CN106978396A - 一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法，方法通过(1)富血小板纤维蛋白胶的提取、(2)特殊完全培养基的配制、(3)原代脂肪间充质干细胞的分离培养与传代培养和(4)不同类型脂肪间充质干细胞扩增后的生物学特征四个步骤完成。本发明获取了一种高纯度的CD54(+)脂肪间充质干细胞群，这群细胞具有较强的克隆形成能力、自我更新能力和成脂分化潜能，为在体外获取大量的具有干性的种子细胞运用于脂肪组织再生提供了新的方法，对提高临床上软组织损伤修复或先天性体表器官软组织缺陷畸形提供一种新的治疗策略，同时，也为确保其将来在临床应用的安全性提供充分的理论依据。

Description

一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体是一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法。它涉及一种人类脂肪间充质干细胞克隆的高效扩增培养方法及相关生物学功能鉴定。
背景技术
自从2001年Zuk等首次发现脂肪组织中含有多向分化潜能的间充质干细胞以来，脂肪间充质干细胞就逐渐成为了成体干细胞中最有前景的种子细胞之一。脂肪组织通过脂肪抽吸术或者外科手术易于获取，对供体的创伤相对较小，而且不涉及伦理问题，成为细胞治疗和组织工程应用中的理想工具，目前已有不少报道证实，脂肪间充质干细胞在皮肤软组织缺损、骨和软骨损伤、中枢神经***疾病、肝硬化以及自身免疫性疾病等具有广阔的临床应用前景[Philips BJ,Marra KG,Rubin JP.Healing of grafted adipose tissue:current clinical applications of adipose-derived stem cells for breast andface reconstruction.Wound Repair Regen,2014,22Suppl 1:11-3.Guillaume-JugnotP,Daumas A,Magalon J,Sautereau N,Veran J,Magalon G,et al.Autologous fat graftand adipose tissue-derived stromal vascular fraction injection for handtherapy in systemic sclerosis patients.2016,Curr Res Transl Med,64(1):35-42.Tissiani LA,Alonso N.A Prospective and Controlled Clinical Trial onStromal Vascular Fraction Enriched Fat Grafts in Secondary BreastReconstruction.Stem Cells Int,2016,2016:2636454.]。然而，在将脂肪间充质干细胞临床应用转化过程中，却发现运用常规培养技术极其难以获得大量的能够保持干细胞稳定“干性”的脂肪间充质干细胞以供临床需要[Bunnell BA,Flaat M,Gagliardi C,Patel B,Ripoll C.Adipose-derived stem cells:isolation,expansionanddifferentiation.Methods,2008,45(2):115-20.Cheng NC,Chen SY,Li JR,YoungTH.Short-term spheroid formation enhances the regenerative capacity ofadipose-derived stem cells by promoting stemness,angiogenesis,andchemotaxis.Stem Cells Transl Med,2013,2(8):584-94.]。按照目前从动物实验获得的数据，间充质干细胞的成人最低有效治疗剂量在(1.0-2.0)×106/kg，即一个体质量75kg的成年人约需输注(0.75-1.5)×108个细胞，不仅如此，为了维持稳定的疗效，经常需要针对同一病症进行阶段性的多次输注治疗[Murphy MB,Moncivais K,Caplan AI.Mesenchymalstem cells:environmentally responsive therapeutics for regenerativemedicine.Exp Mol Med,2013；45:e54.Fernández Vallone VB,Romaniuk MA,Choi H,Labovsky V,Otaegui J,Chasseing NA.Mesenchymal stem cells and their use intherapy:what has been achieved？Differentiation,2013,85(1-2):1-10.Doorn J,MollG,Le Blanc K,et al.Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells:paracrine effects and potential improvements.Tissue Eng Part B Rev,2012；18(2):101-115.]。因此需要建立一个稳定高效的体外培养扩增体系，使有限的初始细胞经扩增后能够达到足够的细胞数量并具有特定分化功能以满足临床的需求。如何在体外扩增过程中最大限度地收获间充质干细胞，同时保持干细胞的生理特性是临床细胞实验室急待解决的关键问题。
在传统培养基中，间充质干细胞容易丧失自我更新能力，极易老化，或“自发性”分化为成骨细胞、脂肪细胞或成纤维细胞[Mark P,Kleinsorge M,Gaebel R,Lux CA,ToelkA,Pittermann E,David R,Steinhoff G,Ma N.Human Mesenchymal Stem Cells DisplayReduced Expression of CD105after Culture in Serum-Free Medium.Stem Cells Int,2013；2013:698076.Tsang WP,Shu Y,Kwok PL,Zhang F,Lee KK,Tang MK,Li G,Chan KM,Chan WY,Wan C.CD146+human umbilical cord perivascular cells maintain stemnessunder hypoxia and as a cell source for skeletal regeneration.PLoS One,2013,8(10):e76153.Zhang D,Kilian KA.The effect of mesenchymal stem cell shape onthe maintenance of multipotency.Biomaterials,2013,34(16):3962-9.]；目前大量的研究证实，干细胞在体外扩增过程中“干性”的丧失提示，在体内微环境中维持间充质干细胞的多种关键因子在传统培养体系中缺失所致，[Scadden DT.The stem-cell niche asan entity of action.Nature,2006,441(7097):1075-9.Sharma MB,Limaye LS,KaleVP.Mimicking the functional hematopoietic stem cell niche in vitro:recapitulation of marrow physiology by hydrogel-based three-dimensionalcultures of mesenchymal stromal cells.Haematologica,2012,97(5):651-60.]；因此，在培养体系中提供足够含量的多种必需细胞因子对细胞微环境的体外再造以有效保持干细胞特性可能是必需的。
自2005年以来，我们的研究团队以人类不同解剖部位的皮下脂肪为组织来源，建立了自己的一整套实验技术平台及方法，进一步优化了脂肪间充质干细胞的分离培养方案，并对其进行多潜能分化表型鉴定，通过在细胞体外培养或体内移植过程中优化其生长增殖、多向分化、旁分泌等生物学功能，取得了可喜的研究成果，为脂肪间充质干细胞应用于组织工程、再生医学及在临床上促进创伤复、组织再生、器官重建提供可靠的理论依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法，包括以下步骤：
(1)富血小板纤维蛋白胶的提取
抽取患者50～100ml的静脉血，分装于无菌负压试血管内，采用转速2700rpm/min高速离心机离心，离心时间为12min，提取富含细胞因子的凝胶状物质，静置5min，即可得到富血小板纤维蛋白凝胶，此时血液分3层：最上层是贫血小板血浆，为淡黄色透明清亮液体；中间层是富血小板纤维蛋白，为淡黄色凝胶状物质(如图1所示)；最下层是红细胞碎片，为暗红色物质；排出其中多余的红细胞，将富血小板纤维蛋白和贫血小板血浆一起加入含体积分数100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养基，放置于4℃冰箱储存备用，7d后采用酶联免疫吸附试验检测培养基中各种细胞因子的浓度显示，血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子-β1、表皮生长因子、白细胞介素-4、白细胞介素-6、基质金属蛋白酶-1和***-1的浓度峰值在提取后第7d，之后呈缓慢下降，但储存28d时仍保持较高的细胞因子水平(如图2所示)。
(2)特殊完全培养基的配制
DMEM高糖培养基500ml+100ml静脉血分离提取的富血小板纤维蛋白和贫血小板血浆+1％青霉素、链霉素，4℃保存备用。
(3)原代脂肪间充质干细胞的分离培养与传代培养
在患者大腿上段内外侧或下腹部低负压抽取脂肪组织50ml，采用转速为600rpm/min离心机离心，离心时间为2min，用0.1％的Ⅰ型胶原酶恒温消化40～50min，以步骤(2)等量的特殊完全培养基中和后采用转速为1300rpm/min离心机离心、离心时间为5min，去除杂质及上清，沉淀混悬后用200目尼龙网过滤，再用特殊完全培养基将细胞混悬，按1×105/ml接种于25cm2的培养瓶中，置于体积浓度为5％CO2中饱和湿度、在37℃恒温培养箱进行单层细胞培养，24～48h后更换培养液一次，以后每3～4d换液1次并动态观察细胞的生长特性，7～10d细胞生长融合达80％～90％后，此时细胞称为原代脂肪间充质干细胞记为ASCs-P0，经0.25％胰酶消化，按1∶3进行传代培养，第一代细胞记为ASCs-P1。选取生长良好的ASCs-P1代细胞进行流式细胞术检测CD29、CD44、CD45、CD49d、CD54、CD105、CD106表面分子阳性细胞数，同时用免疫磁珠分选法将ASCs-P1进行分选，获取CD54(+)ASCs-P1，将获得的CD54(+)ASCs-P1用特殊完全培养基培养并进行继续传代扩增，将CD54(+)ASCs-P3、CD54(+)ASCs-P10分别与胶原蛋白海绵支架形成复合物，在成脂诱导培养基中体外培养至7d，取出材料，用2.5％戊二醛固定，用梯度酒精脱水，临界点干燥，横截面表面喷金，扫描电镜观察；选取生长良好的CD54(+)ASCs-P3、CD54(+)ASCs-P10代细胞及CD54(-)ASCs-P3、CD54(-)ASCs-P10进行常规成脂分化诱导培养14d，比较各组细胞的体外成脂分化能力。
(4)不同类型脂肪间充质干细胞扩增后的生物学特征
原代脂肪间充质干细胞在接种后24h内贴壁，细胞的形态为短梭形或三角形，在特殊完全培养基培养过程中，脂肪间充质干细胞呈现克隆样生长，且7～10d细胞克隆数迅速增多并形成致密细胞群，细胞呈方向性排列，传代后仍可见脂肪间充质干细胞呈现克隆样迅速生长并均匀分布；脂肪间充质干细胞在特殊完全培养基培养过程中生长状态非常活跃，在第10代体外扩增的过程中，增殖速率基本稳定，细胞形态为长梭形，生长过程中基本保持不变，第10代脂肪间充质干细胞仍具有旺盛的增殖能力(如图3所示)，实验结果表明，使用特殊完全培养基，取材20ml脂肪组织分离的脂肪间充质干细胞经过3周左右的体外扩增，总数可达到1×108以上；第1代脂肪间充质干细胞未经免疫磁珠筛选前成脂诱导14d，可见细胞内有透亮的脂滴形成，油红O染色可见脂滴被染成鲜红色；成骨诱导21d后，可见典型的矿化钙结节形成，茜素红染色呈鲜红色；成软骨诱导14d后，可见高度聚集样生长的细胞团，呈斑片状或结节状，周围细胞呈放射状，结节较大，肉眼可见，阿利辛蓝染色提示结节及周边聚集的细胞呈蓝色(如图4所示)；第1代脂肪间充质干细胞进行流式细胞术检测结果显示CD29、CD44、CD49d、CD54、CD105表面分子均为阳表达，而CD45和CD106为阴性(如图5所示)；CD54(+)ASCs-P3、CD54(+)ASCs-P10成脂诱导培养7d后，扫描电镜下观察显示，脂肪间充质干细胞在支架材料表面及内部孔壁伸展、黏附，细胞表面有脂滴附着，细胞形态多为偏圆形、长梭形或不规则状铺开，细胞数量逐渐增多，呈聚集性分布，细胞周围有大量基质，说明胶原支架与细胞有着非常良好的生物相容性，极利于细胞的生长增殖(如图6所示)；CD54(+)ASCs-P3、CD54(+)ASCs-P10脂肪间充质干细胞成脂诱导启动后，细胞增殖速度减缓，细胞体积逐渐变大，7d左右胞浆内出现大小不等的空泡和脂滴，并逐步相互融合，形成较大脂滴；诱导14d时，细胞分化达到高峰，细胞内脂滴经油红O染色后，显示为红色液滴，二者在形态上无显著差别(如图7A、B所示)；而CD54(-)ASCs-P3、CD54(-)ASCs-P10成脂诱导后，细胞体积巨大，形态发生变化，呈多边形，且只有少数细胞内出现红染液滴，与前者形成鲜明对比(如图7C、D所示)；CD54(+)ASCs-P3、CD54(+)ASCs-P10两组成熟脂肪细胞密度(如图8所示)、细胞内脂滴含量检测(如图9所示)、成脂相关基因(如图10所示)及蛋白表达(如图11所示)均显著高于CD54(-)ASCs-P3、CD54(-)ASCs-P10两组，而上述指标在CD54(+)ASCs-P3、CD54(+)ASCs-P10两组之间及CD54(-)ASCs-P3、CD54(-)ASCs-P10无显著差别。
本发明的有益效果
本发明获取了一种高纯度的CD54(+)脂肪间充质干细胞群，这群细胞具有较强的克隆形成能力、自我更新能力和成脂分化潜能，连续传至第10代均不易衰老，仍保持了较好的“干性”特征，为在体外获取大量的具有干性的种子细胞运用于脂肪组织再生提供了新的方法，对提高临床上软组织损伤修复或先天性体表器官软组织缺陷畸形提供一种新的治疗策略，同时，也为确保其将来在临床应用的安全性提供充分的理论依据。
附图说明
图1是本发明的富含细胞因子纤维蛋白胶的提取图。
图2是本发明的不同时间点富血小板纤维蛋白胶释放细胞因子酶联免疫吸附检测结果。
图3是本发明的原代、第1代、第3代、第10代脂肪间充质干细胞显微镜下形态图。
图中，(A)为原代、(B)为第1代、(C)为第3代、(D)为第10代。
图4是本发明第1代脂肪间充质干细胞多向分化实验结果图。
图中，A成脂、B成骨、C成软骨。
图5是本发明第1代脂肪间充质干细胞流式术检测表面CD分子结果
图6是本发明成脂分化诱导7d后，扫描电镜下细胞形态图。
图中，A为CD54(+)脂肪间充质干细胞-第3代、B为CD54(+)脂肪间充质干细胞-第10代。
图7是本发明各组细胞成脂分化诱导2周后油红O染色结果
图中，A为CD54(+)脂肪间充质干细胞-第3代、B为CD54(+)脂肪间充质干细胞-第10代、C为CD54(-)脂肪间充质干细胞-第3代、D为CD54(-)脂肪间充质干细胞-第10代。
图8是本发明各组脂肪间充质干细胞成脂分化诱导2周后脂肪细胞密度比较。
图9是本发明各组脂肪间充质干细胞成脂分化诱导2周后细胞内脂滴含量比较。
图10是本发明各组脂肪间充质干细胞成脂分化诱导2周后成脂相关基因表达比较。
图11是本发明各组脂肪间充质干细胞成脂分化诱导2周后成脂相关蛋白表达比较。
图12是本发明不同类型脂肪干细胞与胶原海绵支架混合后移植效果
图中，a为植入12周后移植物新生组织大体情况，b为两组移植物新生组织湿重比较，A组为胶原支架复合CD54(+)ASCs-P3，B组为胶原支架复合CD54(-)ASCs-P3，c为A组的HE染色，d为B组的HE染色；
图13是本发明两组新生组织内成熟脂肪细胞密度及细胞内脂滴含量比较。
图中，a为脂肪细胞密度，b为细胞内脂滴含量；A组为胶原支架复合CD54(+)ASCs-P3，B组为胶原支架复合CD54(-)ASCs-P3。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
不同类型脂肪干细胞与胶原海绵支架混合后移植与检测，操作步骤如下：
1.细胞-支架复合物(移植物)的制备
将无菌的胶原蛋白支架材料裁制成10mm×10mm×5mm大小，培养的第3代脂肪干细胞消化后制成细胞悬液，每组细胞密度为1×107/ml，将1ml经标记后的细胞悬液与支架混合，静置4h后，加入完全培养液，37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养过夜，次日上午移植到裸鼠体内。
2.验动物及分组
实验分2组：裸鼠10只，体质量20g±5g，雌雄不拘。
A组：胶原支架复合CD54(+)ASCs-P3，植入裸鼠左后侧背部皮下肌筋膜内。
B组：胶原支架复合CD54(-)ASCs-P3，植入裸鼠右后侧背部皮下肌筋膜内。
3.术后取材
移植物植入术后12周，再次手术取出移植物，肉眼观察移植物的形态及胶原支架残留情况，观察是否有新生组织生成；小心将新生组织剥离下来，立即用电子天平称出新生物的湿重，然后将组织块分成两部分，一份用于冰冻切片做油红O染色；另一份用4％多聚甲醛固定、酒精脱水，石蜡包埋，蜡块分别作标记，用于做HE染色及免疫荧光染色。
4.检测项目
组织学检查：石蜡标本切片常规HE染色及冰冻切片油红O染色，荧光显微镜下观察切片新生组织的细胞成分，比较各组成熟脂肪细胞密度、细胞内脂滴含量；
5.体内移植结果
A组移植物新生组织湿重(如图12所示)、成熟脂肪细胞密度(如图13a所示)、细胞内脂滴含量(如图13b所示)均较B组高，统计学分析差异有显著性意义，这些结果表明，经本发明扩增培养的脂肪间充质干细胞CD54(+)ASCs与胶原支架复合后，植入体内后成脂分化效率得到显著的提高，有利于构建较大体积的组织工程化脂肪。

Claims (1)

1.一种脂肪间充质干细胞克隆的扩增培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)富血小板纤维蛋白胶的提取
抽取患者50～100ml的静脉血，分装于无菌负压试血管内，采用转速2700rpm/min高速离心机离心，离心时间为12min，提取富含细胞因子的凝胶状物质，静置5min，即可得到富血小板纤维蛋白凝胶，此时血液分3层：最上层是贫血小板血浆，为淡黄色透明清亮液体；中间层是富血小板纤维蛋白，为淡黄色凝胶状物质；最下层是红细胞碎片，为暗红色物质；排出其中多余的红细胞，将富血小板纤维蛋白和贫血小板血浆一起加入含体积分数100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，放置于4℃冰箱储存备用，7d后采用酶联免疫吸附试验检测培养基中各种细胞因子的浓度显示，血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子-β1、表皮生长因子、白细胞介素-4、白细胞介素-6、基质金属蛋白酶-1和***-1的浓度峰值在提取后第7d，之后呈缓慢下降，但储存28d时仍保持较高的细胞因子水平；
(2)特殊完全培养基的配制
DMEM高糖培养基500ml+100ml静脉血分离提取的富血小板纤维蛋白和贫血小板血浆+1％青霉素、链霉素，4℃保存备用；
(3)原代脂肪间充质干细胞的分离培养与传代培养
在患者大腿上段内外侧或下腹部，采用低负压抽取脂肪组织50ml，采用转速为600rpm/min离心机离心，离心时间为2min，用0.1％的Ⅰ型胶原酶恒温消化40～50min，以步骤(2)等量的特殊完全培养基中和后采用转速为1300rpm/min离心机离心、离心时间为5min，去除杂质及上清，沉淀混悬后用200目尼龙网过滤，再用特殊完全培养基将细胞混悬，按1×105/ml接种于25cm2的培养瓶中，置于体积浓度为5％CO2中饱和湿度、在37℃恒温培养箱进行单层细胞培养，24～48h后更换培养液一次，以后每3～4d换液1次并动态观察细胞的生长特性，7～10d细胞生长融合达80％～90％后，此时细胞称为原代脂肪间充质干细胞记为ASCs-P0，经0.25％胰酶消化，按1∶3进行传代培养，第一代细胞记为ASCs-P1。选取生长良好的ASCs-P1代细胞进行流式细胞术检测CD29、CD44、CD45、CD49d、CD54、CD105、CD106表面分子阳性细胞数，同时用免疫磁珠分选法将ASCs-P1进行分选，获取CD54(+)ASCs-P1，将获得的CD54(+)ASCs-P1用特殊完全培养基培养并进行继续传代扩增，将CD54(+)ASCs-P3、CD54(+)ASCs-P10分别与胶原蛋白海绵支架形成复合物，在成脂诱导培养基中体外培养至7d，取出材料，用2.5％戊二醛固定，用梯度酒精脱水，临界点干燥，横截面表面喷金，扫描电镜观察；选取生长良好的CD54(+)ASCs-P3、CD54(+)ASCs-P10代细胞及CD54(-)ASCs-P3、CD54(-)ASCs-P10进行常规成脂分化诱导培养14d，比较各组细胞的体外成脂分化能力；
(4)不同类型脂肪间充质干细胞扩增后的生物学特征
原代脂肪间充质干细胞在接种后24h内贴壁，细胞的形态为短梭形或三角形，在特殊完全培养基培养过程中，脂肪间充质干细胞呈现克隆样生长，且7～10d细胞克隆数迅速增多并形成致密细胞群，细胞呈方向性排列，传代后仍可见脂肪间充质干细胞呈现克隆样迅速生长并均匀分布；脂肪间充质干细胞在特殊完全培养基培养过程中生长状态非常活跃，在第10代体外扩增的过程中，增殖速率基本稳定，细胞形态为长梭形，生长过程中基本保持不变，第10代脂肪间充质干细胞仍具有旺盛的增殖能力，实验结果表明，使用特殊完全培养基，取材20ml脂肪组织分离的脂肪间充质干细胞经过3周左右的体外扩增，细胞总数可达到1×108以上；第1代脂肪间充质干细胞未经免疫磁珠筛选前成脂诱导14d，可见细胞内有透亮的脂滴形成，油红O染色可见脂滴被染成鲜红色；成骨诱导21d后，可见典型的矿化钙结节形成，茜素红染色呈鲜红色；成软骨诱导14d后，可见高度聚集样生长的细胞团，呈斑片状或结节状，周围细胞呈放射状，结节较大，肉眼可见，阿利辛蓝染色提示结节及周边聚集的细胞呈蓝色；第1代脂肪间充质干细胞进行流式细胞术检测结果显示CD29、CD44、CD49d、CD54、CD105表面分子均为阳表达，而CD45和CD106为阴性如表1所示；CD54(+)ASCs-P3、CD54(+)ASCs-P10成脂诱导培养7d后，扫描电镜下观察显示，脂肪间充质干细胞在支架材料表面及内部孔壁伸展、黏附，细胞表面有脂滴附着，细胞形态多为偏圆形、长梭形或不规则状铺开，细胞数量逐渐增多，呈聚集性分布，细胞周围有大量基质，说明胶原支架与细胞有着非常良好的生物相容性，极利于细胞的生长增殖；CD54(+)ASCs-P3、CD54(+)ASCs-P10脂肪间充质干细胞成脂诱导启动后，细胞增殖速度减缓，细胞体积逐渐变大，7d左右胞浆内出现大小不等的空泡和脂滴，并逐步相互融合，形成较大脂滴；诱导14d时，细胞分化达到高峰，细胞内脂滴经油红O染色后，显示为红色液滴，二者在形态上无显著差别；而CD54(-)ASCs-P3、CD54(-)ASCs-P10成脂诱导后，细胞体积巨大，形态发生变化，呈多边形，且只有少数细胞内出现红染液滴，与前者形成鲜明对比；CD54(+)ASCs-P3、CD54(+)ASCs-P10两组成熟脂肪细胞密度、细胞内脂滴含量检测、成脂相关基因及蛋白表达均显著高于CD54(-)ASCs-P3、CD54(-)ASCs-P10两组。
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