CN103189072A - 新型免疫刺激方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过引起受试者固有免疫应答来治疗或预防疾病的方法，所述方法包含为受试者施用有效量的包含溶液中的TLR2部分的组合物，其特征在于所述TLR2部分包含TLR2激动剂并且其特征在于所述疾病不是通过针对所述TLR2部分的体液或细胞免疫应答来治疗或预防的。

Description

新型免疫刺激方法
技术领域
本发明涉及一种用于在受试者引起固有免疫应答的新方法，所述方法涉及包含TLR2激动剂的TLR2部分（moiety）的使用。
背景技术
甲型流感病毒（IAV）感染每年诱发高达十亿例感染和300,000-500,000人死亡，并且2009年全球爆发的猪H1N1已经凸显了可以用来应对大流行性流感（pandemic influenza）的有限的抗病毒方案。虽然疫苗可以用来对抗季节性IAV流行，但是这些疫苗诱导了对抗IAV总是演化的神经氨酸酶和血凝素表面蛋白的抗体，因而需要每年的重新配制（re-formulation）和施用。此外，这些疫苗通常无法有效地对抗由新近出现的病毒引起的大流行性爆发。可供选择的方法旨在靶向IAV的保守的（conserved）内部区域。然而，最近的猪甲型流感病毒H1N1的大流行性爆发已经引导探寻去发现对抗大流行性流感的广谱疫苗和抗病毒方案。
本发明涉及治疗流感以及其他感染性疾病和癌症的新方法的开发。
发明内容
本发明的第一个方面提供了一种通过在受试者中引起固有免疫应答来治疗或预防疾病的方法，所述方法包含为受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含溶液中的TLR2部分，其特征在于所述TLR2部分包含TLR2激动剂并且其特征在于所述疾病不是通过针对所述TLR2部分的体液或细胞免疫应答治疗或预防的。
本发明的第二个方面提供了一种用于治疗或预防由感染原（infectious agent）引发的疾病的方法，所述方法包含为有其需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含溶液中的TLR2部分，其特征在于所述TLR2部分包含TLR2激动剂并且其特征在于所述TLR2部分不诱导针对所述感染原的特异的细胞或体液免疫应答。
本发明的第三个方面提供了一种通过在受试者中引起固有免疫应答来治疗或预防癌症的方法，所述方法包含为受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含溶液中的TLR2部分，其特征在于所述TLR2部分包含TLR2激动剂并且其特征在于所述TLR2部分不诱导针对所述癌症的特异的细胞或体液免疫应答。
本发明的第四个方面提供了一种药物组合物，其包含有效量的溶液中的TLR2部分和药学上可接受的载体或赋形剂，所述药物组合物通过在受试者中引起固有免疫应答来治疗或预防疾病，其特征在于所述TLR2部分包含TLR2激动剂并且其特征在于所述疾病不是通过针对所述TLR2部分的体液或细胞免疫应答治疗或预防的。
本发明的第五个方面提供了有效量的溶液中的TLR2部分在制备用于治疗或预防受试者中疾病的药物中的用途，其特征在于所述TLR2部分包含TLR2激动剂，其特征在于所述TLR2激动剂在受试者中引起固有免疫应答并且其特征在于所述疾病不是通过针对所述TLR2部分的体液或细胞免疫应答治疗或预防的。
附图说明
图1显示了脂肽疫苗候选物的示意图。Pam2Cys-基构建体（construct）的示意图。（A）聚乙二醇化Pam2Cys（Pam2Cys-PEG11）由通过两个丝氨酸偶联至十一聚乙二醇（undecaethyleneglycol）（聚乙二醇，PEG）的单一的Pam2Cys分子组成。（B）基于Pam2Cys的脂肽疫苗候选物由通过单一的赖氨酸（K）残基连接的靶标CD8+T细胞表位和辅助性T表位（T helper epitope）组成。Pam2Cys脂质部分通过两个丝氨酸残基（Ser）附加以形成支链的肽结构。
图2显示了脂肽的鼻内施用拓展了肺细胞种群。采用25nmol的OT2-P2C-gB498-505脂肽或25nmol的肽OT2-gB498-505（不具有Pam2Cys）对C57BL/6小鼠进行鼻内接种并在指定的时间点进行肺细胞种群的表征（n=3/组/时间点）。（A）显示了肺细胞的总数。符号代表平均细胞计数并且误差条表示SEM，#=P<0.01对比第0天。（B）显示了肺细胞的组成。每个条代表平均细胞计数（n=3）并且误差条表示SD，*=P<0.05对比第0天的细胞种群。使用单因素ANOVA分析和事后（post-hoc）Dunnett氏多重比较检验进行统计分析。重复实验得到类似结果。
图3显示了基于Pam2Cys的脂肽提高了IAV的清除。（A）采用生理盐水、IAV-LP（含有IAV-衍生的表位）或非IAV-LP对小鼠进行接种并在脂肽接种后的第3天（上方图）或第7天（下方图）采用104.5pfu的Mem71（H3N1）流感病毒（n=3-5/组）挑战（challenge）。在感染的第5天评估肺病毒滴度（lung virus titre）并且显示出针对BALB/c小鼠（◇）、C57BL/6小鼠（□）和HHD小鼠（○）的肺病毒滴度。符号代表从单个小鼠中获得的滴度并且线表示该组的平均病毒滴度。（B）在脂肽组上显示了相对于生理盐水对照组的病毒清除百分比。在LP接种后第7天，从采用Mem71挑战的C57BL/6小鼠中检测到IAV-特异性CD8+T细胞应答。在挑战的第5天，使用针对IFN-γ和TNF-α的细胞内染色分析法从脾脏中检测到PA224-233-特异性CD8+T细胞。条形图表示每组中的平均细胞因子-特异性应答和误差条表示SD。*=P<0.05，**P<0.01对比生理盐水（单因素ANOVA分析和事后Dunnett氏多重比较检验。
图4显示了基于Pam2Cys的脂肽降低了高致病性IAV感染的影响。上方图：显示了采用生理盐水、IAV-LP或非IAV-LP（n=5/组）鼻内接种并在7天后采用H1N1PR8病毒挑战的C57BL/6小鼠（左手边）和HHD小鼠（右手边）的存活的Kaplan-Meier曲线。下方图：感染后的体重变化。符号表示平均值并且误差条表示SEM。两种小鼠品系的独立的重复实验中反映了这些结果。
图5显示了Pam2Cys对肺细胞因子的环境。为C57BL/6小鼠施用20nmol的Pam2Cys-PEG11（P2C-PEG11）或50μl的生理盐水（i.n）并且在施用后的第3天（D3）或第7天（D7）使用BDTM流式微球分析法测定支气管肺泡灌洗（BAL）液中的细胞因子浓度。条形图表示各组（n=3）的平均应答并且误差条表示SD，*=P<0.05；**=P<0.01；***=p<0.001对比生理盐水组和未处理
Figure BDA00003100956300031
组（单因素ANOVA分析和事后Tukey氏多重比较检验）。
图6显示了Pam2Cys介导病毒清除。采用生理盐水或20nmol的Pam2Cys-PEG11对小鼠进行接种并在之后的第1（上方图）、3（中部图）或7（下方图）天采用104.5pfu的Mem71（H3N1）病毒（n=3-5/组）挑战。在感染的第5天评估BALB/c小鼠（◇）、C57BL/6小鼠（□）和HHD小鼠（○）中的病毒滴度。符号代表从单个小鼠中获得的滴度并且线表示该组的平均病毒滴度，*=P<0.05对比生理盐水（未配对学生t-检验）。相对于生理盐水组的病毒清除百分比表示为Pam2Cys应答。
图7显示了鼻内Pam2Cys施用拓展了肺中的细胞亚种群。为C57BL/6小鼠施用20nmol的聚乙二醇化Pam2Cys（P2C-PEG11）或50μl的生理盐水（i.n）并且在施用后72小时进行肺细胞种群的表征。条形图代表各组的平均应答（n=3）并且误差条表示SD，*=P<0.05；对比对照组（未配对学生t-检验）。
图8显示了Pam2Cys预防了剧毒性IAV感染。采用生理盐水或20nmol的聚乙二醇化Pam2Cys（P2C-PEG11）对C57BL/6小鼠进行鼻内接种（n=5/组）并且在7天后采用200pfu H1N1 PR8病毒挑战。一组小鼠接受20nmol的P2C-PEG11并且在72小时后进行挑战。感染后的体重变化显示为原始重量的百分比。符号表示平均值并且误差条表示SEM。独立的重复实验中反映了这些结果。
图9显示了Pam2Cys预防法降低了病毒载量（load）和流感的接触传播。采用生理盐水（白条）或20nmol的聚乙二醇化Pam2Cys（P2C-PEG11）（灰条）对BALB/c小鼠进行接种并且在7天、5天、72小时或24小时后采用104.5pfu的Udorn（H3N2）病毒进行挑战（n=2/组）。这些小鼠被指定为传播者（spreader）小鼠。在挑战后的二十四小时，使传播者小鼠与未处理的（naive）接受者（recipient）小鼠合居（co-house）。在合居24小时之后，取出传播者小鼠并取出鼻甲、气管和肺并测定病毒滴度（上方图）。暴露于传播者小鼠之后3.5天收获来自于接受者小鼠的器官并评估病毒滴度（下方图）。白色或灰色的箭头表示从各个处理组到合居的接受者的成功的接触介导的传播。
图10显示了PEG-Pam2Cys在鼻内递送时以单一剂量预防了IAV。经鼻内（i.n）、皮下（s.c）或静脉内（i.v）途经为小鼠预防性施用PEG-Pam2Cys（20nmol）并且在3天后采用致死剂量的PR8病毒进行挑战。然后在PR8之后对小鼠的体重和存活进行为期8天的监测并在人道终点（humane end-point）处死。
图11显示了几个Pam2Cys变体还赋予了对抗IAV挑战的保护。通过鼻内途经为小鼠预防性施用20nmol的含有构建体的各种Pam2Cys并且在3天后采用致死剂量的PR8病毒进行挑战。然后在PR8之后对小鼠的体重（A）和存活（B）进行为期8天的监测。当与每一个其他的处理组比较时，生理盐水组中看到的体重降低是统计学上有显著性的（P<0.01）。
图12显示了当以重复的剂量给出时，PEG-Pam2Cys是有效的。为Balb/c小鼠施用单剂量的PEG-Pam2Cys，或者施用相隔三周的两个剂量的PEG-Pam2Cys，然后在第二剂量的3天后采用PR8进行挑战。然后在挑战之后对小鼠的体重和存活进行为期8天的监测并且在PR8之后第7天处死小鼠用于评估肺病毒载量。当与每一个其他的处理组比较时，生理盐水组中看到的体重降低是统计学上有显著性的（P<0.01）（A）。采用PEG-Pam2Cys处理的小鼠中的病毒载量基本上低于仅接受生理盐水的小鼠中的病毒载量（B）。
图13显示了较低剂量的PEG-Pam2Cys也是有效的。采用2、5和10nmol（c.f.20nmol）的较低剂量的PEG-Pam2Cys对小鼠进行预防性处理并且在3天后采用致死剂量的PR8病毒进行挑战。在挑战之后对小鼠的体重变化和存活进行为期18天的监测并在人道终点处死。生理盐水组中的小鼠在PR8挑战之后没有存活超过8天。
图14显示了对抗IAV挑战的保护不依赖于IFN-γ或1型干扰素（即IFN-α）。为缺乏IFN-γ（B6.IFN-γ-/-）（A）或1型干扰素受体（IFNAR-/-）（B）的小鼠预防性施用20nmol的PEG-Pam2Cys（i.n）并且在3天后采用致死剂量的PR8病毒进行挑战。这些小鼠预防了与PR8感染有关的重量降低和致死性。在第5天处死B6.IFN-γ-/-群体，此时生理盐水组达到人道终点时。
图15显示了PEG-Pam2Cys作为治疗剂是有效的。采用104.5PFU的Udorn病毒对Balb/c小鼠进行i.n挑战并在4小时后施用20nmol的PEG-Pam2Cys（i.n）。两天后，处死动物并测定鼻、口咽、气管和肺中的病毒载量。
图16显示了PEG-Pam2Cys作为抗细菌剂是有效的。采用20nmol的PEG-Pam2Cys对C57BL/6小鼠进行预先处理（i.n）并在3天后采用1×106CFU的嗜肺军团菌（L.pneumophila）（JR32Δfla株）进行挑战。在采用嗜肺军团菌的鼻内挑战后对小鼠进行每日监测并且在挑战后的第1、2和3天评估小鼠肺中的细菌载量（A）。每个符号代表在每个时间点获得的平均细菌载量并且误差条显示标准偏差（SD）。统计学显著性用*（p<0.05）表示，其通过使用学生t-试验比较生理盐水组和PEG-Pam2Cys处理组获得。每个符号上显示了相对于生理盐水组的细菌减少的平均百分比。为了展示PEG-Pam2Cys保护的窗口，在采用嗜肺军团菌的挑战之前3天（B）或7天（C）采用PEG-Pam2Cys对小鼠进行预处理。感染后第3天的细菌载量如图B和C中所示。
具体实施方式
在整个说明书中，除非上下文另有要求，词语“包含（comprise）”，或者如“包含（comprises）”或“包含（comprising）”的变体，将被理解为暗示包含了表述的元素或整数或者元素或整数的组群，但是并不排除任何其他的元素或整数或者元素或整数的组群。
本说明书中对任何先前的出版物（或由其衍生的信息）或者任何已知的物质的引用不是并且也不应该被视为承认或允许或者任何形式的暗示，所述先前的出版物（或由其衍生的信息）或者已知的物质形成了本说明书所涉及的领域中的公知常识的一部分。
将本说明书中提到的所有出版物的全部内容通过引用的形式并入本文。
必须指出的是，如本说明书中所使用的，单数形式的“一（a）”、“一（an）”和“所述（the）”包括复数方面，除非上下文另有清楚的规定。因此，例如，对“试剂（an agent）”的引用包括单一的试剂，以及两个或多个试剂；对“所述组合物（thecompositiom）”的引用包括单一的组合物，以及两个或多个组合物等等。
在本说明书中，术语“TLR2”意指Toll样受体2蛋白。TLR2是Toll样受体（即“TLR”）的膜受体蛋白家族，其包括TLR1、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9。在人类中，TLR2由TLR2基因编码。TLR2在某些细胞的表面上表达并在病原体识别和固有免疫的激活中起着至关重要的作用。
TLR2激动剂是结合Toll样受体2的试剂。所述TLR2激动剂可以结合TLR2作为同源二聚体或异源二聚体。
本发明基于如下观察，TLR2激动剂如S-[2,3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸（Pam2Cys）展示了引起受试者中固有免疫应答并且（特别是）以一种非抗原特异性方式引起对抗感染原如病毒（例如，甲型流感）和细菌（例如，嗜肺军团菌）的预防性和治疗性效果的能力。
因此，在本发明的第一个方面中，提供了一种通过在受试者中引起固有免疫应答来治疗或预防疾病的方法，所述方法包含为受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含溶液中的TLR2部分，其特征在于所述TLR2部分包含TLR2激动剂并且其特征在于所述疾病不是通过针对所述TLR2部分的体液或细胞免疫应答治疗或预防的。
在一些实施方案中，所述TLR2激动剂是脂肽或者包含脂质部分。
根据本发明的实施方案的示例性脂肽是脂肽“Pam2Cys”。本领域技术人员将会理解的是，术语“脂肽”意味着包含一个或多个脂质部分和结合的一个或多个氨基酸序列的物质的任何组成。“Pam2Cys”（也被称为二棕榈酰基-S-甘油基-半胱氨酸或S-[2,3双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸已被合成并且对应MALP-2的脂质部分，所述MALP-2是从发酵支原体（Mycoplasma fermentans）中分离出的激活巨噬细胞的脂肽。已知Pam2Cys是TLR2的配体。
Pam2Cys具有结构：
Figure BDA00003100956300061
另一个示例性脂肽是脂氨基酸（lipoamino acid）N-棕榈酰基-S-[2,3-双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸，也被称为Pam3Cys或Pam3Cys-OH是Braun脂蛋白的N-末端部分的合成版本，所述Braun脂蛋白跨越革兰氏阴性细菌的内膜和外膜。Pam3Cys具有以下结构：
5,700,910号美国专利描述了在用作合成佐剂、B淋巴细胞刺激剂、巨噬细胞刺激剂或合成疫苗的脂肽的制备中作为中间体使用的几种N-酰基-S-(2-羟烷基)半胱氨酸。美国5,700,910还教导了这些化合物在Pam3Cys-OH和N-末端包含该脂氨基酸或其类似物的脂肽的合成中作为中间体的用途。
可以用于靶向细胞表面TLR的其他脂质部分包括棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基、月桂酰基、辛酰基或癸酰基。
除了Pam2Cys和Pam3Cys以外，本发明还涵盖了根据本发明的Set2Cys、Lau2Cys和Oct2Cys的用途。本领域技术人员将会意识到，Ste2Cys也被称为S-[2,3-双(硬脂酰氧基)丙基]半胱氨酸或二硬脂酰基-S-甘油基-半胱氨酸；Lau2Cys也被称为S-[2,3-双(月桂酰氧基)丙基]半胱氨酸或二月桂酰基-S-甘油基-半胱氨酸)，Oct2Cys也被称为S-[2,3-双(辛酰氧基)丙基]半胱氨酸或二辛酰基-S-甘油基-半胱氨酸）。
其他合适的TLR2激动剂包括（但不限于）合成的三酰基化和二酰基化脂肽、FSL-I（由唾液支原体（Mycoplasma salivarium）1衍生的合成脂蛋白）、Pam3Cys（三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酸）和S-[2,3-双(棕榈酰氧基)-(2RS)-丙基]-N-棕榈酰基-(R)-半胱氨酸，其中“Pam3”是“三棕榈酰基-S-甘油基”。Pam3Cys的衍生物也是合适的TLR2激动剂，其中衍生物包括（但不限于）S-[2,3-双(棕榈酰氧基)-(2-R,S)-丙基]-N-棕榈酰基-(R)-Cys-(S)-Ser-(Lys)4-羟基三盐酸盐；Pam3Cys-Ser-Ser-Asn-Ala；PaM3Cys-Ser-(Lys)4；Pam3Cys-Ala-Gly；Pam3Cys-Ser-Gly；Pam3Cys-Ser；PaM3CyS-OMe；Pam3Cys-OH；PamCAG，棕榈酰基-Cys((RS)-2,3-二(棕榈酰氧基)-丙基)-Ala-Gly-OH等。合适的TLR2激动剂的另一个非限制性实例是Pam2CSK4PaM2CSK4（二棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酸-丝氨酸-(赖氨酸)4；或Pam2Cys-Ser-(Lys)4)是合成的二酰基化脂肽。其他的合成TLR激动剂包括（例如）在Kellner等人（1992,Biol.Chem.373:1:51-5）；Seifer等人（1990,Biochem.J,26:795-802）和Lee等人（2003,J.Lipid Res.,44:479-486）中描述的那些。
本领域技术人员将会理解，TLR2激动剂是典型地非极性的，并且，相应地，虽然可溶解于非极性溶剂中，但是仅略微溶解于极性和含水溶剂中。当需要在极性或含水溶剂中使用TLR2激动剂时，所述TLR2激动剂可以与增溶剂结合。
增溶剂可以包括一种（或一种以上的）增溶剂，所述增溶剂可以结合至TLR2激动剂以改善TLR2部分的溶解度。所述增溶剂通常是增加所述TLR2部分在极性或含水溶剂中的溶解度的极性部分。
在本发明的另一个实施方案中，所述增溶剂包括一个或多个由“PEG”（或聚乙二醇）和极性多肽组成的基团，所述极性多肽如“R4”，高度-支链的（hyper-branched）四精氨酸复合物；“H4”，高度-支链的四组氨酸复合物；“H8”，含有组氨酸残基的线性肽；以及“E8”含有谷氨酸残基的线性肽。其他的线性和支链的脂质增溶剂也被想到，包括含有谷氨酸残基的高度-支链的肽（例如，参见下面的“支链的E8”）。在本发明的另一实施方案中，所述增溶剂包括PEG以及一个或多个由R4、H4、H8和E8（线性的或支链的）组成的基团。R4、H4、H8和E8先前已经在PCT/AU2009/000469（WO/2010/115230）中有所描述并且具有以下结构：
Figure BDA00003100956300071
Figure BDA00003100956300081
Figure BDA00003100956300091
本领域技术人员将会理解，本发明并不限于所列举的特定增溶剂，并且根据本发明，本领域中已知的其他合适的增溶剂可以被使用，如碳水化合物。
根据本发明，一种或多种增溶剂可以被结合至脂质的方式将会是本领域技术人员所熟知的。例如，经由芴甲氧羰基（Fmoc）化学（通过二硫化物或二醚桥）或经由肟化学的结合可被想到。在本发明的一个特定实施方案中，通过将O-(N-芴甲氧羰基-2-氨基乙基)-O′-(2-羧基乙基)-十一聚乙二醇（Fmoc-PEG11-OH，Merck公司）加入Pam2Cys制备Pam2Cys的可溶解形式。这导致了脂质的聚乙二醇化形式（Pam2Cys-PEG11）的形成，然后其适合于向受试者施用。
在根据本发明的一个特别优选的形式中，所述TLR2部分包含结合物，所述结合物包含结合至PEG的Pam2Cys。
正如前面所指出的，本发明人已经令人惊讶地观察到，Pam2Cys展示了以一种非抗原特异性方式对抗由感染原如病毒（例如，甲型流感）和细菌（例如，嗜肺军团菌）引起的感染的预防性和治疗性活性。例如，被鼻内递送时，单一剂量的可溶性Pam2Cys提供了立刻的和显著的保护以对抗C57BL/6、BALB/c和HHD小鼠中甲型流感的异源亚型的感染，正如通过轻度H3N1感染之后病毒载量的减少高达99%，以及显著降低了与高致病性H1N1感染有关的发病率和死亡率所展示的。
本发明人还发现，在不存在任何共同施用的TLR激动剂（包括TLR9激动剂）的情况下，根据本发明的方法施用TLR2激动剂引起了受试者中的固有免疫应答。因此，在一些实施方案中，根据本发明的组合物不包括TLR9激动剂。
本发明人已经表明，根据本发明的TLR2激动剂能够引起受试者中非抗原特异性的固有免疫应答。这一点已经通过涉及TLR2部分的施用的实验得到证实，所述TLR2部分包含一种或多种肽抗原，其中所述肽抗原与有待治疗或预防的疾病“不相关”。本文中所使用的术语“不相关”意指不能够引起对于特异性抗原（antigen）或抗原（antigens）的体液或细胞反应并且，在本发明的上下文中，不引起针对TLR2部分的体液或细胞免疫应答。
因此，根据本发明的TLR2激动剂可以进一步包含一种或多种用于治疗或预防疾病的不相关的肽抗原，其包括（但不限于）T-辅助表位（T-helper epitope）和/或细胞毒性T-淋巴细胞（CTL）表位。务必要牢记的是，由于根据本发明的TLR2部分能够以一种非抗原特异性方式在受试者中产生固有免疫应答，因此本领域技术人员将会理解，所述TLR2部分能够包含一种或多种肽抗原，所述肽抗原将与有待预防或治疗的疾病不相关，或者所述TLR2部分能够在不存在一种或多种肽抗原的情况下被使用。
通过例证的方式，本发明证实了在IAV的治疗中，包含一种或多种“不相关”的肽抗原的TLR2部分展示了在该部分施用后，与不含与其结合的肽抗原的相同的TLR2激动剂相同的引起一种非抗原特异性/固有免疫应答的能力。在这些实验中，本发明人使用了包含TLR2部分的组合物，其中，所述TLR2部分包含TLR2激动剂（例如，Pam2Cys）、T-辅助表位（OT2）和/或细胞毒性T淋巴细胞表位单纯性疱疹病毒（Herpes Simplex virus）1衍生的CD8+T细胞表位（参照表1）。两种表位与IAV无关。本发明人因此已经表明，根据本发明的TLR2部分能够引起施用其的受试者的非抗原依赖性、固有免疫应答。
因此，在本发明的另一个方面中，提供了一种用于治疗或预防由感染原引发的疾病的方法，所述方法包含为有其需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含溶液中的TLR2部分，其特征在于所述TLR2部分包含TLR2激动剂并且其特征在于所述TLR2部分不会诱导针对所述感染原的特异的细胞或体液免疫应答。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于在受试者中引起固有免疫应答的方法，所述方法具有在感染之后对抗病毒的立刻的抗病毒效果。特别地，这意味着根据本发明的TLR2部分的施用可以在受试者中具有在病毒感染（并且特别是甲型流感感染）之后的预防性效果。因此，在根据本发明的另一个实施方案中，TLR2受体激动剂的施用可以在受试者由感染原引发的疾病的预防中被使用。以这种方式，根据本发明的方法可以被用于在由感染原引发的感染的预防中引起固有免疫应答，所述感染原包括（但不限于）甲型流感病毒（IAV）、丙型肝炎病毒（HCV）、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、嗜肺军团菌和已知会导致癌症的感染原。
本发明还涵盖了一种用于在已经由感染原感染或定植的受试者中引起固有免疫应答的方法。特别地，这意味着根据本发明的组合物的施用可以在受试者中具有在由感染原引发的感染或定植之后的治疗性效果。因此，在进一步的实施方案中，根据本发明的组合物的施用可用于在受试者中治疗由感染原引发的疾病。
本发明人也已经表明，采用根据本发明的TLR2部分对受试者进行预处理能够显著地降低在采用细菌的鼻内挑战之后肺和气管中的细菌载量，即使当细菌引发的感染发生在施用TLR2部分的7天后。因此，在一些实施方案中，感染原是细菌。所述细菌能够是细胞内的，革兰氏阳性或革兰氏阴性的细菌。在一个实施方案中，所述细菌包括（但不限于）葡萄球菌属（Staphylococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、弗朗西斯氏菌属（Francisella）、耶尔森氏菌属（Yersinia）、嗜肺军团菌（Legionellapneumophila）和结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）。在一个实施方案中，感染原是结核分枝杆菌。在另一个实施方案中，感染原是嗜肺军团菌。
在一些实施方案中，感染原是引发受试者继发感染的原因（例如，肺炎）。因此，本发明还提供了一种通过引起固有免疫应答来治疗或预防受试者继发感染的方法，所述方法包含为受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含溶液中的TLR2部分，其特征在于所述继发感染不是通过针对可溶性TLR2部分的体液或细胞免疫应答来治疗或预防的。
本发明人也已经展示，当被预防性施用时，包含根据本发明的TLR2部分的组合物能够提供立刻的保护以对抗由感染原如甲型流感引发的轻度和致病性感染并且该保护与进入肺的固有免疫介质的大量涌入有关。该抗病毒活性不是抗原特异性的。
本发明还涵盖了如本文中所定义的TLR2部分用于治疗受试者的癌症的用途。因此，在本发明的另一个方面中，提供了一种通过在受试者中引起固有免疫应答来治疗或预防癌症的方法，所述方法包含为受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含溶液中的TLR2部分，其特征在于所述TLR2部分包含TLR2激动剂并且其特征在于所述TLR2部分不会直接诱导针对所述癌症的特异性的细胞或体液免疫应答。在一些实施方案中，TLR2部分的施用抑制了癌症的生长或扩散。
本领域技术人员将会认识到，所述癌症可能是或者可能不是由感染原引发。因此，根据本发明的方法还可以治疗并非由感染原引发的成型的（established）癌症。例如，TLR2部分可以被直接施用至受试者的引发癌症的肿瘤位点，以便诱导受试者的固有免疫应答。TLR2激动剂向引发癌症的肿瘤位点的直接施用可以涉及固有免疫***的细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞和细胞因子）向肿瘤位点的募集。因此，在一些实施方案中，组合物被直接施用至引发癌症的肿瘤位点。术语“肿瘤”意指由细胞的异常生长（有时被称为“赘生的（neoplastic）”）形成的赘生物或固体病变。务必要牢记的是，术语肿瘤未必是癌症的代名词。肿瘤可以是良性的，恶化前的或恶性的，而癌症被定义为恶性的，然而，在许多情况下，肿瘤与癌症相关。如本文中所使用的术语“癌症”是指以不受控制的细胞生长（例如，肿瘤的形成）而那些细胞却没有任何分化成特异的和分化的细胞为特征的一组疾病和失调。
如本文中所使用的术语“受试者”是指动物，特别是哺乳动物，并且更特别地是说包括低等灵长类动物的灵长类动物，甚至更特别地是能够从本发明的医疗方案中受益的人类。无论是人类或非人类的动物或胚胎的受试者可以被称为个体、受试者、动物、患者、宿主（host）或接受者。本发明不但具有人用用途而且具有兽用用途。为了方便起见，“动物”具体包括家畜如牛、马、绵羊、猪、骆驼、山羊和驴。关于马，其包括在赛马行业中使用的马以及供娱乐用或者在畜牧行业中使用的马。实验室测试动物的实例包括小鼠、大鼠、兔子、豚鼠和仓鼠。兔子和啮齿类动物（如大鼠和小鼠）提供了如同灵长类动物和低等灵长类动物一样的方便的测试***或动物模型。在一些实施方案中，受试者是人类。
根据本发明的组合物以有效量被施用。TLR2部分的术语“有效量”和“治疗有效量”，如本文中所使用，意味着在至少统计学上有意义的数量的受试者中提供所需的治疗性或生理学效果的足够量。不想要的效果（例如副作用）有时伴随着所需的治疗性效果而出现；因此，从业者在潜在的利益和潜在的风险之间权衡以确定什么是一个适当的“有效量”。所需的精确量将会在受试者之间变化，这取决于所述受试者的物种、年龄和一般状况，施用模式等。因此，可能不能够指定一个精确的“有效量”。然而，在任何个别的情况下，适当的“有效量”可以由本领域技术人员仅使用常规实验来确定。在一些实施方案中，用于人类受试者的有效量处于大约0.1nmol/kg体重/剂量至1mol/kg体重/剂量的范围内。在一些实施方案中，所述范围是大约1nmol至1mol、大约1μmol至1mol、1μmol至500μmol、1μmol至250μmol、1μmol至50μmol或1nmol至1μmol/kg体重/剂量。在一些实施方案中，所述范围是大约0.08μmol至0.11μmol/kg体重/剂量的TLR2部分。给药方案（dosageregime）被调整以适应紧急情况并且可以被调整以产生最佳的治疗剂量。例如，可以每日地、每周地、每月的或以其他适当的时间间隔提供多个剂量。
术语“治疗（treatment）”或“治疗（treating）”包括（但不限于）（i）减缓或阻止疾病的进展，（ii）部分逆转疾病的进展和（iii）完全逆转疾病的进展（即，治愈疾病）。术语“预防（prevent）”或“预防（preventing）”不应该被解释为限制于疾病的完全预防（即，使得疾病不发展），但是可以包括使疾病的进展最小化，例如，作为预防性施用根据本发明的组合物的结果，疾病在受试者中以较低的强度出现或者以较慢的速度进展。
根据本发明的组合物可以以单一的剂量或一系列的剂量被施用。虽然结合物有可能被单独施用，但是优选使其作为组合物（优选作为药学组合物）给药。这种组合物的制剂是本领域技术人员熟知的。所述组合物可以含有任何药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。合适的剂量和给药方案能够由主治医生确定并且可以取决于被治疗的特殊症状、症状的严重程度以及受试者的一般年龄、健康和重量。
“药学上可接受的”的载体、赋形剂或稀释剂是指药学媒介物，所述药学媒介物由非生物学上的或其他方面非所需的材料组成，即所述材料可以伴随着选定的结合物被施用至受试者，而不会引发任何或一个实质上的不良反应。载体可以包括赋形剂和其他的添加剂如稀释剂、清洁剂、着色剂、润湿或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂等。载体还可以包括所有常规的溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、包衣剂、抗真菌和抗细菌剂、皮肤渗透剂、表面活性剂、等张和吸附剂等。将会理解的是，本发明的组合物还可以包括其他补充的生理学活性试剂。
因此，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的溶液中的TLR2部分和药学上可接受的载体或赋形剂，所述药物组合物通过在受试者中引起固有免疫应答来治疗或预防疾病，其特征在于所述TLR2部分包含TLR2激动剂并且其特征在于所述疾病不是通过针对所述TLR2部分的体液或细胞免疫应答来治疗或预防的。
本发明的组合物可以通过本领域技术人员已知的任何手段被施用，包括（但不限于）鼻内、口服和静脉内。在一些实施方案中，所述组合物被鼻内施用。
本发明还涵盖了有效量的溶液中的TLR2部分在制备用于治疗或预防受试者的疾病的药物中的用途，其特征在于所述TLR2部分包含TLR2激动剂，其特征在于所述TLR2激动剂在受试者引起固有免疫应答并且其特征在于所述疾病不是通过针对所述TLR2部分的体液或细胞免疫应答来治疗或预防的。
本领域技术人员将会理解，本文中所描述的发明允许存在不同于具体描述的变化和修饰。可以理解的是，本发明包括落入本发明的精神和范围之内的所有这样的变化和修饰。本发明还包括在本说明书中单独地或集体地引用或表示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两种或多种所述步骤或特征的任何和所有组合。
通过参照下列实施例来描述本发明的某些实施例，所述实施例仅出于说明性目的，而并非为了限制如前所述的通用性的范围。
实施例
材料和方法
肽和脂肽的合成、纯化和鉴定。通过使用Fmoc（9-芴甲氧羰基）化学的常规固相合成来进行整个脂肽和肽的合成。使用Symphony多通道合成仪（蛋白质技术有限公司，亚利桑那州，美国）或Liberty合成仪（CEM，北卡罗来纳州，美国）自动组装肽类，所述合成仪使用微波技术来促进高保真肽序列的生产。通过反相高效液相色谱法纯化肽和脂肽，并通过质谱法确定产品的真实性。用于肽的组装、纯化和鉴定的过程已被详细描述于其他地方（1，2，3）。通过向Pam2Cys中加入O-(N-芴甲氧羰基-2-氨基乙基)-O′-(2-羧基乙基)-十一聚乙二醇（Fmoc-PEG11-OH，默克公司）来制备可溶性形式的Pam2Cys。这导致脂质的聚乙二醇化形式（Pam2Cys-PEG11）的形成。脂肽构建体中包括的表位以及个别的脂肽组合物如表1中所示。
动物。使用6-8周龄的C57BL/6、BALB/c、B6.IFN-γ-/-、B6.IFNAR-/-和HHD雄性和雌性小鼠。HHD“敲除”小鼠表达HLA-A2.1的α1-α2结构域和H-2Db的α3和胞浆和跨膜结构域的嵌合单链。这些小鼠在双敲除H-2Db-/-β2m-/-小鼠上构建，其未能表达血清学可检测的鼠科H-2Db分子（4，5）。将HHD小鼠在巴黎巴斯德研究所中发育，并由昆士兰医学研究所热情提供。将小鼠饲养并维持在微生物学系的动物房设施中。B6.IFN-γ-/-小鼠中缺乏干扰素-γ且B6.IFNAR-/-小鼠不具备1型干扰素受体。TLR2缺乏型小鼠由大阪大学Shizuo Akira博士热情提供。涉及小鼠的所有过程由墨尔本大学实验动物伦理委员会批准。
接种过程。通过PenthraneTM或异氟烷吸入剂麻醉小鼠并通过鼻内途径接种25nmol的脂肽、25nmol的非脂质化肽或2-20nmol的含有构建体的Pam2Cys。将含有构建体的Pam2Cys和脂肽和肽溶解于生理盐水中，并以50μl的体积施用，而生理盐水对照组仅接受50μl的生理盐水。
采用甲型流感病毒的挑战。在采用脂肽接种后的第1、3或7天，采用鼻内给药活体IAV对小鼠进行挑战。对于轻度IAV感染而言，为小鼠施用104.5PFU的H3N1病毒、Mem71，一种A/Memphis/1/71[H3N2]×A/Bellamy/42[H1N1]的基因重配体。在挑战的第5天，收获肺用于测定病毒滴度并收获脾用于表征CD8+T细胞应答。通过鼻内途径，使用50PFU（HHD小鼠）、200PFU（C57BL/6小鼠）或500PFU（BALB/c小鼠）的甲型H1N1病毒/波多黎各/8/34（PR8）来进行高致病性IAV的挑战。这种高致病性病毒诱导了以体重减轻和脱水为特征的症候性感染。每日监测小鼠的发病症状并且有必要在人道终点将其处死，所述人道终点通过使用墨尔本大学动物伦理委员会批准的临床症状和体重减轻程度的结合来确定。
采用嗜肺军团菌的挑战。在采用1×106CFU的嗜肺军团菌（JR32Δfla株）鼻内挑战之前3天，采用20nmol的PEG-Pam2Cys对C57BL/6小鼠进行鼻内预处理。在感染后第1、2和3天评估小鼠肺中的细菌载量。
接触传播研究。为了评估BALB/c小鼠中的病毒传播，“提供者（donor）”小鼠（n=2）通过鼻内途径接受在50μl的生理盐水中的104.5pfu的H3N2 Udorn病毒（A/Udorn/72）。在挑战后一天，使提供者小鼠与未处理的“接受者”小鼠（n=3）合居24小时，之后将提供者小鼠取出并且收获鼻甲、气管和肺并评估其病毒滴度。在暴露于提供者小鼠之后的三天半，收获接受者小鼠的鼻甲、气管和肺以评估其病毒滴度。该方案基于由Edenborough等人（准备中）开发的接触传播模型。
鼻甲、气管和肺中病毒滴度的评估。将小鼠的鼻甲、气管和肺在3ml的RPMI中匀浆并且使用如前所述的马丁达比狗肾（MDCK）噬菌斑分析法（6）测定肺上清液中的IAV滴度。
来自器官的单细胞悬浮液的制备。在CO2窒息之后，通过心脏的右心室采用10ml的PBS对小鼠的肺进行灌注以去除循环细胞。将肺切成片状并经受采用RPMI中的胶原酶A（2mg/ml，罗氏公司，曼海姆，德国）的酶学消化30分钟。将消化的肺碎片穿过筛子应变（strained）并采用3ml预先温热的Tris-缓冲的氯化铵溶液（ATC）于室温下处理2分钟以便溶解红细胞。然后将肺细胞在RP10（RPMI 1640培养基[Gibco公司，美国]中清洗两次，所述培养基补充有10%FCS[CSL，帕克维尔，澳大利亚]、7.5mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺、76μM 2-巯基乙醇、150U/ml青霉素、150μg/ml链霉素和150μM非必需氨基酸[Gibco公司]。将脾收集到10ml的RP10中，通过穿过筛子的破裂（disruption）而制备单个细胞的悬浮液，然后采用ATC于37℃下处理5分钟。在使用之前，采用RP10将细胞清洗两次。为了获得支气管肺泡灌洗（BAL）液，采用注射器对小鼠气管进行插管并且采用三次单独的1ml的RPMI清洗液冲洗气体空间，以及最后用注射器的1ml洗脱。将来自于BAL清洗液的上清液存储于-70℃以供后续的细胞因子分析。将来自于BAL清洗液的上清液存储于-70℃以供后续的细胞因子分析。使用血细胞计数器和台盼蓝染色排除法对活细胞计数。
肺细胞因子环境的表征。根据生产商的说明书，使用BDTM细胞计数微珠分析仪（CBA）（生命科学公司）小鼠炎症试剂盒测定BAL上清液中的细胞因子水平，不同之处是对于每个50μl BAL样本而言，仅使用2μl的每个捕获珠（capture bead）。为下列细胞因子制备标准曲线（20-5000pg/ml）：白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、γ-干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-12p70的（IL-12p70）。从BAL上清液的未稀释物（neat）或1/10稀释液中测定细胞因子浓度。使用Becton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪和FlowJo软件分析样品。
肺细胞的表征。采用下列抗-小鼠抗体的组合对5×105个肺细胞进行染色；FITC标记的抗-CD11b、PerCP-Cy5.5抗-GR-1（Ly-6G和Ly-6GC）、PE-标记的抗-CD11c、APC抗-F4/80、2类FITC抗-IA/IE、PerCP-Cy5.5抗-CD8、PE抗CD4（BDPharminigen公司）。肺细胞亚群被分类如下；中性粒细胞：CD11bhi、GR1hi、CD11c-、F4/80-；肺泡巨噬细胞：CD11chi、F4/80+、CD11bint/lo、GR1int/lo和CD11chi，Autofluorescencehi；树突状细胞：CD11chi、和2hi类MHC、GR1int；单核细胞和间质巨噬细胞：CD11bhi、GR1int、CD11cint/lo、F4/80+；CD8+T细胞：CD8+；CD4+T细胞：CD4+（7，8，9）。
细胞内细胞因子染色（ICS）分析法。在总体积200μl的RP10中的5μg/mlGolgiPulg（BD Biosciences Pharmingen公司）和25U/ml重组人IL-2（罗氏公司，印第安纳波利斯，美国）的存在下，于37℃采用1μg/ml（C57BL/6和BALB/c）或10ug/ml（HHD）的肽刺激肺或脾细胞的单细胞悬浮液6小时。在冰上采用PerCP（Cy5.5）对细胞染色30分钟，所述PerCP（Cy5.5）采用大鼠抗小鼠CD8α抗体（BD Biosciences Pharmingen公司）标记。固定细胞，并根据生产商的指导，使用BD Cytofix/Cytoperm试剂盒TM（BD）可渗透化处理细胞并且于4℃采用FITC-标记的抗-IFN-γ和APC-标记的抗-TNF-α（BD Biosciences Pharmingen公司）染色30分钟。使用Becton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪分析样品和FlowJo软件分析。
统计分析。对于时间点的比较，使用单因素ANOVA（事后Dunnett氏多重比较检验）来确定接种前（第0天）组和接种后（第1、3、6、8天）组之间的差异。对于其他的研究而言，分别使用双尾未成对学生t-检验或单因素ANOVA（事后Tukey氏多重比较检验）来确定在两个或两个以上的组群之间的统计学差异。<0.05的P值被认为是显著的。
结果
基于Pam2Cys的脂肽接种拓展了肺细胞种群。在C57BL/6小鼠中检查基于Pam2Cys的脂肽对肺细胞环境的影响，采用含有T辅助表位（Th）OT2和单纯性疱疹病毒1衍生的CD8+T细胞表位（gB498-505；参见表1）的脂肽OT2-P2C-gB498-505对所述小鼠进行鼻内接种。使用细胞流式细胞仪表征采用PBS灌注的肺中的肺定居（resident）细胞种群。
采用OT2-P2C-gB498-505的鼻内接种引起肺细胞总数的急剧增加，其在第3天达到最大值并且保持升高直至第8天（图2A）。与此相反，接受肽OT2-gB498-505（没有Pam2Cys）的小鼠表明肺中存在的细胞的总数或细胞类型的比例没有显著性变化，指明Pam2Cys作为细胞流入的介质（图2A）。在脂肽接种的小鼠中，接种后第3天的细胞浸润物（infiltrate）主要由中性粒细胞和间质巨噬细胞组成（图2B）。通过Giemsa染色的显微检测揭示了中性粒细胞表现出高度肺泡表型；表明活化，发现在F480+单核细胞/间质巨噬细胞种群主要由具有大的和成核的形态学的间质巨噬细胞组成，而几乎没有鉴定出拥有圆圈形或肾形核特性的单核细胞的细胞（数据未显示）。虽然肺泡巨噬细胞（AM）以非常低的水平存在于稳定状态的肺中（0天），但是在脂肽接种之后该种群的显著增加是显而易见的。最后，我们还观察到CD4+和CD8+淋巴细胞以及CD11chi树突状细胞在接种后第3-8天之间的增加。BALB/c小鼠和HHD小鼠的肺细胞流入的检测揭示了早期中性粒细胞浸润，然后是间质巨噬细胞和CD11bhi肺泡巨噬细胞的种群拓展的类似模式（数据未显示）。
聚乙二醇化Pam2Cys施用拓展了肺细胞种群。聚乙二醇化Pam2Cys（P2C-PEG11）的鼻内施用还导致C57BL/6小鼠（图7）和BALB/c小鼠（数据未显示）中的中性粒细胞、间质和肺泡巨噬细胞以及淋巴细胞的肺总量（包括肺间质和含有液体的BAL）种群的显著增加。还观察到产生NK细胞和γδT细胞的活化的IFN-γ的提高的水平（图7）。
Pam2Cys预防有效对抗高致病性IAV挑战。为了测定Pam2Cys的抗病毒活性是否有效对抗IAV的毒力株，将接受聚乙二醇化Pam2Cys（P2C-PEG11）的小鼠在72小时或7天以后采用致命剂量的H1N1病毒PR8挑战。生理盐水处理的（72小时以后挑战的）小鼠经历本质上的体重减轻，发展感染的临床症状，并且到第8天所有小鼠均死于感染（图8）。相反，采用PEG-Pam2Cys预处理的小鼠经历基本上较低的体重减轻并且所有小鼠从感染中存活下来（图8）。
Pam2Cys预防能够降低传播速率。为了测定采用Pam2Cys预处理的、感染流感的小鼠是否具有降低的传播病毒的能力，利用接触传播的小鼠模型（Edenborough等人，准备中）。采用PEG-Pam2Cys预处理的“提供者”小鼠在之后的不同时间点接受104.5pfu的H3N2 Udorn病毒的挑战。结果表明，Pam2Cys预防降低了鼻腔、气管和肺病毒滴度（图9）。与生理盐水处理的提供者小鼠合居的所有接受者小鼠成为被感染的，这证实了提供者小鼠传播病毒的能力。虽然在挑战之前5天或7天已经接受Pam2Cys的小鼠向接受者小鼠传播病毒，但是在病毒挑战之前24小时或72小时已经接受Pam2Cys的小鼠并未向合居的接受者小鼠传播感染。
脂肽的鼻内递送提供了对抗IAV挑战的即时保护。为了确定由脂肽的递送诱导的肺部变化是否能够降低IAV挑战的影响，检测对抗轻度（H3N1）和高毒力PR8（H1N1）IAV病毒的脂肽接种的保护作用。为三种品系的小鼠施用脂肽，所述脂肽含有限制于特定小鼠品系的IAV-特异性CD8+T细胞表位（IAV-LP）或不相关的非IAV-衍生的CD8+T细胞表位（非IAV-LP）（表1）。在所有的脂肽中，CD4+Th细胞表位与流感病毒不相关。（表1）。虽然IAV-LP能够诱导CD8+T细胞对递送的IAV-衍生的表位的应答，但是非IAV-LP中IAV-特异性表位（CD8+T或CD4+）的缺失意味着将不会对接种诱导IAV-特异性应答。
在采用IAV-LP或非IAV-LP的接种后的第3天或第7天，采用104.5PFU H3N1病毒、Mem71对C57BL/6、BALB/c和HHD小鼠进行鼻内挑战，并且在感染的第5天评估肺病毒滴度。图3a中的结果表明，在所有品系的小鼠中，当与未接受脂肽的动物相比时，采用IAV-LP以及非IAV-LP的接种均导致肺病毒滴度的显著降低。在非IAV LP组中，当在接种之后3天发生挑战时，病毒清除率是最显著的（图3A）。
非IAV-LP中IAV-特异性表位（CD8+T或CD4+）的缺失表明非IAV-LP的抗病毒活性是由Pam2Cys部分赋予的。为了证实这一理论，我们检测了IAV-特异性CD8+T细胞对PA224-233（C57BL/6小鼠中的一种免疫显性IAV-特异性靶标）的应答的存在，并且相同的表位包括在IAV-LP中而不包括在非IAV-LP中。在接种脂肽的C57BL/6小鼠中，只有接受IAV-LP的小鼠表明IFN-γ+或IFN-γ+TNF-α+PA224-233 -特异性CD8+T细胞的显著性水平，而生理盐水组或非IAV-LP组均不能引起对于这些表位的可检测的应答（图3B）。在BALB/c和HHD小鼠品系中观察到相同模式的CD8+T细胞应答。采用非IAV-LP接种的小鼠中IAV-特异性细胞的缺失表明观察到的早期抗病毒效果是由于Pam2Cys的作用而不是由于发动IAV-特异性的适应性免疫应答的加速能力。
应当指出，与IAV-LP相比，非IAV LP不提供与IAV特异性CD8+T细胞应答的诱导有关的长期保护。如果采用H3N1的挑战发生在接种后的6-8周，那么只有接种IAV-LP的BALB/c和C57BL/6小鼠表现出显著性水平的病毒清除（98±1%和65±14%（分别））（数据未显示）。因此，在缺乏抗原特异性反应的情况下，非IAV LP的抗病毒活性随时间降低，表明脂肽的CD8+T细胞表位成分是采用IAV-LP的长期保护所必需的。
脂肽预防有效对抗高致病性IAV挑战。为了测定Pam2Cys的抗病毒活性是否有效对抗高致病性感染，7天后采用高致病性H1N1病毒，PR8对接种脂肽的小鼠进行挑战。不但IAV-LP而且非IAV LP脂肽接种显著地提高了采用PR8挑战的小鼠的存活率（图4）。虽然大多数采用生理盐水接种的小鼠死于感染，但是100%的采用IAV-LP接种的动物和80%的采用非IAV-LP接种的动物从感染中存活下来。除了改善的存活率以外，非IAV-LP组中的通常与感染有关的体重减轻的程度和临床症状学也被降低（图4）。
由可溶性Pam2Cys诱导的细胞因子表达谱。为了排除肽或来自于***的表位-特异性应答的影响，我们通过将通常不溶性Pam2Cys结合至聚乙二醇（PEG）来构建Pam2Cys的可溶性形式。为了鉴定Pam2Cys-PEG11对肺环境的影响，我们通过流式微球分析仪分析法测量施用20nmol Pam2Cys-PEG11（i.n）的C57BL/6小鼠的支气管肺泡灌洗（BAL）液中与炎症相关的细胞因子的浓度（图5）。在施用之后的第3天，我们检测到与未处理的或接种生理盐水的小鼠相比，接种Pam2Cys-PEG11的小鼠中IL-6、IL-10、MCP-1、IFN-γ、TNF-α和IL-12p70浓度的显著增加。到第7天，Pam2Cys-PEG11组中的细胞因子浓度已经标准化至施用前的水平并且与未处理组没有显著性差异（图5）。
Pam2Cys的抗病毒活性是不依赖抗原的。为了确认Pam2Cys部分对脂肽的早期抗病毒活性负主要责任，采用20nmol的Pam2Cys-PEG11对小鼠进行鼻内接种并在之后的第1、3或7天采用104.5PFU H3N1病毒挑战。图6中所示的结果表明，采用Pam2Cys-PEG11的接种降低肺病毒载量至与非IAV-LP相同的程度，证实观察到的脂肽的早期抗病毒活性是由Pam2Cys介导的。在施用之后的第1天至满7天，采用Pam2Cys-PEG11的预防在挑战之后几乎立刻降低了病毒载量，揭示出Pam2Cys-PEG11预防能够提供至少7天的保护窗。
当以单一的剂量被鼻内递送时，Pam2Cys对抗IAV。在小鼠中通过鼻内（i.n），皮下（s.c）或静脉内（i.v）途径预防性施用聚乙二醇化Pam2Cys（PEG-Pam2Cys）（在本文中也被称为Pam2Cys-PEG11或P2C-PEG11）以及3天后采用致死剂量PR8病毒的随后的挑战之后，只有鼻内施用PEG-Pam2Cys的小鼠得到保护以对抗与PR8感染有关的死亡和体重减轻（图10）。
表1.本发明中使用的小鼠品系和脂肽的详表
Figure BDA00003100956300191
iHHD小鼠为独一的表达嵌合的1类HLA-A2.1分子的转基因品系
iiOT2（氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR）是来自于卵白蛋白的Th表位。
iiiP2C：Pam2Cys
iv在采用H1N1 PR8挑战之前，为HHD小鼠施用三种IAV-LP的混合物。采用H3N1 Mem71挑战的小鼠仅接受OT2-P2C-M158-66。
vP25（氨基酸序列KLIPNASLIENCTKAEL）是来自于麻疹病毒的混杂Th表位（16）。
viPA224-233表位不被BALB/c小鼠中存在的1类限制分子识别。
多种Pam2Cys变体赋予对抗IAV挑战的保护。在采用致死剂量的PR8病毒挑战之后，经由鼻内途径预防性施用20nmol的各种含有Pam2Cys的构建体的小鼠得到保护以对抗体重降低（图11A）和死亡（图11B）。小鼠同样得到保护以对抗与PR8感染有关的其他临床症状（数据未显示）。
当以重复剂量给出时，Pam2Cys是有效的。在采用致死剂量的PR8挑战之后，施用单一剂量的PEG-Pam2Cys（或相隔三周的两个剂量的PEG-Pam2Cys）的Balb/c小鼠得到保护以对抗体重降低（图12B）、死亡和其他临床症状。PEG-Pam2Cys处理的小鼠中的病毒载量在处死时是显著较低的（图12A）。
PEG-Pam2Cys在较低剂量下是有效的。当采用较低剂量的PEG-Pam2Cys对小鼠进行预防性处理并在3天后采用致死剂量的PR8病毒挑战时，与生理盐水组相比，所有小鼠中仍然实现对抗体重降低和死亡的保护（图13）。
对抗IAV挑战的保护不依赖于IFN-γ或1型干扰素（即IFN-α）。采用PEG-Pam2Cys处理的，缺乏IFN-γ（B6.IFN-γ-/-）或者缺乏对1型干扰素（如干扰素-α；IFNAR-/-）的应答能力的小鼠得到保护以对抗与PR8感染有关的体重降低和致死性（图14）。
PEG-Pam2Cys作为治疗剂是有效的。当采用104.5PFU的Udorn病毒（甲型流感）（i.n）挑战小鼠并且在4小时后为其施用20nmol PEG-Pam2Cys（i.n）时，鼻、口咽部、气管和肺中发现降低的病毒载量。特别地，与生理盐水组相比，肺中的病毒载量显示出Log104或10000倍的降低（图15）。
Pam2Cys作为抗细菌剂是有效的。采用PEG-Pam2Cys对小鼠进行预处理（i.n.）时，在采用嗜肺军团菌的i.n.挑战之后，它们显示出显著降低的肺和气管细菌载量（图16A）。肺中的细菌载量在第2天和第3天达到高峰。直至施用PEG-Pam2Cys之后的第7天同样能够实现降低的细菌载量并且显示了在挑战之前3天（图16B）或7天（图16C）接受PEG-Pam2Cys预防的小鼠感染后3天的细菌载量。
讨论
固有免疫应答在感染的控制中所发挥的至关重要的作用表明在感染之前的固有免疫***的早期激活能够提供增强的保护以对抗感染原，如病毒或细菌的挑战。本研究的结果表明，包含TLR2激动剂的可溶性TLR2部分的施用引起施用其的受试者中的固有免疫应答，其特征在于，所述免疫应答是非抗原特异性的。此外，通过根据本发明的组合物的预防性鼻内施用引起的肺部变化与增加的对于随后暴露于病毒和细菌的抵抗性有关，表明这样的组合物适合于作为对抗病毒和细菌感染的预防剂，特别是当存在有流行性或大流行暴发的高风险性时。根据本发明的预防性和治疗性方法还具有不需要感染原（或其抗原成分或特定株）的在先知识的优点并因此（例如）在流感大流行的过程中特别有用。根据本发明的组合物能够被冷冻干燥并且在室温下是稳定的，其稳定性同样意味着它非常适合于在准备用于大流行的情况中的储存。
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Claims (20)

1.一种通过在受试者中引起固有免疫应答来治疗或预防疾病的方法，所述方法包含为受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含溶液中的TLR2部分，其特征在于所述TLR2部分包含TLR2激动剂并且其特征在于所述疾病不是通过针对所述TLR2部分的体液或细胞免疫应答来治疗或预防的。
2.一种通过在受试者中引起固有免疫应答来治疗或预防癌症的方法，所述方法包含为受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含溶液中的TLR2部分，其特征在于所述TLR2部分包含TLR2激动剂并且其特征在于所述TLR2部分不诱导针对所述癌症的特异的细胞或体液免疫应答。
3.一种用于治疗或预防由感染原引发的疾病的方法，所述方法包含为有其需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含溶液中的TLR2部分，其特征在于所述TLR2部分包含TLR2激动剂并且其特征在于所述TLR2部分不诱导针对所述感染原的特异的细胞或体液免疫应答。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于所述TLR2部分包含结合至增溶剂的TLR2激动剂。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于所述TLR2激动剂选自Pam2Cys、Pam3Cys、Ste2Cys、Lau2Cys和OctCys。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述TLR2激动剂是Pam2Cys。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其特征在于所述增溶剂是PEG（聚乙二醇）或极性多肽。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述极性多肽选自R4、H4、E8和H8。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述增溶剂是聚乙二醇。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述增溶剂包含PEG以及R4、H4、H8、EB8和E8中的任一种。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于所述组合物被鼻内施用至受试者。
12.根据权利要求3至11中任一项所述的方法，其特征在于所述感染原是病毒。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述病毒是甲型流感病毒（IAV）。
14.根据权利要求3至11中任一项所述的方法，其特征在于所述感染原是结核分枝杆菌Mycobacterium tuberculosis或嗜肺军团菌Legionella pneumophila。
15.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述癌症由感染原引发。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述癌症由人类***状瘤病毒（HPV）、丙型肝炎病毒（HCV）或EB病毒（EBV）引发。
17.一种药物组合物，其包含有效量的溶液中的TLR2部分和药学上可接受的载体或赋形剂，所述药物组合物通过在受试者中引起固有免疫应答来治疗或预防疾病，其特征在于所述TLR2部分包含TLR2激动剂并且其特征在于所述疾病不是通过针对所述TLR2部分的体液或细胞免疫应答来治疗或预防的。
18.有效量的溶液中的TLR2部分在制备用于治疗或预防受试者疾病的药物中的用途，其特征在于所述TLR2部分包含TLR2激动剂，其特征在于所述TLR2激动剂在受试者中引起固有免疫应答并且其特征在于所述疾病不是通过针对所述TLR2部分的体液或细胞免疫应答来治疗或预防的。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的方法或根据权利要求17所述的组合物，其特征在于所述组合物不包含TLR9激动剂。
20.根据权利要求18所述的用途，其特征在于所述药物不包含TLR9激动剂。
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