CN102123724B - 治疗流行性感冒的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本申请案提供可用于治疗流行性感冒的组合物和方法。如本文所述，所述组合物和方法是基于对流行性感冒显示免疫原性的肽和肽组合的研制。在一些实施例中，所述肽组合诱发针对多个流行性感冒病毒株(例如季节性流行性感冒病毒株或甚至新的猪源性A(H1N1)型大流行性感冒病毒)的保护性反应。

Description

治疗流行性感冒的组合物和方法
相关申请案
本申请案主张于2008年6月19日申请的PCT专利申请案第PCT/US08/67471号和于2009年5月29日申请的美国临时申请案第61/182614号的优先权和权利。所述优先权申请案的内容以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
流行性感冒是一种常见的呼吸***传染性疾病，其与正粘病毒科(Orthomyxoviridae)家族病毒相关联。由于此病毒具有高度变异性，所以通常每年都需要用考虑到病毒株变异并经重新调配的疫苗接种。美国(the United States)每年所研制的疫苗组合物都由食品与药物管理局疫苗和相关生物制剂咨询委员会部门(the Departmentof Food and Drug Administration Vaccines and the Related Biologicals AdvisoryCommittee)确定。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)也类似地运用一个全球实验室监测网络来检测新的流行性感冒变异体，例如参见拉旺希(Lavanchy),疫苗(Vaccine)17:S24(1999)。进行选择的基础是近来分离的流行性感冒病毒的抗原分析、抗原变异体的传播模式、和近来接种的个体的抗体反应。
A和B型流行性感冒是引起流行性人类疾病的两种类型流行性感冒病毒。A型流行性感冒病毒基于以下两种表面抗原进一步分成亚型：血凝素(HA)和神经氨酸酶(N)。B型流行性感冒病毒未分成亚型。从1977年以来，A型(H1N1)流行性感冒病毒、A型(H3N2)流行性感冒病毒和B型流行性感冒病毒已在全球范围内进行传播。对于处于由流行性感冒感染所引起的严重疾病和相关并发症的高风险中的个体来说，接种公认是预防或削弱流行性感冒的单一最有效方式。接种由灭活流行性感冒病毒制备的抗原可刺激特异性抗体的产生。但仅仅预防的是那些制成疫苗的病毒株或密切相关的病毒株。
每年的疫苗都含有三种病毒株(通常为两种A型和一种B型)，这三种病毒株代表着认为在即将到来的冬天可能传播的流行性感冒病毒。当前和出现的流行性感冒病毒株的抗原特征为选择每年的疫苗内所包括的病毒株提供基础。WHO每年都检查世界流行病学情况，且必要时会基于当前的流行病学证据，提出新的病毒株。
尽管重新构成，但疫苗不可能包括世界上在特定季节期间主动感染个体的所有不同病毒株。另外，调配和制备足量的疫苗剂量以应对流感感染的季节性增加也需要花费相对较长的时间。通常制备一种疫苗要花费6个月以上。因此，新的或忽略的流行性感冒病毒株可在这6个月时间内突显，引发一场流行病。2009年4月，首次检测到新的猪源性A(H1N1)型流行性感冒病毒。相较于先前所述的H1N1亚型，其为四重基因重配病毒(quadruplereassortant)。病毒开始是爆发于墨西哥(Mexico)，但此流行病穿过边界迅速席卷美国和加拿大(Canada)，目前几乎所有国际上的国家都报道有新的病例。所属领域中对治疗流行性感冒的改良组合物和方法仍然存在需要。明确地说，需要针对WHO所提出的季节性流行性感冒病毒株和新出现的大流行性感冒病毒株(例如新的猪源性A(H1N1)型流行性感冒病毒)具有广泛免疫原性的组合物。
发明内容
本申请案提供可用于治疗流行性感冒的组合物和方法。如本文所述，所述组合物和方法是基于对流行性感冒显示免疫原性的肽和肽组合的研制。
在一些实施例中，肽组合诱发针对多个流行性感冒病毒株，例如季节性流行性感冒病毒株或甚至新的猪源性A(H1N1)型大流行性感冒病毒的保护性反应。
在一些实施例中，组合物不经肠投予(例如通过肌肉内注射)。在一些实施例中，不经肠组合物包括包含非离子型表面活性剂的囊泡(vesicle)。在一些实施例中，不经肠组合物包括TLR-4激动剂佐剂。在一些实施例中，不经肠组合物中所存在的至少一部分TLR-4激动剂佐剂与囊泡物理缔合。
虽然目前流行性感冒疫苗局限于上述不经肠投药途径(例如肌肉内注射)，但我们已经鉴别出经口投予时诱发保护性反应的组合物。因此，在一些实施例中，组合物经口投予。在一些实施例中，口服组合物包括胆汁盐体(bilosome)。在一些实施例中，口服组合物包括TLR-3激动剂佐剂。在一些实施例中，口服组合物中所存在的至少一部分TLR-3激动剂佐剂与胆汁盐体物理缔合。
附图说明
图1A-B展示如竞争微量中和分析所检测，示范性肽组合物的特异性。稀释人类血清，并与所选肽组合物一起培育，随后与流行性感冒病毒一起培育。培育后，加入MDCK(马丁-达比狗肾(Madin-Darby Canine Kidney))细胞，且培养板在18-22个小时后显影。(A)使用人类血清，检测针对新喀里多尼亚流行性感冒(influenza New Caledonia)(A/NC/20/99)的竞争微量中和。(B)使用人类血清，检测针对威斯康星流行性感冒(influenzaWisconsin)(A/Wis/67/05)的竞争微量中和。
图2展示如IFNγ-ELISPOT分析所检测，由示范性肽组合物所引发的细胞介导的免疫反应，表示为每百万个细胞的斑点形成细胞(SFC)。在所选肽存在下培养流行性感冒接种个体的周围血液单核细胞(PBMC)。2天后，培养板显影，且放大并计数每孔中的斑点数目。
图3展示相较于未接种的对照动物，接种肽组合物INF-61P的动物中用1×106个空斑形成单位(pfu)的H3N2(A/威斯康星/2005)病毒激发后10天时间内的中值日发热计数。发热计数定义为动物每分钟的体温为40℃或40℃以上；每3小时计算每组4只动物的中值发热计数。对照和接种动物具有类似的起始体温(参见第0天)。
图4展示相较于未接种的对照动物，接种肽组合物INF-61P的动物中用1×106个pfu的H3N2(A/威斯康星/2005)病毒激发后10天时间内的重量损失。
图5展示在经肽组合物INF-61P免疫的雪貂的直肠洗液(上图)和鼻洗液样品(下图)中可见的针对流行性感冒病毒的粘膜IgA反应(流感灵(FLUVIRAL))。资料表示为每只动物中相对于接种前反应的增加倍数，且相对于不同样品中所存在的IgA总量标准化。还提供用市售流行性感冒疫苗(流感灵)获得的比较资料。
图6展示在经肽组合物SFV2免疫的雪貂血清中可见的针对B型流行性感冒(俄亥俄州(Ohio))的重组HA蛋白质的血清IgA反应。成对的左列和右列分别展示每只动物接种前和接种后血清样品中通过ELISA所测得的反应(报道为光学密度)。在动物4850号和4860号中可以看到强阳性反应。
图7展示以脂质化肽组合物INF-09L-A诱发的广泛反应性细胞(CTL)免疫。用组合物接种成年(>12个月)HLA(A*0201)转基因小鼠三次，此组合物靶向A型流行性感冒的核蛋白中的可变区。组合物还包括明矾(alum)佐剂。对照组仅仅接收佐剂。用多个亚型的不同流行性感冒病毒株来感染脾细胞：H3N2(A/HK/1/18、A/维多利亚(VICtoria)/3/75)和H1N1(A/NC/20/99、A/PR/8/34)。斑点表示对各病毒株具有特异性的IFNγ分泌T细胞的频率，且误差线表示每组小鼠中的标准偏差(n＝3)。结果从左至右如下呈现：H3N2(A/HK/1/18)、H3N2(A/维多利亚/3/75)和H1N1(A/NC/20/99)和H1N1(A/PR/8/34)。
图8展示在有或者没有TLR-3激动剂佐剂(poly I:C)下对经口投予的肽组合物的免疫反应。小鼠(每组n＝4)经口免疫4次(第0、3、14和17天)。接种后收获脾细胞，并在活体外用相同肽组合物刺激。使用IFNγELISPOT分析测量反应。如图8中所示，接收佐剂的动物反应比接收单独疫苗的动物反应大得多。
图9展示SEQ ID NO 16、17和18的序列。
图10A-B展示针对A型流行性感冒以下亚型的重组血凝素(rHA)蛋白质的血清IgG反应(通过ELISA来测量)：(A/所罗门岛(Solomon Island)/03/06)H1N1或(A/威斯康星/67/05)H3N2，在经肌肉内投予的肽组合物SFV2免疫的雪貂中测量。免疫后血清显示，对于经肌肉内投予的肽组合物SFV2免疫的雪貂，ELISA中对rHA所罗门(A)与威斯康星(B)的免疫反应均为显著的。未检测到针对B型流行性感冒(B/马来西亚(Malaysia)/2506/04)的rHA的IgG反应(资料未示)。还提供用市售流行性感冒疫苗(凡尔灵(VAXIGRIP))获得的比较资料。
图11展示经肌肉内投予的肽组合物SFV2免疫，接着经受病毒激发的雪貂鼻洗液的病毒载量。用免疫原性肽组合物SFV2接种动物，且用2×105个pfu H1N1(A/所罗门岛/03/06)激发，并在病毒血症最高峰(第2天)时通过空斑分析来测量鼻洗液样品的病毒载量。各符号表示个别动物中所测得的病毒载量。还提供用市售流行性感冒疫苗(凡尔灵)获得的比较资料。
图12展示经肌肉内投予的肽组合物SFV2免疫的雪貂中针对潜在大流行性感冒病毒株的体液免疫。在接种两周后(在病毒激发前)从动物中收集血清，并通过ELISA来测试样品与假定大流行性猪(H1N1/加利福尼亚(California)/2009)分离株的重组血凝素(rHA)蛋白质的反应性。还提供用市售流行性感冒疫苗(凡尔灵)获得的比较资料。
图13展示示范性TLR-4激动剂佐剂PHAD(来自亚拉巴马州(AL)阿拉巴斯特市(Alabaster)的雅凡蒂极性脂质公司(Avanti Polar Lipids,Inc.)的磷酸化己酰二糖)的化学结构。
图14展示另一示范性TLR-4激动剂佐剂(来自亚拉巴马州阿拉巴斯特市的雅凡蒂极性脂质公司)二[3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酰基]-脂质A(铵盐)的化学结构。
具体实施方式
定义
整个本申请案中，采用若干个如以下段落中所定义的术语。
如本文所用的术语“免疫反应”是指在动物中引起的反应。免疫反应可指细胞免疫、体液免疫或可包含两者。免疫反应也可限于免疫***的一部分。举例来说，在一些实施例中，免疫原性组合物可诱发IFNγ反应增加。在一些实施例中，免疫原性组合物可诱发粘膜IgA反应(例如在鼻和/或直肠洗液中测量)。在一些实施例中，免疫原性组合物可诱发全身性IgG反应(例如在血清中测量)。
如本文所用的术语“免疫原性”意指能够使在宿主动物中对非宿主实体(例如流行性感冒病毒)产生免疫反应。在一些实施例中，此免疫反应构成由针对特定传染性有机体(例如流行性感冒病毒)的疫苗引起的保护性免疫的基础。
如本文所用的术语“肽”是指一串至少三个通过肽键连接在一起的氨基酸。一般说来，肽中氨基酸的数目没有上限。肽一般仅含有天然氨基酸；然而，可包括非天然氨基酸(即天然不存在，但可并入多肽链中的氨基酸)。本发明肽中的一个或一个以上氨基酸也可以例如通过添加例如碳水化合物基团、磷酸酯基、法呢基、异法呢基、脂肪酸基、用于结合、官能化或其它修饰的连接子等化学实体来修饰。在各个实施例中，修饰可产生更稳定的肽(例如活体内半衰期更长)。合适的修饰可包括环化肽、并入D-氨基酸等。在各个实施例中，修饰可产生免疫原性更强的肽。合适的修饰可包括共价连接一个或一个以上脂质(例如但不限于软脂酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基、月桂酰基、辛酰基、癸酰基等)、融合于载体蛋白(例如但不限于结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative of tuberculin，PPD)、破伤风类毒素(tetanus toxoid)、霍乱毒素(cholera toxin)和其B亚单位、卵白蛋白、牛血清白蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、胞壁酰二肽和其类似物、细胞因子或其片段等)等。
如本文所用的术语“同源性百分比”是指如本申请案中所定义的最佳比对后两种序列之间的序列一致性百分比。如果在经比对以达成如下所述的最大对应时两种序列中的氨基酸序列相同，那么可以说两种氨基酸序列“一致”。通常通过在一个区域或“比较窗”上比较两种最佳比对序列的序列以鉴别和比较序列相似性区域，进行两种氨基酸序列之间的序列比较。用于比较的序列可以通过史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman),应用数学进展(Ad.App.Math.)2:482(1981)的局部同源性算法，通过尼德曼(Neddleman)和伍兹(Wunsch),分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443(1970)的同源性比对算法，通过皮尔森(Pearson)和李普曼(Lipman),美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:2444(1988)的相似法探究，通过这些算法的计算机化执行或通过目测来进行最佳比对。
通过在比较窗上比较两个最佳比对的序列来测定“序列一致性百分比”，其中比较窗中的部分氨基酸序列可包含相较于参考序列(不包含添加或缺失)的添加或缺失(即间隙)，以最佳比对两个序列。此百分比如下计算：通过测定两个序列中相同氨基酸残基所在位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中总位置数并将此结果乘以100，得到序列一致性百分比。以上所给出的序列一致性定义是所属领域的技术人员所使用的定义。定义自身不需要任何算法的帮助。所述算法仅仅是有助于促进序列的最佳比对，而不是计算序列一致性。由所述定义可见两个比较序列之间只存在明确的一个序列一致性值，此值对应于针对最佳比对所获得的值。
如本文所用的术语“治疗有效量”是指足以在所治疗个体中展示有意义益处的量。免疫原性组合物的治疗有效量可视例如所需生物学终点、组合物的性质、投药途径、所治疗个体的健康、体型和/或年龄等因素而变化。
如本文所用的术语“治疗”是指免疫原性组合物投予患有流行性感冒、具有流行性感冒症状或具有发展成流行性感冒的诱因的个体，以达到缓和、减轻、改变、改善、好转或影响流行性感冒、流行性感冒症状或发展成流行性感冒的诱因的目的。在一些实施例中，术语“治疗”是指接种个体。
一些实施例的详细描述
本申请案提供可用于治疗流行性感冒的组合物和方法。如本文所述，所述组合物和方法是基于对流行性感冒显示免疫原性的肽和肽组合的研制。
在一些实施例中，肽组合诱发针对多个流行性感冒病毒株，例如季节性流行性感冒病毒株或甚至新的猪源性A(H1N1)型大流行性感冒病毒的保护性反应。
在一些实施例中，组合物不经肠投予(例如通过肌肉内注射)。在一些实施例中，组合物包括TLR-4激动剂佐剂。在一些实施例中，组合物包括包含非离子型表面活性剂的囊泡。在一些实施例中，组合物中所存在的至少一部分TLR-4激动剂佐剂与囊泡物理缔合。
虽然目前流行性感冒疫苗局限于上述不经肠投药途径(例如肌肉内注射)，但我们已经鉴别出经口投予时诱发保护性反应的组合物。因此，在一些实施例中，组合物经口投予。在一些实施例中，组合物包括TLR-3激动剂佐剂。在一些实施例中，组合物包括胆汁盐体。在一些实施例中，组合物中所存在的至少一部分TLR-3激动剂佐剂与胆汁盐体物理缔合。
I.肽
一方面，本申请案提供可单独或组合使用，产生用于治疗流行性感冒的免疫原性组合物的肽。应了解，任何所述肽都包括在免疫原性组合物中，且本申请案涵盖包括所述肽的任何排列或组合的组合物。下文第II部分将描述一些示范性肽组合。
A型流行性感冒血凝素(HA)亚型1(H1)肽
实例中的表2-6描述来源于A型流行性感冒血凝素(HA)亚型1(H1)蛋白质的若干种肽的氨基酸序列。如表2-5和序列表中所示，一些肽是常见一致序列的变异体。
在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO.2(参见表2)的至少20个相邻氨基酸的肽。应了解，涵盖由SEQ ID NO.2的一致序列所描述的任一变异序列的任何20个相邻氨基酸。在一些实施例中，肽可包含SEQ ID NO.2的至少21、22、23、24、25或26个相邻氨基酸。本申请案还提供包含两种或两种以上所述肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7或8种包含SEQ ID NO.2的至少20个相邻氨基酸的不同肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO.2的不同氨基酸序列的不同肽，其中n＝1-3。在一些实施例中，n＝1。在一些实施例中，n＝2。在一些实施例中，n＝3。
在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO.3(参见表3)的至少20个相邻氨基酸的肽。应了解，涵盖由SEQ ID NO.3的一致序列所描述的任一变异序列的任何20个相邻氨基酸。在一些实施例中，肽可包含SEQ ID NO.3的至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个相邻氨基酸。本申请案还提供包含两种或两种以上所述肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7或8种包含SEQ ID NO.3的至少20个相邻氨基酸的不同肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ IDNO.3的不同氨基酸序列的不同肽，其中n＝1-3。在一些实施例中，n＝1。在一些实施例中，n＝2。在一些实施例中，n＝3。
在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO.4(参见表4)的至少20个相邻氨基酸的肽。应了解，涵盖由SEQ ID NO.4的一致序列所描述的任一变异序列的任何20个相邻氨基酸。在一些实施例中，肽可包含SEQ ID NO.4的至少21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个相邻氨基酸。本申请案还提供包含两种或两种以上所述肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3或4种包含SEQ ID NO.4的至少20个相邻氨基酸的不同肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO.4的不同氨基酸序列的不同肽，其中n＝1-2。在一些实施例中，n＝1。在一些实施例中，n＝2。
在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO.5(参见表5)的至少20个相邻氨基酸的肽。应了解，涵盖由SEQ ID NO.5的一致序列所描述的任一变异序列的任何20个相邻氨基酸。在一些实施例中，肽可包含SEQ ID NO.5的至少21、22、23、24、25、26、27、28或29个相邻氨基酸。本申请案还提供包含两种或两种以上所述肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7或8种包含SEQ ID NO.5的至少20个相邻氨基酸的不同肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO.5的不同氨基酸序列的不同肽，其中n＝1-3。在一些实施例中，n＝1。在一些实施例中，n＝2。在一些实施例中，n＝3。
在一些实施例中，本申请案提供包含与SEQ ID NO.6(参见表6)的至少40个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域的肽。在一些实施例中，同源性可为至少85％、90％、95％或99％。
在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO.6的至少40个相邻氨基酸的肽。在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO.6的至少50、60、70或80个相邻氨基酸的肽。因此，肽可包含SEQ ID NO.6的氨基酸1-81。肽也可包含SEQ ID NO.6的氨基酸82-88。在一些实施例中，肽可包含SEQ ID NO.6的整个序列。在其它实施例中，肽可基本上由SEQ ID NO.6组成。在其它实施例中，肽可由SEQ ID NO.6组成。
除上述外，本申请案还提供包含与SEQ ID NO.16(参见图9)的20-100个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域的肽种类，其中所述肽包括来自A型流行性感冒血凝素(HA)蛋白质的少于100个的相邻氨基酸。此种类涵盖上述其它H1肽。在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID NO.16的20-100个相邻氨基酸具有至少85％、90％、95％或99％同源性的区域。在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID NO.16的20-50个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域。在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID NO.16的50-100个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域。
在一些实施例中，任何上述H1肽都可包含少于30个的氨基酸。然而，如本文所讨论，在一些实施例中，包含任一确定区域的肽也可以包含在较大肽中。
A型流行性感冒血凝素(HA)亚型3(H3)肽
实例中的表9-11描述来源于A型流行性感冒血凝素(HA)亚型3(H3)蛋白质的若干种肽的氨基酸序列。如表9-11和序列表中所示，这些肽都是SEQ ID NO.17(参见图9)的一致序列的变异体。
在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO.17的序列的肽。应了解，涵盖由SEQ ID NO.17的一致序列所描述的任一变异序列。
在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO.9(参见表9)的序列的肽。应了解，涵盖由SEQ ID NO.9的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种或两种以上所述肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种包含SEQ ID NO.9的序列的不同肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO.9的不同氨基酸序列的不同肽，其中n＝1-4。在一些实施例中，n＝1。在一些实施例中，n＝2。在一些实施例中，n＝3。在一些实施例中，n＝4。应了解本申请案还提供基本上由SEQ ID NO.9的氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO.9的氨基酸序列组成的肽。
在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO.10(参见表10)的序列的肽。应了解，涵盖由SEQ ID NO.10的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种或两种以上所述肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种包含SEQ ID NO.10的序列的不同肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO.10的不同氨基酸序列的不同肽，其中n＝1-4。在一些实施例中，n＝1。在一些实施例中，n＝2。在一些实施例中，n＝3。在一些实施例中，n＝4。应了解本申请案还提供基本上由SEQ ID NO.10的氨基酸序列组成、或由SEQ IDNO.10的氨基酸序列组成的肽。
在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO.11(参见表11)的序列的肽。应了解，涵盖由SEQ ID NO.11的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种或两种以上所述肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种包含SEQ ID NO.11的序列的不同肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO.11的不同氨基酸序列的不同肽，其中n＝1-4。在一些实施例中，n＝1。在一些实施例中，n＝2。在一些实施例中，n＝3。在一些实施例中，n＝4。应了解本申请案还提供基本上由SEQ ID NO.11的氨基酸序列组成、或由SEQ IDNO.11的氨基酸序列组成的肽。
在一些实施例中，任何上述H3肽都可包含少于30个的氨基酸。然而，如本文所讨论，在一些实施例中，包含任一确定区域的肽也可以包含在较大肽中。
实例中的表7描述来源于A型流行性感冒血凝素(HA)亚型3(H3)蛋白质的另一种肽的氨基酸序列。本申请案提供包含与SEQ ID NO.7的至少20个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域的肽，其中所述肽包括来自A型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸。在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID NO.7的至少20个相邻氨基酸具有至少85％、90％、95％或99％同源性的区域。在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID NO.7的至少50、60、70或80个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域。在一些实施例中，肽可包含SEQ ID NO.7的整个序列。在其它实施例中，肽可基本上由SEQ ID NO.7组成。在其它实施例中，肽可由SEQ ID NO.7组成。在一些实施例中，肽可包含少于100个的氨基酸，例如少于90、80、70、60、50或40个的氨基酸。然而，如本文所讨论，在一些实施例中，包含任一确定区域的肽也可以包含在较大肽中。
B型流行性感冒血凝素(HA)肽
实例中的表8和12描述来源于B型流行性感冒血凝素(HA)蛋白质的若干种肽的氨基酸序列。
在一些实施例中，本申请案提供包含与SEQ ID NO.18(参见图9)的位置2-49或68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域的肽，其中所述肽包括来自B型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸。在一些实施例中，肽可包含与SEQ IDNO.18的位置2-49或68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少85％、90％、95％或99％同源性的区域。在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID NO.18的位置2-49或68-121的至少25、30、35、40或45个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域。
在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID NO.12(参见表12)的整个序列具有至少80％同源性的区域。在一些实施例中，同源性程度可为至少85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，肽可包含SEQ ID NO.12的整个序列。在一些实施例中，肽可基本上由SEQ ID NO.12组成。在一些实施例中，肽可由SEQ ID NO.12组成。
在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID NO.13(参见表12)的整个序列具有至少80％同源性的区域。在一些实施例中，同源性程度可为至少85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，肽可包含SEQ ID NO.13的整个序列。在一些实施例中，肽可基本上由SEQ ID NO.13组成。在一些实施例中，肽可由SEQ ID NO.13组成。
在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID NO.18的位置2-49的至少20个相邻氨基酸具有至少80％同源性的第一区域和与SEQ ID NO.18的位置68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少80％同源性的第二区域。在一些实施例中，同源性可更高，例如至少85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，第一和/或第二区域中的同源性可覆盖SEQ ID NO.18的位置2-49或68-121的至少25、20、35、40或45个相邻氨基酸。
在一些实施例中，肽可包含与SEQ ID NO.8(参见表8)的整个序列具有至少80％同源性的区域。在一些实施例中，同源性程度可为至少85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，肽可包含SEQ ID NO.8的整个序列。在其它实施例中，肽可基本上由SEQ ID NO.8的序列组成，或由SEQ ID NO.8的序列组成。
在一些实施例中，任何上述的B型HA肽都可包含少于100个的氨基酸，例如少于90、80、70、60、50或40个的氨基酸。然而，如本文所讨论，在一些实施例中，包含任一确定区域的肽也可以包含在较大肽中。
A型流行性感冒核蛋白(NP)肽
实例中的表13和14描述来源于A型流行性感冒核蛋白(NP)的若干种肽的氨基酸序列。表13中的肽是SEQ ID NO.14的一致序列的变异体。表14中的肽是SEQ ID NO.15的一致序列的变异体。
在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO.14(参见表13)的序列的肽，其中所述肽包括来自A型流行性感冒核蛋白的少于20个的相邻氨基酸。应了解，涵盖由SEQ IDNO.14的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种或两种以上所述肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种包含SEQ ID NO.14的序列的不同肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO.14的不同氨基酸序列的不同肽，其中n＝1-4。在一些实施例中，n＝1。在一些实施例中，n＝2。在一些实施例中，n＝3。在一些实施例中，n＝4。应了解本申请案还提供基本上由SEQ ID NO.14的氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO.14的氨基酸序列组成的肽。
在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO.15(参见表14)的序列的肽，其中所述肽包括来自A型流行性感冒核蛋白的少于20个的相邻氨基酸。应了解，涵盖由SEQ IDNO.15的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种或两种以上所述肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种包含SEQ ID NO.15的序列的不同肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO.15的不同氨基酸序列的不同肽，其中n＝1-4。在一些实施例中，n＝1。在一些实施例中，n＝2。在一些实施例中，n＝3。在一些实施例中，n＝4。应了解本申请案还提供基本上由SEQ ID NO.15的氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO.15的氨基酸序列组成的肽。
在一些实施例中，任何上述NP肽都可包含少于30个的氨基酸。然而，如本文所讨论，在一些实施例中，包含任一确定区域的肽也可以包含在较大肽中。
其它流行性感冒肽
本申请案提供包括来自一种以上流行性感冒蛋白质的序列的其它肽。因此，在一些实施例中，本申请案提供包含SEQ ID NO.1(参见表1)的氨基酸序列的肽。如表1和序列表中所示，SEQ ID NO.1为一致序列。一致序列来源于B型流行性感冒HA蛋白质和A型流行性感冒HA H3蛋白质中的序列。应了解，涵盖由SEQ ID NO.1的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种或两种以上所述肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种包含SEQ ID NO.1的序列的不同肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO.1的不同氨基酸序列的不同肽，其中n＝1-4。在一些实施例中，n＝1。在一些实施例中，n＝2。在一些实施例中，n＝3。在一些实施例中，n＝4。应了解本申请案还提供基本上由SEQ ID NO.1的氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO.1的氨基酸序列组成的肽。还应了解，在一些实施例中，肽可包含少于30个的氨基酸。然而，如本文所讨论，在一些实施例中，包含任一确定区域的肽也可以包含在较大肽中。
II.肽组合
一方面，本申请案提供包括第I部分中所描述肽的组合的免疫原性组合物。应了解，以下示范性组合没有限制性，且本申请案涵盖第I部分中所描述肽的所有变更和组合。还应了解，其它肽(包括现有流行性感冒疫苗中发现的传统流行性感冒蛋白质抗原)可加入本文所述的任何免疫原性组合物中。在一些实施例中，免疫原性组合物中的每种肽都独立地具有免疫原性。
在一些实施例中，至少一种肽包含具有20个或20个以上来自非流行性感冒蛋白质的相邻氨基酸的区域。在一些实施例中，每种肽都包含具有20个或20个以上来自非流行性感冒蛋白质的相邻氨基酸的区域。在一些实施例中，组合物的至少两种肽存在于单个蛋白质内。
在一些实施例中，本申请案提供包括来自第I部分的一种或一种以上A型流行性感冒HA H1肽和一种或一种以上A型流行性感冒HA H3肽的免疫原性组合物。
在一些实施例中，本申请案提供包括来自第I部分的一种或一种以上A型流行性感冒HA H1肽和一种或一种以上B型流行性感冒HA肽的免疫原性组合物。
在一些实施例中，本申请案提供包括来自第I部分的一种或一种以上A型流行性感冒HA H3肽和一种或一种以上B型流行性感冒HA肽的免疫原性组合物。
在一些实施例中，本申请案提供包括来自第I部分的一种或一种以上A型流行性感冒HA H1肽、一种或一种以上A型流行性感冒HA H3肽和一种或一种以上B型流行性感冒HA肽的免疫原性组合物。
在一些实施例中，来自第I部分的一种或一种以上A型流行性感冒NP肽可包括在任一上述组合中。
在一些实施例中，本申请案提供包含以下的免疫原性组合物：第一肽，其包含与SEQ ID NO.16的20-100个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域，其中第一肽包括来自A型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸；第二肽，其包含SEQ ID NO.17的氨基酸序列；和第三肽，其包含与SEQ ID NO.18的位置2-49或68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域，其中第三肽包括来自B型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸。在一些实施例中，第一肽和第三肽包含少于100个的氨基酸，且第二肽包含少于30个的氨基酸。
在一些实施例中，还包括包含SEQ ID NO.14或15的氨基酸序列的第四肽，其中第四肽包括来自A型流行性感冒核蛋白的少于20个的相邻氨基酸。
示范性第一肽(A型流行性感冒HA H1)
在一些实施例中，第一肽可包含与SEQ ID NO.16的20-100个相邻氨基酸具有至少85％、90％、95％或99％同源性的区域。在一些实施例中，第一肽可包含与SEQ ID NO.16的20-50个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域。在一些实施例中，第一肽可包含与SEQ IDNO.16的50-100个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域。
在一些实施例中，第一肽可包含SEQ ID NO.2(参见表2)的至少20个相邻氨基酸。应了解，涵盖由SEQ ID NO.2的一致序列所描述的任一变异序列的任何20个相邻氨基酸。在一些实施例中，第一肽可包含SEQ ID NO.2的至少21、22、23、24、25或26个相邻氨基酸。本申请案还提供包含两种或两种以上所述第一肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7或8种包含SEQ ID NO.2的至少20个相邻氨基酸的不同第一肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO.2的不同氨基酸序列的不同第一肽，其中n＝1-3。在一些实施例中，n＝1。在一些实施例中，n＝2。在一些实施例中，n＝3。
在一些实施例中，第一肽可包含SEQ ID NO.3(参见表3)的至少20个相邻氨基酸。应了解，涵盖由SEQ ID NO.3的一致序列所描述的任一变异序列的任何20个相邻氨基酸。在一些实施例中，第一肽可包含SEQ ID NO.3的至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个相邻氨基酸。本申请案还提供包含两种或两种以上所述第一肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7或8种包含SEQ ID NO.3的至少20个相邻氨基酸的不同第一肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQID NO.3的不同氨基酸序列的不同第一肽，其中n＝1-3。在一些实施例中，n＝1。在一些实施例中，n＝2。在一些实施例中，n＝3。
在一些实施例中，第一肽可包含SEQ ID NO.4(参见表4)的至少20个相邻氨基酸。应了解，涵盖由SEQ ID NO.4的一致序列所描述的任一变异序列的任何20个相邻氨基酸。在一些实施例中，第一肽可包含SEQ ID NO.4的至少21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个相邻氨基酸。本申请案还提供包含两种或两种以上所述第一肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3或4种包含SEQ ID NO.4的至少20个相邻氨基酸的不同第一肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO.4的不同氨基酸序列的不同第一肽，其中n＝1-2。在一些实施例中，n＝1。在一些实施例中，n＝2。
在一些实施例中，第一肽可包含SEQ ID NO.5(参见表5)的至少20个相邻氨基酸。应了解，涵盖由SEQ ID NO.5的一致序列所描述的任一变异序列的任何20个相邻氨基酸。在一些实施例中，第一肽可包含SEQ ID NO.5的至少21、22、23、24、25、26、27、28或29个相邻氨基酸。本申请案还提供包含两种或两种以上所述第一肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7或8种包含SEQ ID NO.5的至少20个相邻氨基酸的不同第一肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO.5的不同氨基酸序列的不同第一肽，其中n＝1-3。在一些实施例中，n＝1。在一些实施例中，n＝2。在一些实施例中，n＝3。
在一些实施例中，第一肽可包含与SEQ ID NO.6(参见表6)的至少40个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域。在一些实施例中，同源性可为至少85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，第一肽可包含SEQ ID NO.6的至少40个相邻氨基酸。在一些实施例中，第一肽可包含SEQ ID NO.6的至少50、60、70或80个相邻氨基酸。因此，第一肽可包含SEQ IDNO.6的氨基酸1-81。第一肽也可包含SEQ ID NO.6的氨基酸82-88。在一些实施例中，第一肽可包含SEQ ID NO.6的整个序列。在其它实施例中，第一肽可基本上由SEQ ID NO.6组成。在其它实施例中，第一肽可由SEQ ID NO.6组成。
在一些实施例中，任何上述第一肽都可包含少于30个的氨基酸。然而，如本文所讨论，在一些实施例中，包含任一确定区域的第一肽也可以包含在较大肽中。
示范性第二肽(A型流行性感冒HA H3)
在一些实施例中，第二肽可包含SEQ ID NO.17的序列。应了解，涵盖由SEQ IDNO.17的一致序列所描述的任一变异序列。
在一些实施例中，第二肽可包含SEQ ID NO.9(参见表9)的序列。应了解，涵盖由SEQ ID NO.9的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种或两种以上所述第二肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种包含SEQ ID NO.9的序列的不同第二肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO.9的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中n＝1-4。在一些实施例中，n＝1。在一些实施例中，n＝2。在一些实施例中，n＝3。在一些实施例中，n＝4。应了解本申请案还提供基本上由SEQ ID NO.9的氨基酸序列组成、或由SEQ IDNO.9的氨基酸序列组成的第二肽。
在一些实施例中，第二肽可包含SEQ ID NO.10(参见表10)的序列。应了解，涵盖由SEQ ID NO.10的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种或两种以上所述第二肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种包含SEQ ID NO.10的序列的不同第二肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO.10的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中n＝1-4。在一些实施例中，n＝1。在一些实施例中，n＝2。在一些实施例中，n＝3。在一些实施例中，n＝4。应了解本申请案还提供基本上由SEQ ID NO.10的氨基酸序列组成、或由SEQ IDNO.10的氨基酸序列组成的第二肽。
在一些实施例中，第二肽可包含SEQ ID NO.11(参见表11)的序列。应了解，涵盖由SEQ ID NO.11的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种或两种以上所述第二肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种包含SEQ ID NO.11的序列的不同第二肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO.11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中n＝1-4。在一些实施例中，n＝1。在一些实施例中，n＝2。在一些实施例中，n＝3。在一些实施例中，n＝4。应了解本申请案还提供基本上由SEQ ID NO.11的氨基酸序列组成、或由SEQ IDNO.11的氨基酸序列组成的第二肽。
在一些实施例中，任何上述第二肽都可包含少于30个的氨基酸。然而，如本文所讨论，在一些实施例中，包含任一确定区域的第二肽也可以包含在较大肽中。
示范性第三肽(B型流行性感冒HA)
在一些实施例中，第三肽可包含与SEQ ID NO.18的位置2-49或68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少85％、90％、95％或99％同源性的区域。在一些实施例中，第三肽可包含与SEQ ID NO.18的位置2-49或68-121的至少25、30、35、40或45个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域。
在一些实施例中，第三肽可包含与SEQ ID NO.12(参见表12)的整个序列具有至少80％同源性的区域。在一些实施例中，同源性程度可为至少85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，第三肽可包含SEQ ID NO.12的整个序列。在一些实施例中，第三肽可基本上由SEQ ID NO.12组成。在一些实施例中，第三肽可由SEQ ID NO.12组成。
在一些实施例中，第三肽可包含与SEQ ID NO.13(参见表12)的整个序列具有至少80％同源性的区域。在一些实施例中，同源性程度可为至少85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，第三肽可包含SEQ ID NO.13的整个序列。在一些实施例中，第三肽可基本上由SEQ ID NO.13组成。在一些实施例中，第三肽可由SEQ ID NO.13组成。
在一些实施例中，第三肽可包含与SEQ ID NO.18的位置2-49的至少20个相邻氨基酸具有至少80％同源性的第一区域和与SEQ ID NO.18的位置68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少80％同源性的第二区域。在一些实施例中，同源性可更高，例如至少85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，第一区域和/或第二区域中的同源性可覆盖SEQ ID NO.18的位置2-49或68-121的至少25、20、35、40或45个相邻氨基酸。
在一些实施例中，第三肽可包含与SEQ ID NO.8的整个序列具有至少80％同源性的区域。在一些实施例中，同源性程度可为至少85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，第三肽可包含SEQ ID NO.8的整个序列。在其它实施例中，第三肽可基本上由SEQ ID NO.8的序列组成，或由SEQ ID NO.8的序列组成。
在一些实施例中，免疫原性组合物可包括两种不同的第三肽，其中一者包含与SEQID NO.18的位置2-49的至少20个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域，而另一者包含与SEQ ID NO.18的位置68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域。在一些实施例中，所述肽的一或两者中同源性程度可为至少85％、90％、95％或99％。
在一些实施例中，任何上述第三肽都可包含少于100个的氨基酸，例如少于90、80、70、60、50或40个的氨基酸。然而，如本文所讨论，在一些实施例中，包含任一确定区域的第三肽也可以包含在较大肽中。
示范性第四肽(A型流行性感冒NP)
在一些实施例中，任选的第四肽可包含SEQ ID NO.14(参见表13)的序列。应了解，涵盖由SEQ ID NO.14的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种或两种以上所述第四肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种包含SEQ ID NO.14的序列的不同第四肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO.14的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中n＝1-4。在一些实施例中，n＝1。在一些实施例中，n＝2。在一些实施例中，n＝3。在一些实施例中，n＝4。应了解免疫原性组合物也可包括基本上由SEQ ID NO.14的氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO.14的氨基酸序列组成的第四肽。
在一些实施例中，任选的第四肽可包含SEQ ID NO.15(参见表14)的序列。应了解，涵盖由SEQ ID NO.15的一致序列所描述的任一变异序列。本申请案还提供包含两种或两种以上所述第四肽的免疫原性组合物。因此，在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16种包含SEQ ID NO.15的序列的不同第四肽。在一些实施例中，免疫原性组合物可包含2n种各自包含SEQ ID NO.15的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中n＝1-4。在一些实施例中，n＝1。在一些实施例中，n＝2。在一些实施例中，n＝3。在一些实施例中，n＝4。应了解免疫原性组合物也可包括基本上由SEQ ID NO.15的氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO.15的氨基酸序列组成的第四肽。
在一些实施例中，任何上述第四肽都可包含少于30个的氨基酸。然而，如本文所讨论，在一些实施例中，包含任一确定区域的第四肽也可以包含在较大肽中。
示范性肽组合
在一些实施例中，免疫原性组合物可包括包含与SEQ ID NO.6具有至少80％同源性的区域的第一肽、包含与SEQ ID NO.8具有至少80％同源性的区域的第三肽、和2n种各自包含SEQ ID NO.9、10或11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中n＝1-4。在一个实施例中，第二肽各自包含SEQ ID NO.11的不同氨基酸序列。在一个实施例中，n＝4。在一个实施例中，组合物另外包含2m种各自包含SEQ ID NO.14的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中m＝1-4。在一个实施例中，组合物另外包含2m种各自包含SEQ ID NO.15的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中m＝1-4。在一个实施例中，m＝4。
在一些实施例中，免疫原性组合物可包括包含与SEQ ID NO.6具有至少90％同源性的区域的第一肽、包含与SEQ ID NO.8具有至少90％同源性的区域的第三肽、和2n种各自包含SEQ ID NO.9、10或11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中n＝1-4。在一个实施例中，第二肽各自包含SEQ ID NO.11的不同氨基酸序列。在一个实施例中，n＝4。在一个实施例中，组合物另外包含2m种各自包含SEQ ID NO.14的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中m＝1-4。在一个实施例中，组合物另外包含2m种各自包含SEQ ID NO.15的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中m＝1-4。在一个实施例中，m＝4。
在一些实施例中，免疫原性组合物可包括包含与SEQ ID NO.6具有至少95％同源性的区域的第一肽、包含与SEQ ID NO.8具有至少95％同源性的区域的第三肽、和2n种各自包含SEQ ID NO.9、10或11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中n＝1-4。在一个实施例中，第二肽各自包含SEQ ID NO.11的不同氨基酸序列。在一个实施例中，n＝4。在一个实施例中，组合物另外包含2m种各自包含SEQ ID NO.14的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中m＝1-4。在一个实施例中，组合物另外包含2m种各自包含SEQ ID NO.15的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中m＝1-4。在一个实施例中，m＝4。
在一些实施例中，免疫原性组合物可包括包含SEQ ID NO.6的第一肽、包含SEQ IDNO.8的第三肽、和2n种各自包含SEQ ID NO.9、10或11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中n＝1-4。在一个实施例中，第二肽各自包含SEQ ID NO.11的不同氨基酸序列。在一个实施例中，n＝4。在一个实施例中，组合物另外包含2m种各自包含SEQ ID NO.14的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中m＝1-4。在一个实施例中，组合物另外包含2m种各自包含SEQ IDNO.15的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中m＝1-4。在一个实施例中，m＝4。
在一些实施例中，免疫原性组合物可包括基本上由SEQ ID NO.6组成的第一肽、基本上由SEQ ID NO.8组成的第三肽、和2n种各自基本上由SEQ ID NO.9、10或11的不同氨基酸序列组成的不同第二肽，其中n＝1-4。在一个实施例中，第二肽各自基本上由SEQ IDNO.11的不同氨基酸序列组成。在一个实施例中，n＝4。在一个实施例中，组合物另外包含2m种各自基本上由SEQ ID NO.14的不同氨基酸序列组成的不同第四肽，其中m＝1-4。在一个实施例中，组合物另外包含2m种各自基本上由SEQ ID NO.15的不同氨基酸序列组成的不同第四肽，其中m＝1-4。在一个实施例中，m＝4。
在一些实施例中，免疫原性组合物可包括由SEQ ID NO.6组成的第一肽、由SEQ IDNO.8组成的第三肽、和2n种各自由SEQ ID NO.9、10或11的不同氨基酸序列组成的不同第二肽，其中n＝1-4。在一个实施例中，第二肽各自由SEQ ID NO.11的不同氨基酸序列组成。在一个实施例中，n＝4。在一个实施例中，组合物另外包含2m种各自由SEQ ID NO.14的不同氨基酸序列组成的不同第四肽，其中m＝1-4。在一个实施例中，组合物另外包含2m种各自由SEQ ID NO.15的不同氨基酸序列组成的不同第四肽，其中m＝1-4。在一个实施例中，m＝4。
III.肽合成
本文所述的肽可使用所属领域中的任何已知方法(包括重组方法)合成。在各个实施例中，肽可通过固相肽合成法(SPPS)来合成。在SPPS中，C端氨基酸通过与连接分子所形成的酸不稳定键连接于固相(通常为交联树脂，例如含聚苯乙烯或聚乙二醇的树脂)。所用固相一般不溶于合成所用的溶剂中，从而可相对简单且快速地冲洗掉过量的试剂和副产物。N端用在酸中稳定，但可通过碱来除去的保护基(例如Fmoc基团)保护。侧链官能团用碱稳定而酸不稳定的基团保护。SPSS技术接着包含将N-α上经保护的氨基酸并入生长肽链中，而C端仍然连接于固相。实例1描述示范性SPSS工艺。
一般说来，此工艺可自动操作，且市售装置可用于常规合成长度为20个或20个以上氨基酸的肽。当制备长肽(例如长度超过40个氨基酸)时，可证明适宜在一系列通过使用适当保护基接合的片段中产生肽。
如本文所述，某些肽组合物可包括单个肽序列的多个变异体(例如在相同序列中的2个或2个以上位置具有2个或2个以上不同氨基酸)。虽然指定组中的各变异体可个别合成，但通常适宜在单一合成中合成变异体子集或整组变异体。在各个实施例中，此可使用分开-组合法(split-combine method)实现。因此，如果此组变异体经设计以在指定位置包括两种不同氨基酸的一种，那么树脂可分成两个同等部分，且各部分可与两种氨基酸的一种偶合，形成两种不同的肽链。一旦偶合结束，即可将两个部分重新组合，以便后来的氨基酸可加入两链中。或者，可使用一锅法，其中两个替代性氨基酸加入同一反应中。通常两种氨基酸以等摩尔量加入；然而，在某些情况下(例如在其各别反应动力学差异显著的情况下)，优选非等摩尔量。接着可使用凯撒茚三酮试验(Kaiser ninhydrin test)监测肽反应是否结束。
以下参考文献描述制备肽混合物的一些示范性方法：霍顿(Houghten),美国国家科学院院刊82:5131(1985)；盖森(Geysen)等人,美国国家科学院院刊81:3998(1984)和美国专利第5,010,175号。
IV.佐剂
在一些实施例中，免疫原性组合物可包括一种或一种以上佐剂。如所属领域中所熟知，佐剂是增强免疫反应的试剂。佐剂为所属领域中所熟知(例如参见“疫苗设计：亚单位和佐剂方法(Vaccine Design:The Subunit and Adjuvant Approach)”,制药学生物技术(Pharmaceutical Biotechnology),第6卷,鲍威尔(Powell)和纽曼(Newman)编,普莱南出版社(Plenum Press),纽约(New York)和伦敦(London),1995)。
示范性佐剂包括完全弗氏佐剂(complete Freund′s adjuvant，CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)、角鯊烯、角鯊烷和明矾(氢氧化铝)，所述佐剂都是所属领域中熟知的物质且可从若干来源购得。在一些实施例中，铝或钙盐(例如氢氧化物或磷酸盐)可用作佐剂。明矾(氢氧化铝)已用于许多现有的疫苗中。通常每一剂量可包括约40至约700μg的铝。
在各个实施例中，水包油乳液或油包水乳液也可用作佐剂。举例来说，油相可包括角鯊烯或角鯊烷和表面活性剂。在各个实施例中，可使用非离子型表面活性剂，例如脱水山梨糖醇和二缩甘露醇(mannide)的单-和二-C12-C24脂肪酸酯。油相优选占免疫原性肽的约0.2重量％至约15重量％(例如约0.2％至1％)。PCT公开案第WO 95/17210号描述示范性乳液。
命名为QS21的佐剂是一种具有佐剂活性的免疫活性皂苷部分，其来源于南美树木智利皂荚树(Quillaja Saponaria Molina)的树皮，且其生产方法揭示于美国专利第5,057,540号中。智利皂荚树皂苷的半合成和合成衍生物也是适用的，例如美国专利第5,977,081号和第6,080,725号中所述的皂苷衍生物。
TLR是与果蝇Toll受体同源的蛋白质家族，其识别病原体相关分子模式，因此帮助身体区分自身分子与非自身分子。病毒病原体中常见的物质通过TLR识别为病原体相关分子模式。举例来说，TLR-3识别双股RNA中的模式，TLR-4识别脂多糖中的模式，而TLR-7/8识别病毒和细菌RNA和DNA中含有腺苷的模式。当通过此模式识别引发TLR时，发生一系列信号传导事件，引起发炎和先天性和适应性免疫反应的活化。大量含有各种TLR所识别的分子模式的合成配体正研制成为佐剂，且可包括在如本文所述的免疫原性组合物中。
举例来说，聚核糖肌苷酸:聚核糖胞苷酸或poly(I:C)(得自加利福尼亚州(CA)圣地亚哥市(San Diego)的英孚杰公司(InvivoGen))是双股RNA(病毒感染相关分子模式)的合成类似物，并且为示范性TLR-3激动剂佐剂(例如参见菲尔德(Field)等人,美国国家科学院院刊58:1004(1967)和拉维(Levy)等人,美国国家科学院院刊62:357(1969))。下文实例11将证明此佐剂用于示范性口服肽组合物的益处。在一些实施例中，poly(I:C)可与其它试剂组合，以提高稳定性(例如通过核糖核酸酶的活性来减少降解)。举例来说，美国专利第3,952,097号、第4,024,241号和第4,349,538号描述poly(I:C)与聚L-赖氨酸的复合物。聚精氨酸加入到poly(I:C)中也已展示通过核糖核酸酶的活性来减少降解。美国专利公开案第20090041809号描述具有一种或一种以上锁核酸(LNA)核苷的双股核酸，其可充当TLR-3激动剂。所属领域的技术人员将能够鉴别其它适合的TLR-3激动剂佐剂。
诸如单磷酰基脂质A(MPL)和3-脱酰基单磷酰基脂质A(3D-MPL)等减毒脂质A衍生物(ALD)是示范性TLR-4激动剂佐剂。ALD是类脂质A分子，其经改变或构筑，以使分子显示更少或不同的脂质A的不良影响。这些不良影响包括致热性、局部什瓦茨曼反应性(Shwarzmanreactivity)和毒性，如鸡胚50％致死剂量分析(CELD50)中所评估。MPL和3D-MPL分别描述于美国专利第4,436,727和4,912,094号中。MPL最初来源于作为肠细菌脂多糖(LPS)的组分的脂质A，脂多糖是一种有效但毒性高的免疫***调节剂。3D-MPL与MPL的不同之处在于酯连接于位置3的还原末端葡糖胺的酰基残基已选择性地除去。应了解，MPL和3D-MPL可包括脂肪酸链长变化的大量脂肪酸取代型式(即庚酰基、己酰基、戊酰基等)的混合物。因此，本发明涵盖MPL和3D-MPL的各种形式，包括其混合物在内。
在一些实施例中，这些ALD可与海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)组合于例如2％角鯊烯/TweenTM 80乳液中(例如参见英国专利第2122204号)。以PHAD(磷酸化己酰基二糖)，可从亚拉巴马州阿拉巴斯特市的雅凡蒂极性脂质公司获得MPL。图13展示PHAD的化学结构。下文实例13证明此佐剂用于示范性不经肠肽组合物的益处。图14中展示另一示范性TLR-4激动剂佐剂二[3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酰基]-脂质A(铵盐)的化学结构(也来自亚拉巴马州阿拉巴斯特市的雅凡蒂极性脂质公司)。所属领域的技术人员将能够鉴别其它适合的TLR-4激动剂佐剂。举例来说，其它脂多糖已经描述于WO 98/01139、美国专利第6,005,099号和欧洲专利第729473号中。
咪喹莫特(Imiquimod)(1-异丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺)是小分子TLR-7/8激动剂，其也适宜包括在如本文所述的免疫原性组合物中。
V.囊泡
在一些实施例中，组合物中的一种或一种以上肽可与囊泡组合。如所属领域中所熟知，囊泡一般具有经一个或一个以上包括亲水脂分子(例如脂肪酸、脂质、类固醇等)的双层围住的水性隔室。一种或一种以上肽可存在于囊泡的水性核心中。视肽的疏水性而定，肽也可以与双层缔合(例如通过疏水性相互作用和/或氢键或离子键)。应了解，任何囊泡都可用于如本文所述的免疫原性组合物，且双层的亲水脂分子可为离子型和/或非离子型。
在一些实施例中，囊泡可包含非离子型两性分子(例如非离子型表面活性剂)。具有适当两性分子特性的任何非离子型表面活性剂都可用以形成此类囊泡。适合的表面活性剂的实例包括但不限于基于甘油的酯连接表面活性剂。所述甘油酯可包含例如各酰基部分中含有至少10个碳原子的两种高级脂族酰基的一种。基于所述甘油酯的表面活性剂可包含一个以上甘油单元，例如多达5个甘油单元。可使用甘油单酯，例如含有C12-C20烷酰基或烯酰基部分，例如己酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、软脂酰基、油酰基或硬脂酰基的甘油单酯。一个示范性表面活性剂为1-单棕榈酰基甘油。
醚连接的表面活性剂也可用作非离子型表面活性剂。举例来说，适合的是基于甘油或具有含至多4个碳原子的低级脂族二醇的二醇的醚连接表面活性剂。基于所述二醇的表面活性剂可包含一个以上二醇单元，例如多达5个二醇单元(例如二乙二醇鲸蜡基醚和/或聚氧乙烯-3-月桂基醚)。可使用二醇或甘油单醚，包括含有C12-C20烷基或烯基部分，例如辛基(capryl)、月桂基、肉豆寇基、鲸蜡基、油基(oleyl)或硬脂基的二醇或甘油单醚。可使用的环氧乙烷缩合产物包括PCT公开案第WO88/06882号中所揭示的环氧乙烷缩合产物(例如聚氧乙烯高级脂族醚和胺表面活性剂)。示范性的醚连接表面活性剂包括1-单鲸蜡基甘油醚和二乙二醇鲸蜡基醚。
在一些实施例中，包含非离子型表面活性剂的囊泡可另外包含离子型两性分子，例如使囊泡带负电荷。举例来说，此可有助于稳定囊泡并提供有效分散。不受限制地，例如高级链烷酸和链烯酸(例如棕榈酸、油酸)的酸性物质或包括磷酸酯(例如二烷基磷酸酯(例如二鲸蜡基磷酸酯或磷脂酸或磷脂酰丝氨酸))和硫酸单酯(例如高级烷基硫酸酯(例如鲸蜡基硫酸酯))在内的含有酸基的其它化合物都可用于达成此目的。离子型两性分子如果存在，那么其通常占非离子型表面活性剂的1重量％与30重量％之间。例如2重量％与20重量％之间或5重量％与15重量％之间。
在一些实施例中，囊泡组分可与具有高分子量且能够形成双层的适当疏水性物质(例如类固醇，例如固醇，例如胆固醇)混合。在一些实施例中，类固醇的存在可有助于形成决定囊泡物理性质的双层。类固醇如果存在，那么其通常占非离子型表面活性剂的20重量％与120重量％之间。例如25重量％与90重量％之间或35重量％与75重量％之间。
在一些实施例中，囊泡可为胆汁盐体(参见例如美国专利第5,876,721号)。如本文所用的“胆汁盐体”是包含非离子型表面活性剂和促进类脂质分子传输穿过粘膜的传输增强分子的囊泡。如美国专利第5,876,721号中所述，多种分子可用作传输增强剂。举例来说，侧链的C23碳原子携带羧酸和/或其衍生物的胆固醇衍生物可以用作传输增强剂。所述衍生物包括(但不限于)“胆汁酸”胆酸和鹅脱氧胆酸、其与甘氨酸或牛磺酸的结合产物(例如甘氨胆酸和牛磺胆酸)、包括脱氧胆酸和熊脱氧胆酸在内的衍生物、和这些酸各自的盐。
其它传输增强剂包括酰氧化氨基酸，例如酰基肉碱和其盐。举例来说，诸如棕榈酰基肉碱等含有C6-20烷酰基或烯酰基部分的酰基肉碱可以用作传输增强剂。如本文所用的术语酰氧化氨基酸意欲涵盖一级、二级和三级氨基酸以及α、β和γ氨基酸。酰基肉碱为酰氧化γ氨基酸的实例。
应了解，免疫原性组合物所包括的胆汁盐体可包含一种以上类型的传输增强剂，例如一种或一种以上不同胆汁盐和一种或一种以上酰基肉碱。
还应了解，胆汁盐体也可以合并离子型两性分子，例如使胆汁盐体带负电荷。举例来说，此可有助于稳定胆汁盐体并提供有效分散。不受限制地，例如高级链烷酸和链烯酸(例如棕榈酸、油酸)的酸性物质或包括磷酸酯(例如二烷基磷酸酯(例如二鲸蜡基磷酸酯或磷脂酸或磷脂酰丝氨酸))和硫酸单酯(例如高级烷基硫酸酯(例如鲸蜡基硫酸酯))在内的含有酸基的其它化合物都可用于达成此目的。
在一些实施例中，胆汁盐体组分可与具有高分子质量且能够形成双层的适当疏水性物质(例如类固醇，例如固醇，例如胆固醇)混合。在一些实施例中，类固醇的存在可有助于形成决定胆汁盐体物理性质的双层。
胆汁盐体内所存在的传输增强剂的存在量一般以非离子型表面活性剂计介于40重量％与400重量％之间(例如60重量％与100重量％之间或70重量％与90重量％之间)。类固醇如果存在，那么其通常占非离子型表面活性剂的20重量％与120重量％之间(例如25重量％与90重量％之间或35重量％与75重量％之间)。离子型两性分子如果存在，那么其通常占非离子型表面活性剂的1重量％与30重量％之间(例如2重量％与20重量％之间或5重量％与15重量％之间)。
存在多种已知用于制备包含非离子型表面活性剂的囊泡的技术，例如PCT公开案第WO 1993/019781号中所提及的技术。应了解，任何这些已知的方法可用以制备适合的囊泡且可以通过修改任何这些技术来制备胆汁盐体。一种示范性技术为旋转膜蒸发法，其中通过从有机溶剂(例如烃或氯化烃溶剂，诸如氯仿)中旋转蒸发来制备非离子型表面活性剂膜，例如参见拉塞尔(Russell)和亚历山大(Alexander),免疫学杂志(J.Immunol.)140:1274(1988)。所得薄膜接着在传输增强剂存在下在碳酸氢盐缓冲液中再水合。
另一种用于产生用以制备胆汁盐体的囊泡的方法为柯林斯(Collins)等人,药学与药理学杂志(J.Pharm.Pharmacol.)42:53(1990)所揭示的方法。此方法包含使非离子型表面活性剂、类固醇(在使用的情况下)和离子型两性分子(在使用的情况下)的混合物熔融，及在用力混合下在水性缓冲液存在下水合。传输增强剂可通过与其它组分一起包括在熔融混合物中(即通过共熔融)或伴随用以截留肽的过程中并入囊泡中。
另一种方法包含在剪切力存在下水合。可用于施加所述剪切力的设备为熟知的适合装置(参见例如PCT公开案第WO88/06882号)。声波处理和超声波处理也是形成囊泡或改变其粒径的有效手段。
一种或一种以上肽可与囊泡以任何方式组合。举例来说，在旋转膜蒸发技术中，此可通过在肽连同传输增强剂存在下膜的水合来实现。在其它方法中，一种或一种以上肽可与预先形成的囊泡通过脱水-再水合法组合，在所述方法中存在于水相中的肽通过闪冻、接着冻干来截留，例如参见卡比(Kirby)和格雷格狄斯(Gregoriadis),生物技术(Biotechnology)2:979(1984)。或者，可使用冻融技术，其中囊泡与肽混合，并在液氮中重复闪冻，且升温至约例如60℃的温度(即超过有关表面活性剂的转变温度)，例如参见皮克(Pick),生物化学与生物物理学集刊(Arch.Biochem.Biophys.)212:195(1981)。除截留肽外，脱水-再水合法和冻融技术也能够将其它传输增强剂伴随并入囊泡中。
在每一所述方法中，囊泡组分的悬浮液可在足以维持囊泡形成混合物处于熔融状态的高温下若干次挤压通过微孔聚碳酸酯膜。此过程的优点在于可产生尺寸均一的囊泡。根据本发明可使用的囊泡(包括胆汁盐体)可具有任何直径。在一些实施例中，组合物可包括直径在约10nm至约10μm范围内的囊泡。在一些实施例中，囊泡的直径在约100nm至约5μm之间。在一些实施例中，囊泡的直径在约500nm至约2μm之间。在一些实施例中，囊泡的直径在约800nm至约1.5μm之间。
VI.剂量和投药
本发明的方法适用于治疗包括成人和儿童在内的人类的流行性感冒。然而，一般说来，其可适用于任何动物。在一些实施例中，本文中的方法可用于兽医学应用，例如犬科和猫科应用。必要时，本文中的方法也可以用于农畜，例如羊、禽、牛、猪和马等种类。
本文所述的组合物一般以诱发免疫反应所需或足以诱发免疫反应的量和次数投予。给药方案可由一段时间内单个剂量或多个剂量组成。待要投予的肽组合物的精确量可随各个体而变化，且可视若干因素而定。因此，应了解，一般说来，所用的准确剂量将由执业医师确定，且不仅取决于个体的体重和投药途径，而且也取决于个体的年龄和症状的严重程度和/或感染的风险。在一些实施例中，免疫原性组合物中肽的剂量可在约0.01至50mg范围内。举例来说，在一些实施例中，范围可在0.1与5mg之间，例如0.1与2mg之间。实例14描述示范性投药方案，其包含两次连续肌肉内注射0.2或1mg肽剂量(第0天和第28天)。
一般说来，组合物可通过任何途径投予个体。实例中的结果证明本文所述的免疫原性肽组合物不仅在通过传统的不经肠途径投予时可诱发保护性反应，而且在经口投予时也诱发保护性反应。因此，在一些实施例中，组合物可经口(包括经颊、舌下和通过洗胃或其它人工供应手段)投予。所述经口传递可使用例如呈片剂、胶囊、多颗粒、凝胶、膜、胚珠(ovule)、酏剂、溶液、悬浮液等形式的固体或液体组合物实现。在一些实施例中，当使用液体组合物时，组合物可结合碱性组合物(例如碳酸氢盐溶液)投予以中和胃的pH值。在一些实施例中，碱性组合物可在肽组合物之前和/或之后投予。在一些实施例中，碱性组合物可在投药之前与肽组合物组合，或与肽组合物同时服用。
应了解，考虑到经口传递优于任何形式的注射，所以尤其期望口服途径。还应了解，根据所有已知的流行性感冒疫苗迄今都是不经肠投予的事实，结果是令人意外的。根据本文所述的免疫原性组合物中所包括的肽比当前流行性感冒疫苗中所用的标准蛋白质抗原短得多的事实，能够通过经口传递诱发保护性反应尤其是出乎意外。实际上，长期以来所属领域中对短肽用作免疫原与经口传递蛋白质疫苗两者存在着偏见。
在一些实施例中，口服组合物包含一种或一种以上肽、胆汁盐体和佐剂。在一些实施例中，佐剂为TLR-3激动剂。在一些实施例中，佐剂可与胆汁盐体混合。在一些实施例中，佐剂可与胆汁盐体缔合(例如通过将佐剂与一种或一种以上肽和/或胆汁盐体组分在用以产生胆汁盐体的过程中合并)。
在一些实施例中，组合物经调配，用于例如通过注射等方式不经肠传递。在所述实施例中，可例如通过静脉内、肌肉内、皮内或皮下或通过输注或无针注射技术投药。对于所述不经肠投药，组合物以常规冻干组合物形式制备和维持，并在投药前用医药学上可接受的盐水溶液(例如0.9％盐水溶液)复原。如所属领域中已知，可用例如甲烷磺酸等医药学上可接受的酸调整可注射组合物的pH值。可采用的其它可接受的媒剂和溶剂包括林格氏溶液(Ringer′s solution)和U.S.P。此外，无菌的不挥发性油常规用作溶剂或悬浮介质。出于此目的，可采用包括合成单酸甘油酯或二酸甘油酯在内的任何无刺激性的不挥发性油。此外，例如油酸等脂肪酸用于制备注射剂。可例如通过经过细菌截留过滤器过滤或者通过并入杀菌剂，将可注射调配物杀菌，呈无菌固体组合物形式，这些无菌固体组合物可在临使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中。
在一些实施例中，不经肠组合物包含一种或一种以上肽、包含非离子型表面活性剂的囊泡和佐剂。在一些实施例中，佐剂为TLR-4激动剂。在一些实施例中，佐剂可与囊泡混合。在一些实施例中，佐剂可与囊泡缔合(例如通过将佐剂与一种或一种以上肽和/或囊泡组分在用以产生囊泡的过程中合并)。
组合物也可以通过鼻内或通过吸入投予，且宜以干粉吸入物(dry powderinhaler)形式或在使用或不使用适合推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷、二氧化碳或其它适合的气体)下从加压容器、泵、喷雾器、雾化器或喷洒器产生的气雾剂喷雾呈现形式传递。在加压气雾剂的状况下，单位剂量可通过提供阀传递计量的量来确定。加压容器、泵、喷雾器、雾化器或喷洒器可含有抗体的溶液或悬浮液，所述溶液或悬浮液例如使用乙醇与推进剂的混合物作为溶剂，且可另外含有润滑剂，例如脱水山梨糖醇三油酸酯。用于吸入器或吹入器的胶囊及药筒(例如由明胶制成)可经调配，以含有肽组合物与适合粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
供直肠投药的组合物优选是栓剂，其可通过将肽与适合的无刺激性赋形剂或载剂(例如可可油、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备，这些赋形剂或载剂在周围温度下是固体但在体温下是液体，因此在直肠穹(rectal vault)中融化并释放抗体。如所属领域中已知，也可使用保留灌肠和直肠导管。诸如羟丙基纤维素等粘度增强载剂也是供直肠投药的某些本发明载剂，因为其有助于组合物保留在直肠内。一般说来，所选择的加入到组合物中的载剂体积应使组合物最大程度地保留。明确地说，体积不应大到危及所投组合物保留在直肠穹中。
VII.示范性组合物
在一些实施例中，本发明提供的免疫原性组合物包括TLR-3激动剂佐剂以及包含非离子型表面活性剂和促进类脂质分子传输穿过粘膜的传输增强剂的囊泡。在一些实施例中，所述组合物可经口投予。在一些实施例中，TLR-3激动剂佐剂包含poly(I:C)。在一些实施例中，传输增强剂为胆汁酸、其衍生物或任何前述物质的盐(例如脱氧胆酸钠)。在一些实施例中，非离子型表面活性剂为甘油酯(例如1-单棕榈酰基甘油)。在一些实施例中，囊泡另外包含离子型两性分子(例如二鲸蜡基磷酸酯)。在一些实施例中，囊泡另外包含类固醇(例如胆固醇)。在一些实施例中，囊泡包含1-单棕榈酰基甘油、二鲸蜡基磷酸酯、胆固醇和脱氧胆酸钠。在一些实施例中，组合物另外包含明矾。
在一些实施例中，本发明提供的免疫原性组合物包括TLR-4激动剂佐剂以及包含非离子型表面活性剂的囊泡。在一些实施例中，所述组合物可不经肠投予(例如通过肌肉内注射)。在一些实施例中，TLR-4激动剂佐剂包含单磷酰基脂质A或3-脱酰基单磷酰基脂质A。在一些实施例中，非离子型表面活性剂为甘油酯(例如1-单棕榈酰甘油)。在一些实施例中，囊泡另外包含离子型两性分子(例如二鲸蜡基磷酸酯)。在一些实施例中，囊泡另外包含类固醇(例如胆固醇)。在一些实施例中，囊泡包含1-单棕榈酰基甘油、二鲸蜡基磷酸酯和胆固醇。在一些实施例中，组合物另外包含明矾。
在一些实施例中，上述免疫原性组合物包括：第一肽，其包含与SEQ ID NO.16的20-100个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域，其中第一肽包括来自A型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸；第二肽，其包含SEQ ID NO.17的氨基酸序列；第三肽，其包含与SEQ ID NO.18的位置2-49或68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域，其中第三肽包括来自B型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸；和第四肽，其包含SEQ ID NO.14的氨基酸序列，其中第四肽包括来自A型流行性感冒核蛋白的少于20个的相邻氨基酸。
在一些实施例中，第一肽包含SEQ ID NO.6的至少40个相邻氨基酸。在一些实施例中，第一肽包含SEQ ID NO.6的氨基酸1-88。
在一些实施例中，第二肽包含SEQ ID NO.11的氨基酸序列。在一实施例中，组合物包含2n种各自包含SEQ ID NO.11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中n＝1-4。在一些实施例中，n＝4。
在一些实施例中，第三肽包含与SEQ ID NO.18的位置2-49或68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少90％同源性的区域。在一些实施例中，第三肽包含与SEQ ID NO.18的位置2-49的至少20个相邻氨基酸具有至少80％同源性的第一区域和与SEQ ID NO.18的位置68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少80％同源性的第二区域。在一些实施例中，组合物包含两种不同的第三肽，其中一者包含与SEQ ID NO.18的位置2-49的至少20个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域，而另一者包含与SEQ ID NO.18的位置68-121的至少20个相邻氨基酸具有至少80％同源性的区域。在一些实施例中，组合物包含两种不同的第三肽，其中一者包含SEQ ID NO.12的氨基酸序列，而另一者包含SEQ ID NO.13的氨基酸序列。
在一些实施例中，组合物包含2n种各自包含SEQ ID NO.14的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中n＝1-4。在一些实施例中，n＝4。
在一些实施例中，第一肽包含SEQ ID NO.6的氨基酸1-88；组合物包含2n种各自包含SEQ ID NO.11的不同氨基酸序列的不同第二肽，其中n＝4；组合物包含两种不同的第三肽，其中一者包含SEQ ID NO.12的氨基酸序列，而另一者包含SEQ ID NO.13的氨基酸序列；且组合物包含2m种各自包含SEQ ID NO.14的不同氨基酸序列的不同第四肽，其中m＝4。
在一些实施例中，上述组合物用以治疗患季节性流行性感冒或处于季节性流行性感冒风险中的个体。
在一些实施例中，上述组合物用以治疗患有猪源性A(H1N1)型流行性感冒病毒所引起的流行性感冒或处于此流行性感冒风险中的个体。
实例
以下实例描述制造和实践本文所述的某些组合物和方法的一些示范性方式。应了解，所述实例仅仅是出于示范性的目的，且不欲限制本文所述的组合物和方法的范围。
实例1：肽合成
本文所述的所有肽都通过固相肽合成(SPPS)来合成。一般说来，C端氨基酸通过与连接分子所形成的酸不稳定键连接于交联聚苯乙烯(或基于PEG)树脂。此树脂不溶于合成所用的溶剂中，从而可相对简单且快速地冲洗掉过量的试剂和副产物。N端用在酸中稳定，但可通过碱来除去的Fmoc基团保护。任何侧链官能团都用碱稳定而酸不稳定的基团保护。合成接着是基于将N-α上经Fmoc保护的氨基酸并入生长肽链中，其中链的一端仍然连接于固相。
以下为一种用以制造本文所述肽的示范性SPPS法。为开始各偶合，用含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)除去NovaPEG树脂结合的氨基酸/肽上的Fmoc基团。接着清洗，并加入经保护的氨基酸，此氨基酸已在其α-羧基上经四氟硼酸2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲活化。使经活化的氨基酸和树脂结合的氨基酸在碱存在下反应，形成新的肽键。虽然肽通过分步法合成，但诸如偶合试剂四氟硼酸2-(1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲(TBTU)、碱、二异丙基乙胺(DIPEA)和去阻断剂哌啶等所有可溶性试剂都可通过在各偶合步骤结束时过滤和清洗，从肽-固体支撑基质中除去。重复此过程，直到将所需的肽组装在树脂上为止。用含有至少85％三氟乙酸(TFA)的裂解溶液，使肽从树脂上裂解并脱除肽的保护基后，通过从***中沉淀，接着离心来收集粗肽。接着通过HPLC和质谱分析纯化和表征肽。
如本文所述，某些肽组合物可包括单个肽序列的多个变异体(例如在相同序列中的2个或2个以上位置具有2个或2个以上不同氨基酸)。虽然指定组中的各变异体可个别合成，但通常适宜在单一合成中合成变异体子集或整组变异体。举例来说，此可使用分开-组合法实现。因此，如果此组变异体经设计以在指定位置包括两种不同氨基酸中的一种，那么树脂可分成两个同等部分，且各部分可与两种氨基酸中的一种偶合，形成两种不同的肽链。一旦偶合结束，即可将两个部分重新组合，以便后来的氨基酸可加入两链中。或者，可使用一锅法，其中两个替代性氨基酸加入同一反应中。通常两种氨基酸以等摩尔量加入；然而，在某些情况下(例如在其各别反应动力学差异显著的情况下)，优选非等摩尔量。接着可使用凯撒茚三酮试验监测肽反应是否结束。
实例2：竞争微量中和分析
在本实例中，评估各种肽组合物结合流行性感冒中和抗体的能力。用伊斯科夫改良杜尔贝科培养基(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium，IMDM)稀释不同的肽组合物(参见图1和下表1-9)为80μg/ml，且50μl加入96孔平底微量滴定板(纳克(Nunc))中的不同孔中。适当时，各肽组合物可包括所有变异体(例如表1中所示的8个INF-HA-3-V3肽变异体、表4中的4个INF-H1-4-V4肽变异体等)。用IMDM以1/40稀释市售抗流行性感冒血清和人类血清，且50μl加入各孔中，接着培养板在37℃下培育1小时。将50μl含1×105个pfu流行性感冒病毒株威斯康星(A/Wis/67/05)或新喀里多尼亚(A/NC/20/99)的IMDM加入各孔中，且培养板在37℃下再培育1小时。随后，将5×104个补充有2％胎牛血清(FCS)的马丁达比狗肾(MDCK)细胞加入各孔中。每个培养板都含有4个细胞和4个病毒对照孔。培养板在37℃下培育18-22小时。每孔用50μl 70％乙醇固定细胞10分钟，且在室温下空气干燥。用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤培养板5次，且用10％FCS阻断各孔。在4℃下90分钟后，50μl经阻断缓冲液以1/500稀释的针对A型流行性感冒核衣壳抗原的单克隆抗体(凯美空(Chemicon))加入各孔中。在4℃下再培育1小时后，洗涤培养板5次，且在4℃下将100μl山羊抗小鼠IgG过氧化酶结合的亲和力纯化的抗体(1/10,000)加入各孔中，历时30分钟。洗涤培养板5次，且通过100μl邻苯二胺(OPD：密苏里州(MO)圣路易斯市(St.Louise)的西格玛(Sigma))显影，并在20分钟后用1N HCl停止酶反应。通过ELISA板式读数器(伯乐公司(Bio-Rad))在490nm波长下测量OD，来定量反应。图1中展示关于包含表1、2、3、4、5、6、7、8和9中肽的组合物的结果。
如图1中所示，市售或免疫血清的加入可抑制活体外细胞的流行性感冒病毒感染，可通过ELISA进行光学密度(OD)测量来定量。因此，在免疫血清存在下约0.6的OD值(参见病毒对照)减少至约0.2(参见病毒+血清对照)。用血清培育各种肽组合物可使肽结合于血清中所存在的一些中和抗体，从而逆转其中和活性(例如约0.3或0.3以上的OD值)。
表1-SEQ ID NO.1
肽名称 序列
一致 GSRPXVREDGGLPQSXRISIXWTIVKPG
取代1号 ----D----------G----D-------
取代2号 ----W----------S----Y-------
INF-HA-3-V3/1 GSRPDVREDGGLPQSGRISIDWTIVKPG
INF-HA-3-V3/2 GSRPDVREDGGLPQSGRISIYWTIVKPG
INF-HA-3-V3/3 GSRPDVREDGGLPQSSRISIDWTIVKPG
INF-HA-3-V3/4 GSRPDVREDGGLPQSSRISIYWTIVKPG
INF-HA-3-V3/5 GSRPWVREDGGLPQSGRISIDWTIVKPG
INF-HA-3-V3/6 GSRPWVREDGGLPQSGRISIYWTIVKPG
INF-HA-3-V3/7 GSRPWVREDGGLPQSSRISIDWTIVKPG
INF-HA-3-V3/8 GSRPWVREDGGLPQSSRISIYWTIVKPG
表2-SEQ ID NO.2
肽名称 序列
一致 XTGVSASCSHNGXSSFYXNLLWLTGK
取代1号 V-----------K----R--------
取代2号 T-----------E----K--------
INF-H1-4-V1/1 VTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGK
INF-H1-4-V1/2 VTGVSASCSHNGKSSFYKNLLWLTGK
INF-H1-4-V1/3 VTGVSASCSHNGESSFYRNLLWLTGK
INF-H1-4-V1/4 VTGVSASCSHNGESSFYKNLLWLTGK
INF-H1-4-V1/5 TTGVSASCSHNGKSSFYRNLLWLTGK
INF-H1-4-V1/6 TTGVSASCSHNGKSSFYKNLLWLTGK
INF-H1-4-V1/7 TTGVSASCSHNGESSFYRNLLWLTGK
INF-H1-4-V1/8 TTGVSASCSHNGESSFYKNLLWLTGK
表3-SEQ ID NO.3
表4-SEQ ID NO.4
肽名称 序列
一致 PVTIGECPKYVRSXKLRMXTGLRNIPSIQS
取代1号 -------------A----V-----------
取代2号 -------------T----A-----------
INF-H1-4-V4/1 PVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSIQS
INF-H1-4-V4/2 PVTIGECPKYVRSAKLRMATGLRNIPSIQS
INF-H1-4-V4/3 PVTIGECPKYVRSTKLRMVTGLRNIPSIQS
INF-H1-4-V4/4 PVTIGECPKYVRSTKLRMATGLRNIPSIQS
表5-SEQ ID NO.5
肽名称 序列
一致 CELLISXESWSYIVEXPNPENGTCYPGXF
取代1号 ------K--------T-----------Y-
取代2号 ------R--------K-----------H-
INF-H1-4-V5/1 CELLISKESWSYIVETPNPENGTCYPGYF
INF-H1-4-V5/2 CELLISKESWSYIVETPNPENGTCYPGHF
INF-H1-4-V5/3 CELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGYF
INF-H1-4-V5/4 CELLISKESWSYIVEKPNPENGTCYPGHF
INF-H1-4-V5/5 CELLISRESWSYIVETPNPENGTCYPGYF
INF-H1-4-V5/6 CELLISRESWSYIVETPNPENGTCYPGHF
INF-H1-4-V5/7 CELLISRESWSYIVEKPNPENGTCYPGYF
INF-H1-4-V5/8 CELLISRESWSYIVEKPNPENGTCYPGHF
表6-SEQ ID NO.6
表7-SEQ ID NO.7
表8-SEQ ID NO.8
表9-SEQ ID NO.9
肽名称 序列
一致 YACKXGGKSSGSSYPVLXXXY
取代1号 ----R------------KVS-
取代2号 ----Y------------SRT-
INF-HA-2-V1/1 YACKRGGKSSGSSYPVLKVSY
INF-HA-2-V1/2 YACKRGGKSSGSSYPVLKVTY
INF-HA-2-V1/3 YACKRGGKSSGSSYPVLKRSY
INF-HA-2-V1/4 YACKRGGKSSGSSYPVLKRTY
INF-HA-2-V1/5 YACKRGGKSSGSSYPVLSVSY
INF-HA-2-V1/6 YACKRGGKSSGSSYPVLSVTY
INF-HA-2-V1/7 YACKRGGKSSGSSYPVLSRSY
INF-HA-2-V1/8 YACKRGGKSSGSSYPVLSRTY
INF-HA-2-V1/9 YACKYGGKSSGSSYPVLKVSY
INF-HA-2-V1/10 YACKYGGKSSGSSYPVLKVTY
INF-HA-2-V1/11 YACKYGGKSSGSSYPVLKRSY
INF-HA-2-V1/12 YACKYGGKSSGSSYPVLKRTY
INF-HA-2-V1/13 YACKYGGKSSGSSYPVLSVSY
INF-HA-2-V1/14 YACKYGGKSSGSSYPVLSVTY
INF-HA-2-V1/15 YACKYGGKSSGSSYPVLSRSY
INF-HA-2-V1/16 YACKYGGKSSGSSYPVLSRTY
实例3：ELISPOT分析
在本实例中，通过在ELISPOT分析中测量人类PBMC的活化(如通过IFNγ产量来测量)，来测试实例1的肽组合物的免疫原性。在4℃下，用含10μg/ml抗小鼠IFNγ抗体(mAbAN18，得自俄亥俄州(OH)马里蒙特市(Mariemont)的马伯科技公司(Mabtech))的PBS涂布多筛HTS培养板(得自马萨诸塞州(MA)贝德福德市(Bedford)的密理博公司(Millipore))，过夜。接着用PBS洗涤培养板，且在室温下用含有10％FCS和100U/ml青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)的IMDM阻断1小时。去掉培养基，且将2×105个来自接种流行性感冒疫苗人类个体的周围血液单核细胞(PBMC)(每孔200μl)与肽组合物(40μg/ml，参见图2和表1-9)混合，加入各孔中，维持2天。培育后，除去细胞，用PBS+0.05％Tween 20洗涤，且在室温下与1μg/ml生物素标记的抗小鼠IFNγ抗体(mAb R4-6A2-生物素，马伯科技公司)一起培育2小时。洗涤后，加入含100微升/孔的1/1000抗生蛋白链菌素-ALP-PQ(马伯科技公司)的PBS+0.5％FCS，且在室温下培育1小时。如上洗涤培养板，且在室温下用每孔100μl BCIP/NBT碱性磷酸酶(莫斯公司(Moss Inc))显影20分钟。通过用自来水清洗培养板来停止反应。放大并计数各孔中斑点的数目。图2中展示关于包含表1、2、3、4、5、6、7、8和9的肽的组合物的结果。
如图2中所示，在此分析中，某些肽组合物引起强烈的反应，证实这些组合物具有免疫原性。
实例4：其它肽
本实例中的表10-14描述可用于本文所述的组合物和方法中的其它示范性肽。
表10-SEQ ID NO.10
肽名称 序列
一致 YACKXGGKSSGSSYPVLXVXX
取代1号 ----R------------N-SY
取代2号 ----H------------S-TM
INF-HA-1-V1/1 YACKRGGKSSGSSYPVLNVSY
INF-HA-1-V1/2 YACKRGGKSSGSSYPVLNVSM
INF-HA-1-V1/3 YACKRGGKSSGSSYPVLNVTY
INF-HA-1-V1/4 YACKRGGKSSGSSYPVLNVTM
INF-HA-1-V1/5 YACKRGGKSSGSSYPVLSVSY
INF-HA-1-V1/6 YACKRGGKSSGSSYPVLSVSM
INF-HA-1-V1/7 YACKRGGKSSGSSYPVLSVTY
INF-HA-1-V1/8 YACKRGGKSSGSSYPVLSVTM
INF-HA-1-V1/9 YACKHGGKSSGSSYPVLNVSY
INF-HA-1-V1/10 YACKHGGKSSGSSYPVLNVSM
INF-HA-1-V1/11 YACKHGGKSSGSSYPVLNVTY
INF-HA-1-V1/12 YACKHGGKSSGSSYPVLNVTM
INF-HA-1-V1/13 YACKHGGKSSGSSYPVLSVSY
INF-HA-1-V1/14 YACKHGGKSSGSSYPVLSVSM
INF-HA-1-V1/15 YACKHGGKSSGSSYPVLSVTY
INF-HA-1-V1/16 YACKHGGKSSGSSYPVLSVTM
表11-SEQ ID NO.11
表12
表13-SEQ ID NO.14
肽名称 序列
一致 SVQRNLPFXXXTXMA
取代1号 --------EKS-V--
取代2号 --------DRT-I--
INF-NP-1-V1/1 SVQRNLPFEKSTVMA
INF-NP-1-V1/2 SVQRNLPFEKSTIMA
INF-NP-1-V1/3 SVQRNLPFEKTTVMA
INF-NP-1-V1/4 SVQRNLPFEKTTIMA
INF-NP-1-V1/5 SVQRNLPFERSTVMA
INF-NP-1-V1/6 SVQRNLPFERSTIMA
INF-NP-1-V1/7 SVQRNLPFERTTVMA
INF-NP-1-V1/8 SVQRNLPFERTTIMA
INF-NP-1-V1/9 SVQRNLPFDKSTVMA
INF-NP-1-V1/10 SVQRNLPFDKSTIMA
INF-NP-1-V1/11 SVQRNLPFDKTTVMA
INF-NP-1-V1/12 SVQRNLPFDKTTIMA
INF-NP-1-V1/13 SVQRNLPFDRSTVMA
INF-NP-1-V1/14 SVQRNLPFDRSTIMA
INF-NP-1-V1/15 SVQRNLPFDRTTVMA
INF-NP-1-V1/16 SVQRNLPFDRTTIMA
表14-SEQ ID NO.15
实例5：肽组合物INF-61P
肽组合物INF-61P包括如表15中所阐述的肽的混合物。
表15
肽 SEQ ID NO.
表11的所有十六(16)种变异体 111
表6的肽 6
表8的肽 8
1SEQ ID NO.11为一致序列且涵盖16种不同变异体。
实例6：肽组合物INF-63P
肽组合物INF-63P包括如表16中所阐述的肽的混合物。
表16
肽 SEQ ID NO.
表11的所有十六(16)种变异体 111
表6的肽 6
表12的两种肽 12、13
1SEQ ID NO.11为一致序列且涵盖16种不同变异体。
实例7：肽组合物SFV2
肽组合物SFV2包括如表17中所阐述的肽的混合物。
表17
肽 SEQ ID NO.
表11的所有十六(16)种变异体 111
表6的肽 6
表12的两种肽 12、13
表13的所有十六(16)种变异体 142
1SEQ ID NO.11为一致序列且涵盖16种不同变异体。
2SEQ ID NO.14为一致序列且涵盖16种不同变异体。在某些实施例中，SFV2中的肽可通过在各肽的N端添加KSS连接子而不同于所述序列，所述连接子可任选用于N端赖氨酸部分的脂质化。
实例8：胆汁盐体INF-61P组合物
本实例描述用于实例9和11中经口传递肽组合物的胆汁盐体INF-61P组合物的制备。将脂质(单棕榈酰基-甘油、胆固醇和二鲸蜡基磷酸酯)溶于氯仿中并干燥成膜，接着与实例5的INF-61P肽和脱氧胆酸钠(一种“胆汁盐”)一起再水合。使用动力学光散射，来评估所得胆汁盐体的尺寸，且使用茚三酮分析，评估截留效率。接着调整经负载的胆汁盐体的体积，以产生含有所需量肽的组合物。如下所述，这些经负载的胆汁盐体甚至在经口投予时也能够传递免疫原性肽组合物至雪貂和小鼠。
实例9：口服胆汁盐体INF-61P组合物对雪貂进行流行性感冒免疫
本实例描述某些免疫原性肽组合物在雪貂中的活体内测试。流行性感冒病毒感染的雪貂模型是评估候选流行性感冒疫苗的黄金标准哺乳动物模型。实际上，雪貂可感染A和B型流行性感冒的所有主要亚型的临床分离株，且显示的临床病程可类似于在人类中所见到的临床病程(包括体温增加，和在一些状况下重量损失)。
众多研究人员证明，通过肌肉内(IM)注射给予目前许可的流行性感冒疫苗会诱导也具有血凝抑制活性的中和IgG抗体。这些现有疫苗对细胞免疫的诱导和免疫诱导在保护中的作用尚不清楚。如下所讨论，我们已经展示经口投予的免疫原性肽组合物会全身性(血清)和在粘膜(直肠和鼻洗液样品)诱导IgA抗体。因为流行性感冒感染通过粘膜表面出现，所以IgA反应(粘膜免疫反应的标志)可能比全身性IgG反应有效。如实例13中所示，当免疫原性肽组合物通过标准不经肠途径(例如通过肌肉内注射)投予时，获得全身性IgG反应。
对于接种和激发实验，选择通过血凝抑制分析预先筛检为血清阴性的雄性雪貂。经口传递的组合物经调配，使得肽包含于0.5ml的体积中。所有雪貂都在进行免疫的前3天时放血，并收集血清、血浆和PBMC。在禁食后第0、3、14和17天，通过洗胃，对接收INF-61P组合物的雪貂经口免疫。对于市售疫苗对照，在第0天和第17天经肌肉内注射流感灵疫苗至四头肌中。
在第27天，将雪貂放血，以获得血清，并收集唾液和直肠洗液。接着经鼻内用经PBS稀释至2×106pfu/ml的流行性感冒病毒激发所有雪貂(每鼻孔0.5ml)。在病毒激发10天后，收集鼻洗液，并称重所有动物，且每日监测感染的临床征象(通过各动物体内的植入物电子测量体温)。处死时，将动物放血，以获得血清、血浆、PBMC和(在一些情况下)全血细胞计数(CBC)，并收集和处理脾以获得单核细胞。
如图3中所示，当动物接种免疫原性肽组合物INF-61P(参见实例5)并用H3N2(A/威斯康星/2005)病毒激发时，其显示发热计数减少，表明组合物INF-61P发挥保护作用。此外，接种INF-61P的动物(参见图4)在病毒激发后的数天中的重量损失不如对照小鼠剧烈。
如图5中所描绘，组合物INF-61P诱发粘膜IgA反应，如直肠洗液(上图)和鼻洗液(下图)样品中所示。大多数(3/4)接种INF-61P的动物都显示IgA效价相对于直肠或者鼻洗液样品中的预先接种反应增加至少两倍。正如所料，通过标准肌肉内注射给予市售疫苗诱导全身性(血清)IgG反应(资料未示)。然而，如图5中所示，其未诱导IgA反应。
当用包括SFV2肽的免疫原性肽组合物(参见实例7)复制此实验时，观测到类似结果(资料未示)。值得注意的是，在接种组合物SFV2的动物中检测到针对B型流行性感冒的重组HA蛋白质的血清IgA(参见图6)。
实例10：皮下投予的INF-09L-A组合物的免疫反应研究
本实例描述通过向小鼠皮下投予表13的肽组合物(INF-NP1-V1)的改进型式(INF-09L-A)所诱导的免疫反应。INF-09L-A肽组合物与表13中所示的INF-NP1-V1组合物的不同之处是在各肽的N端包括KSS连接子。N端赖氨酸部分用以双重脂质化各肽。
用INF-09L-A肽组合物接种成年(>12个月)HLA(A*0201)转基因小鼠三次。所投组合物中包括所有十六种变异体。组合物还包括明矾佐剂。对照组仅仅接收佐剂。用多个亚型的流行性感冒不同病毒株来感染脾细胞：H3N2(A/HK/1/18、A/维多利亚/3/75)和H1N1(A/NC/20/99、A/PR/8/34)。通过在ELISPOT分析中定量IFNγ分泌T细胞的频率，来测量T细胞反应(方法参见实例3)。斑点表示对各病毒株具有特异性的IFNγ分泌T细胞的频率，且误差线表示每组小鼠中的标准偏差(n＝3)。结果从左至右如下呈现：H3N2(A/HK/1/18)、H3N2(A/维多利亚/3/75)、H1N1(A/NC/20/99)和H1N1(A/PR/8/34)。如图7中所示，所述肽组合物诱导广泛的细胞(CTL)免疫反应。
实例11：佐剂对经口投予的肽组合物所诱导的免疫反应的影响
本实例比较在有和没有佐剂下向小鼠经口投予肽组合物所诱导的免疫反应。
小鼠(n＝4)接收截留于胆汁盐体中的肽组合物，有或者没有基于TLR-3的佐剂(poly I:C)。经口免疫小鼠4次(第0、3、14和17天)。接种后收获脾细胞，并在活体外用肽组合物中所存在的四种个别肽分开刺激。使用IFNγELISPOT测量反应(方法参见实例3)。图8中比较各肽激发的结果。如图8中所示，接收肽组合物与佐剂组合的动物反应比接收单独肽组合物的动物反应大。
实例12：囊泡SFV2组合物
本实例描述用于实例13中肌肉内(IM)注射肽组合物的组合物的制备。囊泡由以下脂质构成：1-单棕榈酰基甘油(非离子型表面活性剂)、胆固醇(类固醇)和二鲸蜡基磷酸酯(离子型两性分子)。具体地说，将5:4:1摩尔比率的脂质(270mg 1-单棕榈酰基甘油(MPG)、255mg胆固醇(CHO)和90mg二鲸蜡基磷酸酯(DCP))放在25ml平底玻璃烧杯中，确保没有粉末粘附在玻璃烧杯的侧面上。将烧杯夹紧，且用铝箔覆盖，并在热油浴中于135℃下使脂质熔融，维持10分钟，偶尔在烧杯中旋涡。在一些组合物中，合成TLR-4激动剂PHAD(得自雅凡蒂极性脂质公司的磷酸化己酰二糖，图13中所示)与其它脂质共熔融，在其它组合物中PHAD与肽组合物SFV2(实例7中所描述)一起加入。在热水浴中于30℃下，将肽组合物SFV2(400μg/ml)与PHAD(100μg/ml)的10ml所得混合物在碳酸氢钠溶液(pH 8.5)中预先培育5分钟。在8,000rpm下匀化肽溶液，接着转移至熔融脂质溶液中，此刻在30℃下继续均化10分钟(应了解，或者加热的脂质溶液可转移至抗原溶液中，随后匀化)。最后，10ml含400mM蔗糖溶液的缓冲液加入囊泡/肽溶液中并涡动30秒。囊泡(有或者没有肽)等分至小瓶(每小瓶0.5ml)中并冻干。冻干囊泡(有或者没有肽)在投药前在0.5ml盐水中再水合并吸收至明矾(氢氧化铝)。
实例13：用囊泡SFV2组合物不经肠免疫雪貂
本实例描述在雪貂中用实例12的囊泡SFV2组合物进行的活体内测试。对于接种和激发实验，选择通过血凝抑制分析预先筛检为血清阴性的雄性雪貂。肌肉内注射的组合物如实例12中所述调配，使得肽包含于0.5ml的体积中。所有雪貂都在离免疫还有3天时放血，并收集血清、血浆和PBMC。在第0天和第28天，通过肌肉内注射(IM)有或者没有SFV2肽组合物的囊泡使雪貂免疫。对于市售疫苗对照，在第0天和第28天经肌肉内注射凡尔灵市售疫苗至四头肌。此市售疫苗是针对2008-2009季节的A型和B型病毒株(具体地说，A/布里斯班(Brisbane)/59/2007H1N1；A/布里斯班/10/2007H3N2和B/佛罗里达(Florida)/4/2006)的三价灭活流感疫苗。表18中概述用于此研究的实验组。
表18
在第28天，将雪貂放血并收集血清样品。接着经鼻内用经PBS处理为2×105pfu/ml的流行性感冒病毒激发所有雪貂(每鼻孔0.5ml)。在病毒激发10天后，收集鼻洗液，并称重所有动物，且每日监测感染的临床征象(通过各动物体内的植入物电子测量体温)。处死时，将动物放血，以获得血清、血浆、PBMC和(在一些情况下)全血细胞计数(CBC)，并收集和处理脾以获得单核细胞。
如图10A-B中所示，经肌肉内给予的组合物SFV2诱导体液反应。免疫后血清显示，对于经肌肉内投予的肽组合物SFV2免疫的雪貂，ELISA中对rHA所罗门(A)与威斯康星(B)的免疫反应均为显著的。在ELISA中，经凡尔灵处理的动物仅仅展示很小的免疫反应，且经空囊泡(即无SFV2肽)处理的动物未展示反应性。任何动物组中都未检测到针对rHA马来西亚的IgG反应(资料未示)。
如图11中所示，经肌肉内给予的组合物SFV2给予保护以免病毒激发。用实例12的免疫原性肽组合物SFV2接种动物，且用2×105个pfu H1N1(A/所罗门岛/03/06)激发，并在病毒血症最高峰(第2天)时通过空斑分析来测量鼻洗液样品的病毒载量。各符号表示个别动物中所测量的病毒载量。接种SFV2的动物显示鼻洗液样品中的病毒载量相较于经空囊泡处理的对照动物显著减少(p<0.05)。同样通过标准肌肉内注射给予的市售季节性流行性感冒疫苗未减少鼻洗液样品中的病毒载量。
如图12中所示，经肌肉内给予的组合物SFV2诱导针对潜在大流行性感冒病毒株的体液免疫。在第二次接种两周后(在病毒激发前)从动物中收集血清，并通过ELISA来测试样品中与假定大流行性猪(H1N1/加利福尼亚/2009)分离株的重组血凝素(rHA)蛋白质的反应性。接种SFV2的动物显示针对rHA H1N1/加利福尼亚(大流行性猪H1N1)的血清IgG反应性比经空囊泡处理的对照动物高。图12中的资料展示，接种市售季节性流行性感冒疫苗的动物血清未能对此新颖流行性感冒病毒株起反应。
实例14：投药方案
本实例描述在人类中使用实例12的囊泡SFV2组合物的示范性投药方案。进行部分盲法的随机化安慰剂对照研究，特征是以下处理组：
·处理组1：对应于抗原剂量1的两次肌肉内注射囊泡SFV2组合物(1mg肽)，在第0天和第28天给予(n＝50)。
·处理组2：对应于剂量2的两次肌肉内注射SFV2(0.2mg肽)与NAM1组合，在第0天和第28天给予(n＝50)。
·处理组3：两次肌肉内注射磷酸盐缓冲盐水，安慰剂组，在第0天和第28天给予(n＝25)。
个体以2:2:1方式随机化。
在投药后第7天评估短期耐受性。投药28天后，收集自发报导的不良事件。收集整个168天(±14天)跟踪期内严重不良事件和医学上有意义事件。评估每一注射前后和168天跟踪期结束时的生物安全性。
在第0天、第28天(±3天)、第56天(±7天)和168天(±14天)跟踪期结束时收集的血清样品中评估免疫原性。免疫学读数(read-out)为血清HI抗体(血凝抑制分析)、rHA特异性血清IgG(ELISA)以及通过微量中和分析测出的中和抗体。关于细胞(CTL)免疫评估，通过ELISPOT和细胞内细胞因子染色来评估T细胞反应。
序列表
根据37CFR 1.52(e)(5)，呈文本文件(名为“序列表.txt”，在2009年6月18日建立，且具有14kb)的形式并与本文一同申请的序列表以全文引用的方式并入本文中。
其它实施例
所属领域的技术人员根据本文所揭示的本发明的说明或实践，将显而易知本发明的其它实施例。本说明书和实例仅欲视为示范性的，本发明的真正范围通过以下权利要求书来指明。本文中所提及的任何参考文献的内容都以全文引用的方式并入本文中。

Claims (15)

1.一种免疫原性组合物，包括肽，所述肽包括SEQ ID NO.6的氨基酸序列，其中所述肽包括来自A型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸。
2.一种免疫原性组合物，包括：
第一肽，所述第一肽包括SEQ ID NO.6的氨基酸序列，其中所述第一肽包括来自A型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸；
肽的混合物，所述混合物包括SEQ ID NO.11限定的所有16个氨基酸序列；以及
第三肽，所述第三肽包括SEQ ID NO.8的氨基酸序列，其中所述第三肽包括来自B型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸。
3.一种免疫原性组合物，包括：
第一肽，所述第一肽包括SEQ ID NO.6的氨基酸序列，其中所述第一肽包括来自A型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸；
肽的第一混合物，所述第一混合物包括SEQ ID NO.11限定的氨基酸序列中的所有16个肽；
第二肽，所述第二肽包括SEQ ID NO.12的氨基酸序列；以及
第三肽，所述第三肽包括SEQ ID NO.13的氨基酸序列；以及
肽的第二混合物，所述第二混合物包括SEQ ID NO.14限定的所有16个氨基酸序列，其中所述肽的第二混合物包括来自A型流行性感冒核蛋白的少于20个的相邻氨基酸。
4.根据权利要求3所述的免疫原性组合物，其中包括SEQ ID NO.14的氨基酸序列的所述肽的第二混合物中的每个肽包括少于30个氨基酸。
5.根据权利要求1-4中任一所述的免疫原性组合物，其中所述组合物另外包含佐剂。
6.根据权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂为TLR-4激动剂。
7.根据权利要求6所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂含有单磷酰基脂质A或3-脱酰基单磷酰基脂质A。
8.根据权利要求1-3中任一所述的免疫原性组合物，其中至少一种肽与囊泡(vesicle)缔合。
9.根据权利要求8所述的免疫原性组合物，其中所述囊泡包含非离子型表面活性剂、磷酸酯、类固醇、或其组合。
10.根据权利要求9所述的免疫原性组合物，其中所述非离子型表面活性剂为1-单棕榈酰基甘油，所述磷酸酯为二鲸蜡基磷酸酯，以及所述类固醇为胆固醇。
11.根据权利要求9或10所述的免疫原性组合物，其中所述囊泡包括促进类脂质分子传输穿过粘膜的传输增强剂。
12.一种免疫原性组合物，包括：
TLR-3激动剂佐剂；
囊泡，其包含非离子型表面活性剂和促进类脂质分子传输穿过粘膜的传输增强剂；
包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的肽，其中该肽包括来自A型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸；
肽的混合物，其包括含有SEQ ID NO.11的氨基酸序列的所有16个肽；以及
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的肽，其中该肽包括来自B型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸。
13.根据权利要求12所述的免疫原性组合物，其用于治疗患流行性感冒或处于流行性感冒风险中的个体。
14.一种免疫原性组合物，包括：
TLR-4激动剂佐剂；
囊泡，其包含非离子型表面活性剂；
包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的肽，其中该肽包括来自A型流行性感冒血凝素蛋白质的少于100个的相邻氨基酸；
肽的混合物，其包括含有SEQ ID NO.11的氨基酸序列的所有16个肽；
包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的肽；
包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的肽；以及
肽的混合物，其包括含有SEQ ID NO.14的氨基酸序列的所有16个肽。
15.根据权利要求14所述的免疫原性组合物，其用于治疗患流行性感冒或处于流行性感冒风险中的个体。
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