CN102156088A - 粒子分析仪及粒子拍摄方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种粒子分析仪，包括：形成含粒子的试样流的流动室；第一光源和第二光源；使得所述第一和第二光源发出的光照射所述试样流的照射光学***；检测由所述第一光源发出的光照射所述试样流中粒子所产生的前向散射光并输出信号的检测部件；配置在所述流动室和所述检测部件之间的遮光器件；根据所述检测部件输出的信号获取粒子特征参数的控制器；及在所第二光源发出的光的照射下拍摄所述试样流中粒子图像的摄像部件；其中，配置所述遮光器件时使其能够遮挡从所述流动室射出的所述第一光源的直接光，并至少能够遮挡从所述流动室射出的所述第二光源的直接光的一部分。同时，本发明还公开一种粒子拍摄方法。

Description

粒子分析仪及粒子拍摄方法
技术领域：
本发明涉及一种粒子分析仪，该分析仪用光照射流经流动室的含粒子的测定试样，利用该测定试样中的粒子发出的光对该粒子进行分析。本发明还涉及粒子拍摄方法。
背景技术：
US6,133,995中公开了一种粒子测定装置，其包括：用于形成含被鞘液包裹的粒子的试样流的鞘流室、用光照射试样流的连续光源和脉冲光源、检测在连续光源照射下粒子产生的前向散射光和荧光的检测部件、在脉冲光源照明下拍摄粒子图像的摄像机，该粒子测定装置根据检测部件检测的前向散射光和荧光信号获取粒子的特征参数。
在此粒子测定装置中，连续光源发出的光和脉冲光源发出的光相互垂直交叉地照射鞘流室。而且，在此粒子测定装置中，连续光源发出的光在鞘流室的上游照射粒子，脉冲光源发出的光在鞘流室的下游照射粒子。
在上述粒子测定装置中，如果被拍摄的粒子是细胞等透光粒子，则图像的对比度会很低。
发明内容：
因此，本发明如下。
(1)一种粒子分析仪，包括：形成含粒子的试样流的流动室；第一光源和第二光源；让使得所述第一和第二光源发出的光照射所述试样流的照射光学***；检测在由所述第一光源发出的光照射下所述试样流中粒子所发出产生的前向散射光并输出信号的检测部件；配置在所述流动室和所述检测部件之间的遮光器件；根据所述检测部件输出的信号获取粒子特征参数的控制器；及在所第二光源发出的光的照射下拍摄所述试样流中粒子图像的摄像部件；其中，配置所述遮光器件时使其可以能够遮挡从所述流动室射出的所述第一光源的直接光，并至少能够部分遮挡从所述流动室射出的所述第二光源的直接光的一部分。
(2)(1)所述粒子分析仪，其中，配置所述遮光器件时使其遮挡住从所述流动室射出的所述第二光源的全部直接光。
(3)(1)所述粒子分析仪，还包括：使所述第一光源发出的光入射到所述照射光学***的第一光学***；及使所述第二光源发出的光入射到所述照射光学***的第二光学***。
(4)(3)所述粒子分析仪，其中，所述第一光学***使所述第一光源发出的光以平行光从与试样流垂直及平行的方向入射到照射光学***；所述第二光学***使所述第二光源发出的光以平行光从与所述试样流垂直的方向、以会聚光从与所述试样流平行的方向入射到所述照射光学***。
(5)(3)所述粒子分析仪，其中，所述照射光学***将所述第一光学***的光分别从与所述试样流垂直的方向和与所述试样流平行的方向聚光到所述遮光器件配置位置和所述试样流，将所述第二光学***的光分别从与所述试样流垂直和平行的方向聚光到所述遮光器件配置的位置。
(6)(3)所述粒子分析仪，其中，所述第二光学***和所述照射光学***分别至少包含有一个柱面透镜。
(7)(3)所述粒子分析仪，其中，所述遮光器件具有向与所述试样流平行方向延伸的遮光部件，以及在所述遮光部件两侧的开口。
(8)(1)所述粒子分析仪，还包括：检测所述试样流中粒子产生的侧向散射光的第二检测部件及检测所述试样流中粒子产生的侧向荧光的第三检测部件；其中，所述控制器根据所述第一、第二和第三检测部件输出的信号，获取粒子的特征参数。
(9)(1)所述粒子分析仪，其中，所述控制器从粒子获得一定的特征参数后，控制所述第二光源对粒子进行照明。
(10)(1)所述粒子分析仪，还包括：存储部件，其中所述控制器将粒子的特征参数和粒子的图像对应地存入所述存储部件。
(11)(1)所述粒子分析仪，还包括：显示器，其中所述控制器控制所述显示器显示粒子特征参数和粒子的图像中的至少其中之一。
(12)(1)所述粒子分析仪，其中试样中的粒子为细胞。
(13)(1)所述粒子分析仪，其中粒子是从宫颈部采集的细胞。
(14)一种粒子拍摄方法，包括：在流动室中形成含有粒子的试样流；通过照射光学***使第一光源和第二光源发出的光照射到所述试样流；在用遮光器件遮挡从流动室射出的所述第一光源直接光的状态下，至少检测出由所述第一光源射出的光的照射所述试样流中的粒子所产生的前向散射光；根据检测出的所述前向散射光获取粒子的特征参数；及当有一定特征参数的粒子通过所述流动室时，在用所述遮光器件至少遮挡从所述流动室射出的所述第二光源直接光的一部分的状态下，借助所述第二光源发出的光拍摄所述试样流中的粒子。
(15)(14)所述粒子拍摄方法，还包括：显示所拍摄的粒子图像。
(16)(14)所述粒子拍摄方法，还包括：形成所述试样流之前，对粒子进行荧光染色。
(17)(14)所述粒子拍摄方法，其中粒子是从宫颈部位采集的细胞。
根据(1)和(14)所述内容，用于检测粒子的前向散射光的第一光源和用于拍摄粒子图像的第二光源的光通过一个照射光学***照射到试样流。而且，根据上述结构，照射光学***照射到试样流的第一光源的直接光被遮光器件遮挡，直接光无法进入检测部件。因此，至少可以获得基于前向散射光的粒子的特征参数。另外，照射光学***照射到试样流的第二光源的直接光的至少一部分被遮光器件遮挡。由于是在直接光被隔断的状态下(暗视野照明)拍摄粒子图像，比在不遮挡直接光的状态下(明视野照明)拍摄的图像的背景更为黑暗，即使是透光粒子也能拍摄出对比度高的图像。因此，采用上述结构，即使是透光粒子也能获得对比度高的图像，至少能获得基于前向散射光的粒子特征参数。同时，采用上述结构，获取粒子特征参数的***和拍摄粒子图像的***可以共用几乎全部光学***，可以使光学***小型化。
根据(2)所述内容，可以在完全暗视野中拍摄粒子，从而可以获得对比度更高的图像。
附图说明
图1为本发明一实施方式涉及的细胞分析仪的斜视图；
图2为本发明一实施方式涉及的细胞分析仪的结构框图；
图3为构成本发明一实施方式涉及的***控制器的电脑的框图；
图4为本发明一实施方式涉及的光学检测部件的结构平面图；
图5为本发明一实施方式涉及的光学检测部件的结构侧面图；
图6为本发明一实施方式涉及的第一光源相关的光学***的侧面图；
图7为本发明一实施方式涉及的第一光源相关的光学***的平面图；
图8为本发明一实施方式涉及的第二光源相关的光学***的侧面图；
图9为本发明一实施方式涉及的第二光源相关的光学***的平面图；
图10为本发明一实施方式涉及的摄像部件及检测部件相关的光学***的平面图；
图11为本发明一实施方式涉及的遮光板的结构图；
图12为本发明一实施方式涉及的***控制器的CPU处理过程的流程图；
图13为本发明一实施方式涉及的***控制器的CPU进行细胞分析处理的流程图；
图14为本发明一实施方式涉及的显示器的界面结构一例的略图；
图15A为本发明第一实施方式涉及的光学***的结构平面图；
图15B为本发明第一实施方式涉及的光学***的结构侧面图；
图15C为本发明第二实施方式涉及的光学***的结构平面图；
图15D为本发明第二实施方式涉及的光学***的结构侧面图；
图16为拍摄的细胞图像；
图17为拍摄的细胞图像；
图18为拍摄的细胞图像。
具体实施方式
下面参照附图，就本发明一实施方式涉及的粒子分析仪进行说明。本发明范围不限于以下所示粒子分析仪。
上述粒子分析仪是让含采自患者的细胞的测定试样流过流动室，激光照射流经此流动室的测定试样，检测、分析来自测定试样的光(前向散射光、侧向荧光等)，以此判断上述细胞中是否含有癌细胞和异型细胞(以下也称“异常细胞”)。具体而言，是将其用于用宫颈部位的上皮细胞筛查***。
[细胞分析仪的整体结构]
图1为细胞分析仪10的斜视图。细胞分析仪10包括进行试样测定等的仪器本机12、连接到此仪器本机12上、用于分析测定结果等的***控制器13。
图2为细胞分析仪10的结构框图。如图2所示，细胞分析仪10的仪器本机12包括用于从测定试样检测细胞及其细胞核的大小等信息，拍摄细胞图像的光学检测部件3、信号处理电路4、图像处理电路5、测定控制器16、电机、执行器和阀等的驱动设备17以及各种传感器18。信号处理电路4包括用前置放大器(无图示)放大光学检测部件3的输出信号，并对放大的输出信号进行放大处理和滤波处理等的模拟信号处理电路、将模拟信号处理电路输出的信号转换为数字信号的A/D转换器以及对数字信号进行一定波形处理的数字信号处理电路。
测定控制器16在处理传感器18的信号的同时，控制驱动设备17的动作，以此进行测定试样的吸移和测定。当筛查***时，可以使用对采自患者(受检者)宫颈的细胞(上皮细胞)进行离心(浓缩)、稀释、搅拌和碘化丙啶(PI)染色等众所周知的处理所制备的试样作为测定试样。将所制测定试样放入试管，并放置在仪器本机12的吸移管(无图示)下面，由该吸移管将其吸移后与鞘液一起供给流动室，在流动室形成试样流。上述PI染色用含有色素的荧光染色液碘化丙啶(PI)进行。PI染色是有选择地对细胞核染色，因此可以检测出来自细胞核的荧光。
[测定控制器的结构]
测定控制器16包括微处理器20、存储部件21、I/O控制器22、传感器信号处理部件23、控制驱动设备的驱动器24和外部通信控制器25等。存储部件21由ROM、RAM等构成，ROM中装有控制驱动设备17的控制程序和执行控制程序所需的数据。微处理器20可将控制程序下载到RAM或直接从ROM执行此控制程序。
传感器18的信号通过传感器信号处理部件23和I/O控制器22传送到微处理器20。微处理器20通过执行控制程序，可以根据传感器18的信号通过I/O控制器22和控制驱动设备的驱动器24控制驱动设备17。
微处理器20将其处理过的数据和处理所需的数据通过外部通信控制器25与***控制器13等外部设备之间进行传输。
[***控制器的结构]
图3为***控制器13的框图。***控制器13由个人电脑等组成，主要由主机27、显示器28和输入设备29构成。主机27主要由CPU27a、ROM27b、RAM27c、硬盘27d、读取装置27e、输入输出接口27f、图像输出接口27g构成。以上这些均通过总线27h连接，可互相通信。
CPU27a可执行存储在ROM27b的计算机程序和下载到RAM27c中的计算机程序。ROM27b由掩膜ROM、PROM、EPROM、EEPROM等构成，存储有CPU27a执行的计算机程序及其所用数据等。RAM27c由SRAM或DRAM等构成。RAM27c用于读取存储在ROM27b和硬盘27d的计算机程序，还可以作为CPU27a执行这些计算机程序时的工作空间。
硬盘27d装有操作***和应用程序等供CPU27a执行的各种计算机程序以及执行这些计算机程序所需的数据。比如硬盘27d装有美国微软公司制售的windows(注册商标)等提供图形用户界面的操作***。硬盘27d还装有辨别凝集粒子和非凝集粒子的计算机程序及用于执行这些计算机程序的数据。
硬盘27d还装有操作程序，该程序负责传送细胞分析仪10向测定控制器16下达的测定订单(动作命令)，接受并处理仪器本机12测定的测定结果，显示处理的分析结果等。此操作程序在上述操作***上执行。
读取装置27e由软驱、CD-ROM驱动器或DVD-ROM驱动器等构成，可读取存储于移动型存储介质的计算机程序或数据。输入输出接口27f由比如USB、IEEE1394、RS-232C等串行接口、SCSI、IDE、IEEE1284等并行接口以及由D/A转换器和A/D转换器等组成的模拟接口构成。输入输出接口27f连接由键盘和鼠标构成的输入设备29，用户可以用输入设备29直接向电脑输入数据。输入输出接口27f与仪器本机12连接，可以与仪器本机12传输数据等。
图像输出接口27g与由LCD或CRT等构成的显示器28连接，将与从CPU27a接收的图像数据相应的映象信号输出到显示器28。显示器28按照输入的映像信号显示图像(画面)。
在此，在信号处理电路4进行滤波处理和A/D转换处理等信号处理后所获得的前向散射光数据(FSC)、侧向散射光数据(SSC)和侧向荧光数据(SFL)以及用这些数据求出的后述特征参数由微处理器20通过外部通信控制器25输送到上述***控制器13，并存入硬盘27d。***控制器13根据前向散射光数据(FSC)、侧向散射光数据(SSC)、侧向荧光数据(SFL)及特征参数分析细胞及其细胞核。当粒子的特征参数在一定值范围内时，后述第二光源67发光，后述CCD照相机70拍摄粒子图像。还根据特征参数绘制并显示散点图和直方图。
[光学检测部件和摄像部件的结构]
图4为光学检测部件3的结构的俯视图(从y方向看到的图)。图5为光学检测部件3的结构的侧视图(从x方向看到的图)。如图4和图5所示，此光学检测部件3包括由半导体激光器组成的第一光源51，从此第一光源51向y方向射出的激光经过第一透镜***52被分色镜53反射，经照射镜***54聚光于流经流动室55的测定试样。在此，测定试样向与图4纸面垂直的方向(y方向)流动。在第一光源51发出的激光的照射下测定试样中细胞发出前向散射光，该前向散射光通过透镜57a、分色镜58、滤光板59及针孔板60，被光电二极管(检测器)61检测出。第一透镜***52由包括准直镜在内的透镜群构成。第二透镜***69由包括柱面透镜在内的透镜群构成。配置遮光板56是为了遮挡第一光源51发出的直接光。
细胞产生的侧向散射光通过配置在流动室55侧面(x方向)的透镜57b被分色镜62反射，经滤光板63入射光电倍增管64。由此，细胞产生的侧向散射光被光电倍增管64检出。细胞产生的侧向荧光经配置在流动室55侧面(x方向)的透镜57b穿过分色镜62，经滤光板65入射光电倍增管66。由此，细胞产生的侧向荧光被光电倍增管66检出。
光电二极管61、光电倍增管64、66将检测出的光转换为电信号，然后分别输出前向散射光信号(FSC)、侧向散射光信号(SSC)和侧向荧光信号(SFL)。这些信号由无图示的前置放大器放大后，输送到上述信号处理电路4(参照图2)。
也可以用气体激光器代替上述半导体激光器作为第一光源51，但从低成本、小型化且低耗电的观点来看，以采用半导体激光器为宜，采用半导体激光器不仅可以降低产品成本，还可以实现仪器的小型化和省电。在本实施方式中使用的是有利于将光束变窄的、波长较短的蓝色半导体激光器。蓝色半导体激光器对PI等的荧光励起波长也有效。
光学检测部件3还具有由半导体激光器构成、射出脉冲激光的第二光源(脉冲激光器)67和CCD照相机70，第二光源67发出的激光经过光纤束68、第二透镜***69、分色镜53及照明透镜***54入射到流动室55，再通过透镜57a被分色镜58反射到照相机70，在照相机70成像。第二光源67向z方向发出的直接光被遮光板56遮挡。第二光源67如后所述，在照相机70拍摄根据从前向散射光数据(FSC)、侧向散射光数据(SSC)和侧向荧光数据(SFL)求出的特征参数所辨别出的异常细胞时的一瞬间发光。
在此，虽然也可以用气体激光器代替上述半导体激光器，但从低成本、小型化且低耗电的观点来看，以采用半导体激光器为宜，采用半导体激光器不仅可以降低产品成本，还可以实现仪器的小型化和省电。在本实施方式中使用红色半导体激光器作为第二光源67。
在此，当第一光源51射出的光和第二光源67射出的光为同一波长的激光时，需要进行一些控制，比如仅在拍摄细胞图像时阻止第一光源51射出连续光。为此，第二光源67射出的光的波长最好与第一光源51射出的光的波长不同。第二光源67射出的光的波长最好也不同于试样流中粒子产生的荧光的波长。
如图2所示，照相机70拍摄的异常细胞图像由图像处理电路5和微处理器20通过外部通信控制器25输送到***控制器13。异常细胞图像在***控制器13中与根据前向散射光数据(FSC)、侧向散射光数据(SSC)和侧向荧光数据(SFL)求出的特征参数相对应地存入硬盘27d(存储部件)。
[光学***的说明]
下面就第一光源相关的光学***A进行详细说明。图6为第一光源51相关的光学***A的侧面图(从x方向看到的图)，图7是第一光源51相关的光学***A的平面图(从y方向看到的图)。如图6和图7所示，与第一光源51相关的光学***A包括第一透镜***52和照明透镜***54，其中第一透镜***52包括窗口(window)52a和双凸单透镜(准直镜)52b，照明透镜***54包括双R柱面透镜54a、双R球面透镜54b及双R球面柱透镜54c。
如图6所示，第一光源51射出的激光从侧面(x方向)看，第一光源51射出并扩散的激光被双R柱面透镜54a和双R球面透镜54b聚光于流经流动室55的试样流。
另一方面，如图7所示，从上面(y方向)看第一光源51射出的激光时，第一光源51射出并扩散的脉冲激光被窗口52a校直，入射到双凸单透镜52b变为平行光，经分色镜53反射，被双R柱面透镜54a、双R球面透镜54b和双R球面柱透镜54c聚光于流动室55后面的遮光板56。
下面，就第二光源67相关的光学***B进行详细说明。图8为第二光源67相关的光学***B的侧视图(从x方向看的图)，图9为第二光源67相关的光学***B的平面图(从y方向看的图)。如图8、图9所示，与第二光源67相关的光学***B包括第二透镜***69和照明透镜***54，其中第二透镜***69包括双凸单透镜69a和平凸柱面透镜69b，照明透镜***54包括双R柱面透镜54a、双R球面透镜54b及双R球面柱透镜54c。
如图8所示，从侧面(x方向)看光纤束68射出的脉冲激光时，从光纤束68射出并扩散的脉冲激光在双凸单透镜69a被变成平行光，在平凸柱面透镜69b被聚焦于测定试样流动方向F，然后扩散，通过双R柱面透镜54a后，被双R球面透镜54b和双R球面柱透镜54c聚光于流动室55后面的遮光板56。
另一方面，如图9所示，从上面(y方向)看光纤束68射出的脉冲激光时，从光纤束68射出并扩散的脉冲激光入射到双凸单透镜(准直透镜)69a变为平行光，穿过平凸柱面透镜69b，被双R柱面透镜54a、双R球面透镜54b和双R球面柱透镜54c聚光于流动室55后面的遮光板56。
下面就光电二极管61和照相机70相关的光学***C进行说明。图10为光电二极管61和照相机70相关的光学***C的俯视图(从y方向看到的图)。首先，在第一光源51的射出光的照射下，试样流中的细胞产生的前向散射光被透镜57a聚光，透过分色镜58和滤光板59，通过针孔板60入射到光电二极管61。据此光电二极管61检测到细胞产生的前向散射光信号。
第二光源67射出的光照射试样流中的细胞所产生的散射光被透镜57a聚光，由分色镜58反射，聚光(成像)于照相机70。在此，第一光源51和第二光源67射出的直接光如上所述被遮光板56遮挡。因此，照相机70可以在第二光源67的直接光被阻断的状态(暗视野照明)中拍摄细胞图像。此时，获得的图像背景是黑色，细胞为白色。
图11为遮光板56的结构图。如图11所示，遮光板56其中央部有一圆形开口562，圆形开口562中央设有遮光部件561。遮光部件561向与试样流向平行的方向(y方向)延伸，纵向遮断圆形开口562，在与试样流垂直的方向(x方向)有一个很窄的宽度。因此，第一光源52和第二光源67射出的直接光被遮光部件561遮挡。而试样流中的粒子产生的散射光通过遮光板56的圆形开口562入射到透镜57a。可用进行了涂黑加工的金属板等很容易地制作这种遮光板。
[特征参数的内容]
(用于区分待分析细胞的特征参数)
在测定试样中，除待分析细胞外，还会有粘液、血液残渣、细胞碎片等碎片和白细胞等(以下也称这些为“碎片等”)。如果测定试样中含有大量碎片等，这些碎片等产生的荧光就会作为干扰被检测出来，导致测定精度下降。为此，本实施方式由信号处理电路4从光电二极管61输出的前向散射光信号获取前向散射光信号波形的脉冲宽度(FSCW)和前向散射光信号波形的峰值(FSCP)作为反映含待分析细胞的粒子大小的数个特征参数。
前向散射光信号波形的峰值(FSCP)表示检测出的前向散射光的最大强度。前向散射光信号波形的脉冲宽度(FSCW)表示强度大于基线的前向散射光的信号波形宽度。***控制器13通过外部通信控制器25从仪器本机12接收包括前向散射光信号波形的脉冲宽度(FSCW)和前向散射光信号波形的峰值(FSCP)在内的前向散射光数据。***控制器13还用前向散射光信号波形的脉冲宽度(FSCW)和前向散射光信号波形的峰值(FSCP)绘制散点图，根据该散点图区分待分析细胞和待分析细胞以外的粒子(碎片等)。
由于碎片等比待分析细胞小，所以反映粒子大小的前向散射光信号波形的峰值(FSCP)和前向散射光信号波形的脉冲宽度(FSCW)均小于待分析细胞。因此，通过将FSCP和FSCW的值在一定范围内的细胞作为以后的分析目标，可以提高异常细胞的辨别精度。
(用于区分非凝集细胞和凝集细胞的特征参数)
在本实施方式中，由光电倍增管66检测出来自流经流动室55的测定试样的荧光，信号处理电路4从光电倍增管66输出的荧光信号获取反映信号波形高度的值-荧光信号波形峰值(PEAK)作为数个特征参数，同时获取反映信号波形脊线(Ridge Line)长度的值-信号波形的差分积分值(DIV)。荧光信号波形的峰值(PEAK)表示检测出的荧光的最大强度，荧光信号波形的差分积分值(DIV)表示强度大于基准值的荧光信号波形的长度。
***控制器13通过外部通信控制器25接收包括荧光信号波形的差分积分值(DIV)和荧光信号波形峰值(PEAK)在内的侧向荧光数据，将荧光信号波形的差分积分值(DIV)除以荧光信号波形峰值(PEAK)所得商(DIV/PEAK)与一定阈值进行比较，辨别该细胞是凝集细胞还是非凝集细胞。
差分积分值是微分信号波形、将其绝对值加在一起所得的值，波形中没有波谷的信号的差分积分值几乎与其信号峰值的2倍值相同。另一方面，波形中有波谷的信号其差分积分值大于该信号峰值的2倍值，波形中谷越多，谷越深，与峰值的2倍值之间的差也越大。
因此，考虑到叠加在信号上的干扰等，***控制器13将比“2”略大的值“2.6”作为辨别待分析细胞是凝集细胞还是非凝集细胞的基准值、即上述“一定阈值”。另外，一定阈值不限于2.6，但最好是接近2.0的值。荧光信号波形的差分积分值(DIV)除以荧光信号波形峰值(PEAK)所得商(DIV/PEAK)大于一定阈值意味着荧光信号的波形中至少有一个波谷，以此可以将待分析细胞归类为数个细胞凝集而成的凝集细胞。在此，与前向散射光的信号波形和侧向散射光的信号波形相比，荧光信号的波形的峰和谷的部分更分明，因此，可以精确地辨别是凝集细胞还是非凝集细胞。
(用于区分DNA量异常的细胞的特征参数)
细胞的癌变会使细胞的***活跃，致使DNA含量比正常细胞增多。因此可以以此DNA含量为细胞癌变和异型化的指标。可以用激光照射下的待分析细胞发出的荧光信号的脉冲面积(荧光量)(SFLI)作为反映细胞核DNA含量的值。荧光信号的脉冲面积(荧光量)(SFLI)表示基准值和荧光信号波形之间围起来的部分的面积。信号处理电路4从光电倍增管66输出的荧光信号获取反映待分析细胞核的DNA含量的值-荧光信号的脉冲面积(荧光量)(SFLI)作为特征参数。***控制器13判断此荧光量是否超过一定阈值，如果超过一定阈值，则将该细胞归类于有异常DNA含量的DNA异常细胞。
在本实施方式中，区分DNA量异常细胞时，将荧光量超过从标准试样获得的荧光信号峰值荧光量的2.5倍以上的细胞归类于DNA量异常细胞。
(异常细胞的辨别)
可以想象，当二个以上细胞以相互凝集的状态通过激光光斑时，来自数个细胞核的荧光被光电倍增管66检出，会输出整体面积大的脉冲。然而，如前所述，采用本实施方式的话，利用荧光信号波形的差分积分值除以峰值所得商(DIV/PEAK)，可以精确地排除凝集细胞产生的数据。因此，本实施方式通过将归类于DNA量异常细胞的细胞中又分类于凝集细胞的细胞排除，分辨出真正的异常细胞。以此可以防止误将有大量DNA的凝集细胞归类于异常细胞。
[细胞分析方法]
下面就用细胞分析仪10(参照图1)进行细胞分析的方法进行说明。首先，使用者手动制备流入流动室的测定试样。具体而言，对从患者宫颈部位采集的细胞(上皮细胞)进行离心(浓缩)、稀释、搅拌和碘化丙啶(PI)染色等众所周知的处理，制备测定试样。然后，使用者将制备的测定试样装入试管(无图示)，将试管放到仪器本机的吸移管(无图示)下面。
下面参照图12和图13说明***控制器13和仪器本机12的处理流程，其中图13为异常细胞辨别处理流程图。首先，接通***控制器13的电源，于是***控制器13的CPU27a对***控制器13内的计算机程序进行初始化(步骤S101)。CPU27a判断是否从使用者接受了测定指示(步骤S102)，如果收到测定指示(在步骤S102为YES)，则通过I/O接口27f向仪器本机12传送测定开始信号(步骤S103)。
当***控制器13传送的测定开始信号传到仪器本机12的测定控制器16(步骤S201)时，在仪器本机12，装在试管中的测定试样便被吸移管吸移到流动室55，形成试样流(步骤S202)。流经流动室55的测定试样中的细胞受到激光照射，该细胞产生的前向散射光由光电二极管61检测出，侧向散射光由光电倍增管64检测出，侧向荧光由光电倍增管66检测出(步骤S203)。
光学检测部件3输出的前向散射光信号、侧向散射光信号和荧光信号输送到信号处理电路4，在信号处理电路4经过一定处理获得前向散射光数据(FSC)、侧向散射光数据(SSC)和侧向荧光数据(SFL)，同时获得上述各特征参数(步骤S204)。获得的各特征参数存入存储部件21。测定控制器16将获取的各特征参数作为测定数据传送到***控制器13(步骤S205)。
测定控制器16判断该细胞是否为待拍摄细胞(步骤S206)。在此，如果该细胞的FSCW和FSCP在一定范围内则判断该细胞为待拍摄细胞。如果判断该细胞不是待拍摄细胞(步骤S206为NO)，则将处理推进到步骤S209。
当测定控制器16判断该细胞为待拍摄细胞时(步骤S206为YES)，实施拍摄处理(步骤S207)。拍摄处理是使光源67发光，利用此发光进行照明，用照相机70摄取流动室55中的该细胞图像。然后，测定控制器16通过外部通信控制器25将该细胞的图像数据传送到***控制器13(步骤S208)。
接着，测定控制器16判断流经流动室55的试样流是否结束(步骤S209)。如果已经结束，则向***控制器13发送表示结束的信息(结束信号)(步骤S210)。如果试样流尚未结束则处理返回步骤S203。
另一方面，***控制器13的CPU27a接收测定控制器16传送的测定数据，将其存入硬盘27d等(步骤S105)。***控制器13的CPU27a根据收到的粒子的特征参数辨别异常细胞。
CPU27a将从仪器本机12收到的该细胞的前向散射光数据的特征参数中前向散射光信号波形的脉冲宽度(FSCW)和前向散射光信号波形的峰值(FSCP)从硬盘27d读取到RAM27c(步骤S1051)。CPU27a再辨别该细胞是否为待分析细胞(步骤S1052)。在此，若该细胞的前向散射光信号波形的脉冲宽度(FSCW)和前向散射光信号波形的峰值(FSCP)在一定范围内，则CPU27a判断其为待分析细胞，若在一定范围外，则将其作为待分析细胞以外的碎片等排除。
CPU27a将该待分析细胞的侧向荧光数据的特征参数中荧光信号波形的差分积分值(DIV)和荧光信号波形的峰值(PEAK)从硬盘27d读取到RAM27c，获取荧光信号波形的差分积分值(DIV)除以荧光信号波形的峰值(PEAK)所得的商(DIV/PEAK)，同时将待分析细胞的侧向散射光数据中侧向散射光信号波形的脉冲宽度(SSCW)从硬盘27d读取到RAM27c(步骤S1053)。侧向散射光信号波形的脉冲宽度(SSCW)表示强度大于基线(Base Line)的侧向散射光信号波形的宽度。
CPU27a将荧光信号波形的差分积分值(DIV)除以荧光信号波形的峰值(PEAK)的商(DIV/PEAK)与阈值2.6比较，以此将该细胞分类为凝集细胞或是非凝集细胞其中之一(步骤S1054)。在此，当下列算式(1)成立时，该细胞为非凝集细胞，当算式(1)不成立时，该细胞为凝集细胞。
DIV/PEAK≤2.6…(1)
CPU27a将在步骤S1054分类为非凝集细胞的侧向荧光数据的特征参数-表示荧光信号脉冲面积的荧光量(SFLI)从硬盘27d读取到RAM27c(步骤S1055)，其中该荧光量是反映细胞核DNA含量的值。硬盘27d中存有标准试样荧光信号的荧光量，此荧光量也读取到RAM27c。
CPU27a判断归类为非凝集细胞的细胞荧光量(SFLI)是否超过标准试样的荧光量(SFLIP)的2.5倍，即下列算式(2)是否成立。
SFLI≥SFLIP·2.5…(2)
在此，当式(2)成立时，CPU27a将该细胞归类于细胞核DNA含量异常的DNA量异常细胞，并计数(步骤S1056)。CPU27a将在步骤S1056归类为DNA异常细胞的细胞确定为异常细胞(步骤S1057)。
返回图12，***控制器13的CPU27a接收仪器本机12传送的图像数据，该图像如果是在步骤S105被判断为异常细胞的细胞的图像，则将该细胞的特征参数与图像对应地存入硬盘27d(步骤S106)。
***控制器13判断是否收到结束信号(步骤S107)，如果未收到结束信号(步骤S107为NO)，则将处理返回步骤S102。如果收到结束信号(步骤S107为YES)，则进行计算异常细胞比率的处理(步骤S108)。
此异常细胞比率是在步骤S105的异常细胞辨别处理中获取的异常细胞总数X与非凝集细胞总数Y的比率。非凝集细胞总数Y是异常细胞总数X与正常细胞总数Z之和。因此，异常细胞比率W可用以下算式(3)求出。
W＝X/Y×100(％)＝X/(X+Z)×100(％)…(3)
异常细胞比率是一个判断细胞分析仪10分析的测定试样中是否存在一定数量以上的异常细胞的指标。比如，当异常细胞比率在0.1％以上时，说明测定试样中有一定数量以上的异常细胞，据此可以判断患者已患癌症的可能性很高。
异常细胞比率W也可用以下算式(4)求出。
W＝W/Z×100(％)…(4)
接下来，***控制器13将步骤S108求出的异常细胞比率、异常细胞图像以及其他信息显示在显示器28上(步骤S109)。此时，***控制器13用在异常细胞辨别处理中的特征参数绘制散点图。在此，***控制器13绘制横坐标为脉冲宽度(FSCW)、纵坐标为峰值(FSCP)的FSCW-FSCP散点图以及纵坐标为荧光信号波形的差分积分值(DIV)除以峰值(PEAK)的商(DIV/PEAK)、横坐标为侧向散射光信号波形的脉冲宽度(SSCW)的(DIV/PEAK)-SSCW散点图等。
图14是显示器28界面结构一例的略图。显示器28界面上部设有显示工具条和菜单条等的显示部件71，其下方设置有显示患者(受检者)姓名和患者ID等患者属性相关信息的患者属性信息显示部件72。患者属性信息显示部件72下侧设有显示上述散点图和其他图表等D的图表显示部件73、显示异常细胞数量及异常细胞比率等分析结果的分析结果显示部件74以及显示异常细胞图像P等的图像显示部件75。
使用者通过确认分析结果显示部件74所显示的分析结果，就能判断该患者是否有可能正在受到癌症等的侵袭。
图像显示部件75可以同时显示数张(图示为6张)图像P，细胞检查员等使用者可以直接用肉眼观察图像显示部件75所显示的细胞图像P来掌握细胞形态。从该细胞图像可以确认该细胞是否真为异常细胞。
图像显示部件75上设有“正常”选择按钮76和“删除”选择按钮77。使用者当观察图像显示部件75所显示的细胞图像P判断该细胞为正常细胞的图像而不是异常细胞时，点击选择该图像后，按“正常”选择按钮76，即可将该图像P涉及的细胞从异常细胞中排除，重新划分为正常细胞。
当图像显示部件75所显示的细胞图像P既不是异常细胞也不是正常细胞，而是凝集细胞和碎片等的图像(即分析目标外的图像)时，在选择了该图像P后按“删除”选择按钮77，即可将该图像P涉及的细胞从异常细胞和正常细胞中排除(删除)。
图像显示部件75还设有换页按钮78，按此换页按钮78可以在图像显示部件75内将细胞图像P向前或向后翻一页，使全部异常细胞的图像依次在图像显示部件75中显示。
根据上述实施方式，用于检测粒子发出的光信号的第一光源51和用于拍摄粒子图像的第二光源67发出的光通过照射光学***54照射到试样流上。如此被照射光学***54照射到试样流的第一光源51和第二光源67发出的直接光被遮光器件遮挡，直接光射入不到光电二极管61和CCD照相机70。即在直接光被阻断的状态(暗视野照明)下拍摄粒子图像，因此，背景较黑，即使是透光的粒子也能够拍摄到高对比度的图像。因此，采用上述实施方式即使是透光粒子也能够拍摄到高对比度的图像，能够至少根据前向散射光获取粒子的特征参数。而且，用于获取粒子特征参数的***和用于拍摄粒子图像的***其光学***的几乎全部可以共享，使光学***的小型化成为可能。
在上述实施方式中，通过将摄像部件置于第二光源的直接光被遮光器件完全遮挡的位置，使其能够在完全暗视野的状态下拍摄粒子图像，但本发明不限于此。比如也可以将摄像部件置于第二光源的直接光的至少一部分被遮光器件遮挡的位置。关于此实施方式，下面参照图15进行说明。
图15A-15D为在第一实施方式中第二光源相关的光学***与在第二实施方式中第二光源相关的光学***的结构比较图。15A为第一实施方式中光学***的平面图，15B为第一实施方式中光学***的侧面图，15C为第二实施方式中光学***的平面图，15D为第二实施方式中光学***的侧面图。
在第一实施方式中，如图中箭头所示，配置了光纤束68的光出射端68a，使光纤束68射出的直接光全部聚焦于遮光板56的遮光部件561，直接光不能透过开口562。将此时光纤束68光出射端68a和双凸单透镜69a的距离设为a。在此状态下，用照相机70拍摄粒子图像，只有粒子产生的散射光入射到照相机70，光纤束68射出的直接光不入射，因此可以获得背景较暗的完全暗视野的粒子图像。
设此时的遮光部件561的x方向宽度为b，到达遮光板56的直接光的x方向的光的宽度(光投影在遮光板56时产生的的投影影像x方向的长度)为c，则b≥c的关系成立。在第一实施方式中，聚光于遮光部件561，故c＝0。
另一方面，在第二实施方式，光纤束68的光出射端68a和双凸单透镜69a隔距离a’(a＜a’)配置。一般来说，透镜与光源的距离越长，透镜与成像位置(光聚焦的位置)的距离就越短。为此，在第二实施方式中，如图15C中箭头所示，光纤束68射出的直接光在遮光部件561前的位置先聚焦，然后再扩散。扩散的直接光的一部分被遮光部件561遮挡，未被遮光部件561遮挡的另一部分直接光透过开口562。在此状态下照相机70拍摄粒子图像，获得的图像比在完全暗视野状态下拍摄的图像背景亮一些。
设此时的遮光部件561的x方向宽度为b，到达遮光板56的直接光的x方向的光的宽度为c，则b＜c的关系成立。
如此，使部分直接光被遮光部件561遮挡，可以调节图像背景的亮度。背景的亮度可通过改变上述b和c的比率定量调节。具体而言，将c/b设为0≤c/b≤1，可以调节成完全暗视野状态，将c/b设为1≤c/b可以获得背景比完全暗视野亮的图像。通过将c/b调到比1还大，则可以使背景更亮。但是，如果去掉遮光部件561(b＝0)或将遮光部件561宽度调得过窄，则第一光源51发出的直接光入射到光电二极管61，如此便难以检测出前向散射光，因此，可获得背景明亮的图像的c/b比率最好在1＜c/b＜17范围内。要营造接近暗视野的状态，例如可以使c/b＝2。而要营造接近明视野的状态，例如可以使c/b＝4。
b和c的比率如参照图所说明的那样，可以通过任意改变光纤束68的光出射端68a与双凸单透镜69a的距离来调节。
图16～18显示的是粒子分析仪拍摄上皮细胞所得的图像。图16是在第一实施方式所示完全暗视野状态(c/b＝0)下拍摄的图像。图17是在第二实施方式一例所示的接近暗视野状态(c/b＝2)下拍摄的图像，图18是在第二实施方式一例所示的接近明视野状态(c/b＝4)下拍摄的图像。
如图16所示，在完全暗视野拍摄的图像，即使是透光的上皮细胞其细胞核也较明亮且背景黑暗，可以获得一幅对比度很高的图像。
如图17所示，在接近暗视野状态下拍摄的图像是一幅背景比在完全暗视野拍摄的图像亮的图像。
如图18所示，在接近明视野状态下拍摄的图像是一幅背景比在接近暗视野状态下拍摄的图像还亮的图像。
如图16(b)和(c)所示，在接近暗视野状态或接近明视野状态下拍摄图像，细胞核的亮度低于在完全暗视野拍摄的图像，对比度略有下降，但获得的图像背景明亮，容易看清细胞核以外的细胞内部。
在第二实施方式，是使光纤束68发出的直接光的一部分通过圆形开口562入射到照相机70，因此光纤束68的光出射端68a和双凸单透镜69a的距离设置得比第一实施方式长，但不限于此。比如也可以采取调窄遮光部件561宽度b的方式，还可以使遮光板56比在第一实施方式中更远离光纤束68(移到图15中z方向下游一侧)，或使双R柱面透镜54a比在第一实施方式中更靠近光纤束68(移到图15中z方向上游一侧)。采取这种结构将使光纤束68射出的直接光在到达遮光部件561之前聚焦，到达遮光板561的光的宽度变大，致使直接光的一部分通过圆形开口562入射到照相机70。
此次公开的实施方式应认为在所有方面均为例示，绝无限制性。本发明的范围不受上述实施方式的说明所限，仅由权利要求书的范围所示，而且包括与权利要求范围具有同样意思及与权利要求具有同等范围内的所有变化。
比如，上述实施方式是判断采自受检者的测定试样中是否有超过一定数量的宫颈部位的异常细胞，但本发明的细胞分析仪不限于此，也可以用于判断采自受检者的测定试样中是否有超过一定数量的血细胞、尿中有形成份、口腔细胞、膀胱和咽喉等其他上皮细胞的异常细胞、甚至脏器的异常细胞。
上述实施方式的异常细胞辨别处理是在区分非凝集细胞和凝集细胞后，区分DNA含量异常细胞。也可以颠倒顺序。用于辨别异常细胞的特征参数也不限于上述实施方式所述形态。
在上述实施方式，仪器本机12的测定控制器16从光信号获取粒子特征参数，将获取的粒子特征参数传送到***控制器13，由***控制器的CPU27根据粒子特征参数辨别异常细胞。但是本发明不限于此。比如也可以仪器本机12的测定控制器16获取粒子特征参数，并根据粒子特征参数辨别异常细胞。
在上述实施方式，仪器本机12的测定控制器16在步骤S206，当该细胞的FSCW和FSCP在一定范围内时判断该细胞为待拍摄细胞。但是本发明不限于此。比如也可以在上述算式(1)成立时或上述算式(2)成立时判断该细胞为待拍摄细胞。此时，标准试样的荧光信号的荧光量也存入存储部件21。
在上述实施方式，不仅显示异常细胞的图像，还显示数值信息(分析结果)和散点图，但也可以不将这些数据显示在显示器，而印刷到纸上等。
在上述实施方式，作为本发明的实施方式例示了细胞分析仪对采自受检者的、含有宫颈细胞的测定试样进行分析。但本发明不限于此，也可以由尿中有形成分分析仪对含有采自受检者的含有尿中有形成分的测定试样进行分析。
在上述实施方式，使用出射脉冲光的脉冲激光光源作为第二光源67。但本发明不限于此。也可以用比如出射连续光的激光光源作为第二光源67。
在上述实施方式，第一透镜***52没有柱面透镜。但本发明不限于此。比如也可以使第一透镜***52包含柱面透镜。

Claims (17)

1.一种粒子分析仪，包括：
形成含粒子的试样流的流动室；
第一光源和第二光源；
使得所述第一和第二光源发出的光照射所述试样流的照射光学***；
检测由所述第一光源发出的光照射所述试样流中粒子所产生的前向散射光并输出信号的检测部件；
配置在所述流动室和所述检测部件之间的遮光器件；
根据所述检测部件输出的信号获取粒子特征参数的控制器；及
在所第二光源发出的光的照射下拍摄所述试样流中粒子图像的摄像部件；
其中，配置所述遮光器件时使其能够遮挡从所述流动室射出的所述第一光源的直接光，并至少能够遮挡从所述流动室射出的所述第二光源的直接光的一部分。
2.根据权利要求1所述的粒子分析仪，其特征在于，配置所述遮光器件时使其遮挡住从所述流动室射出的所述第二光源的全部直接光。
3.根据权利要求1所述的粒子分析仪，还包括：使所述第一光源发出的光入射到所述照射光学***的第一光学***；及
使所述第二光源发出的光入射到所述照射光学***的第二光学***。
4.根据权利要求3所述的粒子分析仪，其特征在于，所述第一光学***使所述第一光源发出的光以平行光从与试样流垂直及平行的方向入射到照射光学***；
所述第二光学***使所述第二光源发出的光以平行光从与所述试样流垂直的方向、以会聚光从与所述试样流平行的方向入射到所述照射光学***。
5.根据权利要求3所述的粒子分析仪，其特征在于，所述照射光学***将所述第一光学***的光分别从与所述试样流垂直的方向和与所述试样流平行的方向聚光到所述遮光器件配置位置和所述试样流，将所述第二光学***的光分别从与所述试样流垂直和平行的方向聚光到所述遮光器件配置的位置。
6.根据权利要求3所述的粒子分析仪，其特征在于，所述第二光学***和所述照射光学***分别至少包含有一个柱面透镜。
7.根据权利要求3所述的粒子分析仪，其特征在于，所述遮光器件具有向与所述试样流平行方向延伸的遮光部件，以及在所述遮光部件两侧的开口。
8.根据权利要求1所述的粒子分析仪，还包括：检测所述试样流中粒子产生的侧向散射光的第二检测部件及检测所述试样流中粒子产生的侧向荧光的第三检测部件；
其中，所述控制器根据所述第一、第二和第三检测部件输出的信号，获取粒子的特征参数。
9.根据权利要求1所述的粒子分析仪，其特征在于，所述控制器从粒子获得一定的特征参数后，控制所述第二光源对粒子进行照明。
10.根据权利要求1所述的粒子分析仪，还包括存储部件，其中所述控制器将粒子的特征参数和粒子的图像对应地存入所述存储部件。
11.根据权利要求1所述的粒子分析仪，还包括显示器，其中所述控制器控制所述显示器显示粒子特征参数和粒子的图像中的至少其中之一。
12.根据权利要求1所述的粒子分析仪，其特征在于，试样中的粒子为细胞。
13.根据权利要求1所述的粒子分析仪，其特征在于，粒子是从宫颈部位采集的细胞。
14.一种粒子拍摄方法，包括：
在流动室中形成含有粒子的试样流；
通过照射光学***使第一光源和第二光源发出的光照射到所述试样流；
在用遮光器件遮挡从流动室射出的所述第一光源直接光的状态下，至少检测出由所述第一光源射出的光的照射所述试样流中的粒子所产生的前向散射光；
根据检测出的所述前向散射光获取粒子的特征参数；及
当有一定特征参数的粒子通过所述流动室时，在用所述遮光器件至少遮挡从所述流动室射出的所述第二光源直接光的一部分的状态下，借助所述第二光源发出的光拍摄所述试样流中的粒子。
15.根据权利要求14所述的粒子拍摄方法，还包括：显示所拍摄的粒子图像。
16.根据权利要求14所述的粒子拍摄方法，还包括：形成所述试样流之前，对粒子进行荧光染色。
17.根据权利要求14所述的粒子拍摄方法，其特征在于，粒子是从宫颈部位采集的细胞。
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