL-17A在MS患者脑脊液中过量表达(Hellings，P.W.等，美国呼吸细胞分子生物学杂志(Am.J.Resp.Cell Mol.Biol.)28(2003)42-50；Matusevicius，D.等，多发性硬化(Multiple Sclerosis)5(1999)101-104；WO 2005/051422)。此外，IL-17A中和抗体降低小鼠胶原蛋白诱导的关节炎RA模型的严重性和发病率，并且高水平的IL-17A可在来自于RA患者的发炎关节的滑膜液中检测到(Ziolkowska，M.等，免疫学杂志(J.Immunol.)164(2000)2832-2838；Kotake，S.等，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)103(1999)1345-1352；Hellings，P.W.等，美国呼吸细胞分子生物学杂志(Am.J.Resp.Cell Mol.Biol.)28(2003)42-50)。
WO 96/17939、US 5,716,623、WO 95/18826、WO 97/15320、WO 99/35276和WO 00/69436、WO 95/18826、US 6,274,711、US 6,274,711、WO 97/15320、US 6,063,372、WO 2006/013107和WO200802115涉及IL-17A和针对IL-17A的抗体。
发明概述
本发明包括结合IL-17的抗体，其特征在于重链可变结构域包含SEQ ID NO：1的CDR3区，SEQ ID NO：2或9的CDR2区和SEQ ID NO：3的CDR1区，并且其特征在于轻链可变结构域包含SEQ ID NO：4的CDR3区，SEQ ID NO：5的CDR2区和SEQ ID NO：6的CDR1区。优选地该抗体的特征在于重链可变结构域包含SEQ ID NO：7或10。优选地该抗体的特征在于重链可变结构域包含SEQ ID NO：7或10并且轻链可变结构域包含SEQ ID NO：8。优选地结合IL-17并且其特征在于上文所述的氨基酸序列和氨基酸序列片段的该抗体是人IgG1同种型，该人IgG1同种型是在CH1和CH2之间的铰链区氨基酸位置216-240，优选在氨基酸位置220-240，和/或在CH2和CH3之间第二结构域间区域的氨基酸位置327-331被修饰的人IgG1同种型。优选地该抗体包含突变L234A(在氨基酸位置234是丙氨酸而不是亮氨酸)和L235A。优选地包含突变L234A和L235A的重链恒定区显示于SEQ ID NO：11。
优选的本发明所述的杂交瘤细胞系，<hIL-17>1A1.3C1(抗体3C1)保藏在德意志微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)，Braunschweig，Germany)。
  细胞系   保藏号   保藏日
  <hIL-17>1A1.3C1   DSM ACC2941   2008年8月12日
可从所述细胞系获得的抗体(抗体3C1)是本发明的一个优选实施方案。本发明还一个优选实施方案是抗体3C1(DSM ACC2941)的嵌合、人源化或T细胞表位缺失的抗体变体。该抗体以1nM或更低的IC50值特异性结合IL17。优选的3C1的人源化版本是Mab 106和Mab 107。
本发明还涉及结合IL-17的抗体，并且其特征在于其与单克隆抗体3C1结合相同的IL-17表位。该抗体以至少10-8M-1至10-12M-1的亲和力结合IL-17，并且该抗体是人IgG1同种型，该人IgG1同种型是在CH1和CH2之间的铰链区氨基酸位置216-240，优选在氨基酸位置220-240，和/或在CH2和CH3之间第二结构域间区域的氨基酸位置327-331被修饰的人IgG1同种型。优选地该抗体是包含突变L234A(在氨基酸位置234是丙氨酸而不是亮氨酸)和L235A的人IgG1同种型。
优选地该抗体是人源化或人抗体。优选地本发明所述抗体在使用食蟹猴(cynomolgus)皮肤成纤维细胞的细胞因子释放测定中以1.5nM或更低的IC50值抑制浓度100ng/ml食蟹猴IL-17A诱导的IL-6和IL-8产生。
本发明还一个实施方案是包含本发明所述抗体的药物组合物。优选地该药物组合物包含这样的抗体，该抗体的特征在于其与单克隆抗体3C1结合相同的IL-17表位。优选地该药物组合物的抗体以至少10-8M-1至10-12M-1的亲和力结合IL-17，并且该抗体是人IgG1同种型，该人IgG1同种型是在CH1和CH2之间的铰链区氨基酸位置216-240，优选在氨基酸位置220-240，和/或在CH2和CH3之间第二结构域间区域的氨基酸位置327-331被修饰的人IgG1同种型。优选地该抗体是包含突变L234A(在氨基酸位置234是丙氨酸而不是亮氨酸)和L235A的人IgG1同种型。
本发明还一个实施方案是本发明所述抗体在制备药物组合物中的用途。优选地该药物组合物包含这样的抗体，该抗体的特征在于其与单克隆抗体3C1结合相同的IL-17表位。优选地该药物组合物的抗体以至少10-8M-1至10-12M-1的亲和力结合IL-17，并且该抗体是人IgG1同种型，该人IgG1同种型是在CH1和CH2之间的铰链区氨基酸位置216-240，优选在氨基酸位置220-240，和/或在CH2和CH3之间第二结构域间区域的氨基酸位置327-331被修饰的人IgG1同种型。优选地该抗体是包含突变L234A(在氨基酸位置234是丙氨酸而不是亮氨酸)和L235A的人IgG1同种型。
本发明还一个实施方案是本发明所述抗体在治疗多发性硬化(multiple sclerosis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、银屑病(psoriasis)、局限性回肠炎(Crohn’s disease)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘(asthma)和移植排斥(transplant rejection)中的用途。本发明还一个实施方案是制备包含本发明所述抗体的药物组合物的方法。优选地该药物组合物包含这样的抗体，该抗体的特征在于其与单克隆抗体3C1结合相同的IL-17表位。优选地该药物组合物的抗体以至少10-8M-1至10-12M-1的亲和力结合IL-17，并且该抗体是人IgG1同种型，该人IgG1同种型是在CH1和CH2之间的铰链区氨基酸位置216-240，优选在氨基酸位置220-240，和/或在CH2和CH3之间第二结构域间区域的氨基酸位置327-331被修饰的人IgG1同种型。优选地该抗体是包含突变L234A(在氨基酸位置234是丙氨酸而不是亮氨酸)和L235A的人IgG1同种型。
本发明还一个实施方案是编码结合IL-17的抗体的重链的核酸，所述抗体特征在于其包含SEQ ID NO：1的重链CDR3区并且优选地包含IgG1重链恒定结构域的突变L234A和L235A。优选地该抗体另外包含SEQ ID NO：2或9的重链CDR2区和SEQ ID NO：3的CDR1区。本发明还一个实施方案是编码结合IL-17的抗体的轻链的核酸，所述抗体特征在于其包含本发明所述的轻链CDR3区并优选地包含IgG1重链恒定结构域的突变L234A和L235A。优选地该抗体另外包含SEQ ID NO：2或9的重链CDR2区和SEQ ID NO：3的CDR1区。本发明还一个实施方案是编码本发明所述抗体的核酸，所述抗体特征在于其包含SEQ ID NO：7或10的重链可变结构域和SEQ ID NO：8的可变轻链结构域并且优选地包含IgG1重链恒定结构域的突变L234A和L235A。
本发明所述的抗体的特征在于恒定链是人类来源的。此类恒定链是现有技术中熟知的并且例如被Kabat(参见，例如Johnson，G.和Wu，T.T.，核酸研究(Nucleic Acids Res.)28(2000)214-218)所描述。例如有用的人重链恒定区包含含有突变L234A和L235A的SEQ ID NO：11的氨基酸序列。例如有用的人轻链恒定区包含SEQ ID NO：12的κ-轻链恒定区的氨基酸序列。还优选的是该抗体是小鼠来源的并包含依照Kabat的小鼠抗体的抗体可变序列框架(variable sequence frame)(参见，例如Johnson，G.和Wu，T.T.，核酸研究(Nucleic Acids Res.)28(2000)214-218)。
本发明所述的抗体特别地特征在于抑制CCD25-SK细胞白细胞介素-8(IL-8)的释放。本发明所述的抗体以0,5nM(16ng/ml)或更低的IC50值特异性地中和IL17-介导的细胞激活。本发明所述的抗体以1nM或更低的IC50值特异性结合IL17。
本发明所述的抗体优选地是人同种型IgG1。优选的γ1重链恒定区显示于SEQ ID NO：11中和显示于不含L234A和L235A突变的SEQ ID NO：11中。
本发明所述的抗体优选地特征在于不结合人补体因子C1q并因而避免了CDC效应器功能。
本发明所述的抗体优选地是人IgG1同种型，该人IgG1同种型是在CH1和CH2之间的铰链区氨基酸位置216-240，优选在氨基酸位置220-240，和/或在CH2和CH3之间第二结构域间区域的氨基酸位置327-331被修饰的人IgG1同种型。本发明所述的抗体优选地特征在于是人IgG1同种型，该人IgG1同种型含有L234(在氨基酸位置234是亮氨酸)、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329(根据EU索引(index)编号)中至少一个突变。优选地该抗体是包含突变L234A(在氨基酸位置234是丙氨酸而不是亮氨酸)和L235A的人IgG1同种型。
本发明还提供含有本发明所述核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸，以及提供用于重组产生此类抗体的含有此类载体的宿主细胞。本发明还包括原核或真核宿主细胞，该宿主细胞包含本发明所述的载体。本发明还包括用于产生本发明所述重组人抗体或人源化抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达本发明所述的核酸并且从所述细胞或细胞培养物上清液回收所述抗体。本发明还包括可通过此类重组方法获得的抗体。
本发明所述抗体显示出对于需要IL-17靶向治疗的患者的益处。本发明所述抗体具有新的和创造性的性质，该性质产生对于罹患此类免疫性疾病的患者的益处，特别是对于罹患多发性硬化(multiple sclerosis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、银屑病(psoriasis)、局限性回肠炎(Crohn’sdisease)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘(asthma)和移植排斥(transplant rejection)的患者的益处。本发明所述抗体不导致受治疗患者对葡萄球菌和肠道细菌感染的易感性。本发明还提供治疗罹患多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病、局限性回肠炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘和移植排斥的患者的方法，包括向诊断为患有此类疾病(并因而需要此类治疗)的患者施用有效量的本发明所述的结合IL-17的抗体。优选地以药物组合物形式施用该抗体。本发明还一个实施方案是治疗罹患多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病、局限性回肠炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘和移植排斥的患者的方法，其特征在于向患者施用本发明所述的抗体。本发明还包括本发明所述的抗体用于治疗罹患多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病、局限性回肠炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘和移植排斥的患者的用途，以及在制备本发明所述药物组合物中的用途。此外，本发明包括制备本发明所述药物组合物的方法。
本发明还包括药物组合物，该药物组合物包含本发明所述的抗体，任选地连同在配制药用目的的抗体中有用的缓冲液和/或辅剂。本发明还提供药物组合物，该药物组合物包含在药学上可接受载体中的本发明所述的抗体。在一个实施方案中，该药物组合物可包含于制品或试剂盒中。
发明详述
术语“抗体”涵盖各种形式的抗体结构，其包括但不限于完整抗体和抗体片段。本发明所述的抗体优选地是人源化抗体、嵌合抗体或进一步遗传工程化的抗体，只要保留了本发明所述的特征性性质。“抗体片段”包括全长抗体的一部分，优选为其可变结构域或至少其抗原结合位点。抗体片段的实例包括双抗体、单链抗体分子、和由抗体片段形成的多特异性抗体。scFv抗体是例如Huston，J.S.在酶学方法(Methods in Enzymol.)203(1991)46-52.中描述的抗体。另外，抗体片段包括单链多肽，所述单链多肽具有VH结构域的特征，即能够与VL结构域组装在一起或者具有结合IL-17的VL结构域的特征，即能够与VH结构域组装在一起成为功能性抗原结合位点，并且由此提供本发明所述的抗体的性质。当用于本文时，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一氨基酸组成的抗体分子的制剂。术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中框架和/或“互补决定区”(CDR)已被修饰成包括与亲本免疫球蛋白相比具有不同种类(species)的免疫球蛋白的CDR。在优选的实施方案中，将小鼠CDR移植到人抗体的框架区，以制备“人源化抗体”。参见，例如，Riechmann，L.，等，自然(Nature)332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.，等，自然(Nature)314(1985)268-270。
术语“结合IL-17”当用于本文时意指在ELISA结合测定中抗体与人IL-17结合。如果在抗体浓度为1μg/ml时该抗体产生7∶1或更高的S/N(信号/噪声)则认为结合。本发明所述的抗体以1nM(0.15μg/ml)或更低的IC50值特异性结合人IL-17A。该抗体不结合IL-17B、C、D、E和F(S/N(信号/噪声)比值低于7∶1)，因此是特异性地结合IL-17A。与IL-17A和变体的结合通过ELISA使用固定的IL-17或变体进行。
术语“表位”指能够特异结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面组如氨基酸或者糖侧链组成并且表位通常具有特定的三维结构特征，以及特定电荷特征。构象和非构象表位的区别在于在变性溶剂的存在下对前者的结合丧失，但是对后者的结合不丧失。优选地本发明所述的抗体特异性结合天然但不结合变性的IL-17。本发明的IL-17抗体结合的在IL-17上的表位与抗体Mab317结合的表位相同。可使用本领域已知的技术确定本发明的IL-17抗体的表位结合性质。该IL-17抗体通过体外交叉阻断结合测定(crossblocking binding assay)进行测试，以便确定该测试抗体阻碍抗体Mab317结合IL-17的能力。如果测试抗体被抗体Mab317置换至少15％，则该表位在附近。
“可变结构域”(轻链可变结构域(VL)，重链可变结构域(VH))，当用于本发明时，指每对轻链和重链结构域的每个结构域，其直接参与抗体与抗原的结合。轻链和重链的可变结构域具有相同的通用结构，并且每个结构域包括序列是广泛保守的4个框架(FR)区，其由3个“高可变区”(或互补决定区，CDR)连接。所述框架区采用β-折叠构象，并且所述CDR可以形成连接所述β-折叠结构的环。在每条链中的CDR通过框架区保持在它们的三维结构中，并且与另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在本发明所述的抗体的结合特异性/亲和性中起着特别重要的作用，并且因此提供本发明的另一个目的。
术语“抗体的抗原-结合部分”，当用于本发明时，是指抗体负责抗原-结合的氨基酸残基。抗体的抗原-结合部分包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是除超可变区之外的那些可变结构域区域，如本文所定义的。因此，抗体的轻链和重链可变结构域从N端到C端包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域，并且限定所述抗体的性质。CDR和FR区按照Kabat等，免疫目的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公共健康服务(Public Health Service)，美国全国卫生研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，MD(1991)的标准定义和/或来自于“高变环”的那些残基来确定。
当在本申请中应用时，术语“氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸的组，其包括丙氨酸(三字母符号：ala，单字母符号：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。
用于本文时，术语“核酸”或“核酸分子”意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但是优选地是双链DNA。当核酸被置于与另外的核酸的功能性关联中时，核酸被“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌前导区的DNA被表达为参与多肽分泌的前蛋白，所述DNA可操作地与多肽的DNA连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，其可操作地与编码序列连接；或如果将核糖体结合部位定位以促进翻译，其可操作地与编码序列连接。通常，“可操作地连接”意味着被连接的DNA序列是在同一直线上的，并且在分泌前导区的情况中，是连续的，并且在阅读框中。但是，增强子不一定是连续的。通过在适宜限制性位点的连接反应来完成连接。如果这些位点不存在，依照常规惯例，使用合成的寡核苷酸连接物或接头。用于本文时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以交换使用并且所有这些命名都包括后代。因而，单词“转化子”和“经转化的细胞”包括原代主题细胞及源于它的培养物，不考虑转移的数量。还理解由于有意或无意的突变，所有后代可能在DNA内容上并不精确相同。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的不同后代。
抗体的“Fc部分”不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出各种效应器功能。“抗体的Fc部分”是技术人员熟知的术语并基于木瓜蛋白酶切割抗体进行定义。取决于它们的重链的恒定区的氨基酸序列，将抗体或免疫球蛋白分成下列种类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1与IgA2。按照重链恒定区，不同种类的免疫球蛋白分别称为α、δ、ε、γ和μ。基于补体激活、C1q结合和Fc受体结合，抗体的Fc部分直接参与ADCC(抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体-依赖性细胞毒性)。补体激活(CDC)通过补体因子C1q与大部分IgG抗体亚类的Fc部分结合而起始。尽管抗体对补体***的影响取决于某些条件，抗体与C1q的结合由Fc部分中定义的结合位点引起。这样的结合位点是本领域状态中已知的，并且例如由Boakle，R.J.等，自然(Nature)282(1979)742-743；Lukas，T.J.等，免疫学杂志(J.Immunol.)127(1981)2555-2560；Brunhouse，R.和Cebra，J.J.，分子免疫学(Mol.Immunol.)16(1979)907-917；Burton，D.R.等，自然(Nature)288(1980)338-344；Thommesen，J.E.等，分子免疫学(Mol.Immunol.)37(2000)995-1004；Idusogie，E.E.等，免疫学杂志(J.Immunol.)164(2000)4178-4184；Hezareh，M.，等，病毒学杂志(J.Virology)75(2001)12161-12168；Morgan，A.，等，免疫学(Immunology)86(1995)319-324；EP 0307434。这样的结合位点是，例如，L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331和P329(按照Kabat的EU索引编号，见下文)。亚类IgG1，IgG2和IgG3的抗体通常表现出补体活化和C1q结合，而IgG4不激活补体***，并且不结合C1q。
本发明所述的抗体包含来源于人源的Fc部分，其是亚类IgG1人抗体的Fc部分。对于本发明所述的抗体的Fc部分，优选地不能检测到如下文定义的C1q结合。
因此本发明包括本发明所述的抗体，其特征在于所述的抗体结合IL-17，含有来自于人源的Fc部分，并且不结合人补体因子C1q并因此避免CDC效应器功能。
优选地，本发明所述的抗体是关于人IgG1或IgG2亚类的Fcγ结合受体，具有L234、L235和/或D265的突变和/或含有PVA236突变。优选的是突变L234A、L235A、L235E和/或PVA236(PVA236意指IgG1的氨基酸位置233-236的氨基酸序列ELLG(以单字母氨基酸密码表示)或者IgG4的EFLG由PVA替代)。本发明因而提供本发明所述的抗体，其特征在于所述抗体是人亚类IgG1抗体，含有L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和/或P329中的至少一个突变。在一个实施方案中，该抗体是人抗体。在另一实施方案中，该抗体是人源化抗体。在一个实施方案中，本发明提供本发明所述的抗体，含有来自于人源的Fc部分，并且其特征在于所述抗体是人亚类IgG1抗体，其含有L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331中至少一个突变，并且其中该抗体以在BIAcore测定中低于10-8M的KD值结合IL-17。在另一个实施方案中，该KD的范围是10-11至10-9M。
C1q结合可以按照Idusogie，E.E.，等，免疫学杂志(J.Immunol.)164(2000)4178-4184进行测量。本发明所述的无C1q结合的特征在于，如果这样的测定中(其中ELISA板用不同浓度的抗体包被)，添加人C1q。C1q的结合如下检测，通过针对人C1q的抗体随之通过过氧化物酶-标记的缀合物通过过氧化物酶底物ABTS
Figure BPA00001332081100101
2，2’-连氮基-双-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸]检测。如果测试抗体在抗体浓度为10μg/ml时405nm的光密度(OD)低于0.05，则认为是本发明所述的无C1q结合。
本发明所述的抗体优选的特征在于恒定链为人类来源。此类恒定链在现有技术中是众所周知的并且例如由Kabat描述(参见例如Johnson，G.，和Wu，T.T.，核酸研究(Nucleic Acids Res.)28(2000)214-218)。例如，有用的人重链恒定区包括SEQ ID NO：23。例如，有用的人轻链恒定区包括κ-轻链恒定区SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
本发明又一个实施方案是编码本发明所述抗体的重链和轻链的核酸。
本发明包括治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于向该患者施用治疗有效量的本发明所述的抗体。本发明包括本发明所述的抗体用于治疗的用途。本发明包括本发明所述的抗体在制备用于预防和治疗炎症和血栓形成病症的药物中的用途。本发明包括本发明所述的抗体在治疗炎症疾病中的用途，优选在治疗慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disorder(COPD))、多发性硬化(multiple sclerosis)和类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)中的用途。
此外，本发明所述的抗体包括了具有不影响或不改变以上提及的本发明抗体特征的“保守序列修饰”(变体抗体)、核苷酸序列修饰和氨基酸序列修饰的抗体。可以通过本领域内已知的标准技术如定点诱变和PCR-介导的诱变导入修饰。保守氨基酸置换包括其中氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基置换的保守氨基酸置换。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，可以优选地用来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基替代在人抗-IL-17抗体中被预测为非必需的氨基酸残基。因此，本文中“变体”抗-IL-17抗体是指这样的分子，其氨基酸序列与“亲本”抗-IL-17抗体的氨基酸序列不同，在亲本抗体的一个或多个可变区具有达到10个，优选约2至约5个添加、缺失和/或置换。可基于如由Riechmann，L.，等，自然(Nature)332(1988)323-327和Queen，C.，等，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86(1989)10029-10033描述的分子建模，通过诱变实施氨基酸置换。
本发明又一个实施方案是产生针对IL-17的抗体的方法，该抗体不结合Fcγ受体和/或C1q，其特征在于编码结合IL-17的人IgG1型抗体重链的核酸序列以这样的方式进行修饰从而所述修饰的抗体不结合C1q和/或Fcγ受体，将所述修饰的核酸和编码所述抗体轻链的核酸***到表达载体，所述载体***到真核宿主细胞，所编码的蛋白质被表达并从该宿主细胞或上清液回收。
在本文中，将序列的同一性或同源性定义为在比对序列和根据需要导入缺口以获得最大序列同一性百分数后，候选序列中与亲本序列相同的氨基酸残基的百分数。抗体序列的N末端、C末端或内部延伸、缺失或***均不应解释为影响序列同一性或同源性。变体保留了结合人IL-17的能力并且优选地具有优于亲本抗体特性的特性。例如，在治疗过程中变体可具有降低的副作用。
“亲本”抗体包含抗体3C1的CDR区并优选地用于制备变体。优选地，亲本抗体具有人构架区并且根据需要具有人抗体恒定区或人抗体恒定结构域。例如，亲本抗体可以是人源化抗体或人抗体。
本发明所述的抗体优选地通过重组方法产生。此类方法在本领域内是众所周知的并且包括在原核细胞和真核细胞中表达蛋白质，随后分离抗体多肽并且通常纯化至可药用的纯度。为了表达蛋白质，通过标准方法将编码重链和轻链或其片段的核酸插至表达载体内。在适宜的原核宿主细胞或真核宿主细胞如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、酵母或大肠杆菌(E.coli)细胞内进行表达，并且从细胞(从上清液或细胞裂解后)回收抗体。重组生成抗体是现有技术中公知的且记述在，例如，综述文章Makrides，S.C.，蛋白实验纯化(Protein Expr.Purif.)17(1999)183-202；Geisse，S.，等，蛋白实验纯化(Protein Expr.Purif.)8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，分子生物技术(Mol.Biotechnol.)16(2000)151-160；Werner，R.G.，等，药物研究(Drug Res.)48(1998)870-880中。抗体可以以完整细胞、以细胞裂解产物或以部分纯化或基本纯形式存在。通过标准技术，包括柱层析法和本领域其他公知技术进行纯化，从而消除其他细胞成分或其他污染物，例如其他细胞核酸或蛋白。参见Ausubel，F.，等，编辑，当前分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing and Wiley Interscience，纽约(1987)。在NS0细胞中的表达记述在，例如，Barnes，L.M.，等，细胞技术学(Cytotechnology)32(2000)109-123；Barnes，L.M.，等，生物技术和生物工程(Biotech.Bioeng.)73(2001)261-270中。瞬时表达记述在，例如，Durocher，Y.，等，核酸研究(Nucl.Acids.Res.)30(2002)E9中。可变结构域的克隆记述在Orlandi，R.，等，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86(1989)3833-3837；Carter，P.，等，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89(1992)4285-4289；Norderhaug，L.，等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)204(1997)77-87中。优选的瞬时表达***(HEK 293)记述在Schlaeger，E.-J.和Christensen，K.，在细胞技术学(Cytotechnology)30(1999)71-83中和Schlaeger，E.-J.，在免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)194(1996)191-199中。通过常规免疫球蛋白纯化程序，诸如例如，蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石层析法、凝胶电泳、透析或亲合层析法，从培养基中适当分离单克隆抗体。编码单克隆抗体的DNA和RNA容易利用常规程序分离和测序。杂交瘤细胞可以起所述DNA和RNA来源的作用。一旦分离后，可以将DNA***到表达载体中，所述表达载体随后转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞诸如HEK 293细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞中，以在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。
人IL-17抗体的氨基酸序列变体通过向编码抗体的DNA引入适当的核苷酸变化或通过肽合成制备。然而，此类修饰可仅在非常有限的范围内实施，例如如上文所描述。例如该修饰不改变上文提及的抗体的特性如IgG同种型和表位结合，但可改善重组蛋白的产量、蛋白稳定性或帮助纯化。也可以替换任何不参与维持抗IL-17抗体正确构象的半胱氨酸残基，以便提高分子的氧化稳定性和阻止异常交联，通常使用丝氨酸进行替换。反之，可以向抗体中引入半胱氨酸键，以便提高抗体的稳定性(特别是当抗体是抗体片段如Fv片段时)。抗体的另一类型氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化模式。“改变”意味着去除一个或多个在抗体中存在的糖部分和/或添加一个或多个在抗体中不存在的糖基化位点。抗体的糖基化一般是N型连接。N型连接指糖部分连接于天冬酰胺残基的侧链。天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸三肽序列是糖部分与天冬酰胺侧链发生酶连接的识别序列，其中X是除脯氨酸以外的任一氨基酸。因此，在多肽中出现这类三肽序列中的任何一个将产生潜在的糖基化位点。向抗体中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列以使其含有一个或多个上述的三肽序列(对于N型连接的糖基化位点)而方便地实现。
通过本领域内所知的多种方法制备了编码抗-IL-17抗体氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括，但不限于(在天然存在的氨基酸序列变体情况下)从天然来源分离或通过对较早制备的人源化抗-IL-17抗体的变体或非变体形式进行寡核苷酸介导的(或位点定向的)诱变、PCR诱变以及盒式诱变制备。
抗体共价修饰的另一个类型包括以如美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；4,179,337中所述的方式使抗体连接于多种非蛋白聚合物中的一种，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。
本发明所述的重链和轻链可变结构域与启动子、翻译起始、恒定区、3′非翻译区、多腺苷酸化和转录终止序列组合以形成表达载体构建体。重链和轻链表达构建体可组合成单个载体、共转染、顺次转染或单独转染进入宿主细胞，然后其融合以形成表达两条链的单个宿主细胞。
另一方面，本发明提供一种组合物(例如药物组合物)，其含有一种本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分或其组合，与药学上可接受的载体配制在一起。用于本文时，“药学上可接受的载体”包括生理相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收/再吸收延缓试剂等。优选地，所述载体适合于注射或输注。通过许多本领域已知的各种方法可以施用本发明的组合物。如本领域技术人员将理解，施用路径和/或模式将取决于所需结果而变化。药学上可接受的载体包括用于制备无菌可注射溶液或分散体的灭菌水溶液或分散体和灭菌粉末。这些介质和试剂用于药学上可接受的活性物质的应用为本领域所知。除了水，载体可以是例如等渗的缓冲盐溶液。无论选择何种施用路径，通过为本领域技术人员已知的常规方法，将可以以适合的水合形式和/或本发明的药物组合物形式使用的本发明的化合物配制成可药学上可接受的剂型。对于特定患者、组合物和施用方式，本发明药物组合物的活性成分的实际剂量水平可以变化以获得有效实现理想的治疗反应而不会对患者具有毒性的活性成分的量(有效量)。选定的剂量水平将取决于许多药物动力学因素，其包括所用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，施用的路径，施用的时间，所用的特定化合物的***率，与所用的特定化合物组合使用的其它药物、化合物和/或物质，待治疗的患者的年龄、性别、体重、疾病状况、一般健康和以前的疾病史等医学领域众所周知的类似因素。
本发明包括本发明所述的抗体用于治疗罹患多发性硬化(multiple sclerosis)、类风湿性关节炎(RA)、银屑病(psoriasis)、局限性回肠炎(Crohn’s disease)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘(asthma)和移植排斥(transplant rejection)的患者的用途。
本发明又一个实施方案是抗-IL-17抗体(优选为本发明所述的抗体)用于治疗罹患类风湿性关节炎的患者的用途，所述患者对TNF拮抗剂、抗-CD20抗体、CTLA4Ig或抗-IL6抗体的治疗有中度反应或无反应。本发明的又一个实施方案是抗-IL-17抗体(优选为本发明所述的抗体)在制备用于治疗罹患类风湿性关节炎患者的药物中的用途，所述患者对TNF拮抗剂、抗-CD20抗体、CTLA4Ig或抗-IL6抗体的治疗有中度反应或无反应。用于治疗RA的TNF拮抗剂是，例如英夫利昔单抗(infliximab，IFX，Remicade
Figure BPA00001332081100141
)，依那西普(etanercept，ETA，Enbrel
Figure BPA00001332081100142
)和阿达木单抗(adalimumab，ADA，Humira
Figure BPA00001332081100143
)。优选地，向对TNF拮抗剂、抗-CD20抗体、CTLA4Ig或抗-IL6抗体的治疗有中度反应或无反应的患者施用抗-IL-17抗体至少3个月，优选6个月。
本发明还提供制备药物组合物的方法，该组合物包括有效量的本发明所述的抗体以及药学上可接受的载体，提供用于此类方法的本发明所述的抗体的用途。本发明还提供有效量的本发明所述的抗体在制备用于治疗罹患多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病、局限性回肠炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘和移植排斥的患者的药剂中的用途，该抗体优选与药学上可接受的载体在一起。本发明还提供有效量的本发明所述的抗体在制备用于治疗罹患多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病、局限性回肠炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘和移植排斥的患者的药剂中的用途，该抗体优选与药学上可接受的载体在一起。
序列的描述
SEQ ID NO：1重链CDR3，Mab 106和Mab 107
SEQ ID NO：2重链CDR2，Mab 106
SEQ ID NO：3重链CDR1，Mab 106和Mab 107
SEQ ID NO：4轻链CDR3，Mab 106和Mab 107
SEQ ID NO：5轻链CDR2，Mab 106和Mab 107
SEQ ID NO：6轻链CDR1，Mab 106和Mab 107
SEQ ID NO：7重链可变结构域，Mab 106
SEQ ID NO：8轻链可变结构域，Mab 106和Mab 107
SEQ ID NO：9重链CDR2，Mab 107
SEQ ID NO：10重链可变结构域，Mab 106
SEQ ID NO：11γ1重链恒定区
SEQ ID NO：12κ轻链恒定区
实施例
实施例1
免疫接种的描述
使用5只雌性Balb/c小鼠在20周内实施免疫接种，每只小鼠使用来自于Peprotech(http://www.peprotech.com；Cat.Nr.：200-17于含有1％白蛋白的1％PBS中)的250(1x)和100μg(3x)重组人IL17实施。
实施例2
通过ELISA测量与IL-17的结合
通过在PBS中浓度为0,5μg/ml的重组人IL-17(Peprotech#200-17，www.peprotech.com)(100ml/孔)包被NUNC
Figure BPA00001332081100161
Maxisorp板(96-孔)。板子在37℃温育并在定轨摇床上振荡2小时。其后去除包被溶液并添加100μl/孔的PBSTC(磷酸盐缓冲盐水，0,05％Tween
Figure BPA00001332081100162
20，2％小鸡血清)。板子在室温温育1小时。去除封闭溶液，并将样品(空白：PBSTC，样品(10μg/ml于PBS中)：本发明所述的抗-人IL-17抗体3C1和Mab 106；eBioscience(www.ebioscience.com)的Mab 16-7178-85；R&D Systems(www.rndsystems.com)的MAB 317，NVP-AIN-497(WO 2006013107)；添加到板中(100μl/孔)。板子在室温下振荡温育。去除样品，通过200μl/孔的PBST(磷酸盐缓冲盐水，0,05％Tween
Figure BPA00001332081100163
20)洗涤板子三次，并添加用于检测小鼠抗体的第二抗体(山羊抗-小鼠IgG，Fcγ，HRP缀合物；Chemicon AP127P，www.millipore.com)或用于检测人源化抗体的山羊抗-人IgG，Fcγ，HRP缀合物(Chemicon AP113P)。第二抗体以1∶10000在PBSTC中稀释并且板子在室温下振荡温育1小时。去除第二抗体，通过200μl/孔的PBST(磷酸盐缓冲盐水，0,05％Tween20)洗涤板子三次，并添加100μl/孔的ABTS
Figure BPA00001332081100165
(Roche Diagnostics GmbH)。与IL-17A结合相关的光密度在405/492nm测量(设定为100％)。与其它人IL-17亚型(IL-17B，IL-17C，IL-17D，IL-17E和IL-17F)的结合以相同测定形式实施。结合显示在表1中。
表1：
Figure BPA00001332081100166
实施例3
制备IgG1类免疫球蛋白的表达质粒
质粒6454(下文称为p6454)是用于在真核细胞中表达抗-IL-17-抗体(带有保留的外显子-内含子组织的基因组上组织的表达盒)的表达质粒。
其包括下述结构元件：
-来自于载体pUC18(pUC起点)的复制起点，
-在大肠杆菌(E.coli)中赋予氨苄西林抗性的β-内酰胺酶基因(Amp)，
-用于表达γ1-重链的表达盒，其包括下述元件：
-来自于人巨细胞病毒的主要立即-早期启动子和增强子(hCMV IE1启动子)，
-包括Kozak序列的合成的5’UTR，
-包括信号序列内含子(L1_内含子_L2)的鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-在3’端排列有剪切供***点的重链可变区(VH)的cDNA，
-小鼠免疫球蛋白μ-增强子区，
-人免疫球蛋白重链γ1-基因(IGHG1)，其包括外显子CH1，铰链，CH2和CH3，间插内含子和带有多腺苷酸化信号序列的3’UTR，
-用于表达κ-轻链的表达盒，其包括下述元件：
-来自于人巨细胞病毒的主要立即-早期启动子和增强子(hCMV IE1启动子)，
-包括Kozak序列的合成的5’UTR，
-包括信号序列内含子(L1_内含子_L2)的鼠免疫球蛋白重链信号序列，，
-在3’端排列有剪切供***点的轻链可变区(VL)的cDNA，，
-内含子(intronic)小鼠Ig-κ增强子区，
-人免疫球蛋白κ基因(IGK)，其包括IGKC外显子和带有多腺苷酸化信号序列的IGK 3’UTR，
-用于表达鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)(其适合在真核细胞中进行营养缺陷型选择)的表达盒，其包括
-缩短版本的SV40早期启动子和起点，
-鼠DHFR的编码序列，
-SV40早期多腺苷酸化信号。
将P6454转染进入CHO-K1细胞，并且在通过甲氨蝶呤(MTX)选择后分离稳定的细胞系，并通过对人IgG的ELISA筛选产生人抗体的细胞系。
实施例4
补体***激活的研究(C1q结合ELISA)
为研究C1q与本发明所述的抗体的结合，使用ELISA方法。C1q是适应性免疫***的一部分，结合免疫复合物后，引发数个酶原的相继激活。该酶反过来导致C3分子的切割，其导致炎症反应的发生，导致对外源或异常颗粒的调理作用和细胞膜的裂解。
MTP(Nunc)通过待测抗体在PBS-缓冲液中在4℃包被过夜，该包被在10μg/mL和0.156μg/mL之间的7种浓度下100μl/孔进行。用200μl/孔在PBS中的3％BPLA(Roche)在室温下封闭自由结合位点1小时。MTP与2μg/mL C1q(Quiddel)在3％BPLA的PBS溶液，100μg/mL中温育。MTP在室温下用0.1％Tween
Figure BPA00001332081100181
20的PBS溶液洗涤3次。通过添加0.25μg/mL多克隆兔抗-C1q抗体(DAKO)，在3％BPLA，0.1％Tween
Figure BPA00001332081100182
20的PBS溶液，100μl/孔中，室温下1小时对结合进行检测。MTP在室温下通过0.1％Tween20的PBS溶液洗涤3次。以在3％Tween 20的PBS溶液中0.1μg/mL添加次级抗体山羊抗-兔IgG POD(Jackson Immuno Research)，100μl/孔，室温下1小时。通过0.1％Tween20的PBS溶液在室温下洗涤MTP 3次后，MTP与ABTS溶液(Roche)一起温育，并且测量在波长405nm处的吸收，参比波长为490nm。背景信号在没有包被抗体的孔但通过相同检测程序处理的孔中测定。如果对于抗体浓度为10μg/ml的检测抗体在405nm的光密度(OD)低于0,05，则认为没有C1q结合。
实施例5
通过BIAcore交叉封闭实验进行表位区作图
所有测量使用BIAcore 3000仪器在25℃实施。***和样品缓冲液是HBS-EP(10mM HEPES，150mM NaCl，3.4mM EDTA，0.005％聚山梨酯20(v/v))。BIAcore CM5传感器芯片进行预处理程序。对于流动池FC1，FC2，FC3和FC4相继注射0.1％SDS，50mM NaOH，10mM HCl和100mM H3PO430sec。使用BIAcore 3000wizard v.4.1根据制造商说明书进行胺偶联程序。
为实施通过嵌合或人源化抗体的交叉封闭实验，在EDC/NHS激活传感器表面后，多克隆山羊抗-人IgG抗体(Jackson)固定在所有传感器流动池(Flow Cell，FCs)上。30μg/ml多克隆山羊抗-人IgG抗体在10mM NaAc pH5.0中以10μl/min使用7分钟来固定10.000RU的抗体捕获***。表面通过乙醇胺饱和进行灭活。人捕获***传感器通过5个循环的huIgG分析物(Bayer)以10μl/min进行2min的结合来调节，并通过10mM甘氨酸pH 1.7以30μl/min进行3min来再生。
初级mAb以10μl/min的流量注射3min到FC1-FC4中。传感器捕获***的自由结合容量使用以10μl/min注射50μg/ml huIgG(Bayer)在HBS-EP缓冲液中的混合物(cocktail)3min到FC1-FC4中进行封闭。随后，以10μl/min注射3min抗原rhuIL17-A到FC1-FC4中以使初级抗体结合容量饱和。在次级抗体以30μl/min单独注射3min到流动池FC1，FC2，FC3和FC4之前，以30μl/min进行3min的第二次注射。使用10mM甘氨酸pH 1.75以30μl/min进行3min来使传感器再生。
首先，从所有传感图(sensorgram)中减去0nM的分析物注射，以便纠正初级抗体从多克隆山羊抗-人IgG捕获***的解离。通过次级抗体和初级抗体的反应信号形成商。该商的名称为摩尔比值(Molar Ratio，MR)并表示表位区的可及性(accessibility)。
摩尔比值列在阵列中。同源mAb组合用作对照，无论封闭程序是否成功实施。截止值(cut off)通过同源mAb的组合进行定义。
交叉封闭实验中的截止值设定为Mab106同质测定形式(9％)。高于MR＝15％的摩尔比值说明可接触独立的表位。
表位作图的结果(参见表2)表明Mab K106及其衍生物Mab107结合与NVP-AIN-497不同的表位区。此外，Mab K106覆盖与eBio64CAP17不同的表位，并覆盖与Mab317相同的表位区。
表2：
表位作图结果
  抗体1   抗体2   摩尔比[％]
  eBio64CAP17   106   41
  NVP-AIN-497   106   17
  Mab317   106   11
  NVP-AIN-497   107   21
  Mab317   Mab317   0
  106   106   9
  eBio64CAP17   eBio64CAP17   7
  NVP-AIN-497   NVP-AIN-497   6
该分析的截止值通过同质测定组合(106，9％)；(AIN-457，6％)；(eBio64CAP17，7％)；(Mab317，0％)进行定义。在此截止值设定为同质Mab106测定。
实施例6
细胞因子释放测定，IL-17A诱导的hIL-8释放的抑制
该测定如下实施：检测与抗-IL-17抗体预温育的IL-17A和TNF-α刺激后CCD-25SK细胞的hIL-8的产生。CCD-25SK细胞具有IL-17受体。可溶性IL-17A结合这些IL-17受体。针对IL-17A的抗体结合IL-17A。该机制仅在TNFα存在下工作。通过IL-17A与IL-17受体的结合，细胞产生hIL-8，其通过ELISA检测作为读数读出。测量的hIL-8给出了这样的信息，在何种浓度抗-IL-17抗体抑制IL-17对CCD-25SK细胞的刺激。
CCD-25SK细胞以细胞密度2.5x104细胞/孔接种于48-孔板(体积0.45ml/孔)并在37℃和5％CO2中温育24h。温育过夜后，细胞通过终浓度为9000；3000；1000；333.3；111.1；37.03；12.34；和4.11ng/ml的抗-IL-17抗体处理30分钟。通过50μl/孔(10x浓缩)的培养基制备每种抗体稀释系列。30分钟后，细胞的刺激通过10ng/ml IL-17A和50pg/ml TNF-α混合物，50μl/孔(10x浓缩)并在37℃和5％CO2中温育24h完成。温育过夜后，上清液转移到96-孔板并作为hIL-8 ELISA的中间体冻存于-20℃。
hIL-8 ELISA如下实施。向每孔添加100μl稀释的捕获抗体并在4℃温育过夜。通过包被缓冲液进行稀释。对板子进行抽吸，通过200μl/孔洗涤3次，通过200μl/孔测定稀释剂封闭并在室温温育1小时。对板子进行抽吸并通过200μl/孔洗涤3次。添加100μl标准品和样品并在室温温育2小时。标准品稀释系列：400pg/ml；200pg/ml；100pg/ml；50pg/ml；25pg/ml；12.5pg/ml；6.3pg/ml并且测定稀释剂作为阴性对照。样品的稀释为1∶200。对板子进行抽吸并通过250μl/孔洗涤4次。向每孔添加100μl缀合物。缀合物通过检测抗体和在测定稀释剂中1∶250稀释的酶试剂制备。对板子进行抽吸并通过250μl/孔洗涤6次。向每孔添加100μl底物并温育12分钟。温育后反应通过50μl/孔1M H2SO4终止。在450nm 30分钟内进行读数，同时在570nm进行λ校正。结果显示于表3(相对于80％的最大抑制测量IC50值)。
表3：
  抗体   IL-6中和IC50(nM)   IL-8中和IC50(nM)
  3C1   1.0   1.0
  106   1.0   1.0
  Mab 317   5.5   5.5
实施例7
滑膜细胞细胞因子释放测定，IL-17A诱导的hIL-6和hIL-8的抑制
原代人成纤维细胞样滑膜细胞(HFLS)对IL-17A刺激反应产生hIL-6和hIL-8。实施该测定以测量在刺激前该细胞与抗-IL-17抗体预温育后这种IL-17A刺激的HFLS细胞产生hIL-6和hIL-8的抑制。
HFLS细胞以0.5ml的体积和4x105细胞/ml的细胞密度接种到48-孔板中，并在37℃和5％CO2中温育过夜以粘附。温育过夜后，培养基替换为400μl新鲜培养基，并且通过抗体浓度范围(10000，3000，1000，300，100，30，10，3，0ng/ml)的抗-IL-17抗体处理细胞30分钟。通过50μl/孔(10x浓缩)的培养基制备每种抗体稀释系列。30分钟后，细胞通过100ng/ml IL-17A(1000ng/ml 10x浓缩液50μl)在37℃和5％CO2中温育过夜(18h)进行刺激。温育期后，上清液转移到新管中，立即分析或存储在-80℃直至通过ELISA进行分析。对于hIL-6和hIL-8 ELISA，向每孔添加100μl稀释的捕获抗体并在4℃温育过夜。通过包被缓冲液进行稀释。对板子进行抽吸，通过200μl/孔洗涤3次，通过200μl/孔测定稀释剂封闭并在室温温育1小时。对板子进行抽吸并通过200μl/孔洗涤3次。根据制造商的说明书，添加100μl标准品和样品并在室温温育2小时。对板子进行抽吸并通过250μl/孔洗涤至少3次。向每孔添加100μl缀合物。缀合物通过检测抗体和在测定稀释剂中1∶250稀释的酶试剂制备。对板子进行抽吸并通过250μl/孔洗涤至少3次。向每孔添加100μl底物并温育直至产生足够用于读数的颜色。温育后反应通过50μl/孔1M H2SO4终止，并在板读数仪上在波长450nm30分钟内进行读数。结果显示于表4。
表4：
Figure BPA00001332081100221
实施例8
与食蟹猴(Cynomolgus)IL-17A的交叉反应性(结合测定)
结合测定根据实施例2实施。结果显示于表5。
表5：
Figure BPA00001332081100222
Figure BPA00001332081100231
实施例9
食蟹猴(Maccaca Fasicularis)细胞因子释放测定，食蟹猴IL-17A诱导的IL-6和IL-8产生的抑制
食蟹猴表皮成纤维细胞(CDF)对人或食蟹猴IL-17A刺激反应产生食蟹猴IL-6和IL-8。实施该测定以测量在刺激前该细胞与抗-IL-17抗体(其针对人IL-17产生)预温育后这种食蟹猴IL-17A刺激的CDF细胞产生IL-6和IL-8的抑制。
CDF细胞以0.5ml的体积和2x105细胞/ml的细胞密度接种到48-孔板中，并在37℃和5％CO2中温育过夜以粘附。温育过夜后，培养基替换为400μl新鲜培养基，并且通过抗体浓度范围(10000，3000，1000，300，100，30，10，3，0ng/ml)的抗-IL-17抗体处理细胞30分钟。通过50μl/孔(10x浓缩)的培养基制备每种抗体稀释系列。30分钟后，细胞通过100ng/ml IL-17A(1000ng/ml 10x浓缩液50μl)在37℃和5％CO2中温育过夜(18h)进行刺激。温育期后，上清液转移到新管中，立即分析或存储在-80℃直到通过ELISA进行分析。显示hIL-6和hIL-8 ELISA与它们各自的食蟹猴细胞因子交叉反应并用于定量细胞因子水平。对于ELISA，向每孔添加100μl稀释的捕获抗体并在4℃温育过夜。通过包被缓冲液进行稀释。对板子进行抽吸，通过200μl/孔洗涤3次，通过200μl/孔测定稀释剂封闭并在室温温育1小时。对板子进行抽吸并通过200μl/孔洗涤3次。根据制造商的说明书，添加100μl标准品和样品并在室温温育2小时。对板子进行抽吸并通过250μl/孔洗涤至少3次。向每孔添加100μl缀合物。缀合物通过检测抗体和在测定稀释剂中1∶250稀释的酶试剂制备。对板子进行抽吸并通过250μl/孔洗涤至少3次。向每孔添加100μl底物并温育直至产生足够用于读数的颜色。温育后反应通过50μl/孔1M H2SO4终止，并在板读数仪上在波长450nm30分钟内进行读数。结果显示于表6。
表6：
Figure BPA00001332081100241
实施例10
基于铕(Europium)的ADCC测定
通过Ficoll Paque Plus梯度离心分离PBL∶肝素化血液样品通过PBS1∶1稀释。8ml的稀释血液覆盖到Ficoll上并在800g离心30min。收集细胞(PBLs)，通过RPMI1640/10％FCS洗涤并重悬浮于细胞培养基中。细胞稀释至2.5x106细胞/ml(这将产生的25∶1效应器/靶比值，因为每孔使用5x103靶细胞)。
靶细胞通过BADTA(2，2′：6′，2″-三联吡啶-6，6″-二羧酸乙酰氧基甲基酯)((2，2′：6′，2″-terpyridine-6，6″-dicarboxylic acid acetoxymethylester))标记：通过添加AccutaseTM(Millipore)收获细胞，洗涤一次并稀释至1x106细胞/ml。添加2.5μl BADTA/1x106细胞并在37℃/5％CO2中温育35min。标记期后细胞通过10ml培养基稀释，在200g离心10min并抽吸上清液。这一步骤通过培养基/2mM Probenicid重复三次，并且样品稀释至1x105细胞/ml，在300g离心5min，去掉上清液并且将50μl通过移液器取至意图用于背景对照的孔中。
背景：50μl等份，通过100μl培养基稀释。自发裂解：50μl标记的靶细胞悬液；添加100μl培养基并温育2h/37℃作为测试样品。最大裂解：50μl/孔标记的靶细胞悬液；添加100μl Triton
Figure BPA00001332081100242
X-100(PBS中0.5％)并温育2h/37℃。无抗体的裂解对照：50μl/孔标记的靶细胞悬液；添加50μl培养基；添加50μl的效应器细胞，在37℃下2小时。无效应器细胞的裂解对照：50μl/孔标记的靶细胞悬液；添加50μl培养基，添加50ml所使用的最高浓度的抗体溶液并温育2h/37℃。
温育期结束时96孔板在100rpm离心。20μl的每种上清液转移到OptiPlateTM HTRF-96(Packard)并且添加200ml铕溶液并且在振荡器上温育15min。测定对于时间溶解荧光和自发释放的荧光，并且根据下述公式计算特异性释放(specific release)：
Figure BPA00001332081100251
添加抗体106后没有测量到显著的特异性释放(ADCC)。
实施例11
CDC测定
通过添加胰岛素收获细胞，洗涤，稀释至1x105细胞/ml并添加100μl/孔至96-孔平底微量滴定板中。以培养基中25μl的体积6-倍终浓度添加抗体(分别为抗体-配体复合物)。30min温育时间后，添加25μl新鲜溶解的小兔补体(Cedarlane CL3441，1ml冻干的，在4ml双蒸馏水中新鲜稀释的)至补体终浓度1∶24。在20h温育期后，去除50μl上清液并添加100μl Cell Titer Glo
Figure BPA00001332081100252
试剂(Promega Corp.)到剩余的100μl上清液。板子在定轨振荡器上振荡2min，转移100μl/孔到黑色发光微量滴定板(Costar)中并测量发光(luminescence)。
对照：培养基对照(靶细胞+50μl培养基)；最大裂解(靶细胞+50μl0.5％Triton X-100)，补体对照(靶细胞+25μl培养基+25μl补体)。
结果：对于抗-IL17抗体106，没有检测到补体依赖性细胞毒性(CDC)。
Figure IPA00001332080700011
Figure IPA00001332080700021
Figure IPA00001332080700041
Figure IPA00001332080700051
Figure IPA00001332080700061
PCT/RO/134表
     PCT/RO/134表的中文译文(共2页)
涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示
          (PCT细则13bis)
Figure QPA00001332080500012
C.附加指示(附页)
申请人：霍夫曼-拉罗奇有限公司，等
申请人文件参考号：25345WO-SR
国际申请号：PCT/EP2009/006784
关于说明书引用的保藏生物材料的专家解决方案相关的指示
涉及保藏的生物材料的指示全部包含在说明书中。下列另外的指示不要求是说明书的一部分，并且应当作为“分开的指示”对待。它们仅涉及专家解决方案。以下作出的另外的指示涉及在说明书第2页(注：中文第2页)中称为：<hIL-17>1A1.3C1 DSM ACC 2941的保藏的生物材料。
另外的指示是：
对于CA(加拿大)指定：
对于加拿大的指定，按照加拿大专利法案专利细则第107和108条规定，只有通过将样品签发给局长提名的独立专家(细则104(4))，直到授予加拿大专利，或直到申请被驳回或被放弃且不再要求恢复、或被撤回的日期，才可以提供保藏的生物材料的样品。
对于EP(欧专局)指定：
关于EPO的指定，按照EPC实施细则的细则28(3)的规定，只有通过将样品签发给请求人提名的专家(细则28(4)EPC)，直到欧洲专利授权通知公开，或者如果申请被驳回或撤回或视撤，直至从申请日起20年，才可以提供保藏的生物材料的样品。
对于SG(新加坡)指定：
申请人由此提请注意，我们意欲根据1995年专利法则目录四的第3段，上述培养物仅可提供给专家。
19-OKT-2009 15:50 Von：ROCHE DIAGN.TR-E  +498856603451    An：41223388270   S.3/4
INDICATIONS RELATING TO DEPOSITED MICROORGANISM
         OR OTHER BIOLOGICAL MATERIAL
                (PCT Rule 13bis)
Figure QPA00001332080500032
19-OKT-2009 15:50 Von：ROCHE DIAGN.TR-E  +498856603451      An：41223588270    S.4/4
C.ADDITIONAL INDICATIONS(additional sheet)
Applicants                   ：F.Hoffmann-La Roche AG，et al.
Applicants file reference    ：25345 WO-SR
International application No.：PCT/EP2009/006784
Figure QPA00001332080500041

Claims (18)

1.结合人IL-17的抗体，其特征在于重链可变结构域包含SEQ ID NO：1的CDR3区，SEQ ID NO：2或9的CDR2区和SEQ ID NO：3的CDR1区，并且其特征在于轻链可变结构域包含SEQ ID NO：4的CDR3区，SEQ ID NO：5的CDR2区和SEQ ID NO：6的CDR1区。
2.根据权利要求1的抗体，其特征在于重链可变结构域包含SEQ ID NO：7或10。
3.根据权利要求2的抗体，其特征在于重链可变结构域包含SEQ ID NO：7或10并且轻链可变结构域包含SEQ ID NO：8。
4.结合人IL-17的抗体，其特征在于该抗体可从杂交瘤细胞系DSMACC2941获得。
5.结合人IL-17的抗体，其特征在于该抗体是抗体3C1(DSM ACC2941)的嵌合、人源化或T细胞表位缺失的抗体变体。
6.根据权利要求1至5的抗体，其特征在于该抗体是人IgG1同种型，该人IgG1同种型是在铰链区氨基酸位置216-240，和/或在CH2和CH3之间第二结构域间区域的氨基酸位置327-331被修饰的人IgG1同种型。
7.结合人IL-17的抗体，其特征在于该抗体与单克隆抗体3C1(DSM ACC2941)结合相同的IL-17表位，特征在于该抗体是人IgG1同种型，该人IgG1同种型是在铰链区氨基酸位置216-240，和/或在CH2和CH3之间第二结构域间区域的氨基酸位置327-331被修饰的人IgG1同种型。
8.根据权利要求6或7的抗体，其特征在于该抗体包含突变L234A(在氨基酸位置234是丙氨酸而不是亮氨酸)和L235A。
9.药物组合物，其特征在于包含根据权利要求1至8的抗体。
10.药物组合物，其特征在于包含抗体，该抗体与单克隆抗体3C1(DSM ACC2941)结合相同的IL-17表位。
11.根据权利要求1至8的抗体在制备药物组合物中的应用。
12.抗体在制备药物组合物中的应用，该抗体的特征在于其与单克隆抗体3C1(DSM ACC2941)结合相同的IL-17表位。
13.根据权利要求1至8的抗体在治疗多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病、局限性回肠炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘和移植排斥中的应用。
14.抗体在治疗多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病、局限性回肠炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘和移植排斥中的应用，该抗体的特征在于其与单克隆抗体3C1(DSM ACC2941)结合相同的IL-17表位。
15.编码结合IL-17的抗体的重链的核酸，其特征在于所述抗体包含SEQ ID NO：1的重链CDR3区，SEQ ID NO：2或9的重链CDR2区和SEQ ID NO：3的重链CDR1区，SEQ ID NO：4的轻链CDR3区，SEQ ID NO：5的轻链CDR2区和SEQ ID NO：6的轻链CDR1区。
16.表达载体，其特征在于包含根据权利要求15的核酸，该表达载体用于在原核或真核宿主细胞中表达结合IL-17的抗体。
17.产生结合IL-17的重组抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达根据权利要求15的核酸并且从所述细胞或细胞培养物上清液回收所述抗体。
18.杂交瘤细胞系DSM ACC2941。
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