CN102120975B - 一株具有较强抑菌作用的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株具有较强抑菌作用的枯草芽孢杆菌，该菌株命名为Bacillus subtilisB7348，已于2010年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M2010260。本发明的枯草芽孢杆菌经过安全性试验和效率性试验，结果表明可以做为饲料添加剂。应用时，以菌粉的形式添加到饲料中，在使用时，将枯草芽孢杆菌B7348和植物乳杆菌LP-11及其代谢产物进行复配，进行合理搭配，可以满足不同动物、不同养殖阶段的需求，非常适合现阶段养殖特点和养殖模式。
Description
技术领域
本发明涉及一株具有较强抑菌作用的枯草芽孢杆菌及其作为饲料添加剂的应用。
背景技术
目前因滥用抗生素导致的畜禽产品药物残留超标、耐药致病菌株的大量增加等问题已引起人们的高度重视。从2006年1月1日起，欧盟全面禁止饲料中使用抗生素促生长饲料添加剂。最后四种允许做为促生长用途的抗生素饲料添加剂——黄霉素、效霉素、盐霉素和莫能霉素也停止使用。面对竞争日益激烈的国际市场，抗生素等残留问题一直是限制我国畜产品出口的瓶颈。所以，寻找饲用抗生素替代品迫在眉睫。
抗生素是某些微生物通过酶促反应将初级代谢产物转变为结构性的次生代谢产物，诸如短杆菌肽等通过酶促反应把氨基酸转变为结构复杂的化合物。而Nisin(乳酸链球菌素)等细菌素则需要通过核糖体来合成，从而是真正的蛋白类物质。细菌素与抗生素的根本差别是：大部分细菌素只对近缘关系的细菌有损害作用，且具有无毒、无副作用、无残留、无耐药性，同时也不污染环境等优点。因此，高效安全的饲料添加剂——细菌素的使用可以在部分情况下减少甚至取代抗生素的使用。
使用微生态制剂解决饲用抗生素问题，已经从机理上得到证明：有益微生物在其生长代谢过程中，会产生多种抑菌物质，主要包括芽孢杆菌类产生的抗菌肽、乳酸菌类生成的细菌素等。有益菌通过这些物质一方面抑制如大肠杆菌、沙门氏菌等的生长，另一方面为自身的活化、定植提供有利条件。
目前，饲料添加剂中，使用的芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、东洋芽孢杆菌等，芽孢杆菌具有以下优点和特点：①具有耐高温、耐酸碱、耐压等特点，能够耐受颗粒饲料加工的影响；②在贮藏过程中以孢子形式存在，不消耗饲料的营养成分，可以保证饲料的质量；③进入肠道后，在肠道迅速复活，复活率接近100％；④芽孢杆菌能够产生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及多种氨基酸；⑤芽孢杆菌可以消耗大量的氧，维持肠道厌氧环境，抑制致病菌的生长，维持肠道正常生态平衡；⑥具有平衡和稳定乳酸杆菌的作用。
由于枯草芽孢杆菌所产的枯草菌素具有抑制一些革兰氏阳性菌，不产生耐药性，无残留，不污染环境等优点，可以推断，枯草芽孢杆菌代谢产物若能用于饲料添加剂，替代饲料中的饲用抗生素，必将为饲料微生物添加剂的应用提供广阔的前景。因此，枯草芽孢杆菌代谢产物作为抗生素的替代品，其研究和开发意义重大，市场前景广阔。
目前，现有的枯草芽孢杆菌存在以下缺陷：具有抑菌活性的代谢产物的产量不高，抑菌能力一般，急需抑菌活性较高的枯草芽孢杆菌菌种。
发明内容
针对上述现有技术，本发明旨在筛选抑菌活性高的枯草芽孢杆菌菌株，并对其代谢产物活性最高的发酵工艺条件、抑菌谱进行研究，并试验其在动物上的应用效果，为今后的工业化开发奠定基础。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一株具有较强抑菌作用的枯草芽孢杆菌，该菌株命名为Bacillus subtilis B7348，已于2010年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010260。
所述枯草芽孢杆菌的菌种生物学特性如下：该菌种的细胞大小为通常为(0.7μm～0.8μm)×(2.0μm～3.0μm)，杆状，很少成链，染色均匀，无荚膜，鞭毛侧生，能运动；芽孢呈椭圆形或柱状，中生或偏生，大小为0.8μm×(1.5μm～1.8μm)；游离孢子表面着色弱；培养基上的菌落圆或者不规则形，表面色暗，变厚和不透明，可起皱，可呈奶油色或褐色；革兰氏阳性，接触酶阳性，能发生V-P反应；能利用葡萄糖、***糖、木糖和甘露醇产酸，能水解淀粉，分解色氨酸形成吲哚；生长温度最高值45～55℃，最低值5～20℃，最适温度为37℃。
所述枯草芽孢杆菌，通过SDSS-PCR鉴定，其代谢产物中主要抑菌物质为分子量在7000～8000d的小分子物质。
所述枯草芽孢杆菌经过安全性试验和效率性试验，结果表明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisB7348，CCTCC M 2010260可以做为饲料添加剂。
所述枯草芽孢杆菌做为饲料添加剂应用时，以菌粉的形式添加到饲料中，所述菌粉是通过以下步骤得到的：
(i)菌种：选用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis B7348，CCTCC M 2010260；
(ii)斜面培养：将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在32～40℃培养20～28h；
(iii)一级种子培养：取培养好的斜面，在无菌条件下接种于50mL～100mL种子液体培养基中，在32～40℃条件下，静置培养14～18h，制得一级种子液；
(iv)扩大培养：以5％的接种量，将一级种子液接于500mL～1000mL种子液体培养基中，在32～40℃条件下，静置培养10～16h，制得二级种子液；
(v)发酵罐培养：以5％的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于32～40℃条件下，静置培养16～24h；
(vi)收集发酵产物：待步骤(v)之发酵液黏度达12000～15000cP时，收集发酵液；
(vii)发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，如此反复2～3遍后冷冻干燥，粉碎，即为菌粉成品；或：发酵结束后，立即喷雾干燥，即得菌粉成品；
上述步骤(iii)、(iv)中所述种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L，使用时，调节pH至6.5～7.5，115℃条件下灭菌20min；步骤(ii)中所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.5～2.0％的琼脂粉；步骤(v)中所述液体发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L，氯化钠5g/L，使用时，调节pH至6.5～7.5。
鉴于枯草芽孢杆菌B7348对革兰氏阳性菌抑制效果较好，而植物乳杆菌LP-11(该菌株命名为Lactobacillus plantarum，已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010150，记载在中国专利申请CN201010240725.X中)对革兰氏阴性菌抑制效果明显，同时，两者的代谢产物具有较强的抑菌作用，两菌种间有着很好的互补关系，联合使用效果更佳。综合考虑两株菌不同的抑菌效果，将枯草芽孢杆菌B7348和植物乳杆菌LP-11及其代谢产物进行复配(其中枯草芽孢杆菌B7348菌粉活菌数为2.0×108cfu/g，乳酸菌菌粉活菌数为1.0×108cfu/g)，进行合理搭配，形成产品肽菌素，以满足不同动物、不同养殖阶段的需求。
所述的肽菌素的使用剂量如下：对正常不患病的种禽，用量为饲料总质量的0.2％；对患病的种禽，用量为饲料总质量的0.4％；对妊娠母猪，用量为饲料总质量的0.1～0.2％；对哺乳母猪，用量为饲料总质量的0.3～0.4％；对患有***炎的奶牛，用量为80～120g/头/天，可以先用120g/头/天，半个月，再用80g/头/天，半个月，使体细胞(一般以每毫升牛奶中含20万个细胞为亚临床***炎的临界值，超过该值为阳性，低于该值则正常)逐渐控制在20万个以下；对患有阴性***炎的奶牛，用量为40g/头/天，长期使用即可，1个月后体细胞逐渐被控制在20万个以下。
附图说明
本发明提供的具有较强抑菌作用的枯草芽孢杆菌命名为Bacillus subtilis B7348，已于2010年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010260。
图1为枯草芽孢杆菌B7348和枯草芽孢杆菌Nxc6对不同指示菌的抑菌效果图，其中，A为B7348对鸡大肠杆菌O78的抑菌效果图，B为B7348对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图，C为B7348对猪大肠杆菌2116的抑菌效果图，D为Nxc6对鸡白痢沙门氏菌C79-13的抑菌效果图。
图2为枯草芽孢杆菌B7348 SDS-PAGE分析。
图3为安全性试验增重率数据图。
图4为试验各组肉鸡的饲料转化率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1产抑菌物质芽孢杆菌的筛选
一、芽孢杆菌初筛
芽孢杆菌在动物体内定殖能产生大量淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和植酸酶等。这些酶在动物肠道内，有助于直接分解、消化饲料营养成分，降解植物性饲料中的非淀粉多糖，改善消化道食糜的物理特性或消除日粮中的抗营养因子，促进动物的生长和生产。另外，芽孢杆菌产生了大量的代谢产物，也包括细菌素，例如枯草菌素(subtilin)等。细菌素具有直接的抑菌活性，通过与其它代谢产物如乙酸、丙酸、丁酸等共同作用，可有效抑制病原菌生长，提高动物的免疫水平，最终提高了饲料的转化率。
1.材料与方法
1.1试验菌株 枯草芽孢杆菌N9、枯草芽孢杆菌N9-1-35、地衣芽孢杆菌S、冷水菌1#、纳豆芽孢杆菌1#、短小芽孢杆菌BT123、纳豆芽孢杆菌4#、蜡样芽孢杆菌等。
1.11发酵培养基及培养条件 葡萄糖1.5％，黄豆饼粉3.0％，蛋白胨0.2％，NaCl 0.1％，(NH4)2SO4 0.5％，CaCO3 0.6％，MgSO4 0.6％，pH 7.2～7.5，37℃液态培养48h。
1.1.2试验菌株前处理将斜面菌种接种到装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，37℃恒温振荡(180rpm)培养至芽孢率10％以上，5000rpm离心分离菌体和上清液，取上清液备用。
1.2指示菌
猪大肠杆菌1565、藤黄八叠球菌、金黄色葡萄球菌。
培养基及培养条件：葡萄糖0.2％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，牛肉膏0.5％，pH 7.0，37℃液态培养24h。
以上培养所得指示菌试验前均稀释100倍，OD值0.2～0.3之间。
1.3体外抑菌试验-管碟法
双碟的制备：取直径90mm的培养皿，注入灭菌的营养琼脂(1.5％)15mL，水平放置使之凝固，作为底层，另取指示菌培养基(浓度为0.8％，冷至50℃左右)与指示菌菌液适量混匀，取6mL铺在底层培养基上，水平放置使之凝固，作为菌层。
加样品：用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯，打开皿盖，放在培养基上。在牛津杯中加满相同量的抗菌液(300μL)，每个样品三个重复。将加完样的培养皿小心放入37℃恒温箱内，培养18h后取出测量抑菌圈直径。
1.4主要仪器设备
2.结果与分析
具体试验结果如表1所示：
表1芽孢杆菌初筛结果
试验结果表明，枯草芽孢杆菌N9-1-35、纳豆芽孢杆菌1#对以上列出的三种致病菌没有明显的抑制作用；枯草芽孢杆菌N9、地衣芽孢杆菌S、冷水菌1#、纳豆芽孢杆菌4#、短小芽孢杆菌BT123至少对两种致病菌具有较明显的抑制作用，所以初步选定枯草芽孢杆菌N9、冷水菌1#、地衣芽孢杆菌S、纳豆芽孢杆菌4#、短小芽孢杆菌BT123作为下一步试验菌株，同时为了获得具有较高抑菌性能的芽孢杆菌，在下一步的试验中又重新筛选了几株芽孢杆菌。
二、芽孢杆菌复筛
1材料与方法
1.1材料
新鲜牛粪、猪粪；
指示菌：大肠杆菌O78、猪大肠杆菌2116、鸡伤寒沙门氏菌C79-20、鸡白痢沙门氏菌C79-13、鸡大肠杆菌249、金黄色葡萄球菌。
1.2样品采集与处理
分别称取新鲜的牛粪、鸡粪10g，置于装有100mL生理盐水的三角瓶中，于85℃的水浴中处理15min，离心(3000rpm)10min。取上清液备用。
1.3菌株分离
取一定量的样品上清液与大肠杆菌O78发酵液混合涂布平板，置于37℃恒温培养24h，选取菌落周围有抑菌圈的菌落进行分离纯化，并进行体外抑菌试验。
1.4试验菌株的前处理以及指示菌的培养：具体方法同芽孢杆菌初筛。
1.5体外抑菌试验-管碟法(具体方法同芽孢杆菌初筛)。
1.6对新筛选出的菌株与初筛菌株进行对比试验，采用管碟法进行体外抑菌试验。
1.7pH值对芽孢杆菌抑菌效果的影响
1.7.1试验菌株前处理
37℃恒温振荡(180rpm)培养，观察芽孢生成率，达10％时即可用于试验。按无菌操作将发酵液pH调至3.0、4.0、5.0、6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5、9.0、10.0、11.0，5000rpm离心10min，取上清待用。
1.7.2对照组处理
取空白培养基调pH至3.0、4.0、5.0、6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5、9.0、10.0、11.0，5000rpm离心10min，取上清待用。
1.8产酶性能检测 测定芽孢杆菌发酵液中的中性蛋白酶酶活-采用福林法。
1.9药敏试验 采用常规方法测定抗生素对芽孢杆菌的抑菌作用。
2结果与分析
2.1新筛选菌株：试验从牛粪、猪粪中共分离出40余株杆菌，革兰氏染色呈阳性，有芽孢，初步鉴定为芽孢杆菌。对这40余株菌进行抑菌性能试验，其中以枯草芽孢杆菌B7348、Nxc6菌株的性能最突出。抑菌试验结果见图1和表2。
表2抑菌试验结果(单位：mm)
2.2新筛菌株与初筛菌株的比较试验，结果见表3。
表3 8株芽孢杆菌的抑菌试验效果(单位：mm)
注：+表示抑菌圈直径为9～13mm，++表示抑菌圈直径为＞13mm；-表示抑菌圈不明显。
由试验结果可以看出，地衣芽孢杆菌S只对革兰氏阳性菌有较好的抑制作用，枯草芽孢杆菌N9只对革兰氏阴性菌有较好的抑制作用，B7348、Nxc6对革兰氏阳性菌表现出较强的抑制作用，同时对革兰氏阴性菌也有一定的抑制作用，短小芽孢杆菌BT123对几种指示菌无明显的抑制效果，冷水菌1#对革兰氏阴性菌有一定的抑制作用，纳豆芽孢杆菌4#只对革兰氏阳性菌有抑制作用。
通过复筛的试验结果可以看出，枯草芽孢杆菌N9、B7348、Nxc6、地衣芽孢杆菌S和冷水菌1#对试验所用的几株指示菌具有一定的抑制作用，再通过体外抑菌试验进一步加以筛选，结果见表4。
表4复筛后剩余菌株的抑菌效果(单位：mm)
试验结果表明，枯草芽孢杆菌B7348和Nxc6对所用的指示菌具有比较理想的抑菌效果，尤其对革兰氏阳性病原菌-金黄色葡萄球菌，抑制效果十分明显，具体抑菌效果图见图1所示。
2.3pH值对芽孢杆菌抑菌效果的影响
2.3.1pH值对地衣芽孢杆菌S抑菌效果的影响(由于地衣芽孢杆菌S只对革兰氏阳性菌有明显的抑制作用，所以此试验中指示菌为金黄色葡萄球菌和藤黄八叠球菌)，结果见表5。
表5pH值对地衣芽孢杆菌s抑菌效果的影响(单位：mm)
试验结果表明，地衣芽孢杆菌S的代谢产物能产生具有明显抑制革兰氏阳性菌的物质，并且其抑菌活性在7.0～8.0时达到最高，在pH值3.0-11.0的范围内，其抑菌活性呈现先升高后降低的特性。
2.3.2pH值对枯草芽孢杆菌B7348抑菌效果的影响结果见表6。
表6pH值对枯草芽孢杆菌B7348抑菌效果的影响(单位：mm)
试验结果表明，枯草芽孢杆菌B7348能产生具有明显抑制革兰氏阳性菌的代谢产物，并且其抑菌活性在pH6.5～8.5的范围内无明显差异，在pH值3.0-11.0的范围内，其抑菌活性呈现先升高后降低的特性。
2.3.3pH值对枯草芽孢杆菌Nxc6抑菌效果的影响结果见表7。
表7pH值对枯草芽孢杆菌Nxc6抑菌效果的影响(单位：mm)
试验结果表明，枯草芽孢杆菌Nxc6能产生具有明显抑制革兰氏阳性菌的代谢产物，并且其抑菌活性在pH6.5～8.5的范围内无明显差异，在pH值3.0-11.0的范围内，其抑菌活性呈现先升高后降低的特性。
2.4芽孢杆菌的产酶性能结果见表8。
表8中性蛋白酶测定结果
由试验结果可以看出，枯草芽孢杆菌B7348中性蛋白酶活力明显高于其他筛选菌株。
2.5药敏试验 药敏试验结果如表9所示。
表9抗生素对枯草芽孢杆菌B7348，Nxc6的抑菌试验结果 抑菌圈直径(mm)
试验结果表明，B7348、Nxc6对氧氟沙星属于高度敏感，B7348对青霉素属于高度敏感，Nxc6对青霉素属于中度敏感，B7348、Nxc6对链霉素属于高度敏感。
3.结论
3.1pH值对芽孢杆菌抑菌效果的影响 pH在6.5～8.5范围内对芽孢菌的抑菌活性影响不明显；一般情况下芽孢杆菌培养结束后pH中性偏碱，即pH为7.0～8.5。
3.2各菌株抑菌效果比较 通过试验得出，试验的多株芽孢杆菌对不同致病菌的抑菌效果是有明显差异的，整体上对革兰氏阳性菌效果要好于革兰氏阴性菌。其中以B7348和Nxc6最稳定，抑菌谱最广，抑菌效果最佳。地衣芽孢杆菌S只对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌的效果明显。
3.3筛选菌株产酶特性 通过分析几株芽孢杆菌产中性蛋白酶活力，发现枯草芽孢杆菌B7348产酶特性最好，中性蛋白酶活力可达140U/mL。
3.4试验菌株的确定 综合菌株的抑菌能力、产酶性能和对抗生素的敏感性等多方面因素，最终选取枯草芽孢杆菌B7348做为后续试验的备选菌株。
实施例2枯草芽孢杆菌B7348代谢产物理化性质的初步研究
1研究的目的意义
枯草芽孢杆菌在自然界分布非常广泛，大量研究证明它能够产生多种抑制植物病原菌的抑菌物质，多数芽孢杆菌的抗菌物质具有抗菌谱广，对酸碱度要求不高，热稳定性好等优点，这些都为开发新型天然防腐剂以及生防制剂提供了很好的条件。目前，利用枯草芽孢杆菌产抑菌物质的性质将其应用于动物微生态制剂的研究报道却很少，枯草芽孢杆菌的抗菌物质对畜禽具有促生长、保健和治疗疾病的功能，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型制剂，作为一种新型饲料添加剂是目前饲料上的一个新的研究发展方向。
大量试验研究表明，枯草芽孢杆菌代谢产物对大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella Lignieres)等多种致病菌均有较强的抑制作用，但所产抑菌物质的理化性质及抑菌物质的成分还有待继续试验研究，本研究拟对枯草芽孢杆菌代谢产物抑菌物质的理化性质进行初步研究，并对其进行初步分离纯化试验，以期为枯草芽孢杆菌代谢产物在动物微生态制剂方面的进一步开发和应用提供依据。
2试验材料
2.1供试菌株
枯草芽孢杆菌N9、7348、Nxc6。
2.2指示菌
鸡大肠杆菌O1(Escherichia coli O1)、金黄色葡萄球菌(Staphy loccocus aureus)。
2.3培养基
芽孢杆菌斜面培养基：蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 5g、琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH值7.0。
芽孢杆菌液体种子培养基：葡萄糖2g、酵母膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g，蒸馏水1000mL，pH值7.0。
芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖5g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，蒸馏水1000mL，pH值7.0。
指示菌发酵培养基：同枯草芽孢杆菌液体种子培养基。
2.4仪器与设备
恒温培养箱，高压蒸气灭菌锅，超净工作台，显微镜，酸度计，恒温振荡培养箱，移液枪，牛津杯，陶瓦盖等。
3试验方法
3.1体外抑菌试验-管碟法
双碟的制备：取直径90mm的培养皿，注入灭菌的营养琼脂(1.5％)15mL，水平放置使之凝固，作为底层，另取指示菌培养基(浓度为0.8％，冷至50℃左右)与指示菌菌液适量混匀，取6mL铺在底层培养基上，水平放置使之凝固，作为菌层。
加样品：用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯，打开皿盖，放在培养基上。在牛津杯中加满相同量的抗菌液(300μL)，每个样品三个重复。将加完样的培养皿小心放入37℃恒温箱内，培养18h后取出测量抑菌圈直径。
3.2代谢产物的制备
枯草芽孢杆菌代谢产物的制备：将菌种接种在斜面培养基中，37℃培养复壮，24h后传代到装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，37℃恒温振荡培养(180rpm)24h，然后接种到装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，37℃恒温振荡(180rpm)，培养至芽孢率10％以上，5000rpm离心分离菌体和上清液，取上清液经细菌过滤器过滤(滤膜直径为0.22μm)，收集滤液即为枯草芽孢杆菌的代谢产物；然后用管碟法对代谢产物进行抑菌活性测定。
3.3H2O2抑菌作用排除试验。
用50mmol/L的磷酸缓冲溶液配制20mg/mL的H2O2酶溶液，在1mL酶溶液中加入0.4mL培养代谢产物，使酶的终浓度为4mg/mL，另取0.1mL磷酸缓冲溶液加入等量培养上清液作对照。37℃水浴2h后与处理前的发酵上清液比较抑菌活性的大小，以排除代谢产物中的H2O2抑菌作用。
3.4乳酸菌酸性产物抑菌作用排除试验
将乳酸菌代谢产物调pH至4.0，以pH值4.0的乳酸和pH值4.0的MRS培养基作对照，用管碟法测定抑菌圈大小，确定代谢产物中排除乳酸以外的抑菌物质。
3.5代谢产物抑菌物质特性分析
3.5.1温度稳定性
分别将各供试菌株的代谢产物在60℃、80℃、100℃下分别处理10min、30min、60min，冷却后做抑菌试验，测定抑菌活性，同时设置对照组。
3.5.2pH值对抑菌物质抑菌活性的影响
代谢产物分别用NaOH和HCl调pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，在室温下放置24h(对照组置于4℃冰箱24h)，然后用牛津杯法测定其体外抑菌效果。
3.5.3蛋白酶对抑菌物质活性的影响
枯草芽孢杆菌B7348代谢产物调至胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶作用的最适pH值(分别为2.0、7.5、7.5和6.5)，按终质量浓度1.0mg/mL分别加入上述各酶液，在上述各蛋白酶的最适温度下(分别为40℃、37℃、58℃和60℃)恒温水浴酶解3h后，将酶解液的pH值调回原发酵液的pH值，以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O1为指示菌，以未酶解处理的代谢产物为对照，管碟法进行体外抑菌试验，作三个平行。
3.6抑菌物质的初步提取
采用硫酸铵沉淀法，对枯草芽孢菌B7348设计不同浓度的硫酸铵提取效果优化试验方案，找出最佳硫酸铵提取浓度，并对各试验组枯草芽孢杆菌菌株代谢产物中抑菌物质进行了初步提取。
最佳硫酸铵浓度的选择：将培养好的发酵液于4000rpm离心20min，去除菌体。将上清液平均倒入8个锥形瓶中，边搅拌边缓慢加入经过研磨的无水硫酸铵粉末，使溶液的最终质量分数分别达到10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％。放置在4℃冰箱中静置8～12h，使蛋白沉淀出来。然后于5000rpm离心10min，弃上清液，用去离子水将沉淀复溶，倒人透析袋中进行透析(过夜)。分别测定8个浓度透析液和上清液的抗菌活性，根据抑菌圈的大小确定硫酸铵沉淀的最佳使用浓度。
4结果与讨论
4.1H2O2抑菌作用排除试验
表10枯草芽孢杆菌H2O2酶解试验结果 抑菌圈直径：(mm)
结果如表10所示，试验结果表明，枯草芽孢杆菌B7348经过氧化氢酶酶解后对金黄色葡萄球菌的抑制作用有一定程度的降低，说明枯草芽孢杆菌B7348代谢产物中有一定的H2O2，但是还有大量其他的物质同样具有抑菌活性。
4.2乳酸菌酸性产物抑菌作用排除试验
表11乳酸菌酸性产物抑菌作用排除试验结果 抑菌圈直径：(mm)
注：指示菌为金黄色葡萄球菌。
结果如表11所示，试验结果表明，同样是pH值4.0的乳酸菌LP代谢产物和MRS培养基(用乳酸调pH)均有明显的抑菌效果，且代谢产物的抑菌圈直径略大于培养基抑菌圈直径，但单纯pH值4.0的乳酸却没有抑菌效果，这说明乳酸菌LP的代谢产物或MRS培养基中的某种抑菌物质在酸性条件下具有一定的抑菌活性，而单纯的乳酸没有抑菌作用。
4.3温度稳定性试验
表12枯草芽孢杆菌B7348不同温度处理试验 抑菌圈直径：(mm)
结果如表12所示，试验结果表明，枯草芽孢杆菌B7348代谢产物中的抑菌物质经60℃、80℃、100℃处理10min、30min、60min，对鸡大肠杆菌O1和金黄色葡萄球菌的抑制作用随处理温度的升高和时间的延长而略有降低，但总体来看，枯草芽孢杆菌B7348具有比较良好的热稳定性。
4.4pH值对抑菌物质抑菌活性的影响
表13枯草芽孢杆菌B7348pH值稳定性试验 抑菌圈直径：(mm)
结果如表13所示，试验结果表明，枯草芽孢杆菌B7348的代谢产物中的抑菌物质在室温下放置24h其抑菌活性略有降低，在pH值8.0时活性达到最高，在pH值4.0-11.0的范围内，其抑菌活性呈现先升高后降低的特性。
4.5蛋白酶的稳定性
表14枯草芽孢杆菌B7348蛋白酶酶解试验 抑菌圈直径：(mm)
结果如表14所示，试验结果表明，将枯草芽孢杆菌B7348代谢产物经各蛋白酶酶解后，只有胰蛋白酶和胃蛋白酶处理的还有部分抑菌活性，而经蛋白酶K和木瓜蛋白酶处理后，已经完全失去抑菌活性。结果证实枯草芽孢杆菌B7348代谢产物的抑菌物质中含有部分蛋白类成分。
4.6抑菌物质的初步提取
4.6.1最佳硫酸铵浓度的选择
以枯草芽孢杆菌B7348为试验菌株，进行最佳硫酸铵浓度试验结果如表15所示。
表15枯草芽孢杆菌B7348代谢产物不同硫酸铵浓度相提试验结果 抑菌圈直径：(mm)
结果如表15所示，由试验结果可以看出，硫酸铵浓度在10％～70％，提取后对大肠杆菌O1无抑制作用；硫酸铵浓度为30％、40％和50％时，提取后对金黄色葡萄球菌有抑制作用，并且在30％时提取的比较彻底，上清液的抑菌圈直径是最小的，所以硫酸铵沉淀浓度以30％为佳。
5结论
5.1作为益生素主要生产菌种之一，枯草芽孢杆菌制剂在动物生产中的研究和应用一直是畜牧业科研和生产人员关注的焦点，但将枯草芽孢杆菌所产抑菌物质的特性应用在动物疾病防治方面报道却比较少，本试验对枯草芽孢杆菌B7348代谢产物抑菌物质的理化性质进行初步研究，并对其进行初步提取试验，以期为枯草芽孢杆菌在动物疾病防治方面的进一步开发和应用提供依据。
5.2在本试验菌株中，枯草芽孢杆菌B7348所产抑菌物质具有一定的热稳定性，在60℃、80℃、100℃处理30min后活性没有变化或变化很小，各处理间无显著性差异。抑菌物质的热稳定性表明其可以在工业化生产和在食品加工中经受高温处理，可降低其工业化生产的条件限制，从而降低其生产和应用的成本，为其大规模的工业化生产和应用提供了可能。
实施例3枯草芽孢杆菌B7348代谢产物中有效抑菌成分分析
1.材料与方法
采用SDS-PAGE方法进行分析。
胶浓度为15％，样品上样量20μL，Maker上样量10μL。两端为Maker。
样品经过不同处理：枯草芽孢杆菌菌体、枯草芽孢杆菌培养液、枯草芽孢杆菌培养液4000rpm离心5min，取上清。
三种处理分别加至4、5、6泳道，进行分析。
2.试验结果
枯草芽孢杆菌B7348 SDS-PAGE结果如图2所示。
3.分析与讨论
枯草芽孢杆菌B7348在4、5、6的三个泳道中在8kd左右均出现了三条浓密的条带，从分子量上分析，此三条带均为小分子肽类物质。其中培养液上清及沉淀中均能出现此条带，说明枯草芽孢杆菌B7348能够分泌出这种活性小肽。笔者又将该物质进行抑菌试验，验证其具有较强的抑菌效果，从而证实，枯草芽孢杆菌B7348具有较强的抑制病原指示菌的作用。
实施例4菌粉的制备工艺
(i)菌种：选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B7348，CCTCC M 2010260；
(ii)斜面培养：将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在37℃培养24h；
(iii)一级种子培养：将培养好的斜面，在无菌条件下用接种环接2环于100mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养16h，制得一级种子液；
(iv)扩大培养：以5％的接种量，将一级种子液接于1000mL种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养12h，制得二级种子液；
(v)发酵罐培养：以5％的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，于37℃条件下，静置培养20h；
(vi)收集发酵产物：待步骤(v)之发酵液黏度达14000cP时，收集发酵液；
(vii)发酵结束后，立即喷雾干燥，即得菌粉成品。
上述步骤(iii)、(iv)所述种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L，调节pH7.0，115℃条件下灭菌20min；步骤(ii)所述固体斜面培养基为上述种子液体培养基中添加1.5％的琼脂粉；步骤(v)中所述液体发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠5g/L，pH 7.0。
实施例5复配研究及添加量研究
由于枯草芽孢杆菌B7348对革兰氏阳性菌抑制效果较好，而植物乳杆菌LP-11对革兰氏阴性菌抑制效果明显，两者有着很好的互补关系，联合使用效果更佳。综合考虑两株菌不同的抑菌效果，将枯草芽孢杆菌B7348和植物乳杆菌LP-11及其代谢产物进行复配(其中枯草芽孢杆菌B7348菌粉活菌数为2.0×108cfu/g，乳酸菌菌粉活菌数为1.0×108cfu/g。)，进行合理搭配，形成产品肽菌素，满足不同动物、不同养殖阶段的需求。
肽菌素在种禽的推荐用量为正常0.2％，患病时0.4％；肽菌素在妊娠母猪按0.1～0.2％用量，在哺乳母猪按0.3～0.4％用量；对于临床***炎，肽菌素用量为80～120g/头/天，可以先用120克半个月，再用80克半个月，体细胞(一般以每毫升牛奶中含20万个细胞为亚临床***炎的临界值，超过该值为阳性，低于该值则正常。)逐渐控制在20万个以下；对于阴性***炎，肽菌素用量为40g/头/天，长期使用即可，1个月体细胞逐渐控制在20万个以下。
实施例6菌种安全性试验
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验菌株：枯草芽孢杆菌B7348和Nxc6，由前述实施例1筛选分离纯化得到。
1.1.2试验动物：海兰褐雏公鸡，由泰安市东岳种禽公司购得。
1.1.3基础日粮配方：成分见表16。
表16基础日粮配方
注：预混料中未添加饲用抗生素
1.2试验地点：泰安巴夫巴夫农业科技有限公司徂徕山生态牧场。
1.3试验方案
1.3.1试验分组及饲养管理：450只1日龄海兰褐雏公鸡，鸡只大小、健康状况基本相同，以不含抗生素的全价料为基础日粮。随机分成11个组，即1个对照组和10个试验组，每组设2个重复，每个重复20只鸡，在基础日粮的基础上分别添加不同浓度的B7348和Nxc6喷干粉进行试验，其中1～7d为预饲期，正式试验期为14d；按照常规对鸡舍进行消毒，采用笼养方式，自由采食、饮水。按鸡场正常程序进行免疫接种；试验设计见表17(其中枯草芽孢杆菌B7348和Nxc6喷干粉的活菌数均为2×108cfu/g)。
表17试验设计
1.3.2检验指标
(1)外观性状的观察
(2)观察内脏器官的病变情况
(3)生长指标的测定
2结果与讨论
2.1经两周饲喂后，雏鸡生长发育正常，观察雏鸡的外观及粪便均未见异常。
2.2试验动物解剖后，未见异常病变。
2.3对生长性能的影响
生长试验结束后，称量每组雏鸡总重以计算末均重、增重率、生长比率等指标，结果如表18所示。
增重率＝(Wt-W0)/W0
生长比率(％)＝(ln Wt-ln W0)/T
Wt-试验末雏鸡均重(g)，W0-试验初雏鸡均重(g)，T-试验天数。
表18枯草芽孢杆菌对雏鸡生长性能的影响
对增重率及生长比率两组数据分析，如图3所示。
试验结果表明，除7(2)和N(3)外，其余各组的增重率和生长比率均高于对照组，尤其是7(3)、7(5)组增重率比对照组提高10.0％、11.1％，生长比率比对照组提高5.4％、6.7％。
试验结果进一步表明，枯草芽孢杆菌B7348对雏鸡的增重效果优于枯草芽孢杆菌Nxc6。
实施例7枯草芽孢杆菌B7348的效率试验
1试验目的：
本试验的试验目的是检测枯草芽孢杆菌B7348并复合乳酸菌代谢产物是否对治病动物具有一定免疫效果，并考察其在提高肉鸡的生产性能方面是否与抗生素对照具有可比性。
2试验材料
2.1试验动物：AA+白羽肉鸡，购自泰安市省庄肉鸡场。
2.2试验菌株：枯草芽孢杆菌B7348(2010年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，
其保藏编号为CCTCC M 2010260)、植物乳杆菌LP(该菌株命名为Lactobacillusplantarum，已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCM 2010150，记载在中国专利申请CN201010240725.X中)。
2.3试验地点：泰安巴夫巴夫农业科技有限公司徂徕山生态牧场。
2.4基础日粮配方：见表19。
表19基础日粮配方
3试验方法
3.1试验分组及饲养管理：240只1日龄AA+白羽肉鸡，鸡只大小、健康状况基本相同，以不含抗生素的全价料为基础日粮。随机分成4个组，即1个对照组和3个试验组，每组设2个重复，每个重复30只鸡。试验设计见表20。雏鸡出壳第二天开始，用鸡白痢沙门氏菌24h培养物攻毒，攻毒量0.5mL/只。待雏鸡七日龄左右观察雏鸡粪便的变化，统计发病率和病程等指标。按照常规对鸡舍进行消毒，采用笼养方式，自由采食、饮水。试验期21天。
表20试验设计方案
*注：枯草芽孢杆菌B7348菌粉活菌数为2×108cfu/g，乳酸菌菌粉活菌数为1×108cfu/g，氧氟沙星纯度为2％。
3.2检测指标
3.2.1各组鸡发病率及病程的测定
3.2.2生长性状分析：分别测定7、14、21日龄的增重以及饲料转化率。
4结果与分析
4.1效率分析：结果如表21所示。
表21试验各组功毒后的发病情况
其中对照组发病率在90％以上，而且在21日龄时仍有10％未痊愈，发病率和病程明显高于其它各组。其次，第III组发病率在60％左右，在发病后三天内就已痊愈，发病率和病程明显低于其它各组。另外，第I组和第II组发病率在70％左右，第I组在发病后四天时间内也已痊愈，第II组病程稍长些，此两组发病率和病程介于阴性对照和阳性对照之间。
试验结果表明，在肉鸡的日粮中添加枯草芽孢杆菌B7348和植物乳杆菌LP能够明显缓解因沙门氏菌感染引起的肉鸡下痢症状。
4.2生产性状分析：结果如表22所示，并根据表22做出对比图，如图4所示。
表22试验各组肉鸡的生长性能情况
表22和图4的试验结果表明，从平均饲料转化率来看，第III组饲料转化率稍高于其他试验组。第一周，抗生素试验组较其他试验组有着明显的优越性。主要是因为试验初期抗生素对杂菌的抑制效果明显，其能够起到保护肠道菌群的作用。随着试验周期的延长，动物机体和其它杂菌对抗生素均产生了一定的耐药性，导致抗生素组饲料转化率下降趋势明显，到试验后期就失去了优越性。相反，活菌在动物体内定植是有一定周期的，越早摄入枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌等益生菌可以帮助其尽早形成优势乳酸菌等菌群，有助于动物提高抵抗力，避免外来有害细菌的感染。因此第I和II组到试验后期较抗生素组优势明显。
试验结果表明，在肉鸡的日粮中添加枯草芽孢杆菌B7348和乳酸菌LP-11能够明显缓解因沙门氏菌感染引起的肉鸡下痢症状。与饲用抗生素比较，使用两株益生菌及其代谢产物，在提高机体抵抗力，减少发病率等方面，已经达到和超过饲用抗生素的效果。对动物后期恢复效果尤其明显。
总之，由试验结果可以得出，动物摄入含有枯草芽孢杆菌B7348、植物乳杆菌LP以及LP发酵物的微生态制剂，能够起到提高饲料转化率、提高动物机体的抗病能力等效果，在一定程度上能够起到替代饲用抗生素的作用。
实施例8肽菌素对笼养肉种鸡的作用效果
肽菌素含有多种对鸡有益的活菌成分，它们可以在鸡的肠道内特定的部位繁殖，形成特定的菌群优势，通过产生一系列代谢产物来抑制有害菌群的生长，从而维持了肠道健康，减少了肠道疾病的发生。有益菌能产生一些消化酶和B族维生素，促进肠道内的营养物质的吸收，提高饲养效果，还能减少肠道内及排出体外粪便的氨的形成和有害菌的数量，对改善空气质量和鸡舍环境很有好处。
微生态制剂对鸡的有益作用是公认的，但经济效益是用户最为关心的问题，本试验选定几项主要技术和经济指标来分析评定笼养肉种鸡饲喂肽菌素的效果。
1材料与方法
1.1肽菌素：为枯草芽孢杆菌B7348菌粉和植物乳杆菌LP-11菌粉的混合，其中，枯草芽孢杆菌B7348菌粉活菌数为2.0×108cfu/g，植物乳杆菌LP-11菌粉活菌数为1.0×108cfu/g；枯草芽孢杆菌B7348菌粉按实施例4中方法制备。
1.2试验鸡AA父母代肉种鸡
1.3试验时间
2009年11月17日-20010年1月17日，试验鸡周龄：0-61周龄
1.4试验鸡分组
1.4.1育雏育成期(0-22周龄)
入舍时，将同批1日龄雏鸡(母)随即分成两组，试验组11088只，对照组11039只，每组分养在5栋育雏舍内。
1.4.3产蛋期(23--61周龄)
将育成期试验鸡转入同一产蛋场条件相同的6栋鸡舍，试验组对照组各3栋，每组5856只。
1.4.3饲养管理
试验组日粮中额外添加0.1％肽菌素，不再添加任何药物，对照组按按常规方法饲养和管理，全程笼养。
1.5考查统计项目
1.5.1育雏育成期：成活率、育成合格率、耗料量、药费成本、鸡群常规检查；
1.5.2产蛋期：死淘率、入舍鸡产蛋数、入舍鸡产合格蛋数、种蛋率、碎蛋率、药费成本、鸡群常规检查。
2结果与分析
2.1育雏育成期
表23育雏期蛋鸡统计数据 单位：(只、％、kg、元)
*迁出鸡数为母系公鸡数，计算成活率时将此数从入舍鸡数中刨去。
结果如表23所示，结果表明，试验组比对照组成活率高0.14个百分点，育成合格率高0.2个百分点，每只鸡耗料减少0.41g；试验鸡的粪便明显比对照组干燥，形态正常，鸡舍内的氨味减轻(感官判断)。
2.2产蛋期
表24产蛋期蛋鸡统计数据 单位：(只、％、枚/只、kg)
结果如表24所示，结果表明，试验组比对照组入舍鸡数产蛋数多6.56枚/只，合格蛋多8.17枚/只。这些差别主要是由死淘率和种蛋率的差别造成，试验组的死淘率低6.2个百分点，种蛋率高1.34个百分点。
2.3经济效益
2.3.1育雏育成期
药费成本试验组比对照组低0.383元/只，节省药费57.4％(其它项目不计)。
2.3.1产蛋期
合格种蛋按1.35元/枚计，8.17枚多收入11.03元/只；
试验组比对照组成活鸡多363只，只售价多6.8元，平均多收入0.4215元/只；
试验组只平均用肽菌素41.01g，按12元/kg计，平均0.4921元/只；
试验组多耗料1.62kg/只，按1.35元/kg计，多2.187元/只；
对照组药费平均0.7644元/只。
2.3.3全期合计增收节支
产出：11.03+0.383-0.22+0.4215-2.187-0.4921＝8.9354元/只
投入：0.284+0.984+0.4921+2.187＝3.9471元/只
投入产出比＝3.9471∶8.9354＝1∶2.26
3结论
3.1本试验条件下的肉种鸡日粮中添加0.1％的肽菌素，不再添加任何药物，可以保证鸡群健康，生长发育正常，生产性能发挥良好。
3.2试验组比对照组，育雏育成期成活率、育成合格率略高，耗料数略高，节省药费57.4％，且粪便形态明显好于对照组，鸡舍氨味减轻；产蛋期可明显降低死淘率，提高产蛋率和种蛋率，到61周每只入舍母鸡多产8.17枚合格种蛋。
3.3肉种鸡饲料中添加肽菌素经济效益显著，投入产出比1∶2.26以上。
综合以上实验结论，本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌B7348具有良好的抑菌效果，可以作为饲料添加剂应用，为通常所见的枯草芽孢杆菌所不具备的，现已于2010年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010260。
Claims (3)
1.一株具有抑菌作用的枯草芽孢杆菌，其特征在于：该菌株命名为Bacillus subtilis B7348，已于2010年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M2010260。
2.权利要求1所述的具有抑菌作用的枯草芽孢杆菌作为饲料添加剂的应用，其特征在于：将所述枯草芽孢杆菌B7348的菌粉和植物乳杆菌LP-11的菌粉进行复配，组成产品：肽菌素，作为饲料添加剂加入到饲料中，其中，枯草芽孢杆菌B7348菌粉的活菌数为2.0×108cfu/g，植物乳杆菌LP-11菌粉的活菌数为1.0×108cfu/g；植物乳杆菌LP-11已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010150。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述肽菌素作为饲料添加剂的用量如下：
对正常不患病的种禽，用量为饲料总质量的0.2％；
对患病的种禽，用量为饲料总质量的0.4％；
对妊娠母猪，用量为饲料总质量的0.1～0.2％；
对哺乳母猪，用量为饲料总质量的0.3～0.4％；
对患有***炎的奶牛，用量为80～120g/头/天；
对患有阴性***炎的奶牛，用量为40g/头/天。
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