CN103849944A - 一种宫膜干细胞库的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种宫膜干细胞库的构建方法，包括月经血采集、宫膜干细胞分离除菌、扩增及分析检测、长期保存及定期检测的步骤。本发明提供了简便易行的除菌方法，去除细菌等物质的宫膜干细胞通过扩增培养可以获得大量纯度较高的宫膜干细胞，并长期保存，为未来的临床及科研应用研究提供大量的宫膜干细胞资源。

Description

一种宫膜干细胞库的构建方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及干细胞库的构建，更具体涉及宫膜干细胞库的构建。

背景技术

1999年，《Science》将人类胚胎干细胞研究成果评为当年世界十大科技进展之首，2000年，《Time》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首，并认为胚胎干细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域。至此干细胞研究成为近年来生物学以及医学领域中最引人注目的热点之一。干细胞(stem cells，SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，改变了人类疾病的应对方法，医学界称为“万用细胞”。目前干细胞来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞，但这两种来源都存在着部分局限性，因此寻找一种克服肿瘤形成的潜在性、标本来源的缺乏及伦理学争议等弊端的干细胞来源具有重要意义。近年来，美国Musina领导的研究小组从健康女性的月经血中得到分离的干细胞。宫膜干细胞（MenSCs）避免了其他干细胞的不足，成为一种全新的具有重大研究和应用潜力的干细胞。

然而，经对现有技术文献的检索发现，报道的宫膜干细胞的获取方法中，并没有人针对分离过程中除菌的方法以及除菌的效果进行报道，不能保证宫膜干细胞分离的成功率，不利于后续过程的进行。

本发明者通过摸索，根据细胞与细菌、真菌等的密度差异，通过密度梯度离心以及一定范围内反复洗涤离心的方法，可以去除细菌、真菌等，进而降低宫膜干细胞染菌的可能性，提高分离的成功率。通过大规模扩增培养可以获得大量的宫膜干细胞，并长期保存，定期质量检测，以便为未来的临床以及科研应用研究提供大量的宫膜干细胞资源。

发明内容

本发明的目的是为了克服宫膜干细胞分离过程中的不足，实现高效的宫膜干细胞分离和长期保存。

本发明提供一种宫膜干细胞库的构建方法，包括月经血采集、宫膜干细胞分离除菌、扩增及分析检测、长期保存及定期检测的步骤，该方法的特征在于：所述宫膜干细胞分离除菌包括用密度梯度离心或磁珠分选得到单个核细胞，并在密度梯度离心前后多次用缓冲液冲洗去除残余细菌和杂质，所述密度梯度离心法使用密度为1.077的细胞分离液，300-500×g，15℃-25℃离心20-40分钟，所述缓冲液冲洗中使用的缓冲液为含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS。

本发明的宫膜干细胞库的构建方法中，月经血的采集包括使用月事杯收集月经血，并保存在月经血保存液中，所述月经血保存液为添加肝素钠的PBS盐缓冲溶液或SPB盐缓冲溶液。

本发明方法中，月经血保存液中还可添加抗菌物质，所述抗菌物质选自两性霉素、青霉素、头孢拉定、头孢唑啉、头孢羟氨苄、头孢呋辛、头孢噻吩、链霉素、妥布霉素、四环素、土霉素、琥乙红霉素、克拉霉素、乙酰螺旋霉素、阿奇霉素、罗红霉素、红霉素、克林霉素和林可霉素。月经血保存液中添加的抗菌物质优选两性霉素、青霉素、链霉素。

本发明方法中的扩增步骤包括将分离所得单个核细胞于α-MEM+10％-20％血清完全细胞培养液中培养48-72小时后，更换新鲜的培养液，以后每3天全换液一次，细胞长满约80％-90％时，用含EDTA的0.25％胰酶消化，然后进行传代培养。

本发明方法中的分析检测步骤包括无菌性检测、流式细胞仪检测、核型检测和分化能力检测。

本发明方法中的长期保存步骤包括将细胞以1×10⁶至1×10⁷细胞/ml的密度重悬在含细胞培养液、DMSO和血清的细胞冻存液中，采用程序降温盒在-80℃冰箱中过夜进行程序降温法保存，然后转移到-196℃液氮中长期保存。

在长期保存过程中，进行定期检测，包括细胞复苏后进行细胞活性检测、无菌性检测、流式细胞仪检测和分化能力检测。

细胞活性检测每隔12个月进行一次，将细胞复苏后用台盼蓝染色检测细胞存活率。

流式细胞仪检测包括细胞表面抗原CD14、CD29、CD44、CD45、CD90、HLA的检测。

分化能力检测包括成骨分化能力、成脂分化能力和成软骨分化能力的检测。

本发明的宫膜干细胞库的构建方法中，扩增后的分析检测和长期保存过程中的定期检测都要进行无菌性检测，包括真菌的检测和细菌的检测。

本发明的一个具体实施方式包括以下步骤：

1、月经血的收集

利用月事杯收集月经血，保存在月经血保存液（含肝素钠的PBS盐缓冲溶液或SPB盐缓冲溶液）中，于4℃条件下运送到GMP车间。

2、宫膜干细胞的分离和除菌

利用密度梯度离心或磁珠分选方法收集单个核细胞（PBMC），通过多次PBS缓冲液反复冲洗，去除残留的细菌等物质。

3、宫膜干细胞的扩增

将分离得到的单个核细胞在α-MEM+10%-20%血清完全细胞培养液中培养，48-72小时后更换新鲜的培养液。以后每3天全换液一次，细胞长满约80%-90%时，用0.25%胰酶（含EDTA）消化，传代。

4、宫膜干细胞的检测

将传代的细胞进行无菌性检测，流式细胞仪检测，成骨分化检测等一系列检测。

5、宫膜干细胞的冻存

将传代后的宫膜干细胞通过程序降温法保存，即将细胞以1×10^6-至1×10⁷细胞/ml的密度重悬在含细胞培养液、DMSO和血清的细胞冻存液中，采用程序降温盒在-80℃冰箱中过夜，然后转移到-196℃液氮中长期保存。

6、宫膜干细胞的定期检测

每隔一定的时间（例如：12个月），将宫膜干细胞复苏，进行细胞活率、无菌性、流式细胞仪、分化能力等各项检测，对保存的宫膜干细胞的质量进行监控。

发明人经过研究开发，提供了简便易行的除菌方法，在获得月经血样本后，经过密度梯度离心、磁珠分选等方法得到单个核细胞（PBMC），再通过多次PBS洗涤离心的方法去除残余的细菌等物质，以提高获得无菌的宫膜干细胞的成功率。通过扩增培养可以获得大量纯度较高的宫膜干细胞，并长期保存，定期质量检测，以便为未来的临床及科研应用研究提供大量的宫膜干细胞资源。

附图说明

图1为本发明实施例的人宫膜干细胞的获取方法及干细胞库的构建方法流程图。

图2为本发明实施例的人宫膜干细胞的生长曲线示意图。

图3为本发明实施例的人宫膜干细胞流式检测结果示意图。

具体实施例

以下用实施例对本发明的技术方案作进一步阐述。本技术领域普通技术人员应当认识到，这些实验例仅仅用于举例说明本发明而不对本发明的范围构成任何限制，对本发明所作的任何改变，只要不违背本发明的精神实质，都将落在权利要求范围内。

实施例中的操作都国家认证的GMP车间中进行。操作流程见图1。

实施例1、月经血的采集

供者签署知情同意书后，将利用月事杯收集到的5ml-15ml月经血保存在等体积的月经血保存液（PBS，并添加100U/ml青霉素和100U/ml链霉素）中，4℃的条件下48小时内运送到国家认证的GMP车间。

实施例2、宫膜干细胞的分离

将5ml月经血混合液直接放在100mm的平皿中，补加5mlα-MEM（含20%的血清），在37℃、5%CO₂的条件下静置培养。48小时后，更换10ml新鲜培养液。对弃除的上清液进行无菌性检测（见表1）。

表1对宫膜干细胞的无菌性检测

	真菌	细菌
			未除菌分离的宫膜干细胞	阳性	阳性
除菌分离的宫膜干细胞	阴性	阴性
			扩增后的宫膜干细胞	阴性	阴性

（注：阳性为供试管中培养基澄清，阴性为供试管中培养基显浑浊）

实施例3、宫膜干细胞的除菌分离

将5ml月经血混合液缓慢加入含5ml Ficoll分离液的15ml离心管中，利用密度梯度离心的方法，加速度和降速度均设为1,转速为300-500×g，离心20-40分钟后收集白膜层，即单个核细胞（PBMC）。将PBMC用10mlPBS冲洗，1000rpm-1500rpm离心5-10分钟，弃除废液。该过程重复3次，去除残留的细菌等物质。将分离得到的目标细胞用3ml α-MEM（含10%-20%的血清）重悬，放在六孔板中在37℃、5%CO₂的条件下静置培养，48小时后，更换3ml新鲜的培养液，显微镜下观察到贴壁细胞，细胞呈梭形。对弃除的上清液进行无菌性检测（见表1）。

实施例4、宫膜干细胞的扩增

将实施例3的六孔板每3天全换液一次，细胞长满约80%-90%时，用0.25%胰酶（含EDTA）在37℃下消化3-5分钟，离心后去除胰酶，用10mlPBS洗涤3次，用10mlα-MEM（含20%的血清）重悬于T75培养瓶中，在37℃，5%CO₂的条件下静置培养。细胞在7天左右形成集落，12天左右细胞长满约80%-90%，可以开始传代。宫膜干细胞的扩增进程见图2的生长曲线。

实施例5、宫膜干细胞检测

1）无菌性检测

将扩增后的宫膜干细胞送入药品非临床研究质量管理规范标准实验室进行质量检测，包括无菌检测、支原体检测、病毒检测（根据《中国药典》2010版三部附录XIIA无菌性检测的方法，检测分离得到的宫膜干细胞是否被细菌或真菌污染）。结果见表1。

2）流式细胞仪检测

取对数生长期的第3代MenSCs，用0.25%胰酶-EDTA消化后，以含10%-20%胎牛血清的α-MEM中和，1000-1500rpm离心3-5min，PBS清洗3遍以除去血清。调整细胞密度至10⁶个细胞/ml，以1ml体积分装至无菌离心管中。分别按照说明书上的量加入鼠抗人CD14-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD29-PE、CD90-PE、HLA-PE抗体，混匀，4℃避光孵育30min。同时以未加抗体的细胞作为阴性对照，以相应的鼠抗人IgG1作为同型对照。孵育结束后，PBS清洗3遍除去未结合的抗体，BD流式细胞仪检测细胞表面抗原表达情况，CellQuest软件处理结果。其中CD14、CD29、CD90呈阳性，CD14、CD45、HLA呈阴性。结果见图3。

3）成骨分化检测

0.25%胰酶-EDTA将细胞消化下来，以10⁴个细胞/ml的密度分别接种至3块六孔板，待细胞贴壁后更换成骨诱导液（α-MEM添加10%FBS、100nM***、10mMβ-甘油磷酸钠和0.05mM抗坏血酸）诱导分化28天。每周更换2次成骨诱导液。

3.1碱性磷酸酶（ALP）检测

消化获得的MenSCs在成骨诱导液诱导分化14天时，进行ALP活力测定：吸去六孔板中的培养液，PBS洗3遍，加入400μl裂解缓冲液(1.5M Tris-HCl，1mM ZnCl₂，1mM MgCl₂，1%Triton-X100，pH 9.2)，37℃裂解30min，13,000rpm离心10min，取20μl上清用ALP试剂盒检测碱性磷酸酶活性，酶标仪读取405nm处吸光值。经计算ALP检测值是10IU/10⁶个细胞。

3.2茜素红矿化节染色

MenSCs细胞成骨诱导分化28天时，进行茜素红染色以观察矿化节形成。具体步骤为：六孔板中的细胞用PBS洗三次，加入70%的冷乙醇，4℃固定1小时，去离子水洗3遍除去残留的乙醇，加入3ml 0.1%茜素红溶液（pH 8.3）室温下染色15min，间歇晃动，去离子水洗5次除去未结合的茜素红，37℃，PBS清洗15min，显微镜观测到红色矿化节。

实施例6、宫膜干细胞冻存

细胞长满约80%-90%时，利用胰酶（含EDTA）消化后，PBS冲洗3次，送入药品非临床研究质量管理规范标准实验室进行质量检测，包括无菌检测，支原体检测，细胞计数和活力测定，以确定其是否到达合格标准。经过检测符合标准的宫膜干细胞按1×10⁶~2×10⁷个细胞/ml的密度在冻存液（DMSO、胎牛血清和α-MEM培养液1:2:7）中重悬，分装入冻存管。在冻存管外贴标签，标签上记录细胞的详细信息，包括供者姓名、细胞代数、细胞培养液成分和浓度、细胞接种密度、冻存液成分和冻存日期等，完整记录每一样本的真实冷冻状况，将信息准确无误地扫描入数据管理***，完成细胞库信息录入和构建。冻存管放入程序降温盒在-80℃冰箱中过夜，次日将冻存管转移到-196℃液氮罐中相应的空格中长期保存。冻存空间具有良好的卫生环境，包括洁净区，通风，采光环境，并符合国家相关文件规定。

实施例7、宫膜干细胞定期检测

每隔12个月，将宫膜干细胞复苏，取50μl细胞悬液添加50μl台盼蓝染液，染色3min，将细胞混合液加入细胞计数板中，显微镜下观察，计算并未染成蓝色的细胞比例即细胞存活率，细胞存活率需大于等于95%。并按照上述方法进行无菌性检测、流式细胞仪检测、成骨分化检测等各项检测，以便对保存的宫膜干细胞进行质量监控。定期将检测报告交给供者。

实施例8、宫膜干细胞在含微载体的转瓶中进行培养扩增

在本实施例中使用的是含有微载体的转瓶培养扩增细胞，转瓶工作体积为125ml，微载体为Cytodex-3。按照如下步骤进行操作。

①转瓶预处理：125ml转瓶清洗干净，烘干至完全干燥，加入20ml硅化液(Sigmacote,Sigma)于转瓶中，缓慢旋转转瓶使硅化液浸润瓶壁，吸去硅化液后，将转瓶置于通风处风干12h，蒸馏水冲洗备用。

②微载体预处理：本实施例中微载体密度定为2g/L，由于培养体积为50ml，因此称取0.1gCytodex-3转瓶中，加入20ml PBS浸泡3h，吸去后加入20ml新的PBS，121℃高压蒸汽灭菌20min，吸去PBS并加入20ml含15%胎牛血清的α-MEM培养液，37℃浸泡过夜。

③宫膜干细胞的接种：取4平皿生长至80%融合的宫膜干细胞，0.25%胰酶-EDTA消化后，以15%胎牛血清的培养液终止消化，1,000rpm离心5min，新鲜培养液重悬，以4×10⁴个细胞/ml的密度接种在三维微载体上。将含有8×10⁶个细胞的悬液加入含有Cytodex-3的转瓶中，再分别补足培养液至25ml，置于Wheaton磁力搅拌器上间歇搅拌，间歇搅拌条件为45rpm搅拌2min，停止13min，如此循环3h，37℃，5%CO₂。接种结束后，分别补入25ml培养液至50ml最终工作体积，转速调整为55rpm，每2天更换2/3培养液直至培养结束。

④宫膜干细胞的获取：停止转瓶内的搅拌，弃去上清液，0.25%胰酶-EDTA消化后，以含15%胎牛血清的培养液终止消化，1,000rpm离心5min，新鲜培养液重悬，可得到5.8×10⁵个细胞/ml密度的细胞。

Claims (13)

1.一种宫膜干细胞库的构建方法，包括月经血采集、宫膜干细胞分离除菌、扩增及分析检测、长期保存及定期检测的步骤，其特征在于：所述宫膜干细胞分离除菌包括用密度梯度离心或磁珠分选得到单个核细胞，并在密度梯度离心前后多次用缓冲液冲洗去除残余细菌和杂质，所述密度梯度离心法使用密度为1.077的细胞分离液，300-500×g，15℃-25℃离心20-40分钟，所述缓冲液冲洗中使用的缓冲液为含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的PBS。

2.如权利要求1所述的宫膜干细胞库的构建方法，其中所述月经血采集包括使用月事杯收集月经血，并保存在月经血保存液中，所述月经血保存液为添加肝素钠的PBS盐缓冲溶液或SPB盐缓冲溶液。

3.如权利要求2所述的宫膜干细胞库的构建方法，其中所述月经血保存液中还添加抗菌物质，所述抗菌物质选自两性霉素、青霉素、链霉素。

4.如权利要求1所述的宫膜干细胞库的构建方法，其中所述扩增步骤包括将分离所得单个核细胞于α-MEM+10%-20%血清完全细胞培养液或无血清培养液中培养48-72小时后，更换新鲜的培养液，以后每3天全换液一次，细胞长满约80%-90%时，用含EDTA的0.25%胰酶消化，然后进行传代培养。

5.如权利要求1所述的宫膜干细胞库的构建方法，其中所述分析检测步骤包括无菌性检测、流式细胞仪检测和分化能力检测。

6.如权利要求1所述的宫膜干细胞库的构建方法，其中所述长期保存的步骤包括将细胞以1×10⁶至1×10⁷细胞/ml的密度重悬在含细胞培养液、DMSO和血清的细胞冻存液中，采用程序降温盒在-80℃冰箱中过夜进行程序降温法保存，然后转移到-196℃液氮中长期保存。

7.如权利要求1所述的宫膜干细胞库的构建方法，其中所述定期检测的步骤包括细胞复苏后进行细胞活性检测、无菌性检测、流式细胞仪检测和分化能力检测。

8.如权利要求7所述的宫膜干细胞库的构建方法，其中所述细胞活性检测每隔12个月进行一次，将细胞复苏后用台盼蓝染色检测细胞存活率。

9.如权利要求5或7所述的宫膜干细胞库的构建方法，其中所述流式细胞仪检测包括细胞表面抗原CD14、CD29、CD44、CD45、CD90、HLA的检测。

10.如权利要求5或7所述的宫膜干细胞库的构建方法，其中所述分化能力检测包括成骨分化能力、成脂分化能力和成软骨分化能力的检测。

11.如权利要求1所述的方法，还包括：细胞收获之后，检测合格后冻存于管内，并填写细胞的详细信息，包括供者姓名、细胞代数、细胞培养液成分和浓度、细胞接种密度，冻存液成分和冻存日期，完整记录每一样本的真实冷冻状况，将信息准确无误地扫描入数据管理***，完成细胞库信息录入和构建。

12.如权利要求11所述的方法，还包括：细胞冻存信息录入完毕后，自动化***根据液氮情况自动寻找空缺位置，将细胞冻存于相应的空格中。

13.如权利要求12所述的方法，冻存空间具有良好的卫生环境，包括洁净区，通风，采光环境，并符合国家相关文件规定并定期从冻存环境中取出细胞进行复苏检测活性等指标。

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