CN101023102B - 抗-ox40l抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗-OX40L抗体，并且特别地涉及抗-OX40L抗体及其变体，其含有衍生于人源的Fc片段并且不结合补体因子Clq。这些抗体具有给受炎症疾病折磨的患者带来益处的新颖性和创造性特点。
Description
本发明一般涉及抗-OX40L抗体，并且特别地涉及不结合补体因子Clq的抗-OX40L抗体，涉及其药物组合物及应用。优选地，这些抗体是人的或人源化的抗体。
当CD40/CD40L连接时，人OX40L(gp34，SwissProt P23510)在活化的B细胞和树突细胞上表达，并且在炎症组织的内皮细胞上表达(综述：Weinberg，A.D.，Trends Immunol.23(2002)102-109)。它首次从HTLV-1感染的人白血病细胞中分离出来(这些T细胞通过与OX40产生autokrine环而无限增殖)。例如，OX40L和针对其的抗体在下列各项中提及：WO95/12673；WO95/21915；WO99/15200；Baum，P.R.，等.，EMBO J.13(1994)3992-4001；Imura，A.，等.，Blood89(1997)2951-2958；Imura，A.，等.，J.Exp.Med.183(1996)2185-2195；Kjaergaard，J.，等.，J.Immunol.167(2001)6669-6677；Lane，P.，J.Exp.Med.191(2000)201-206；Mallett，S.，和Barclay，A.N.，Immunol.Today12(1991)220-223；Mallett，S.，等.，EMBO J.9(1990)1063-1068；Ndhlovu，LC.，等.，J.Immunol.167(2001)2991-2999；Ohshima，Y.，等.，J.Immunol.159(1997)3838-3848；Rogers，P.R.，等.，Immunity15(2001)445-455；Stüber，E.，和Strober，W.，J.Exp.Med.183(1996)979-989；Stüber，E.，等.，Gastroenterology115(1998)1205-1215；Takahashi，Y.，等.，J.Virol.75(2001)6748-6757；Takasawa，N.，等.，Jpn.J.Cancer Res.92(2001)377-382；Taylor，L，和Schwarz，H.，J.Immunol.Meth.255(2001)67-72；Weinberg，A.D.，等.，Nature Medicine2(1996)183-189；Weinberg，A.D.，等.，Semin.Immunol.10(1998)471-480；Weinberg，A.D.，Trends Immunol.23(2002)102-109；Wu，T.，等.，Transplant.Proc.33(2001)217-218；Higgins，LM.，等.，J.Immunol.162(1999)486-493；和Yoshioka，T.，等.，Eur.J.Immunol.30(2000)2815-2823。人OX40L是在活化的CD4+T细胞上瞬时表达的人OX40(CD134)的配体。其配体结合OX40引起T细胞活化的共刺激性信号。描述了产生双向信号的OX40/OX40L相互作用(Matsumura，Y.，等.，J.Immunol.163(1999)3007-3011；Kotani，A.，等.，Immunol.Lett.84(2002)1-7)。此外，OX40/OX40L相互作用调控活化的T细胞与炎症组织的内皮细胞的黏附。由于OX40L只是在活化的B细胞、DC和内皮细胞上瞬时表达，所以，针对OX40L的抗体应该在炎性应答中选择性地阻断T细胞活化和内皮细胞黏附，而使得未活化的、外周T细胞不受影响。Yoshioka，A.，等.(Eur.J.Immunol.30(2000)2815-2823)证明了中和抗-mOX40L mAb在类风湿性关节炎小鼠模型中的治疗潜力。它的施用显著地改善疾病的严重性。在其它相关疾病模型中，例如，炎性皮肤病、试验性自体免疫疾病(EAE)、GVHD、泌尿炎性肠病(urine inflammatory boweldisease)，这种抗体表现出相似的活性(Yoshioka，A.，等.，Eur.J.Immunol30(1999)2815-2823；Salek-Ardakani，S.，等.，J.Exp.Med.198(2003)315-324；Burgess，J.K.，等.，J.Allergy Clin.Immunol.113(2004)683-689；Hoshino，A.，等.，Eur.J.Immunol.33(2003)861-869；Arestides，R.S.，等.，Eur.J Immunol.32(2002)2874-2880；Nohara，C.，等.，J.Immunol.166(2001)2108-2115；Weinberg，A.D.，等.，J.Immunol.162(1999)1818-1826；Higgins，L.M.，等.，J.Immunol.162(1999)486-493；Humphreys，I.R.，等.，J.Exp.Med.198(2003)1237-1242；Akiba，H.，等.，J.Exp.Med.191(2000)375-380；Ishii，N.，等.，Eur.J.Immunol.33(2003)2372-2381；Blazar，B.R.，等.，Blood101(2003)3741-3748；Tsukada，N.，等.，Blood95(2000)2434-2439；Akiba，H.，等.，Biochem.Biophys.Res.Commun.251(1998)131-136)。
已经研究针对OX40L的抗体在各种疾病模型中的消炎作用(Sugamura，K.，等.，Nat.Rev.Immunol.4(2004)420-431)。
Tanaka，Y.，等，Int.J.Cancer36，(1985)549-555；Tozawa，H.，等.，Int.J.Cancer41(1988)231-238；和Miura，S.，等.，Mol.Cell.Biol.11(1991)1313-1325描述了命名为TARM-34和TAG-34的小鼠单克隆抗体，其与携带人T细胞I型白血病毒(HTLV-I)的人淋巴细胞系的表面抗原反应。TAG-34抗体可从MBL国际公司商购。TAG-34也与OX40L结合。
发明概述
本发明涉及一种抗体，优选地一种单克隆抗体，其特征在于所述抗体结合OX40L，含有来自人源的Fc片段，并且不结合在NK细胞上的人补体因子Clq和/或人Fcγ受体。
本发明还涉及一种抗体，优选地一种单克隆抗体，其特征在于所述抗体含有来自人源的Fc片段，在100ng的抗体浓度中与OX40L和变性的OX40L(在蛋白质印迹中)结合。这一抗体结合到与单克隆抗体LC.001结合的相同表位的OX40L多肽表位上。这样的抗体为，例如，LC.001、LC.033和LC.060。这些抗体优选地为人IgG1型(野生型)，或不结合在NK细胞上的人补体因子Clq和/或人Fcγ受体。
本发明还涉及一种结合OX40L的抗体，其特征在于包括可变轻链和可变重链，特征在于所述可变重链包括CDR1、CDR2和CDR3，CDR3特征在于选自SEQ ID NOs：33-38。特别优选地，CDR1选自SEQ ID NOs：21-25，CDR2选自SEQ ID NOs：26-32以及CDR3选自SEQ ID NOs：33-38。
按照本发明的抗体优选地以包括可变轻链和可变重链为特征，特征在于所述可变轻链包括CDR1、CDR2和CDR3，CDR3特征在于选自SEQ IDNOs：51-57。特别优选地，CDR1选自SEQ ID NOs：39-44，CDR2选自SEQID NOs：45-50以及CDR3选自SEQ ID NOs：51-57。
按照本发明的抗体优选地以包括可变轻链和可变重链为特征，特征在于所述可变重链包括CDR1、CDR2和CDR3，CDR3特征在于重链的CDR3选自SEQ ID NOs：33-38，和轻链的CDR3选自SEQ ID NOs：51-57。特别优选地，可变重链包括选自SEQ ID NOs：21-25的CDR1，选自SEQ ID NOs：26-32的CDR2以及选自SEQ ID NOs：33-38的CDR3，并且可变轻链包括选自SEQ ID NOs：39-44的CDR1，选自SEQ ID NOs：45-50的CDR2以及选自SEQ ID NOs：51-57的CDR3。
所有的CDRs都独立地从彼此选择，但是自然是以所述抗体结合OX40L的这样的方式。因此，相同的LC抗体的轻链和重链的CDRs可以组合，或者LC.001的轻链CDRs与LC.001、LC.059或LC.063的重链CDRs组合。每条链上的CDRs由构架氨基酸分离。
按照本发明的抗体优选地特征在于所述抗体包括独立地选自由下列各项组成的组的CDRs
a)氨基酸序列SEQ ID NO:1的轻链(VL)可变CDRs和SEQ ID NO:2的重链(VH)可变CDRs；
b)氨基酸序列SEQ ID NO:3的轻链可变CDRs和SEQ ID NO:4的重链可变CDRs；
c)氨基酸序列SEQ ID NO:5的轻链可变CDRs和SEQ ID NO:6的重链可变CDRs；
d)氨基酸序列SEQ ID NO:7的轻链可变CDRs和SEQ ID NO:8的重链可变CDRs；
e)氨基酸序列SEQ ID NO:9的轻链可变CDRs和SEQ ID NO:10的重链可变CDRs；
f)氨基酸序列SEQ ID NO:11或16的轻链可变CDRs和SEQ ID NO:12的重链可变CDRs；
g)由氨基酸序列SEQ ID NO:1定义的轻链(VL)可变结构域和由SEQ IDNO:17定义的重链(VH)可变结构域；
h)由氨基酸序列SEQ ID NO:18定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO:19定义的重链可变结构域；
i)由氨基酸序列SEQ ID NO:1定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO:20定义的重链可变结构域；
或其OX40L-结合片段。
按照本发明的抗体优选地特征在于所述抗体包括独立地选自由下列各项组成的组的可变区
a)由氨基酸序列SEQ ID NO:1定义的轻链(VL)可变结构域和由SEQ IDNO:2定义的重链(VH)可变结构域；
b)由氨基酸序列SEQ ID NO:3定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO:4定义的重链可变结构域；
c)由氨基酸序列SEQ ID NO:5定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO:6定义的重链可变结构域；
d)由氨基酸序列SEQ ID NO:7定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO:8定义的重链可变结构域；
e)由氨基酸序列SEQ ID NO:9定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO:10定义的重链可变结构域；
f)由氨基酸序列SEQ ID NO:11或16定义的轻链可变结构域和由SEQID NO:12定义的重链可变结构域；
g)由氨基酸序列SEQ ID NO:1定义的轻链(VL)可变结构域和由SEQ IDNO:17定义的重链(VH)可变结构域；
h)由氨基酸序列SEQ ID NO:18定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO:19定义的重链可变结构域；
i)由氨基酸序列SEQ ID NO:1定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO:20定义的重链可变结构域；
或其OX40L-结合片段。
按照本发明的抗体优选地特征在于人轻链可变区包括独立地选自由SEQ ID NO：1，3，5，7，9，11，16和18组成的组的氨基酸序列。
按照本发明的抗体优选地特征在于人重链可变区包括独立地选自由SEQ ID NO：2，4，6，8，10，12，17，19和20组成的组的氨基酸序列。
重链和轻链的CDR区在SEQ ID NO：21-38和39-57中显示。
按照本发明的抗体优选地特征在于所述抗体包括由氨基酸序列SEQID NO:1定义的轻链可变结构域和由SEQ ID NO:2，17或20定义的重链可变结构域。
按照本发明的抗体优选地特征在于人重链恒定区包括独立地选自由SEQ ID NO：14和15组成的组的氨基酸序列或者SEQ ID NO：58的重链恒定区。
按照本发明的抗体优选地特征在于所述抗体包括SEQ ID NO：13的κ-轻链恒定区或者SEQ ID NO:61，65或69的轻链恒定区。
优选地，按照本发明的抗体特征在于结合OX40L，并且是人IgG1种类(野生型)，并且包括γ重链SEQ ID NO：58，62或66。特别优选地是这样的抗体，其包括
a)γ重链SEQ ID NO:58和κ轻链SEQ ID NO:61，
b)γ重链SEQ ID NO:62和κ轻链SEQ ID NO:65或
c)γ重链SEQ ID NO:66和κ轻链SEQ ID NO:69。
本发明的另一个实施方案是结合OX40L的抗体，其特征在于它由细胞系hu-Mab<hOX40L>LC.001，hu-Mab<hOX40L>LC.005，hu-Mab<hOX40L>LC.010，hu-Mab<hOX40L>LC.019，hu-Mab<hOX40L>LC.029或hu-Mab<hOX40L>LC.033产生。
按照本发明的抗体优选地是嵌合的、人的或人源化的抗体。
按照本发明的抗体优选地特征在于以小于10-8M(10-12-10-8M)的KD值结合OX40L，更优选地特征在于在BIAcore检测中10-12-10-9M的KD范围。
按照本发明的抗体优选地在使用0.5μg/ml包被浓度的固定OX40L(优选地为固定在链霉抗生物素蛋白表面上的生物素化的OX40L)的ELISA中抑制OX40L与OX40的相互作用，具有不大于4nM的IC50值。更优选地，IC50值在1-4nM范围内。
按照本发明的抗体优选地特征在于，所述抗体与补体因子Clq的不结合是指这样一种ELISA检测，即，与抗体LC.001的Bmax相比较，其中浓度为10μg/ml的抗体与Clq的最大结合(Bmax)为30％或更低，优选地20％或更低。
优选地，所述抗体不结合人FcγRI，FcγRIIA和/或FcγRIIIA。特别优选地，所述抗体不结合在NK效应细胞上的人Fcγ受体。
按照本发明的抗体优选地特征在于所述抗体与NK细胞上的Fcγ受体的不结合是指这样的检测，即，与抗体LC.001的Bmax相比较，其中浓度为20μg/ml的抗体与NK细胞的最大结合(Bmax)为20％或更低，优选地10％或更低。
按照本发明的抗体优选地特征在于，它不与FcγRI结合。这意味着，当在检测浓度为0.078-10μg/ml范围内的抗体与缺少FcγRIIA和FcγIIB但是表达重组FcγRI的B-细胞淋巴瘤细胞的结合的检测中，所述抗体的特征在于，与LC.001的EC50值相比较，所述抗体的EC50值是5倍或更高，优选地7倍或更高，诸如8倍或更高。
按照本发明的抗体优选地特征在于为一种IgG4抗体或IgG1抗体，其包括至少一个氨基酸突变，优选地在人Fc片段，这使得不与补体因子Clq结合和/或不与NK细胞上的人Fcγ受体结合。
按照本发明的抗体优选地特征在于它不活化补体因子C3。
按照本发明的抗体优选地特征在于为人亚类IgG4。在本发明的另一个优选实施方案中，所述抗体特征在于为任何IgG种类，优选地为IgG1或IgG4，其包含在E233，L234，L235，G236，D270，N297，E318，K320，K322，A327，A330，P331和/或P329(按照EU索引进行编号)的至少一个突变。特别优选的是IgG1突变PVA236，L234A/L235A和/或GLPSS331以及IgG4突变L235E。另外，优选地，IgG4亚类抗体包含突变S228P或突变S228P和L235E(Angal，S.，等.，Mol.Immunol.30(1993)105-108)。
因此，按照本发明的抗体优选地为人亚类IgG1的抗体，其含有一个或多个PVA236，GLPSS331和/或L234A/L235A(按照EU索引进行编号)的突变。
优选地，按照本发明的抗体特征在于与OX40L结合，是含有突变L234A/L235A的IgG1种类，并且包括γ重链SEQ ID NO：59，63或67。
特别优选地，抗体包括
a)γ重链SEQ ID NO:59和K轻链SEQ ID NO:61，
b)γ重链SEQ ID NO:63和K轻链SEQ ID NO:65或
c)γ重链SEQ ID NO:67和κ轻链SEQ ID NO:69。
优选地，按照本发明的抗体特征在于是含有突变S228P的IgG4种类的抗体，包括γ重链SEQ ID NO：60，64或68。
特别优选地，抗体包括
a)γ重链SEQ ID NO:60和κ轻链SEQ ID NO:61，
b)γ重链SEQ ID NO:64和K轻链SEQ ID NO:65或
c)γ重链SEQ ID NO:68和κ轻链SEQ ID NO:69。
按照本发明的抗体优选地特征在于，它不引发依赖于补体的细胞毒性(CDC)。
按照本发明的抗体优选地特征在于，它不引发依赖于抗体的细胞的细胞毒性(ADCC)。
因此，本发明包括抗-OX40L抗体或以它们的CDRs为特征的单一重链或轻链，可变区，完整氨基酸序列或杂交瘤，并且其不包括Fc片段或者包括任何类型的Fc片段，优选地人IgG1Fc或人IgG4Fc，来自于人源未修饰的或者由上述提及的突变修饰的Fc片段。
因此，本发明还包括抗体，优选地单克隆抗体，特征在于所述抗体结合OX40L，包含人源Fc片段，并且不结合人补体因子Clq和/或NK细胞上的人Fcγ受体，特征在于为人IgG4型或者为由上述提及的突变修饰的人IgG1或人IgG4。
因此，本发明还包括抗体，优选地单克隆抗体，特征在于所述抗体以100ng的抗体浓度与OX40L和变性的OX40L(在蛋白质印迹中)结合。这一抗体结合到与单克隆抗体LC.001结合的表位相同的OX40L多肽表位上。所述抗体不包括Fc片段，或者包括任何类型的Fc片段，优选地人IgG1或人IgG4，野生型的或者由上述提及的突变修饰的。
按照本发明的抗体具有新颖性和创造性特点，其给需要用针对OX40L的抗体治疗的患者，特别为遭受炎症疾病折磨的患者，特别是受类风湿性关节炎、过敏性哮喘和移植中的GvHD折磨的患者带来益处(还参见Sugamura，K.，等.，Nat.Rev.Immunol.4(2004)420-431)。
本发明的另一个实施方案是一种核酸分子，其编码按照本发明的抗体分子、其可变链或CDR结构域。
在本发明的一个优选实施方案中，所述抗体是Fab、F(ab’)2或单链片段。
本发明的另一个实施方案是一种载体，其包括按照本发明的核酸分子。
本发明的另一个实施方案是一种宿主细胞，其包括按照本发明的载体。
本发明的另一个实施方案是一种制备按照本发明的抗体的方法，所述方法包括在允许所述抗体分子合成的条件下，培养按照本发明的宿主细胞，并且从所述培养物中获得所述抗体分子。
本发明的另一个实施方案是一种组合物，优选地是按照本发明的抗体的药物或诊断组合物。
本发明的另一个实施方案是一种药物组合物，其包括按照本发明的抗体和至少一种药用赋形剂。
本发明的另一个实施方案是一种治疗需要治疗的患者的方法，其特征在于给所述患者施用治疗有效量的按照本发明的抗体。
本发明的另一个实施方案是按照本发明的抗体用于治疗的应用，其优选地用于治疗炎症疾病，特别用于治疗和/或预防类风湿性关节炎、哮喘和GvHD(移植物抗宿主病)。
本发明的另一个实施方案是按照本发明的抗体用于制备药物的应用，所述药物用于预防和/或治疗炎症疾病，优选地用于治疗类风湿性关节炎、哮喘和GvHD。
本发明的另一个实施方案是一种诊断试剂盒，其包括按照本发明的抗体、按照本发明的核酸分子、按照本发明的载体或按照本发明的宿主细胞。
发明详述
术语“OX40L”是指属于TNF-配体家族的II型膜蛋白。其它的命名为ACT-4受体，CD134L，gp34或TNF4_人。它具有34KDa的分子量，并且存储在SwissProt中，登记号为P23510。
术语“OX40”是指与OX40L结合的受体。它是属于TNF受体家族的I型膜蛋白。其它的命名为ACT-4，OX40L受体，CD134抗原，ACT35抗原，TNR4_人。它具有50kDa的分子量，并且存储在SwissProt中，登记号为P43489。
术语“抗体”包括各种形式的抗体，优选地为单克隆抗体，其包括但不限于完整抗体、抗体片段、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和遗传加工的抗体(变体或突变抗体)，只要保留按照本发明的特征性特点。特别优选的是人或人源化的单克隆抗体，特别是重组人抗体。
当用于本文时，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一氨基酸组合物的抗体分子的制剂。
术语“嵌合抗体”是指一种单克隆抗体，其包括来自一种来源或物种的可变区，即，结合区，和来源于不同来源或物种的至少一部分恒定区，这种抗体通常通过重组DNA技术制备。优选包括小鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明所包括的其它优选形式的“嵌合抗体”是，其中恒定区已经从初始抗体的恒定区修饰或改变，以产生按照本发明的特性，特别是关于Clq结合和/或Fc受体(FcR)结合特性的那些。这样的嵌合抗体也叫作“种类-转换抗体”。嵌合抗体是免疫球蛋白基因的表达产物，所述免疫球蛋白基因包括编码免疫球蛋白可变区的DNA片段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA片段。产生嵌合抗体的方法包括本领域公知的常规重组DNA和基因转染技术。参见，例如，Morrison，S.L，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855；US Patent Nos.5，202,238和5,204,244。
术语“人源化抗体”是指这样的抗体，与亲本免疫球蛋白的CDR相比较，其中构架或“互补决定区”(CDR)已经被修饰成包括不同特异性的免疫球蛋白CDR。在一个优选实施方案中，将小鼠CDR移植到人抗体的构架区，以制备所述“人源化抗体”。参见，例如，Riechmann，L，等.，Nature332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.，等.，Nature314(1985)268-270。特别优选的CDRs对应代表识别上文提及的抗原序列的那些，所述抗原针对嵌合的和双功能抗体。本发明包括的其它形式的“人源化抗体”是其中的恒定区已经从初始抗体的恒定区另外修饰或改变，以产生按照本发明的特性，特别是关于Clq结合和/或Fc受体(FcR)结合的特性的那些抗体。
术语“人抗体”，当用于本文时，意欲包括具有源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。人抗体在本领域内是公知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。人抗体还可以在转基因动物(例如，小鼠)中产生，在缺乏内源性免疫球蛋白产生的情况下，一旦免疫，所述动物能够产生人抗体的全部所有成分或所选择的部分。当抗原刺激时，将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到这样的种系突变小鼠中将导致人抗体的产生(参见，例如，Jakobovits，A.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)2551-2555；Jakobovits，A.，等.，Nature362(1993)255-258；Bruggemann，M.，等.，Year Immunol.7(1993)33-40)。人抗体还可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom，H.R.，和Winter，G.，J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks，J.D.，等.，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。Cole等.和Boerner等.的技术还可以用于制备人单克隆抗体(Cole等.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；和Boerner，P.，等，J.Immunol.147(1991)86-95)。由于已经提及按照本发明的嵌合和人源化抗体，术语“人抗体”，当用于本文时，还包括这样的抗体，其在恒定区被修饰以产生按照本发明的特性，特别是关于Clq结合和/或FcR结合的特性，例如，通过“种类转换”，即，Fc片段的改变或突变(例如，从IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突变)。另外，本发明包括针对OX40L的单克隆人抗体，其结合Clq和/或FcR。这样的人抗体特征在于相对小鼠OX40L而言对于人OX40L的高选择性(与小鼠OX40L结合比与人OX40L结合低>30倍)，并且在达到500nM浓度时，没有表现出对TNFα或CD40L的非特异性结合。这样的抗体有效用于产生不与Clq和/或FcR结合的抗体。
术语“重组人抗体”，当用于本文时，意欲包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如从宿主细胞如NS0或CHO细胞或从用人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体，或者应用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。这样的重组抗体具有重排形式的可变和恒定区。将按照本发明的重组人抗体进行体内体细胞高变。因此，尽管来源于并且与人种系VH和VL序列相关，所述重组抗体VH和VL区的氨基酸序列是不可能在体内人抗体种系所有成分中天然存在的序列。
当用于本文时，“可变区”(轻链(VL)的可变区，重链(VH)的可变区)表示直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链。可变人轻链和重链的结构域具有相同的常规结构，并且每个结构域包括4个构架(FR)区，其序列普遍是保守的，由3个“高变区”(或互补决定区，CDRs)连接。构架区采用β-片层构象，并且CDRs可以形成连接β-片层结构的环。每条链中的CDRs在它们的三维空间结构中由构架区拥有，并且与其它链的CDRs一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在按照本发明的抗体的结合特异性/亲和力中起着特别重要的作用，并且因此提供了本发明的另一个目的。
当用于本文时，术语“高变区”或“抗体的抗原-结合部分”是指负责抗原-结合的抗体氨基酸残基。所述高变区包括“互补决定区”或＂CDRs＂的氨基酸残基。“构架”或＂FR＂区是除本文定义的高变区残基以外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链从N-到C-端包括结构域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，和FR4。每条链上的CDRs由这样的构架氨基酸分离。特别地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大的区域。按照Kabat等.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)的标准定义，确定了CDR和FR区域。
当用于本文时，术语“核酸或核酸分子”意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，但是优选是双链DNA。
当它与另一核酸序列处于功能关联中时，核酸是“可操作性连接的”。例如，如果它作为参与多肽分泌的前蛋白而表达，那么，将前序列或分泌性前导序列的DNA可操作地连接到多肽的DNA上；如果它影响了所述序列的转录，那么将启动子或增强子可操作地连接到编码序列上；或者，如果它位于促进翻译的位置，那么将核糖体结合位点可操作地连接到编码序列上。一般地，“可操作连接”意指，要连接的DNA序列是相邻的，并且，在分泌性前导序列的情形中，是相邻的并且在阅读框内。然而，增强子不必是相邻的。连接通过在便利的限制性位点的连接而实现。如果不存在这样的位点，按照常规惯例，使用合成的寡聚核苷酸衔接子或接头。
当用于本文时，表达“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”互换地使用，并且所有这样的名称都包括后代。因此，词语“转化子”和“转化的细胞”包括初级受试细胞和源于其的培养物，而不考虑转移的次数。还应该理解，由于有意或无意的突变，所有的后代在DNA内容物上可以不是精确地相同的。包括具有与在原始转化细胞中所筛选的相同的功能或生物活性的变体后代。在使用不同的名称的情况下，从上下文中它将是清楚的。
“恒定结构域”不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出不同的效应器功能。取决于它们重链恒定区的氨基酸序列，将抗体或免疫球蛋白分成下列种类：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中的几个可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4，IgA1和IgA2。与不同种类的免疫球蛋白对应的重链恒定区分别叫作α，ε，γ和μ。按照本发明的抗体优选地为IgG型。
按照本发明的抗体包含Fc片段，优选地是源于人源的Fc片段，并且优选地是人恒定区的所有其它片段。抗体的Fc片段直接参与补体激活、Clq结合、C3活化和Fc受体结合。尽管抗体对补体***的影响取决于特定的条件，但是，与Clq的结合由Fc片段中定义的结合位点引起。这样的结合位点是本领域已知的，并且例如由Lukas，T.J.，等.，J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse，R.，和Cebra，J.J.，Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton，D.R.，等.，Nature288(1980)338-344；Thommesen，J.E.，等.，Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie，E.E.，等.，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh，M.，等.，J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan，A.，等.，Immunology86(1995)319-324；和EP0 307 434进行了描述。这样的结合位点如L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331和P329(按照Kabat EU索引进行编号，参见下文)。亚类IgG1、IgG2和IgG3的抗体通常表现出补体激活、Clq结合和C3活化，而IgG4不激活补体***，不与Clq结合并且不激活C3。当用于本文时，术语“来源于人源并且不结合NK细胞上的人补体因子Clq和/或人Fcγ受体的Fc片段”表示这样的Fc片段，即，其为亚类IgG4的人抗体Fc片段，或者亚类IgG1、IgG2或IgG3的人抗体Fc片段，其以这样的方式进行修饰，即不能检测到下文定义的Clq结合、C3活化和/或FcR结合。“抗体的Fc片段”是技术人员公知的术语，并且是基于抗体的木瓜蛋白酶分解而定义。优选地，所述Fc片段是人Fc片段，并且特别优选地来自人IgG4亚类，优选地在铰链区突变(例如，S228P和/或L235E)，或者是来自人IgG1亚类的突变的Fc片段。最优选地是包括这样的重链恒定区的Fc片段，即，所述重链恒定区选自SEQ ID NO：14和15显示的区域，或者包含在SEQ ID NO:58，59，60，具有突变L234A和L235A的SEQ ID NO：14，或者具有突变S228P或突变S228P和L235E的SEQ ID NO:15中。
本发明涉及与OX40L结合而不与补体因子Clq和/或Fc受体结合的抗体。在本发明的一个优选实施方案中，这些抗体不引发依赖于补体的细胞毒性(CDC)和/或依赖于抗体的细胞的细胞毒性(ADCC)。优选地，这一抗体特征在于，它结合OX40L，包含来源于人源的Fc片段，并且不结合补体因子Clq。更优选地，这一抗体是人的或人源化的单克隆抗体。
由所述抗体Fc区域的Fc片段介导的效应器功能是指抗体与抗原结合后运行的效应器功能(这些功能包括Fc受体对补体级联和/或细胞活化的激活作用)。
补体级联的功能可以通过CH50检测进行评估。将用抗-红细胞抗体(EA)致敏的绵羊红细胞加入到检测血清中，以激活导致红血球溶解的经典途径。裂解50％红细胞所需的血清体积确定CH50单位。AP-CH50测定备选的和末期途径。除了使用兔红细胞之外，流程是相似的。当加入检测血清时，备选途径被激活。
Clq和两种丝氨酸蛋白酶，Clr和Cls，形成复合物C1，是依赖于补体的细胞毒性(CDC)途径的第一个成分。为了激活补体级联效应，Clq结合附着到抗原性靶点上的至少两分子的IgG1或一分子的IgM(Ward，E.S.，和Ghetie，V.，Ther.Immunol.2(1995)77-94)。Burton，D.R.，描述了(Mol.Immunol.22(1985)161-206)包括氨基酸残基318-337的重链区域参与补体固定。Duncan，A.R.，和Winter，G.(Nature332(1988)738-740)，使用定点诱变，报道了Glu318、Lys320和Lys322形成与Clq的结合位点。Glu318、Lys320和Lys322残基在与Clq结合中的作用由含有这些残基的合成的短肽抑制补体介导的裂解的能力而证实。
术语“依赖于补体的细胞毒性(CDC)”是指，在补体存在下，按照本发明的抗体对表达OX40L的人内皮细胞的裂解。优选地，在补体存在下，通过用按照本发明的抗体处理表达OX40L的人内皮细胞，而测定CDC。优选地将细胞用钙荧光素标记。如果在30μg/ml的浓度，所述抗体诱导20％或更多的靶点细胞的裂解，那么可以发现CDC。本发明人发现，对于按照本发明的抗体的特性，在ELISA检测中减少与补体因子Clq的结合是重要的。在这样的检测中，理论上将ELISA平板用不同浓度范围的抗体包被，向平板中加入纯化的人Clq或人血清。通过针对Clq的抗体，接着过氧化物酶-标记的缀合物，检测Clq的结合。结合的检测(最大结合Bmax)作为对于过氧化物酶底物ABTS
(2，2＇-叠氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯(6)]在405nm的光学密度(OD405)进行检测。因此，本发明涉及一种抗体，其特征在于，所述抗体与补体因子Clq的不结合是指这样的ELISA检测测定，其中在10μg/ml的抗体浓度，Clq与按照本发明的抗体的最大结合(Bmax)是用抗体LC.001观察到的Bmax的20％或更低，优选地，10％或更低。
还优选的是，按照本发明的抗体在ELISA检测中表现出对补体因子C3减少的激活。所述检测用同Clq检测相同的方式进行。在这样的检测中，理论上，将ELISA平板用不同浓度范围的抗体包被，向其中加入人血清。通过针对C3的抗体，接着过氧化物酶-标记的缀合物，检测C3的结合。结合的检测(最大结合Bmax)作为对于过氧化物酶底物ABTS
在405nm的光学密度(OD405)进行检测。因此，本发明涉及一种抗体，其特征在于，所述抗体与补体因子C3的不结合是指这样的ELISA检测测定，其中在10μg/ml的抗体浓度，C3与所述抗体的最大结合(Bmax)是抗体LC.001的Bmax的10％，优选地，5％或更低。
术语“依赖于抗体的细胞的细胞毒性(ADCC)”是由Fc受体结合介导的功能，并且是指在效应细胞存在下，按照本发明的抗体对表达OX40L的靶点细胞的裂解。优选地，通过在存在效应细胞时，诸如新鲜分离的PBMC(外周血单核细胞)或从暗黄覆盖层(buffy coats)纯化的效应细胞，如单核细胞或NK(天然杀伤性)细胞，用按照本发明的抗体处理表达OX40L的类红细胞(例如，表达重组人OX40L的K562细胞)制剂，而测量ADCC。将靶点细胞用51Cr标记，并且随后与抗体一起温育。将标记的细胞与效应细胞一起温育，并且分析上层清液释放的51Cr。对照包括用效应细胞而不用所述抗体温育靶点内皮细胞。通过测定它们与表达Fcγ受体的细胞诸如重组表达FcγRI和/或FcγRIIA的细胞或NK细胞(基本上表达FcγRIIIA)的结合，而研究抗体诱导调控ADCC的初始步骤的能力。优选地测定与NK细胞上FcγR的结合。
Fc受体结合效应器功能受到抗体的Fc区与Fc受体(FcRs)的相互作用的调控，Fc受体是造血细胞上特有的细胞表面受体。Fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且已经表明其介导通过免疫复合体的吞噬细胞溶解作用而将抗体-包被的病原体移除，和通过依赖于抗体的细胞调控的细胞毒性(ADCC)而将用相应抗体包被的红细胞和各种其它细胞目的物(例如，肿瘤细胞)的裂解。Van de Winkel，J.G.，和Anderson，C.L.，J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)。FcRs由它们对免疫球蛋白同种型的特异性而定义；IgG抗体的Fc受体叫作FcγR，IgE的叫作FcεR，IgA的叫作FcαR，等等。例如，Fc受体结合在Ravetch，J.V.，和Kinet，J.P，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492；Capel，P.J.，等.，Immunomethods4(1994)25-34；de Haas，M.，等.，J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341；和Gessner，J.E.，等.，Ann.Hematol.76(1998)231-248中描述。
对于IgG抗体Fc结构域的受体(FcγR)的交联引发了广泛种类的效应器功能，包括吞噬细胞溶解作用、依赖于抗体的细胞的细胞毒性和炎性调控因子的释放、以及免疫复合体清除和抗体产生的调控。在人中，已经区分了3种FcγR，它们是：
-FcγRI(CD64)以高亲和力结合单体IgG，并且在巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达。IgG中E233-G236、P238、D265、N297、A327和P329至少一种的修饰减少与FcγRI的结合。在位置233-236的IgG2残基，代入IgG1和IgG4，将与FcγRI的结合减小103-倍，并且消除了对抗体-致敏的红细胞的人单核细胞应答(Armour，K.L.，等..Eur.J.Immunol.29(1999)2613-2624)。
-FcγRII(CD32)以中等到低亲和力结合复合的IgG，并且广泛地表达。这些受体可以分成2种主要类型，FcγRIIA和FcγRIIB。FcγRIIA在许多参与杀伤的细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞)上发现，并且似乎能够激活杀伤过程。FcγRIIB似乎在抑制过程中起作用，并且在B细胞、巨噬细胞上以及肥大细胞和嗜酸性粒细胞上发现。在B细胞上，看起来它行使抑制其它免疫球蛋白产生和同种型转换如向IgE种类转换的功能。在巨噬细胞上，FcγRIIB作用抑制通过FcγRIIA调控的吞噬细胞溶解作用。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，b形式可以通过IgE与其独立的受体结合而帮助抑制这些细胞的活化。例如，对于E233-G236，P238，D265，N297，A327，P329，D270，Q295，A327，R292和K414至少一种的IgG突变，发现减小了与FcγRIIA的结合。
-FcγRIII(CD16)以中等到低亲和力结合IgG，并且以两种类型存在。FcγRIIIA在NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和一些单核细胞和T细胞上发现，并且调控ADCC。FcγRIIIB在嗜中性粒细胞上高度表达。例如，对于E233-G236，P238，D265，N297，A327，P329，D270，Q295，A327，S239，E269，E293，Y296，V303，A327，K338和D376至少一种的突变，发现减小了与FcγRIIIA的结合。
对于Fc受体在人IgG1上结合位点、上文提及的突变位点的定位和测定与FcγRI和FcγRIIA的结合的方法在Shields，R.L，等.JBC276(2001)6591-6604中描述。
当用于本文时，术语“Fc受体”是指活化受体，其特征在于存在与所述受体相缔合的胞质(cytoplasmatic)ITAM序列(参见，例如，Ravetch，J.V.，和Bolland，S.，Annu.Rev.Immunol.19(2001)275-290)。这样的受体是FcγRI、FcγRIIA和FcγRIIIA。按照本发明的受体优选地表现出与Fcγ受体，优选地与FcγIIIA减小的结合。优选地，术语“不与FcγR结合”意指，在10μg/ml的抗体浓度，按照本发明的抗体与NK细胞的结合是对于抗体LC.001所发现的结合的10％或更少。
尽管IgG4表现出减少的FcR结合，但是其它IgG亚类的抗体表现出强结合。然而，如果改变，Pro238，Asp265，Asp270，Asn297(失去Fc碳水化合物)，Pro329和234,235,236和237，Ile253，Ser254，Lys288，Thr307，Gln311，Asn434和His435是也提供减小的FcR结合的残基(Shields，R.L，等.J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund，J.，等.FASEB J.9(1995)115-119；Morgan，A.，等.，Immunology86(1995)319-324；和EP0307434)。优选地，按照本发明的IgG1或IgG2亚类的抗体包括突变PVA236、GLPSS331和/或L234A/L235A。按照本发明的IgG4亚类的抗体优选地包括突变L235E。其它优选的IgG4突变是S228P或L235E和S228P(参见表1)。
当用于本文时，术语“与OX40L结合”意指在BIAcore检测(PharmaciaBiosensor AB，Uppsala，Sweden)中抗体与人OX40L的结合。为了进一步证实，与OX40L的结合还在用纯化的OX40L包被微量滴定平板的ELISA中确定，或者在FACS-检测中确定，其中直接或间接标记的抗体结合到表达OX40L的K562细胞上。
在BIAcore检测中，抗体结合到表面，并且OX40L的结合通过表面胞质基因共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)进行测定。结合的亲和力通过术语ka(抗体与抗原缔合的速率常数)、kd(解离的速率常数)和KD(kd/ka)进行定义。按照本发明的抗体表现出10-8或更小，优选约10-12-10-9M的KD(参见实例)。因此，本发明涉及上文所述的抗体，其中所述抗体在BIAcore检测中以小于10-8M的KD值与OX40L结合，优选地其中KD的范围是10-12-10-9M。
在OX40L-特异性结合ELISA中，将OX40L包被到微量滴定平板上，并且用HRP-缀合的抗人IgG和常规ELISA步骤检测抗体与OX40L的结合。在这一检测中的EC50值优选地在3nM-8nM范围内。
当用于本文时，术语“抑制OX40与OX40L结合”是指本发明所述的抗体与人OX40L的结合，由此抑制OX40/OX40L相互作用，并且由此抑制OX40L诱导的信号传导。
本发明的抗体抑制hOX40L/OX40的相互作用，优选地
i)在由ELISA检测所示的体外水平上，通过在(固相)0.5μg/ml生物素化OX40L的包被浓度的抗体而阻滞生物素化的、固定的OX40L与可溶OX40的相互作用，具有1nM-4nM范围的IC50值，
ii)在由Biacore检测所示的体外水平上，通过0.78-100nM抗体浓度的抗体而阻滞固定的OX40与可溶的OX40L(10nM，优选地为hOX40L-His)的相互作用，具有1nM-10nM范围的IC50值，
iii)在由FACS-检测所示的细胞水平上，其中所述抗体抑制表达OX40L的K562细胞(K562_OX40L)(浓度为2×105个细胞/样品)与OX40的相互作用，具有4nM-20nM范围的IC50值，
iv)通过OX40-信号传导检测，其中所述抗体阻滞由K562_OX40L诱导的OX40信号传导到每份样品3×104个表达OX40的HeLa-细胞中，这导致NFκB活化的阻滞，具有1nM-5nM范围的IC50值，
v)通过T细胞活化检测，其中通过在浓度为1.5×105个细胞/样品的K562_OX40L和浓度为0.75μg/ml的PHA，所述抗体阻滞OX40L诱导的T细胞激活，具有1nM-10nM范围的IC50值，和/或
vi)通过T细胞活化检测，其中通过在浓度为10μg/ml的抗体的活化的B细胞或树突细胞(Tetanus检测)，所述抗体阻滞OX40L诱导的T细胞激活，得到40％-60％的抑制。
优选这样的抗体，即，其在ELISA检测中表现出抑制，通过在0.5μg/ml OX40L的包被浓度阻滞固定的OX40L与可溶的OX40的相互作用而进行抑制，具有1nM-4nM范围的IC50值。
因此，本发明的另一个优选实施方案涉及一种抗体，其特征在于所述抗体由此抑制OX40/OX40L相互作用，并且由此抑制OX40L诱导的信号传导。
更优选地，按照本发明的抗体在浓度达到500nM的TNFα或CD40L，不表现出与TNFα和CD40L的非特异性结合。
更优选地，与人OX40L相比，按照本发明的抗体表现出至少低于30倍的与小鼠OX40L的结合。
更优选地，浓度为10μg/ml的按照本发明的抗体不诱导对OX40L在HUVEC细胞上表达的下调。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体特征在于，它们包括可变结构域的组合，所述组合独立地选自由下列组合组成的组
a)由氨基酸序列SEQ ID NO:1定义的抗体LC.001的轻链可变结构域和由SEQ ID NO:2定义的抗体LC.001的重链可变结构域；
b)由氨基酸序列SEQ ID NO:3定义的抗体LC.005的轻链可变结构域和由SEQ ID NO:4定义的抗体LC.005的重链可变结构域；
c)由氨基酸序列SEQ ID NO:5定义的抗体LC.010的轻链可变结构域和由SEQ ID NO:6定义的抗体LC.010的重链可变结构域；
d)由氨基酸序列SEQ ID NO:7定义的抗体LC.029的轻链可变结构域和由SEQ ID NO:8定义的抗体LC.029的重链可变结构域；
e)由氨基酸序列SEQ ID NO:9定义的抗体LC.019的轻链可变结构域和由SEQ ID NO:10定义的抗体LC.019的重链可变结构域；
f)由氨基酸序列SEQ ID NO:11或16定义的抗体LC.033的轻链可变结构域和由SEQ ID NO:12定义的抗体LC.033的重链可变结构域；
g)由氨基酸序列SEQ ID NO:1定义的轻链(VL)可变结构域和由SEQ IDNO:17定义的重链(VH)可变结构域；
h)由氨基酸序列SEQ ID NO:18定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO:19定义的重链可变结构域；
i)由氨基酸序列SEQ ID NO:1定义的轻链可变结构域和由SEQ IDNO:20定义的重链可变结构域。
在另一个优选实施方案中，本发明的抗体特征在于，它们包括独立地选自由下列各项组成的组的恒定区
k)由序列SEQ ID NO:13定义的轻链/κ链；
1)具有一个或多个选自L234A和L235A、PVA236或GLPSS331的突变的IgG1同种型SEQ ID NO:14的重链/γ链；
m)IgG4同种型SEQ ID NO:15的重链/γ链；
n)具有突变S228P或突变S228P和L235E的IgG4同种型SEQ IDNO:15重链/γ链；
o)包含在SEQ ID NO:61，65或69中的轻链恒定链；
p)包含在SEQ ID NO:58，59，60，62，63，64，66，67或68中的重链恒定链。
更优选地是每种可变抗体结构域组合a)-i)与γ链l)、m)、n)或p)，并且优选地与κ链k)或o)的所有组合。特别优选地是下列抗体：这样的抗体，其包括抗体LC.001，LC.005，LC.010，LC.019，LC.029，LC.033，LC.059，LC.060或LC.063的可变链(其中每种抗体具有序列SEQ IDNO:13定义的K链)，或包含在SEQ ID NO:61，65或69中的轻链恒定链和具有突变L234A和L235A的IgG1同种型SEQ ID NO:14的重链/γ链，或包含在SEQ ID NO:59，63或67中的重链恒定链；这样的抗体，其包括抗体LC.001，LC.005，LC.010，LC.019，LC.029，LC.033，LC.059，LC.060或LC.063的可变链(其中每种抗体具有序列SEQ ID NO:13定义的K链)，或包含在SEQ ID NO:59，63或67中的重链恒定链和IgG4同种型SEQ IDNO:15的重链/γ链，或包含在SEQ ID NO:60，64或68中的重链恒定链，所有这3种都没有S228P突变；这样的抗体，其包括抗体LC.001，LC.005，LC.010，LC.019，LC.029，LC.033，LC.059，LC.060或LC.063的可变链(其中每种抗体具有序列SEQ ID NO:13定义的κ链)，或包含在SEQ ID NO:61，65或69中的轻链恒定链和具有突变S228P的IgG4同种型SEQ ID NO:15的重链/γ链，或包含在SEQ ID NO:60，64或68中的重链恒定链。
优选地，所述抗体包括氨基酸序列SEQ ID NO:1的轻链可变CDR，和SEQ ID NO:2，17或20的重链可变CDR，或氨基酸序列SEQ ID NO:18的轻链可变CDR，和SEQ ID NO:19的重链可变CDR。
优选的抗体特征在于，所述抗体是人IgG4亚类或是其它的人亚类(优选IgG1)，其包括至少一个引起不结合补体因子C1q和/或失去FCR结合的氨基酸突变。例如，这样优选的变体抗体包括具有突变L234A和L235A的氨基酸序列SEQ ID NO：14，或者具有或没有突变S228P的SEQID NO：15。
按照本发明的优选抗体是定义为IgG1v1(PVA-236；表示为E233P的GLPSS331；L234V；L235A；△G236；A327G；A330S；P331S)，IgG1v2(L234A；L235A)和IgG4v1(S228P；L235E)和IgG4x(S228P)的抗体。
根据用于专利程序目的的微生物保藏国际承认的布达佩斯公约，按照本发明的杂交瘤细胞系hu-Mab<hOX40L>LC.001于2004年7月27日保藏在德国的德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSMZ)，保藏号DSM ACC2672。
根据用于专利程序目的的微生物保藏国际承认的布达佩斯公约，按照本发明的杂交瘤细胞系hu-Mab<hOX40L>LC.005(DSM ACC2685)，hu-Mab<hOX40L>LC.010(DSM ACC2686)，hu-Mab<hOX40L>LC.019，hu-Mab<hOX40L>LC.029(DSM ACC2688)和hu-Mab<hOX40L>LC.033(DSM ACC2689)于2004年9月2日保藏在德国的德意志微生物保藏中心(DSMZ)。
可从所述细胞系得到的抗体是本发明优选的实施方案，并且特别有效用作中间物质，用于产生不结合补体因子Clq和/或不结合人Fcγ受体的按照本发明的抗体。
本发明的其它优选实施方案是分离的抗-OX40L抗体，其结合OX40L，并且与由所保藏的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体LC.005，LC.010或LC.029也与之结合的相同的OX40L-表位结合。
本发明的另一个实施方案是用于产生针对OX40L的抗体的方法，所述针对OX40L的抗体不结合人补体因子Clq和/或人Fcγ受体，其特征在于，编码以小于10-8M的KD值结合OX40L的抗体的重链的核酸序列以这样的方式进行修饰，以致所述修饰的抗体不结合NK细胞上的补体因子Clq和/或人Fcγ受体，将所述修饰的核酸和编码所述抗体轻链的核酸***到表达载体中，将所述载体***到原核或真核宿主细胞中，所编码的蛋白得以表达并且从宿主细胞或上层清液回收。
本发明的另一个实施方案是用于产生按照本发明的不结合补体因子Clq和/或不结合人Fcγ受体的抗体的方法，特征在于，可从所述细胞系之一得到的抗体通过“种类转换”而进行修饰，即，改变或者突变优选地定义为IgG1v1(PVA-236；表示为E233P的GLPSS331；L234V；L235A；△G236；A327G；A330S；P331S)，IgG1v2(L234A；L235A)和IgG4v1(S228P；L235E)和IgG4x(S228P)的Fc片段(例如，从IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突变)。
在另一个优选实施方案中，这些抗体还包括选自由Fab、F(ab’)2和单链片段组成的组的抗体片段。
因此，“变体”抗-OX40L抗体在本文是指这样一种分子，其通过在亲本抗体序列中加入、删除和/或取代一个或多个氨基酸残基而在氨基酸序列中与“亲本”抗-OX40L抗体氨基酸序列不同。在优选实施方案中，所述变体包括在亲本抗体一个或多个恒定区或可变区，优选在恒定区的一个或多个氨基酸取代。例如，所述变体可以包括在亲本抗体的一个或多个可变区的至少一个，例如，从约1个到约10个，并且优选地从约2个到约5个取代。通常，所述变体具有这样的氨基酸序列，即，其与亲本抗体恒定和/或可变结构域序列有至少90％的氨基酸序列相同性，更优选的至少95％，和更优选地至少99％的相同性。
本发明包括修饰选自由SEQ ID NOs：21-38组成的组的亲本抗体重链CDR和/或选自由SEQ ID NOs：39-57组成的组的抗体轻链CDR的初始氨基酸序列的方法，其特征在于，提供编码所述初始氨基酸序列的核酸，修饰所述核酸，在这点上，重链CDR1中1个氨基酸被修饰，重链CDR2中1-2个氨基酸被修饰，重链CDR3中1-2个氨基酸被修饰，轻链CDR1中1-3个氨基酸被修饰，轻链CDR2中1-3个氨基酸被修饰，和/或轻链CDR3中1-3个氨基酸被修饰，在抗体结构中表达所述修饰的CDR氨基酸序列，测定所述抗体是否以小于10-8M的KD结合OX40L，并且如果所述抗体以小于10-8M的KD结合OX40L，选择所述修饰的CDR。优选地，这样的修饰是保守序列修饰。
关于序列的相同性或同源性在本文定义为在候选序列中与亲本抗体残基相同的氨基酸残基的百分比，如果必要，在对所述序列进行比对并且引入缺口后，获得最大的序列相同性百分数。抗体序列内的N-端、C-端、或内部的延长、删除或***都不应该解释为影响序列相同性或同源性。变体保持结合人OX40L的能力，并且优选地具有优于亲本抗体的那些特性的特性。例如，由于OX40L不仅在B细胞、树突细胞和巨噬细胞上瞬时表达，还在内皮细胞(Kotani，A.，等.，Immunol.Lett.84(2002)1-7)、呼吸道平滑肌细胞(＝ASM)(Burgess，J.K.，J.Allergy Clin.Immunol113(2004)683-689)和小胶质细胞(Weinberg，A.D.，等.，J.Immunol.162(1999)1818-1826)上瞬时表达，所以，所述变体可以在治疗类风湿性关节炎和哮喘过程中具有减小的副作用。针对OX40L的抗体与内皮细胞、ASM和小胶质细胞的结合可以导致细胞损伤，并且与内皮细胞的结合导致血管渗漏，与ASM细胞结合导致肺部毁坏，与小胶质细胞的结合导致小胶质的损伤。
在本文中，“亲本”抗体是由用于制备变体的氨基酸序列编码的一种抗体。优选地，所述亲本抗体具有人构架区域，并且如果存在，具有人抗体恒定区。例如，所述亲本抗体可以是人源化的或人抗体，优选为IgG1型。
另外，按照本发明的抗体包括具有“保守序列修饰”、核苷酸和氨基酸序列修饰的这样的抗体，所述修饰不影响或者改变按照本发明的抗体的上述提及的特征。修饰可以通过本领域已知的标准技术引入，诸如定点诱变和PCR-介导的诱变技术。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基取代的那些取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)的、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)的、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)的、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)的、β-支化侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)的和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，人抗-OX40L抗体的预计的非必需氨基酸残基可以优选地用来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基取代。
氨基酸取代可以通过基于Riechmann，L，等.，Nature332(1988)323-327和Queen，C.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)10029-10033描述的制作分子模型的诱变进行。
本发明还包括用于产生抗体的方法，其特征在于，对编码以小于10-8M的KD值结合OX40L的抗体的重链的第一核酸序列以这样的方式进行修饰，以致所修饰的抗体不与NK细胞上的补体因子Clq和/或人Fcγ受体结合，将所述修饰的第一核酸和编码所述抗体轻链的第二核酸***到表达载体中，将所述载体***到原核或真核宿主细胞中，在允许所述抗体合成的条件下培养所述宿主细胞并且从所述培养物中回收所述抗体。
本发明还包括用于产生按照本发明并且包括来源于人源的Fc片段的抗体的方法，所述方法包括下列步骤：a)用编码按照本发明的亲本人抗体轻链的第一核酸序列和编码所述亲本人抗体重链的第二DNA序列转化宿主细胞，其中Fc片段被修饰，使得所述Fc片段不结合补体因子Clq和/或Fc受体；b)表达所述第一和第二DNA序列，以致产生所述抗体重链和轻链；和c)从宿主细胞或宿主细胞培养物中回收所述抗体。
本发明还包括编码上文提及的抗体的核酸分子、包括这些核酸的相应的载体和用于这些载体的相应的宿主细胞。本发明包括用于制备所述抗体的方法，其包括在允许合成所述抗体的条件下培养相应的宿主细胞，并且从所述培养物回收所述抗体，例如，通过在原核或真核宿主细胞中表达编码重链的核酸和编码轻链的核酸，并且从所述细胞回收所述多肽来实现。
考虑了所述抗体的诊断和治疗应用。在一种诊断应用中，本发明提供确定OX40L蛋白存在的方法，其包括将怀疑含有OX40L的样品暴露于抗-OX40L抗体，并且确定抗体与样品的结合。OX40L蛋白可以通过其跨膜结构域***到表达OX40L的细胞的细胞膜内，或者可以作为通过如脱落(shedding)或蛋白水解释放的机制释放到体液中的可溶性胞外结构域而存在。对于这种应用，本发明提供一种试剂盒，其包括所述抗体和应用所述抗体检测OX40L蛋白的用法说明。
本发明的抗体有效用于预防和/或治疗哺乳动物中的、优选地怀疑患有或者遭受这样的疾病折磨的患者中的炎症疾病。这样的疾病包括过敏性反应，诸如哮喘。其它应用是自体免疫疾病包括类风湿性关节炎的治疗。
本发明还提供用于治疗遭受上文提及的炎症疾病，特别是哮喘和类风湿性关节炎的折磨的哺乳动物的方法。
优选地，本发明的抗体可以用于治疗患者中的严重顽固性哮喘，所述患者的症状没有充分受到吸入的糖皮质激素的控制。患者群体包括患有不充分控制的严重顽固性哮喘的成人和青少年(12岁或年龄更大的)。抗体将优选地通过皮下递送每月一次或两次。主要的终点(endpoint)将优选地在急性恶化中下降。其它终点包括峰值流量、日间哮喘症状、夜间醒来、生活质量、急诊室随访、没有哮喘的天数、β-2激动剂应用、类固醇减少或逐渐减弱以及对高-响应性的作用。
还优选将按照本发明的抗体用于单一治疗或者与甲氨喋呤或其它DMARDs(疾病修饰的抗-类风湿性药物，Disease ModifyingAnti-Rheumatic Drugs)组合来治疗患有中等到严重急性(active)类风湿性关节炎的成年人。它将作为每2或4周的皮下注射进行施用。它将在对一种或多种DMARDs无效的患者中进行慢性治疗。终点包括患有急性类风湿性关节炎的成年患者中的迹象和症状的减少以及结构损伤进展的抑制。无能力的预防、迹象和症状的改善通过ACR标准(ACR20>60％，ACR50>35％，ACR70>15％；指数来源于American College of Rheumatology；www.rheumatology.com)进行测定。
本发明的另一个实施方案是按照本发明的抗体用于制备治疗这些疾病的药物的应用。
本发明还涉及上文定义的抗体用于制备药物组合物的应用，并且包括药物组合物，其包含按照本发明的抗体，与药物有效量、任选地与用于配制药物目的的抗体的缓冲剂和/或佐剂。
本发明还提供药物组合物，其包含在药用载体中的这样的抗体。在一个实施方案中，所述药物组合物可以包含在一套产品或试剂盒中。
按照本发明的抗体优选地通过重组方法产生。这样的方法是本领域内公知的，并且包括在原核和真核细胞中的蛋白表达，随后分离抗体多肽，并且通常纯化到药学可用的纯度。对于蛋白表达，将编码轻链和重链或其片段的核酸通过标准方法***到表达载体中。表达在适宜的原核或真核宿主细胞如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、酵母、或大肠杆菌(E.coli)细胞中进行，并且将所述抗体从所述细胞回收(裂解后的上层清液或细胞)。
抗体的重组生产是本领域公知的，并且例如，在Makrides，S.C.，ProteinExpr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.，等.，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner，R.G.，等.，Arzneimittelforschung48(1998)870-880的综述论文中描述。
所述抗体可以存在于完整的细胞中、细胞裂解物中、或者以部分纯化或基本上纯化的形式存在。为了除去其它细胞成分或其它污染物，例如，其它细胞核酸或蛋白，通过标准技术，包括碱/SDS处理、柱层析和其它本领域公知的技术进行纯化。参见，Ausubel，F.，等.，ed.，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。
例如，在NS0细胞中的表达由Barnes，LM.，等.，Cytotechnology32(2000)109-123；和Barnes，LM.，等.，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述。例如，瞬时表达由Durocher，Y.，等.，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述。可变结构域的克隆由Orlandi，R.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)3833-3837；Carter，P.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289；和Norderhaug，L，等.，J.Immunol.Methods204(1997)77-87描述。优选的瞬时表达***(HEK293)由Schlaeger，E.-J.，和Christensen，K.，在Cytotechnology30(1999)71-83中和由Schlaeger，E.-J.，在J.Immunol.Methods194(1996)191-199中描述。
例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子、任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞应用启动子、增强子和多聚腺苷酸化信号。
当它处于与其它核酸序列的功能性关系中时，核酸是“可操作地连接的”。例如，如果它作为参与多肽分泌的前蛋白而表达，那么，将前序列或分泌性前导序列的DNA可操作地连接到多肽DNA上；如果它影响所述序列的转录，那么将启动子或增强子可操作地连接到编码序列上；或者如果它位于促进翻译的位置时，将核糖体结合位点可操作地连接到编码序列上。一般地，“可操作地连接”意指要连接的DNA序列是相邻的，并且，在分泌性前导序列的情形中，是相邻的并且在阅读框内。然而，增强子不必是相邻的。连接通过在便利的限制性位点的连接而实现。如果不存在这样的位点，那么，按照常规应用，使用合成的寡聚核苷酸衔接子或接头。
通过常规免疫球蛋白纯化方法，诸如，例如，蛋白质A-琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将单克隆抗体适当地从培养基中分离。应用常规方法，易于对编码单克隆抗体的DNA和RNA进行分离和测序。杂交瘤细胞可以作为这样的DNA和RNA的来源。一旦分离，可以将DNA***到表达载体中，然后将其转染不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞，诸如HEK293细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞，以在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。
人OX40L抗体的氨基酸序列变体(或突变体)通过将适宜的核苷酸改变引入抗体DNA中或通过核苷酸合成而制备。然而，这样的修饰可以只在非常有限的范围内如上文所述的那样进行。例如，所述修饰不改变上述提及的抗体特性，诸如IgG同种型和表位结合特性，但是可以提高重组生产的产量、蛋白稳定性或者促进纯化。
还可以将任何不参与保持抗-OX40L抗体的正确构象的半胱氨酸残基取代，通常用丝氨酸取代，以提高所述分子的氧化稳定性，并且防止异常交联。相反，可以向所述抗体中加入半胱氨酸键，以提高其稳定性(特别地当所述抗体是抗体片段诸如Fv片段时)。
可以通过本领域已知的各种方法制备编码抗-OX40L抗体的氨基酸变体的核酸分子。这些方法包括，但不限于，从天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情形中)或通过人源化-OX40L抗体更早制备的变体或非变体译本的寡聚核苷酸-介导的(或定点的)诱变、PCR诱变、和盒式诱变而制备。
本发明还关于免疫缀合物，其包括缀合到细胞毒性剂，诸如化疗剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素、或其片段)、放射活性同位素(即，放射性缀合物)上的按照本发明的抗体。抗体和细胞毒性剂的缀合物应用各种双功能蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、iminothiolane(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物；(诸如dimethyl adipimidate HCL)、活性酯(诸如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(诸如戊二醛)、双-叠氮基化合物(诸如双(对-叠氮基苯甲基)己二胺)、双-二氮鎓衍生物(诸如双-(对-二氮鎓苯甲基)-ethylenediatnine)、二异氰酸酯(诸如tolyene2，6-二异氰酸酯)和双-活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)而制备。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可以按照在Vitetta，E.S.，等.，Science238(1987)1098-1104)中所述的那样进行制备。碳-14-标记的1-异氰硫基苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是一种用于将放射性核苷酸偶联到抗体上的示例性螯合剂。参见WO94/11026。
所述抗体的另一种类型的共价修饰包括以在美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中提出的方式将抗体连接到各种非蛋白质聚合物中的一种上，例如，聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。
在另一方面，本发明提供从转基因非-人动物例如转基因小鼠分离的B细胞，所述转基因非-人动物表达人抗-OX40L抗体(例如，由选自产生按照本发明的抗体的杂交瘤细胞组成的组的细胞系产生的亲本抗体)。优选地，分离的B细胞从转基因非-人动物例如转基因小鼠而获得，所述转基因非-人动物已经用纯化的或重组形式的OX40L抗原和/或表达OX40L的细胞免疫。优选地，所述转基因非-人动物，例如转基因小鼠，具有包括人重链转基因和人轻链转基因的基因组，其编码完整的或部分的本发明的抗体。然后，使分离的B细胞无限增殖以提供人抗-OX40L抗体的来源(例如，杂交瘤)。因此，本发明还提供能够产生按照本发明的人单克隆抗体的杂交瘤。在一个实施方案中，所述杂交瘤包括从转基因非-人动物例如转基因小鼠获得的B细胞，所述转基因动物具有包括人重链转基因和人轻链转基因的基因组，其编码本发明的抗体的全部或部分，被融合到无限增殖的细胞上。
在一个具体的实施方案中，所述转基因非-人动物是转基因小鼠，其具有包括人重链转基因和人轻链转基因的基因组，所述基因组编码本发明的抗体的全部或部分。所述转基因非-人动物可以用OX40L抗原的纯化的或富集制剂和/或表达OX40L的细胞进行免疫。优选地，所述转基因非-人动物例如转基因小鼠能够产生针对OX40L的人单克隆抗体的同种型。
按照本发明的人单克隆抗体可以通过用OX40L抗原的纯化的或富集制剂和/或表达OX40L的细胞来免疫转基因非-人动物例如转基因小鼠而产生，所述转基因非-人动物具有包括人重链转基因和人轻链转基因的基因组，所述基因组编码本发明的抗体的全部或部分。然后得到所述动物的B细胞(例如脾B细胞)，并且与骨髓瘤细胞融合，以形成分泌针对OX40L的人单克隆抗体的无限增殖的杂交瘤细胞。
在一个优选实施方案中，针对OX40L的人单克隆抗体可以使用携带部分人免疫***而不是小鼠免疫***的转基因小鼠而产生。这些转基因小鼠，本文叫作＂HuMAb＂小鼠，含有编码未重排的人免疫球蛋白基因的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)(所述未重排的人免疫球蛋白基因包括重(μ和γ)和κ轻链(恒定区基因))，以及使内源μ和κ链基因座失活的目标突变(Lonberg，N.，等.，Nature368(1994)856-859)。因此，所述小鼠表现出减少的小鼠IgM或K的表达，并且响应免疫，所引入的人重和轻链转基因经历了种类转换和体细胞突变，以产生高亲和力的人IgG单克隆抗体(Lonberg，N.，等.，Nature368(1994)856-859；在Lonberg，N.，Handbook ofExperimental Pharmacology113(1994)49-101中综述；Lonberg，N.，和Huszar，D.，Intern.Rev.Immunol.25(1995)65-93；和Harding，F.，和Lonberg，N.，Ann.N.Acad.Sci.764(1995)536-546)。HuMAb小鼠的制备在Taylor，L，等.，Nucleic Acids Res.20(1992)6287-6295；Chen，J.，等.，Int.Immunol.5(1993)647-656；Tuaillon，N.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)3720-3724；Choi，T.K.，等.，Nat.Genet.4(1993)117-123；Chen，J.，等.，EMBO J.12(1993)821-830；Tuaillon，N.，等.，J.Immunol.152(1994)2912-2920；Lonberg，N.，等.，Nature368(1994)856-859；Lonberg，N.，Handbook of Experimental Pharmacology113(1994)49-101；Taylor，L，等.，Int.Immunol.6(1994)579-591；Lonberg，N.，和Huszar，D.，Intern.Rev.Immunol.25(1995)65-93；Harding，F.，和Lonberg，N.，Ann.N.Acad.Sci.764(1995)536-546；Fishwild，D.M.，等.，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中描述，所有这些的内容通过参考完全结合于此。还可以参见，美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；5,545,807；5,770,429；WO98/24884；WO94/25585；WO93/1227；WO92/22645；和WO92/03918。
为了充分地产生针对OX40L的人单克隆抗体，可以按照常规方法，如由Lonberg，N.，等.，Nature368(1994)856-859；Fishwild，D.M.，等.，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851和WO98/24884所描述的那样，将HuMAb小鼠用OX40抗原纯化的或富集的制剂和/或表达OX40L的细胞进行免疫。优选地，在第一次免疫时，小鼠应该是6-16周龄。例如，可以使用偶联到KLH上的或在PBS中的可溶OX40L抗原(例如，从表达OX40L的细胞纯化的)的纯化的或富集的制剂来腹膜内免疫HuMAb小鼠。这可以通过用分离的OX40L蛋白与表达OX40L的细胞如肿瘤细胞系交替免疫而组合，以促进免疫应答。使用各种抗原累积的经验表明，当初始用在完全弗氏佐剂中的抗原进行腹膜内(i.p.)免疫时，其后每隔一周用在不完全弗氏佐剂中的抗原i.p.免疫(例如，达到总共6次)，HuMAb转基因小鼠应答最好。免疫应答可以用从后眼眶采血获得的血浆样品而在免疫流程的过程中进行监测。血浆可以通过ELISA进行筛选，并且具有足够的抗-OX40L人免疫球蛋白滴度的小鼠可以用于使得相应的B细胞无限增殖。在处死和移除脾和***前3-4天，可以用抗原将小鼠静脉内增强。一些小鼠将对于每种抗原进行免疫。例如，总共HCo7和HCo12种系的12只HuMAb小鼠可以被免疫。
HCo7小鼠具有在其内源轻链(κ)基因中的JKD中断(如在Chen，J.，等.，EMBO J.12(1993)821-830中所述)、在其内源重链基因中的CMD中断(如在WO01/14424实施例1中所述)、KCo5人κ轻链转基因(如在Fishwild，D.M.，等.，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中所述)、和HCo7人重链转基因(如在美国专利号5,770,429中所述)。
HCo12小鼠具有在其内源轻链(κ)基因中的JKD中断(如在Chen，J.，等.，EMBO J.12(1993)821-830中所述)、在其内源重链基因中的CMD中断(如在WO01/14424实施例1中所述)、KCo5人κ轻链转基因(如在Fishwild，D.M.，等.，Nat.Biotechnol.14(1996)845-851中所述)、和Hco12人重链转基因(如在WO01/14424实施例2中所述)。可以将小鼠的淋巴细胞分离，并且基于标准流程使用PEG与小鼠骨髓瘤细胞融合，以产生杂交瘤细胞。然后，筛选得到的杂交瘤关于抗原-特异性抗体的产生。例如，用50％PEG，将来自于免疫小鼠的脾和***来源的淋巴细胞的单一细胞混悬液与1/6数目的SP2/0非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1581)融合。将细胞以大约2×105接种在平底微量滴定培养平板上，其中在选择培养基中培养约2周。
然后，对于人抗-OX40L单克隆IgM和IgG抗体，通过ELISA筛选单个孔。一旦广泛的杂交瘤生长发生，通常在10-14天后，分析培养基。将分泌抗体的杂交瘤细胞重新接种，再次筛选，并且如果仍然对于人IgG、抗-OX40L单克隆抗体是阳性的，那么可以通过限制性稀释亚克隆至少2次。然后，将稳定的亚克隆在体外培养，以在组织培养基中产生抗体用于表征。
检测树主要由关于IgG的非特异性检测(“IgG-ELISA”)、接着通过特异性ELISA检测和外观(apparent)FACS检测组成，用来确定与纯化的OX40L蛋白或OX40L-表达细胞结合的抗原。下一步骤包括功能性检测，其中确定了抗OX40L抗体与其天然相互作用伴侣，例如对于纯化的OX40L或者在细胞上表达的OX40L的可溶的、纯化的OX40，的竞争，例如，竞争性ELISA或FACS。下一步骤包括功能性检测，其中确定了抗-OX40L抗体阻滞OX40-信号传导的能力，例如，NFκB-活化(＝“NFκB-检测”)。下一步骤包括功能性检测，其中确定了抗-OX40L抗体关于T细胞活化的阻滞能力(“T-细胞活化检测”和“TT-检测”)。
由于CDR序列负责抗体-抗原的相互作用，所以，可能通过在来自于不同的人抗体的构架序列上构建表达载体而表达按照本发明的重组抗体，所述表达载体包括按照本发明的CDR序列(参见，例如，Riechmann，L，等.，Nature332(1998)323-327；Jones，P.，等.，Nature321(1986)522-525；和Queen，C.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)10029-10033)。这样的构架序列可以从包括种系人抗体基因序列的公共DNA数据库获得。由于这些种系序列不包括在B细胞成熟过程中通过V(D)J连接而形成的完全组装的可变基因，所以，这些种系序列不同于成熟的抗体基因序列。种系基因序列还在个体均一地贯穿可变区不同于高亲和力次级所有成分抗体的序列。
本发明还包括按照本发明的抗体用于在体外诊断OX40L的应用，优选地通过确定样品的OX40L(可溶的或膜-结合的)与按照本发明的抗体的结合的免疫学检测。
在另一方面，本发明提供一种组合物，例如，药物组合物，其包含一种或者本发明的人单克隆抗体或其抗原-结合部分的组合，与药用载体一起配制。更具体地，所述组合物是药物或诊断组合物，并且甚至更具体地，所述药物组合物包括上文定义的抗体和至少一种药用赋形剂。所述组合物必须是无菌的，并且在某种程度上是流体，以便于通过注射器递送所述组合物。
当用于本文时，“药用载体”包括任何和所有生理上相容的溶剂、分散基质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。优选地，所述载体适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或灌注)。优选地，这样的载体是水性pH缓冲溶液(例如，乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐或组氨酸)，优选地等渗，优选地另外含有无机盐、糖、多羟基化合物和/或表面活性剂。药用载体还是诸如在Remington’sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.Ed.(1980)中描述的那些。
抗体浓度优选地从0.1mg/ml到50mg/ml。优选地，1mM-200mM缓冲浓度的缓冲溶液的pH值在4.0-8.0范围。优选的盐是1mM-200mM范围的氯化钠和/或磷酸钠。优选的糖是在1％-15％(w/v)范围的蔗糖和/或海藻糖。优选的多羟基化合物是1％-15％(w/v)范围的丙三醇、丙二醇、液体聚乙二醇、和/或类似的。表面活性剂优选地是0.001％-0.5％(w/v)范围的聚山梨酸酯(例如聚山梨酸酯20或80)和/或poloxamere。优选的药物组合物含有0.1mg/ml-50mg/ml的抗体和1mM-200mM pH4.0-8.0磷酸缓冲的盐。
本发明的组合物可以通过本领域内已知的各种方法施用给需要其的患者。熟练的技术人员应该理解，施用的途径和/或方式将取决于需要的结果而不同。
药用赋形剂或载体包括无菌水性溶液或无菌粉剂，用于临时制备无菌注射溶液或分散液。药物活性物质的这样的介质和试剂的应用是本领域内已知的。
当用于本文时，短语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”意指除了肠和局部施用外的施用模式，通常通过注射的方式，并且包括但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管的、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外和胸骨内的注射和灌注。
在本发明的药物组合物中的活性成分的实际给药水平可以不同，以便获得一定量的活性成分，所述一定量的活性成分有效实现对于具体的患者、组合物和施用模式的理想的治疗反应，而对患者没有毒性。选择的给药水平将取决于许多药物动力学因素，包括所用的本发明的具体的组合物或其酯、盐或胺的活性，施用的途径，施用的时间，要用的具体化合物***速率，治疗的持续时间，与所用的具体组合物组合应用的其它药物、化合物和/或物质，要治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、综合健康状体和现有病历等医学领域内公知的因素。典型的每周给药剂量可以在约0.1mg/kg-约20mg/kg的范围或更多，这取决于上文提及的因素。
提供下述实例、参考文献、序列表和附图，以辅助对本发明的理解，它们的真正范围在附上的权利要求中列出。应该理解，可以以不背离本发明的精神对提出的方法进行改进。
附图简述
图1a：显示TAG-34，LC.001，LC.005，LC.010，LC.019，LC.029，LC.033的“结合ELISA”。
图1b：显示TAG-34，LC.001，LC.005，LC.010，LC.019，LC.029，LC.033的“阻滞ELISA”+IC50数据。
图2：显示TAG-34，LC.001，LC.005的“封闭FACS”。
图3：显示TAG-34，LC.001，LC.019和LC.024(不结合的抗体)的“NFkB-检测”。
图4和5：显示TAG-34，LC.001和LC.005的“T细胞活化检测”和IC50-值(图4：IL-2释放，图5：抑制)。
图6：显示TAG-34，LC.001和LC.033的“TT-检测”数据。
图7：显示本发明的抗体与小鼠OX40L的交叉反应性。A)对于在转染的和WT细胞上表达的hOX40L的控制，B)抗体与表达hOX40L的K562细胞的结合，C)对于在转染的和WT细胞上表达mOX40L的控制，D)抗体与表达hOX40L的K562细胞的结合，和E)抗体与WT K562细胞的结合(n＝3)。
图8：显示本发明的抗体结合Clq的能力(n＝3)。
图9：显示本发明的抗体激活C3c的能力(n＝3)。
图10：显示本发明的抗体结合FcγRI(n＝4)、FcγRIIa(n＝4)和FcγRIIb(n＝4)的能力。
图11：显示本发明的抗体结合NK细胞上FcγRIIIa(CD16)的能力(6个供体的平均值±SEM)。
图12：蛋白质印迹；泳道1，4，7：标记；泳道2，5，8：100ng OX40L；泳道3，6，9：40ng OX40L。
序列表描述
SEQ ID NO:1 κ轻链，LC.001的可变区
SEQ ID NO:2 LC.001的γ重链可变区
SEQ ID NO:3 κ轻链，LC.005的可变区
SEQ ID NO:4 LC.005的γ重链可变区
SEQ ID NO:5 κ轻链，LC.010的可变区
SEQ ID NO:6 LC.010的γ重链可变区
SEQ ID NO:7 K轻链，LC.029的可变区
SEQ ID NO:8 LC.029的γ重链可变区
SEQ ID NO:9 κ轻链，LC.019的可变区
SEQ ID NO:10 LC.019的γ重链可变区
SEQ ID NO:11 κ轻链，LC.033的可变区
SEQ ID NO:12 LC.033的γ重链可变区
SEQ ID NO:13 κ轻链恒定区
SEQ ID NO:14 γ1重链恒定区
SEQ ID NO:15 γ4重链恒定区
SEQ ID NO:16 κ轻链，LC.033的突变可变区
SEQ ID NO:1 κ轻链，LC.059的可变区
SEQ ID NO:17 LC.059的γ重链可变区
SEQ ID NO:18 K轻链，LC.060的可变区
SEQ ID NO:19 LC.060的γ重链可变区
SEQ ID NO:1 κ轻链，LC.063的可变区
SEQ ID NO:20 LC.063的γ重链可变区
SEQ ID NO:21-57 CDR序列
SEQ ID NO:58 LC.001的γ重链(人IgG1型)
SEQ ID NO:59 LC.001的γ重链(L234A，L235A人IgG1突变体)
SEQ ID NO:60 LC.001的γ重链(S228P人IgG4突变体)
SEQ ID NO:61 LC.001的κ轻链
SEQ ID NO:62 LC.005的γ重链(人IgG1型)
SEQ ID NO:63 LC.005的γ重链(L234A，L235A人IgG1突变体)
SEQ ID NO:64 LC.005的γ重链(S228P人IgG4突变体)
SEQ ID NO:65 LC.005的κ轻链
SEQ ID NO:66 LC.060的γ重链(人IgG1型)
SEQ ID NO:67 LC.060的γ重链(L234A，L235A人IgG1突变体)
SEQ ID NO:68 LC.060的γ重链(S228P人IgG4突变体)
SEQ ID NO:69 LC.060的κ轻链
缩略词：
氨基酸缩写为3个(Leu)或1个字母编码(L)。
S228P意指在IgG4重链位置228的丝氨酸与脯氨酸的置换。
L234意指按照EU编号方式(Kabat)在位置234的氨基酸亮氨酸。
L234A意指在位置234的氨基酸亮氨酸变成丙氨酸。
L235A意指在位置235的氨基酸亮氨酸变成丙氨酸。
PVA236意指在236区域，IgG1的ELLG或者IgG4的EFLG被修改成PVA。
GLPSS331意指在331区域，IgG1的ALPAP或IgG2的GLPAP变成GLPSS。
△G236意指位置236的氨基酸被删除。
IgG4x意指IgG4中突变S228P。
LC2010-001是LC.001的异名。
Fcg是Fcgamma(Fcγ)的异名。
抗体的其它序列修改类似地定义。
| 融合到组氨酸标记上的重组可溶的人OX40L | hOX40L-His |
| 融合到组氨酸标记上的重组可溶的小鼠OX40L | mOX40L-His |
| 融合到Flag标记上的重组可溶的人OX40L | hOX40L-Flag |
| 融合到Flag标记上的重组可溶的小鼠OX40L | mOX40L-Flag |
| 融合到人Fcγ上的重组可溶的人OX40 | hOX40-hFc |
| 兔抗-小鼠Fcγ单克隆抗体 | 抗-mFc |
| 山羊抗-人Fcγ单克隆抗体 | 抗-hFc |
| 小鼠抗-组氨酸单克隆抗体 | 抗-His |
| 融合到小鼠Fcγ上的重组可溶的人OX40 | hOX40-mFc |
| 小鼠抗-TNFα单克隆抗体 | 抗-TNFα |
| 小鼠抗-CD40L单克隆抗体 | 抗-CD40L |
| 肿瘤坏死因子α | TNFα |
| CD40配体 | CD40L |
| 兔抗-人OX40L单克隆抗体 | TAG34 |
| 人抗-人OX40L单克隆抗体 | LC.001，LC.005， |
| LC.010，LC.019，LC.029，LC.033，LC.059，LC.060，LC.063 | |
| 植物凝集素 | PHA |
实施例
实施例1
产生生产抗-OX40L抗体的杂交瘤细胞系
杂交瘤的培养
在IMDM(Cambrex)，胎克隆1牛血清(Perbio Science)，原始杂交瘤克隆因子(Igen)，丙酮酸钠，青霉素/链霉素，2-巯基乙醇，HAT(Sigma-Aldrich)和卡那霉素(Invitrogen)中，在37℃和5％CO2，培养HuMab杂交瘤细胞。
转基因小鼠的免疫流程
LC2010-001：将6只HCo7(2只雄性和4只雌性)，种系GG2201(Medarex，San José，CA，USA)，和4只HCo12(4只雄性)，种系GG2198(Medarex，San José，CA，USA)交互地用瞬时转染了人OX40L(hOX40L)表达载体的1×106个HEK293细胞和20μghOX40L可溶的胞外结构域进行免疫。总共进行8次免疫，4次用表达hOX40L的细胞进行腹膜内(i.p.)免疫，和4次在尾巴底部用重组蛋白进行皮下(s.c.)免疫。对于第一次免疫，将100μl1×106个HEK293-hOX40L细胞与100μl完全弗氏佐剂(CFA；Difco Laboratories，Detroit，USA)混合。对于所有其它的免疫，使用100μl在PBS中的细胞，或者将重组蛋白与100μl不完全弗氏佐剂(ICFA；Difco)混合。
当发现抗-hOX40L的血清滴度足够时，在融合前4和3天，将小鼠用在200μl PBS中的15μg hOX40L胞外结构域另外静脉内(i.v.)增强2次。
LC2010-001，LC.059，LC.060和LC.063来源于HCo12小鼠。
LC2010-005，-010，-019，-029和-033：将5只HCo7(4只雄性和1只雌性)，种系GG2201(Medarex，San José，CA，USA)用20μghOX40L可溶的胞外结构域免疫。总共在尾巴底部进行7次免疫，4次腹膜内(i.p.)和3次皮下(s.c.)免疫。对于第一次免疫，将100μl重组蛋白与100μl完全弗氏佐剂(CFA；Difco Laboratories，Detroit，USA)混合。对于所有其它的免疫，将100μl重组蛋白与100μl不完全弗氏佐剂(ICFA；Difco)混合.
当发现抗-hOX40L的血清滴度足够时，在融合前4和3天，将小鼠用在200μl PBS中的15μg hOX40L胞外结构域另外静脉内(i.v.)增强2次。
杂交瘤的产生
将小鼠处死，并且收集脾和在腹部大动脉和腔静脉侧面的***。按照标准操作方法，用融合伴侣SP2.0细胞进行脾细胞和***细胞的融合。
抗原特异性ELISA
通过抗原特异性ELISA确定免疫小鼠血清中的抗-OX40L滴度。将平板(96平底ELISA平板，Greiner)用溶解在PBS中的0.1μg/ml纯化的OX40L包被，并且在室温下包被过夜。此后，在室温下将孔用PBSTC(含有0.05％吐温20(Sigma-Aldrich Chemie BV)和2％鸡血清(Gibco)的PBS)封闭1小时。
将检测的血清样品(taps)在PBSTC中1:50稀释，并且添加到孔中。将从免疫前小鼠获得的血清1:100溶解在PBSTC中，并且用作阴性对照。将针对人OX40L的小鼠抗体1:50溶解在PBSTC中，并且用作阳性对照。将平板在室温温育1小时。随后，将平板用PBST(含有0.05％Tween20的PBS)洗涤2次。将Gt-α-huIgG-HRP(Jackson)1:5000稀释在PBSTC中，并且添加到含有测试样品和阴性对照的孔中。将Rb-α-mIgG(Jackson)1:3000稀释在PBSTC中，并且添加到含有阳性对照的孔中。将平板在室温下温育1小时。最后，将平板用PBST洗涤3次，并且用新鲜制备的
溶液(1mg/ml)(ABTS：2，2’-叠氮基双(3-乙苯基噻唑啉-6-磺酸))在室温下黑暗处反应30分钟。在405nm处测定吸收。
K-ELISA
为了确定由融合产生的杂交瘤细胞是否产生人抗体，进行了κ-ELISA。将ELISA平板用在PBS中1/10000稀释的大鼠抗-人IgG κ-轻链抗体(DAKO)包被，在4℃培养过夜。弃去细胞后，将平板通过在室温下与PBSTC(PBSC，补充了0.05％吐温-20(PBSTC))温育1小时进行封闭。此后，将孔用1/2稀释在PBSTC中的杂交瘤培养物上层清液温育。1/2稀释在PBSTC中的培养基用作阴性对照，1/100稀释在PBSTC中的K-轻链阳性小鼠血清用作阳性对照。随后，将孔洗涤3次，并且在37℃，用1/2000稀释在PBSTC中的HRP-缀合的大鼠抗-人IgG F(ab’)2(DAKO)温育1h。将孔洗涤3次，并且在室温下(RT)黑暗处用新鲜制备的
溶液(1mg/ml)进行检测30分钟。在ELISA平板读数仪上测定405nm的吸收。
实施例2
抗-OX40L HuMab可变结构域的克隆和测序
(K-轻链和γ1-重链)
通过标准cDNA合成/PCR方法，分离编码OX40L HuMabs的轻链可变区VL和重链可变区VH的核苷酸序列。
使用GeneRacerTM试剂盒(Invitrogen)，从1×106-1×107个杂交瘤细胞中制备总RNA。来源于杂交瘤的RNA用作第1链cDNA合成和GeneRacerTM Oligo-dT引物连接的模板。第2链cDNA合成和编码VL与VH的cDNA片段的进一步PCR扩增分别用反向轻链和重链引物和5’-特异的GeneRacerTM引物进行，所述反向轻链和重链引物与K-轻链和γ1-重链恒定区的核苷酸序列互补。使用来自InvitrogenTM Life Technologies的TOPOTM TA克隆试剂盒，和pCR4-TOPOTM作为克隆载体，而将PCR产物克隆。通过使用EcoRI消化将适当的质粒限制性绘图，以及分别约740和790bp的VL和VH的期望/计算的DNA片段大小，而确定克隆的PCR产物。
克隆的PCR片段的DNA序列通过双链测序进行确定。
GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)软件包版本10.2和载体-NTI8(InforMax，Inc)用于常规数据处理。使用GCG模CLUSTALW比对DNA和蛋白序列。使用程序GENEDOC(版本2.1)进行序列比对。
实施例3
构建抗-OX40L IgG1HuMab的表达质粒
将抗-OX40L HuMab轻链和重链的编码基因分别组装在哺乳动物细胞表达载体中。
因此，将编码抗-OX40L HuMab轻链可变区(VL)和人K-轻链恒定区(CL，SEQ ID NO:13，或来自SEQ ID NO：61，65或69)的基因片段连接起来，同样地将抗-OX40L HuMab重链可变区(VH)和人γ1-重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3，SEQ ID NO:14，或来自SEQ ID NO:58，62或66)的基因片段连接起来。
关于从中可以推断出密码子应用的人轻链和重链核苷酸序列的一般信息在Kabat，E.A.，等.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.，NIH Publication No.91-3242(1991)中给出。
抗-OX40L HuMab κ-轻链的转录单位由下列元件组成：
-人巨细胞病毒(HCMV)的直接早期增强子和启动子，
-包括Kozak序列的合成的5’-UT，
-包括信号序列内含子的小鼠免疫球蛋白重链信号序列，
-克隆的抗-OX40L HuMab可变轻链cDNA，其用5’端唯一的BsmI限制性位点，和剪接供***点，以及3’端唯一的NotI限制性位点而排列，
-基因组人κ-基因恒定区，其包括内含子2小鼠Ig-κ增强子[Picard，D.，和Schaffner，W.，Nature307(1984)80-82]和
-人免疫球蛋白κ-多聚腺苷酸化(“poly A”)信号序列。
抗-OX40L HuMabγ1-重链的转录单位由下列元件组成：
-人巨细胞病毒(HCMV)的直接早期增强子和启动子，
-包括Kozak序列的合成的5’-UT，
-修饰的小鼠免疫球蛋白重链信号序列，其包括信号序列内含子，
-克隆的抗-OX40L HuMab可变重链cDNA，其用5’端唯一的BsmI限制性位点，和剪接供***点，以及3’端唯一的NotI限制性位点而排列，
-基因组人γ1-重链基因恒定区，其包括小鼠Igμ-增强子(Neuberger，M.S.，EMBO J.2(1983)1373-1378)，
-人γ1-免疫球蛋白多聚腺苷酸化(“poly A”)信号序列。
抗-OX40L HuMab κ-轻链和γ1-重链表达质粒的功能性元件：除了抗-OX40L HuMab κ-轻链或γ1-重链表达盒之外，这些质粒还包含
-潮霉素抗性基因
-埃巴病毒(EBV)的复制起点，oriP
-载体pUC18的复制起点，其允许这一质粒在大肠杆菌中复制，和
-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
实施例4
构建抗-OX40L IgG4 HuMab的表达质粒
抗-OX40Lγ4-重链原型表达质粒衍生于抗-OX40Lγ1-重链表达质粒，其通过用人基因组γ4-恒定区(SEQ ID NO:15或来自SEQ ID NO:60，64或68的未突变的γ4-恒定区)和γ4-免疫球蛋白多聚腺苷化-信号序列取代人基因组γ1-恒定区和γ1-免疫球蛋白多聚腺苷化(“poly A”)信号序列。
对于抗-OX40L HuMab κ-轻链的表达，使用同用于IgG1所述相同的表达质粒(参见上文)。
实施例5
基于LC.001构建突变体(变体)抗-OX40L IgG1和IgG4的表达质粒
使用QuickChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene)，通过定点诱变野生型表达质粒而生成编码突变体抗-OX40L γ1-和γ4-重链的表达质粒。按照EU编号方式(Edelman，G.M.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA63(1969)78-85；Kabat，E.A.，等.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.，Public Health Service，NIH Publication No.91-3242，Bethesda，MD(1991))，对氨基酸进行编号。
表1
| 同种型 | 缩写 | 突变 | 描述 |
| IgG1 | IgG1v1 | PVA-236；由E233P表示的GLPSS331；L234V；L235A；△G236；A327G；A330S；P331S | 将人γ1-重链的氨基酸序列Glu233Leu234Leu235Gly236用人γ2-重链的氨基酸序列Pro233Val234Ala235取代。将人γ1-重链的氨基酸序列Ala327Leu328Pro329Ala330Pro331用人γ4-重链的氨基酸序列Gly327Leu328Pro329Ser330Ser331取代。 |
| IgG1 | IgG1v2 | L234A；L235A | 将人γ1-重链的氨基酸序列Leu234Leu235用氨基酸序列Ala234Ala235取代 |
| IgG4 | IgG4v1 | S228P；L235E | 将人γ4-重链的Ser228用Pro228取代，并且将人γ4-重链的Leu235用Glu235取代 |
| IgG4 | IgG4x | S228P | 将人γ4-重链的Ser228用Pro228取代 |
实施例6
重组抗OX40L HuMabs的生产
重组HuMabs通过贴壁HEK293-EBNA细胞(ATTC CRL-10852)的瞬时转染而产生，所述HEK293-EBNA细胞培养在补充了10％超低IgG FCS(Gibco)、2mM谷氨酰胺(Gibco)、1％v/v非必需氨基酸(Gibco)和250μg/mlG418(Roche)的DMEM(Gibco)中。对于转染，以3:1-6:1范围的试剂(μl)比DNA(μg)的比例使用FugeneTM 6(Roche)转染试剂。使用1:2-2:1摩尔比例的轻链比重链编码的质粒，将免疫球蛋白轻链和重链从两个不同的质粒上表达。在转染后第4-11天，收集含有HuMab的细胞培养物上层清液。在纯化前将上层清液保存在-20℃。
关于人抗体在例如HEK293中重组表达的一般信息在Meissner，P，等，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203.中给出。
实施例7
抗体TAG34，LC.001，LC.005，LC.010，LC.019，LC.029，LC.033的亲和力分析
仪器：Biacore3000，运行和反应缓冲液：HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％吐温20，ph7.4)，25℃。分析物的注射在0.78nM和100nM之间的7个浓度进行3分钟，并且用HBS-P洗涤5分钟。表面(羧甲基化的葡聚糖表面，CM)的再生通过每次10mM甘氨酸pH2.0持续1min的2次注射而进行。芯片、检测形式和注射的顺序以及动力学数据与下表中的描述相对应。动力学数据通过将动力学数据与1:1Langmuir结合模型相适配而计算。
表2
| 芯片 | 捕获 | 配体 | 分析物 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) |
| CM5 | 抗-mFcg | TAG34 | hOX40L-His | 8.84×104 | 3.32×10-5 | 3.75×10-10 |
| CM5 | 抗-hFcg | LC.001 | hOX40L-His | 9.01×104 | 7.16×10-9 | <1.1×10-11 |
| CM5 | 抗-hFcg | LC.005 | hOX40L-His | 6.84×104 | 2，02×10-7 | <1.5×10-11 |
| CM5 | 抗-hFcg | LC.010 | hOX40L-His | 6.25×104 | 2.5×10-5 | 3.99×10-10 |
| CM5 | 抗-hFcg | LC.019 | hOX40L-His | 7.89×104 | 7.53×10-8 | <1.2×10-11 |
| CM5 | 抗-hFcg | LC.029 | hOX40L-His | 1，41×105 | 2，4×10-8 | <7，1×10-12 |
| CM5 | 抗-hFcg | LC.033 | hOX40L-His | 7.01×104 | 2.09×10-7 | <1.4×10-11 |
在TAG34和mOX40L之间没有相互作用可以被测定。
对于所有Biacore检测的数据评估和数据保存
从样品曲线中减去阴性对照数据(例如，缓冲液曲线)，以校正***固有的基线漂移和减少噪声信号。BiaEvaluation版本4.01用于sensorgrams分析和亲和力数据计算。
实施例8
抑制hOX40L与固定的hOX40相互作用的抗-hOX40L抗体的抑制竞争检测
仪器：Biacore3000，运行和反应缓冲液：HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％吐温20，ph7.4)，25℃。注射前，将分析物(10nM)和竞争剂(在0.78nM和100nM之间的8个浓度)在22℃预先温育至少20min。分析物+/-竞争剂的注射进行3分钟，并且用HBS-P洗涤3分钟。表面的再生通过每次10mM甘氨酸pH2.0持续1min的2次注射而进行。芯片、检测形式和注射的顺序以及动力学数据与下表3中的描述相对应。
表3
| 芯片 | 配体 | 分析物 | 竞争剂 | IC50(M) |
| CM5 | OX40-hFc | hOX40L-His | TAG34 | 7×10-9 |
| CM5 | OX40-hFc | hOX40L-His | LC.001 | 4×10-9 |
| CM5 | OX40-hFc | hOX40L-His | LC.005 | 3×10-9 |
所有的抗体抑制溶液中OX40L与OX40的结合(溶液亲和力)。LC.001和LC.005表现出比TAG34更低的IC50-值。
实施例9
抗-OX40L抗体TAG34，LC.001，LC.005，LC.010，LC.019，LC.029，LC.033，LC.060的表位特性描述
仪器：Biacore3000，运行和反应缓冲液：HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％吐温20，ph7.4)，25℃。通过列出的抗体之间的交叉竞争而确定表位组。注射前，将分析物(50nM)和竞争剂(100nM)在22℃预先温育至少20min。分析物+/-竞争剂的注射进行2分钟，并且用HBS-P洗涤3分钟。表面的再生通过每次10mM甘氨酸pH2.0持续1min的2次注射而进行。芯片、检测形式和注射的顺序以及动力学数据与下表4中的描述相对应。
表4
| 芯片 | 捕获 | 配体 | 分析物 | 竞争剂 | 表位 |
| CM5 | 抗-hFcg | 抗-OX40L(A，B，C) | hOX40L-His | TAG34 | A |
| CM5 | 抗-hFcg | 抗-OX40L(A，B，C) | hOX40L-His | LC.001 | A |
| CM5 | 抗-hFcg | 抗-OX40L(A，B，C) | hOX40L-His | LC.005 | B |
| CM5 | 抗-hFcg | 抗-OX40L(A，B，C) | hOX40L-His | LC.010 | B |
| CM5 | 抗-hFcg | 抗-OX40L(A，B，C) | hOX40L-His | LC.019 | A/B |
| CM5 | 抗-hFcg | 抗-OX40L(A，B，C) | hOX40L-His | LC.029 | B |
| CM5 | 抗-hFCg | 抗-OX40L(A，B，C) | hOX40L-His | LC.033 | A |
| CM5 | 抗-hFCg | 抗-OX40L(A，B，C) | hOX40L-His | LC.060 | A |
TAG34识别的OX40L表位定义为表位A。然而，TAG34不结合抗体浓度为100ng的变性的OX40L(在蛋白质印迹检测中)。在一个表位组(A或B)内的抗体表现出交叉抑制活性，而不同组的抗体表现出附加的结合信号。LC.019中和来自组A以及组B的其它抗体。
实施例10
TAG34，LC.001和LC.005与CD40L和TNFα的结合特异性
仪器：Biacore3000，运行和反应缓冲液：HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％吐温20，ph7.4)，25℃。分析物的注射在100nM和500nM进行3分钟，并且用HBS-P洗涤2分钟。表面的再生通过每次100mMHCl持续1min的2次注射而进行。芯片、检测形式和注射的顺序以及动力学数据与下表5中的描述相对应。
表5
| 芯片 | 捕获 | 配体 | 分析物 |
| CM5 | 抗-mFcg抗-hFcg | TAG34LC.001LC.005抗-TNFα抗-CD40L | TNFαCD40LOX40L |
在这种检测中，CD40L表现出对所有抗体或对芯片表面的某种非特异性结合，但是在减去背景信号后，这一检测表明，不存在TNFα和CD40L(达到500nM)与固定的抗体TAG34，LC.001和LC.005的非特异性结合。
实施例11
抗体LC.001-IgG1和LC.001-IgG4x的亲和力分析
仪器：Biacore3000，运行和反应缓冲液：HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％吐温20，ph7.4)，25℃。分析物的注射在0.78nM-100nM的8个浓度进行3分钟，并且用HBS-P洗涤5分钟。表面的再生通过每次100mM HCl持续1min的2次注射而进行。芯片、检测形式和注射的顺序以及动力学数据与下表中的描述相对应。动力学数据通过将动力学数据与1:1Langmuir结合模型相适配而计算。
表6
| 芯片 | 捕获 | 配体 | 分析物 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) |
| CM5 | 抗-mFcg | LC.001 | hOX40L-His | 4.27x104 | 3.46x10-8 | <2，3x10-11 |
| CM5 | 抗-mFcg | LC.001-IgG4x | hOX40L-His | 4.85x104 | 7.72x10-8 | <2，06x10-11 |
LC.001和LC.001-IgG4x表现出对hOX40L-His相同的亲和力。
实施例12
检测与OX40L结合的抗体的ELISA检测
将SA-包被的平板(96平底ELISA平板，Microcoat)用溶解在温育缓冲液(IB＝含有0.1％吐温20(Serva)和1％封闭蛋白的PBS)中的0.5μg/ml生物素化的OX40L在室温下包被1小时。然后，将平板用洗涤缓冲液(WB＝含有0.1％吐温20的盐水)洗涤2次。
将样品(细胞培养物上层清液或纯化的抗体)在IB中连续稀释，并且添加到孔中。将平板在室温下温育1小时。随后，将平板用WB洗涤2次。随后，将针对人IgG的山羊抗体与POD(Dianova)的缀合物在IB中稀释到50ng/ml，并且添加到孔中。平板在室温下温育1小时。最后，将平板用WB洗涤2次，并且在室温(RT)下黑暗处用现成可用的
溶液反应。在最高浓度的吸收达到足够的OD时，在405nm测量吸收(图1a)。获得3nM-8nM范围内的EC50值。
实施例13
检测抑制人OX40/人OX40L相互作用的抗体的ELISA检测
将SA-包被的平板(96平底ELISA平板，Microcoat，德国)用溶解在IB中的0.5μg/ml生物素化的OX40L在室温下包被1小时。然后，将平板用WB(PBS缓冲液，0.1％(w/v)吐温TM20)洗涤2次。
将样品在IB中稀释到1μg/ml浓度，并且以连续稀释添加到孔中。为了获得OX40与OX40L的最大结合，在某些孔中只加入IB。然后，向每个孔中，加入浓度为0.2μg/ml的与洋地黄毒苷(Roche Diagnostics GmbH，DE)缀合的人OX40溶液。将平板在室温下温育1小时。随后，将平板用WB洗涤2次。将绵羊<洋地黄毒苷>-POD(Roche)在IB中稀释到50mU/ml，并且添加到孔中。平板在室温下温育1小时。最后，将平板用WB洗涤2次，并且在室温(RT)下黑暗处用现成可用的
溶液反应。10-20分钟后，在405nm测量吸收(图1b)。获得1nM-4nM范围内的IC50值。
实施例14
检测抑制人OX40与在K562细胞(K562_OX40L细胞)上表达的人OX40L相互作用的HuMabs的FACS-检测
目的：用于确定HuMab hOX40L阻滞Dig-标记的hOX40:hFc融合蛋白与表达hOX40L的细胞系K562_hOX40L相互作用的特性的检测。
方法：所述检测用Dig标记的hOX40:hFc作为“检测剂”和HuMabhOX40L作为“竞争剂”而进行。
检测剂：储液0.5μg/μl-1:10稀释在PBS中，100μl抗-洋地黄毒苷-FLUOS。1:25稀释在PBS/0.5％BSA/1％封闭试剂(Roche DiagnosticsGmbH，DE)中。
将2x105K562_OX40L细胞(在ISF-0中生长)在2ml PBS中洗涤，并且重悬在100μl PBS中。这之后加入在PBS中的竞争剂(竞争剂/试剂关系0:1/1:1/1.5:1/2:1/2.5:2/5:1)。这之后是30Min温育时间，RT和白天光照。然后，加入试剂(在PBS中)；温育时间：30Min，RT和白天光照。将细胞在2ml PBS中洗涤，并且通过离心沉淀。加入用于染色的二级抗体(抗-洋地黄毒苷-荧光素，Fab-片段(Roche，1207741))，并且温育30Min，4℃在黑暗处。将细胞在2ml PBS中洗涤，并且通过离心沉淀。之后将细胞重悬在0.5ml PBS中。样品的测定在FACS-Scan中进行(图2)。
实施例15
确定抗体对hOX40/hOX40L信号传导的抑制能力的功能性检测(，，NFκB-检测“)
将Hela野生型(wt)和表达人OX40的HeLa细胞(HeLa_OX40)生长在极限必需培养基(MEM)，1×丙酮酸钠，1×非必需氨基酸(Gibco)，10％FCS中，并且在重组细胞的情形中，+600μg/ml G418。K562和表达OX40L的K562生长在ISF-O培养基中，并且在重组细胞的情形中，加入200μg/mlG418。
将HeLa_wt或HeLa_OX40细胞以3x104个细胞/100μl的细胞密度接种在96-孔平板中，w/o G418，并且在CO2-培养箱中培养过夜。以1:1的细胞-比-细胞关系加入K562_wt或K562_OX40L细胞。将***-固定的或没有***-固定的表达OX40L的K562细胞(在-70℃冻存)解冻，并且在MEM/10％FCS中1：10稀释；将K562_OX40L细胞与针对OX40L的抗体在RT下预温育30min。K562_OX40L细胞的刺激时间在30-150min之间。按照Active Motif NE-试剂盒的供应者用法说明，进行从细胞核提取蛋白。Active Motif的TransAM NFκB-ELISA(检测按照供应者的用法说明进行)用来确定OX40-信号传导，其导致NFκB活化。所述检测在Tecan MTP-读数仪中在波长450/620nm吸收处进行(图3)。得到在0.6-5nM范围内的对于所有LC抗体的IC50值。
实施例16
T-细胞活化检测
检测原理：
将人外周血单核细胞(PBL)用低于最佳浓度的T-细胞促***原植物凝集素(PHA)激活，并且用过量表达OX40L的K562细胞共同刺激。在检测条件下，在37℃培养24hr的活化的T-细胞产生IL-2。应用ELISA检测，测定在上层清液中的细胞因子。为了确定Mab的阻滞作用，在与PBL共同培养之前，将K562_OX40L细胞用抗体的适当稀释液预先温育1小时。
方法：
通过在1077(Sigma)中的密度梯度离心，将人外周血单核细胞(PBL)从肝素化的全血中分离。用Hanks洗涤后，使用Turk’s溶液计数细胞，并且将细胞以106/ml的浓度重悬在补充了青霉素、链霉素和谷氨酰胺(Gibco10378-016)以及10％FBS的RPMI1640(Gibco)中。K562对照细胞(野生型)保持在补充了上述物质的相同的RPMI培养基中。将转染了OX40L的K562细胞保持在补充了终浓度为50mg/ml的遗传霉素(G418，Gibco)的相同的培养基中。将K562细胞(WT或OX40L+)用相同的培养基稀释为1.5×105个细胞/ml，并且以50μl/孔(0.75×104/孔)分装到96孔组织培养平板的每个孔中。将适当的Mab稀释液以20μl/孔的体积添加到孔中，并且在37℃温育1hr。每一份稀释液在一式两份的孔内检测。PBL以100μl/孔(105个细胞/孔)的体积加入。PBL比K562细胞的最终比例是～13：1。以20μl/孔(终浓度0.75μg/ml)加入PHA(10×)(Sigma L-9132)。用RPMI/10％FCS使每个孔的总体积达到200μl。将平板在37℃5％CO2-湿润的培养箱中温育24hrs。将平板离心后，收集上层清液，并且按照制造者说明书，通过ELISA(BD，San Diego，CA，CatNo2627KI)检测IL-2(图4)。为了计算IC50(阻滞OX40L-刺激的PBL的IL-2释放的50％的Mab浓度)，将在对照培养物(PBL+PHA+K562WT)中产生的背景IL-2浓度从由K562xOX40L+细胞刺激的PBL产生的总IL-2中减去(图5)。IC50TAG34：0.07μM；LC.001：2nM；LC.005：10nM。IC50值在2-10nM范围。
实施例17
破伤风检测(‘TT-检测’)检测抗体对由破伤风毒素刺激的外周血淋巴细胞的抑制作用
通过Ficoll Hypaque将外周血单核细胞(PBMC)从肝素化的血液中分离。在大多数情形中，将新鲜分离的PBMC用于这一检测。在一些情形中，也使用冷藏的PBMC。用于这—检测的培养基是含有10％人男性AB血清(Sigma-Aldrich)；2mM谷氨酰胺和Pen/Strep(抗生素青霉素和链霉素的现成可用的混合物(Roche Diagnostics GmbH DE)；以20ml重建的冷冻干燥物；每1000ml培养基用2ml)的RPMI。
为了附着到塑料上，将每孔300.000PBMC在96孔平底平板上预培养过夜。
第二天，将破伤风毒素(TT)(Chiron Behring)加入到孔中，终浓度2-5μg/ml。阳性对照孔(最大增殖/刺激)只含有TT，抗体(如纯化的IgG)加入所有其它的孔中，终浓度10μg/ml。小鼠Mab TAG-34包含在检测中(终浓度10μg/ml)。使用单独的非刺激性背景对照培养基。所有的检测进行一式三份。
继续培养(37℃，5％CO2，95％湿度)6天后，加入3H-胸苷，终浓度为1μCurie/ml，并且在额外的16h培养期间后，收集平板并且在β-计数器中确定结合的3H-胸苷(图6)。
实施例18
OX40L抗体与小鼠OX40L的交叉反应性
为了确定本发明的抗体与小鼠OX40L的交叉反应能力，将连续稀释的抗体和对照抗体与稳定表达mOX40L的K562-mOX40L细胞一起温育。还评估了与K562WT细胞和稳定表达hOX40L的K562-hOX40L细胞的结合。针对匙孔血蓝蛋白(α-KLH)的HuMab抗体用作阴性对照。包含抗体RM134L，大鼠抗-mOX40L(eBioscience，San Diego，CA)作为mOX40L表达的阳性对照。包含抗体TAG-34，小鼠抗-mOX40L(MBL，Nagoya，Japan)作为hOX40L表达的阳性对照。为了检测结合的人抗体，使用荧光素(FITC)-缀合的山羊抗-人IgG抗体。为了检测结合的RM134L，将生物素化的兔抗-大鼠IgG抗体(DAKO，Glostrup，Denmark)与用藻红蛋白(PE)(DAKO)缀合的链霉抗生物素蛋白组合应用。为了检测结合的TAG-34，使用FITC-缀合的兔抗-小鼠IgG抗体。使用Graphpad Prism软件用非线性回归(具有可变斜率的S型剂量-反应)确定关于在20μg/ml检测的HuMabs的EC50值或最大结合(Bmax)的计算。
结果：
按照本发明的LC.001能够结合hOX40L，这由5.16±2.93μg/ml的EC50值和385.22的Bmax(MFI)值表明，但不结合mOX40L或WT细胞，这分别由11.41和9.67的Bmax(MFI)值表明。此外，按照本发明的LC.001(IgG4)也能够有效地结合hOX40L，这由8.19±1.05μg/ml的EC50值和311.30的Bmax(MFI)值表明，但是不结合mOX40L或WT细胞，这分别由13.47和9.58的Bmax(MFI)值表明。如预计的那样，阴性对照α-KLH不与任何细胞结合(图7)。因此，与人OX40L相比，按照本发明的OX40L抗体表现出至少30倍更低的与小鼠OX40L的结合。
实施例19
OX40L HuMabs激活补体***的潜力
Clq和C3c结合ELISA
为了确定本发明的抗体诱导Clq结合和C3活化的能力，将ELISA平板用连续稀释的抗体和对照抗体包被。非常弱地结合Clq的人IgG4(The Binding Site，Birmingham，England)用作阴性对照。包含人IgG1(TheBinding Site)和α-KLH(IgG1)作为阳性对照。随后，将包被的抗体与重组的Clq或作为C3来源的收集的人血清一起温育。为了检测结合的Clq，应用与缀合了辣根过氧化物酶(HRP)(DAKO)的猪抗-兔IgG抗体组合的针对Clq的兔抗体(DAKO)。为了检测活化的C3c(通过C3活化产生)，应用与缀合了HRP(Jackson Immuno Research Laboratories，West Grove，PA)的兔抗-小鼠IgG抗体组合的小鼠抗-人C3c抗体(DAKO)。为了评估包被效率的不同，将包被的抗体用与HRP缀合的山羊抗-人IgG抗体显现。使用Graphpad Prism软件用非线性回归(具有可变斜率的S型剂量-反应)确定关于在10μg/ml检测的HuMabs的EC50值或最大结合(Bmax)的计算。
结果：
按照本发明的LC.001能够有效地结合Clq，这由2.19±0.42μg/ml的EC50值和3.089的Bmax(OD405)值表明。此外，阳性对照人IgG1和抗-KLH都能够有效地结合Clq，这由分别为4.17±1.08μg/ml和2.57±1.51μg/ml的EC50值以及分别为2.685和3.306的Bmax(OD405)值表明。如预计的那样，阴性对照人IgG4不结合Clq，这由0.353的OD405Bmax值表明。并且，按照本发明的LC.001IgG4x失去了结合C1q的能力，这由0.357的OD405Bmax值表明。
在排列与Clq结合的能力时，C3c通过LC.001的沉积以依赖于抗体浓度的方式发生，具有2.67±0.16μg/ml的EC50值和2.614的Bmax(OD405)值。此外，阳性对照人IgG1和抗-KLH都能有效地沉积C3c，这由分别为为5.45±0.36μg/ml和2.16±0.26μg/ml的EC50值以及分别为2.543和2.633的Bmax(OD405)值表明。如预计的那样，阴性对照人IgG4不沉积C3c，这由0.095的OD405Bmax值表明。并且，按照本发明的LC.001IgG4x失去了沉积C3c的能力，这由0.090的OD405Bmax值表明(图8和9)。
实施例20
OX40L HuMabs结合Fcγ受体I、IIa和IIb的潜力
IgG-诱导的依赖于抗体的细胞的细胞毒性(ADCC)受到效应细胞上的Fcγ受体(FcγR)的调控。为了确定本发明的抗体结合FcγRs的能力，将稳定地转染了人FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb的IIA1.6细胞(来源于IIA1细胞的限制性稀释；Jones，B.，等.，J.Immunol.136(1986)348-356)和野生型细胞用连续稀释的抗体和对照抗体温育。不结合FcγRI的人IgG2(The BindingSite Ltd.，UK)和不结合FcγRII的人IgG4(The Binding Site)用作阴性对照。包括用于FcγRI结合的人IgG1(The Binding Site)和用于FcγRII结合的人IgG3(The Binding Site)作为阳性对照。应用与藻红蛋白(PE)缀合的针对人IgG的抗体，通过FACS检测结合的抗体。使用Graphpad Prism软件用非线性回归曲线适配(可变斜率)确定关于在10μg/ml检测的HuMabs的EC50值或最大结合(Bmax)的计算。
LC.001能够有效地结合FcγRI(与对照IgG1抗体相当)，这由0.11±0.03μg/ml的EC50值和8041.54的Bmax(MFI)值表明，但是不结合FcγRIIa和FcγRIIb，这由分别为25，06和21，18的Bmax(MFI)值表明。
与LC.001相比，LC.001IgG4x较不有效地结合FcγRI，并且与对照IgG4抗体相当，具有0.86±0.12μg/ml的EC50值和6030.07的Bmax(MFI)值。没有观察到LC.001IgG4x与FcγRIIa和FcγRIIb的结合(Bmax(MFI)值分别为21.40和19.27)，而对照IgG3抗体能够与之结合(Bmax(MFI)值分别为536.65和418.59)(图10)。因此，与抗体LC.001的EC50值相比较，对于LC.001IgG4x结合FcγRI的EC50值是8倍。
实施例21
OX40L HuMabs与NK细胞上的FcγRIIIa结合的潜力
为了确定本发明的抗体与天然杀伤(NK)细胞上的FcγRIIIa(CD16)结合的能力，将外周血单核细胞(PBMCs)分离，并且，在存在或不存在20μg/ml针对FcγRIIIa的封闭小鼠抗体(抗-CD16，克隆3G8，RDI，Flanders，NJ)时，与20μg/ml HuMab抗体和对照抗体一起温育，以证实通过FcγRIIIa的结合。应用不与FcγRIIIa结合的人IgG2和IgG4(The Binding Site)作为阴性对照。包含人IgG1和IgG3(The Binding Site)作为对于FcγRIIIa结合的阳性对照。应用与FITC-标记的山羊F(ab)2抗-人IgG(Fc)抗体(Protosimmunoresearch，Burlingame，CA)组合的PE-标记的小鼠抗-人CD56(NK-细胞表面标记)抗体(BD Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)，通过FACS分析而检测在NK细胞上结合的抗体。确定了20μg/ml检测的HuMab的最大结合(Bmax)。
LC.001能够有效地结合FcγRIIIa(与对照IgG1抗体相当)，这由641.37的Bmax(MFI)值表明。加入针对FcγRIIIa的封闭抗体消除了LC.001与NK细胞的结合(与145.38的背景染色相比，Bmax(MFI)值为194.61)。LC.001IgG4x不结合FcγRIIIa，并且表现相当于对照IgG4抗体，具有170.52的Bmax(MFI)值，这导致大约仅为LC.001Bmax的10％的LC.001IgG4x的Bmax。加入针对FcγRIIIa的封闭抗体对LC.001IgG4x结合没有影响(Bmax(MFI)值174.26)(图11)。
实施例22
hMab_hOX40L和Mab TAG-34与HUVEC(初级人脐静脉内皮细胞/幼细胞)结合的作用
描述内皮细胞表达hOX40L(Kotani，A.，等.，Immunol.Lett.84(2002)1-7)。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)天然表达hOX40L，并且因此可以用作“内皮细胞模型”。这一检测的目的是确定在与抗体TAG-34和LC.001结合后HUVEC细胞上的hOX40L的命运。
将HUVEC解冻，并且在T175-烧瓶(Sarstedt)中在ECG-M培养基+2％FCS中扩展4天。将细胞接种在24孔平板中(10.000个细胞/孔)。
3天后，将培养基换成ECG-M+0.5％FCS。加入10μg/ml的抗体(<KLH>(针对匙孔血蓝蛋白的抗体)，TAG-34或LC.001，用于诱导下调)，并且温育2，5h或24h。用TAG-34或LC.001将HUVEC细胞重新染色。用每种为10μg/ml的Alexa488标记的针对小鼠IgG(＝<m>)或者Alexa488标记的针对人IgG(＝<h>)的二级抗体进行FACS-染色。FACS-测定在FACS-扫描仪(Becton Dickinson)中进行，并且计算平均荧光密度(MFI)。
<KLH>抗体用作非特异性的阴性对照。
表7表明，加入LC.001在2，5或24h后都没有导致OX40L在HUVEC细胞上表达的下调(将第4行与第5和6行比较)。然而，加入TAG34在2，5h后和在24h后都表现出对在HUVEC细胞上hOX40L的强(约3倍)下调(将第10行与第11和12行比较)。
浓度为10μg/ml的按照本发明的抗体没能诱导OX40L在HUVEC细胞上表达的下调。
表7
实施例23
TAG34，LC.001和LC.005的蛋白质印迹分析
制备40和100ng hOx40L-His(R&D***，具有28-34kDa的理论大小)和分子量标记Magik Mark XP(Invitrogen；20，30，40，50，60，80,100，120,220kDa)用于凝胶-电泳。因此，将xμl蛋白质，2.5μl NuPage LDS(十二烷基硫酸锂盐)样品缓冲液(4×)，1μl NuPage还原剂(10×)，和H2O加10μl混合在一起，并且在70℃变性10min。此后，将样品上样到NuPage凝胶上(Novex；10％Bis-Tris)，并且在150V1×MOPS电泳缓冲液(Novex)中电泳1h。
在半干室中，使用1x NuPage转移缓冲液(1×缓冲液，0.1％抗氧化剂，10％甲醇)持续1h/50mA，将所述凝胶通过半干印迹(Semi-Dry-Blot)印迹到PVDF膜上(Millipore；通过在甲醇中温育5min并且在1×转移缓冲液中温育10min而将膜活化)。在RT下摇动1h，将膜在1x PBS/5％牛奶/0，5％吐温中封闭。将一级抗体(pAB)在1x PBS/1％牛奶/0.5％吐温中稀释，加入并且在4℃温育过夜。
LC.001：1.9μl(1.6μg)，在4ml的总体积中
LC.005：1.1μl(1.6μg)/4ml
TAG34：1.6μl(1.6μg)/4ml
将膜在1×PBS/0.5％吐温中洗涤3×。将二级抗体(sAB)在1×PBS/1％牛奶/0.5％吐温中稀释，加入并且在RT温育1.5h。对于LC.001和LC.005，将1:10000稀释的针对人IgG的多克隆抗体(Pierce)用作sAB；对于TAG34，将1:400稀释的来自Lumi-Light蛋白质印迹试剂盒(Roche)的针对小鼠IgG的多克隆抗体用作sAB。将膜用1x PBS/0.5％吐温洗涤2×持续30min。按照制造者的用法说明使用Lumi-Light蛋白质印迹试剂盒(Roche)用于检测。蛋白质印迹的结果在图12中显示。LC.001能够检测(十二烷基硫酸)变性的OX40L，而LC.005和TAG34不能结合变性的OX40L。
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<151>2004-09-17
<150>EP 04030546
<151>2004-12-23
<160>69
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>light chain，variable region of LC.001，LC.059 and LC.063
<400>1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>2
<211>120
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>重链，LC.001的可变区
<400>2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Leu Val Ala Pro Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>3
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>轻链，LC.005的可变区
<400>3
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210>4
<211>120
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>重链，LC.005的可变区
<400>4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Trp Tyr Asp Gly His Asp Lys Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Ser Ser Trp Tyr Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>5
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>轻链，LC.010的可变区
<400>5
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210>6
<211>120
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>重链，LC.010的可变区
<400>6
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Trp Tyr Asp Gly His Asp Lys Tyr Tyr Ala Tyr Tyr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Ser Ser Trp Tyr Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>7
<211>58
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>轻链，LC.029的可变区
<400>7
Met Leu His Pro Leu Cys Lys Val Gly Ser His Gln Gly Ser Val Ala
1 5 10 15
Val Asp Leu Gly Gln Ile Ser Leu Ser Pro Ser Ala Ala Cys Ser Leu
20 25 30
Lys Ile Leu Gln Leu Ile Thr Val Asn Ser Ile Ile Val Ser Leu Thr
35 40 45
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
50 55
<210>8
<211>120
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>重链，LC.029的可变区
<400>8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala Ile Trp Tyr Asp Gly His Asp Lys Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Ser Ser Trp Tyr Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>9
<211>57
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>轻链，LC.019的可变区
<400>9
Met Pro Pro Val Trp Lys Val Gly Ser His Gln Gly Ser Ala Ala Val
1 5 10 15
Asp Leu Gly Gln Ile Ser Leu Ser Pro Ser Ala Ala Cys Ser Leu Lys
20 25 30
Ile Leu Gln Leu Ile Thr Val Asn Ser Leu Ile Val Thr Leu Thr Phe
35 40 45
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
50 55
<210>10
<211>116
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>重链，LC.019的可变区
<400>10
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Asn Trp Ser Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210>11
<211>106
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>轻链，LC.033的可变区(a)
<400>11
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Val Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Pro Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Asp Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Gln Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105
<210>12
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>重链，LC.033的可变区
<400>12
Gln Lys Gln Leu Val Glu Phe Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Met Gly Ile Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>13
<211>107
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>轻链，恒定区
<400>13
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210>14
<211>330
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>重链，恒定区(γ1)
<400>14
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210>15
<211>327
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>重链，恒定区(γ4)
<400>15
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210>16
<211>104
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>轻链，LC.033的可变区(b)
<400>16
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Thr Phe
85 90 95
Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100
<210>17
<211>120
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>重链，LC.059的可变区
<400>17
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Asp Ile Pro Ala Ala Gly Thr Phe Asp Pro Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>18
<211>106
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>轻链，LC.060的可变区
<400>18
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Val Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>19
<211>119
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>重链，LC.060的可变区
<400>19
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Leu Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Arg Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ile Leu Val Thr Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>20
<211>120
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>重链，LC.063的可变区
<400>20
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Asp Ile Pro Ala Ala Gly Thr Phe Asp Pro Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>21
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>21
Ser Tyr Thr Met His
1 5
<210>22
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>22
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210>23
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>23
Asn Phe Gly Met His
1 5
<210>24
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>24
Asn Tyr Gly Met His
1 5
<210>25
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>25
Ser Tyr Ala Met Asn
1 5
<210>26
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>26
Ile Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>27
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>27
Ala Ile Trp Tyr Asp Gly His Asp Lys Tyr Tyr Ser Tyr Tyr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>28
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>28
Ala Ile Trp Tyr Asp Gly His Asp Lys Tyr Tyr Ala Tyr Tyr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>29
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>29
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>30
<211>17
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>30
Val Ile Trp Asn Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210>31
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>31
Ile Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly Arg
<210>32
<211>18
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>32
Leu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Leu Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly Arg
<210>33
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>33
Asp Ser Ser Ser Trp Tyr Arg Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210>34
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>34
Asp Arg Leu Val Ala Pro Gly Thr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210>35
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>35
Lys Asn Trp Ser Phe Asp Phe
1 5
<210>36
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>36
Asp Arg Met Gly Ile Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210>37
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>37
Lys Asp Asp Ile Pro Ala Ala Gly Thr Phe Asp Pro
1 5 10
<210>38
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>38
Lys Asp Ile Leu Val Thr Gly Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210>39
<211>11
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>39
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210>40
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>40
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210>41
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>41
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210>46
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>46
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210>47
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>47
Met Pro Pro Val Trp Lys Val
1 5
<210>48
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>48
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210>49
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>49
Leu His Pro Leu Cys Lys Val
1 5
<210>50
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>50
Asp Val Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210>51
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>51
Asn Ser Leu Ile Val Thr Leu Thr
1 5
<210>52
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>52
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210>53
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>53
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Phe Thr
1 5
<210>54
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>54
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Gln Tyr Thr
1 5
<210>55
<211>7
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>55
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Thr
1 5
<210>56
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>56
Asn Ser Ile Ile Val Ser Leu Thr
1 5
<210>57
<211>9
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>CDR/抗体片段
<400>57
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Trp Thr Phe
1 5
<210>58
<211>450
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>LC.001的重链(人IgG1型)
<400>58
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Leu Val Ala Pro Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210>59
<211>450
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>LC.001的重链(L234A，L235A人IgG1突变体)
<400>59
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ile Ile Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Thr Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Leu Val Ala Pro Gly Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
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Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Val Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
Claims (13)
1.一种结合人OX40L的抗体，其特征在于所述抗体含有氨基酸序列SEQID NO：1的轻链可变(VL)CDRs和SEQ ID NO：2的重链可变(VH)CDRs。
2.按照权利要求1的抗体，其特征在于包括由氨基酸序列SEQ ID NO：1定义的轻链可变结构域和由SEQ ID NO：2定义的重链可变结构域。
3.按照权利要求1-2任一项的抗体，其特征在于所述抗体包括由SEQ IDNO：13定义的κ轻链恒定区或者SEQ ID NO：61的轻链恒定区。
4.按照权利要求1-3任一项的抗体，其特征在于所述抗体包括由SEQ IDNO：14或者SEQ ID NO：58，59或60定义的重链恒定区。
5.按照权利要求1-4任一项的抗体，其特征在于其κ轻链恒定区由SEQ IDNO：61定义，其重链恒定区由SEQ ID NO：58，59或60定义。
6.按照权利要求1的抗体，其特征在于其由细胞系hu-Mab＜hOX40L＞LC.001产生。
7.按照权利要求1-5任一项所述的抗体，其特征在于所述抗体是Fab或F(ab’)2。
8.一种编码权利要求1-7中任一项的抗体分子的核酸分子。
9.一种包括权利要求8的核酸分子的载体。
10.一种包括权利要求9的载体的宿主细胞。
11.一种用于制备权利要求1-7中任一项的抗体分子的方法，其包括将权利要求10的宿主细胞在允许所述抗体分子合成的条件下培养，并且从所述培养物回收所述抗体分子。
12.一种药物组合物，其包括权利要求1-7中任一项的抗体和至少一种药用赋形剂。
13.权利要求1-7中任一项定义的抗体用于制备预防和治疗炎症疾病的药物的应用。
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