CN111321227A - 白血病mef2d基因及znf384基因的多重荧光rt-pcr检测方法 - Google Patents

白血病mef2d基因及znf384基因的多重荧光rt-pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT‑PCR检测方法，所述的试剂盒来特异性检测MEF2D‑BCL9融合基因或CREBBP‑ZNF384融合基因，其检测方法具体包括以下步骤：S1、荧光PCR检测，S2、数据收集处理和分析，S3、融合基因检测结果分析，涉及生物技术领域。该白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT‑PCR检测方法，灵敏度高：最低可以检测到5copies/ul的MEF2D融合基因或ZNF384融合基因，异性高：使用高特异性的引物和Taqman探针，能够保证准确的检出融合基因且假阳性低，全程监控：同时检测内参基因、阳性对照和阴性对照，保证低的假阴性和假阳性，低成本高效率：应用成本更低的荧光PCR检测融合基因，多重的检测保证融合基因通量的扩大。

Description

白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中白血病融合基因检测，具体为白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法，尤其是针对Ph阴性急性淋巴细胞白血病(Ph--ALL)患者，提供MEF2D及ZNF384不同断裂位点融合基因的多重荧光RT-PCR检测方法及检测试剂盒。
背景技术
白血病是一种骨髓造血干细胞恶性克隆性增生的疾病，尤其在儿童和青年中最为常见。白血病中具有明确病理意义的重现性的融合基因是导致白血病发生及发展的主要变异，并且伴随着白血病细胞稳定存在。WHO 2016版血液肿瘤分类标准中所提到的融合基因已有一百多种，基因突变也有一百多种。融合基因的鉴定为血液肿瘤的诊断、分型、临床治疗方案的选择、疗效监测和靶向药物的研发提供了重要的分子指标。
急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)作为儿童中最常见的恶性肿瘤，儿童B-ALL中大量的染色体重排异常导致多种融合基因的形成。儿童B-ALL中四大融合基因类型(TEL-AML1、E2A-PBX1、BCR-ABL、MLL-AF4)常发生于白血病早期阶段，通过干扰正常造血功能、激酶信号通路等来导致白血病发生。因此融合基因已被广泛应用于B-ALL的临床危险度分层，例如TEL-AML1阳性、E2A-PBX1阳性患者预后较好，临床危险度分层划为低危，而BCR-ABL1阳性、MLL-AF4阳性患者划为高危。除了常见的融合基因以外，现在越来越多的研究报道了B-ALL中存在MEF2D及ZNF384重排易位形成的融合基因，具有重要的临床意义。
MEF2D基因位于1号染色体，属于MEF2转录因子家族成员，具有结合和增强转录调控因子MCM1的结构域，主要功能是调节细胞的分化。急性白血病中染色体重排可以导致MEF2D基因的异常高表达，从而会促进白血病的形成和发展。MEF2D基因重排多发生于B-ALL中，在儿童和青少年患者中分别占有4.1％和6.5％。而在年轻成人和成年人中的发生率相对较低，分别为2.7％和1.8％。MEF2D基因重排累及的伙伴基因包括BCL9、SS18、DAZAP1、HNRNPUL1、CSF1R及FOXJ2，最常见的是MEF2D-BCL9融合基因，该类患者CD10阴性、CD38阳性。
ZNF384基因位于12号染色体，编码锌指蛋白384转录因子，可以结合并调节细胞外基质基因MMP1、MMP3、MMP7及COL1A1的启动子。ZNF384重排常发生于伴髓系抗原表达的B-ALL患者中，在儿童和成人B-ALL患者中分别占有3％-4％和7％。ZNF384基因重排常累及的伙伴基因包括TCF3、TAF15、CREBBP、EP300、ARID1B、EWSR1、BMP2K、SYNRG及SMARCA2等。ZNF384基因重排多见于亚洲国家，在亚洲人群中的发生频率约4％。研究报道ZNF384和MEF2D基因重排患者均预后不良，MEF2D预后极差。
目前用于检测融合基因的方法主要包括染色体核型分析、荧光原位杂交(FISH)、实时荧光PCR(RQ-PCR)以及二代测序(NGS)。与染色体核型分析和荧光原位杂交技术相比较，实时荧光PCR检测的灵敏度达到10-5-10-6，可以进行更快速、更精准的检测融合基因，这也是NCCN指南、ELN指南以及专家共识中所推荐的检测融合基因行之有效的方法。二代测序技术虽然灵敏度也可以达到10-5-10-6，但是由于高昂的成本及较长的检测周期限制了其在融合基因检测中的应用。多重荧光RT-PCR可以同时扩增多个目的基因，具有节省时间、降低成本、提高效率的优点，尤其是适用于样本量比较少且检测靶标比较多的项目。因此多重荧光RT-PCR方法在白血病融合基因筛查方面有更大的应用价值。
2003年由欧洲25个实验室合作的EAC项目(Europe Against Cancer Program)，通过实时荧光RT-PCR方法来检测白血病中常见的10种融合基因异构体，建立了一套标准化的MRD方法以及所涉及到的荧光PCR引物、探针(Leukemia，2003，17，2318-2357)。对于B-ALL中MEF2D及ZNF384重排易位形成的融合基因更多的以文献报道为主，且主要是用二代测序的方法进行检测。国内已有批准的通过RT-qPCR方法检测白血病相关融合基因(BCR-ABL1、PML-RARA、AML1-ETO)的定量检测试剂盒，但是应用多重荧光RT-PCR方法去检测MEF2D及ZNF384重排的融合基因试剂盒很少看到。
基于多重荧光RT-PCR的基础上，本发明提出了白血病MEF2D基因及ZNF384基因不同断裂位点融合基因的筛查检测方法，其中包括6类12种MEF2D的融合基因(MEF2D-BCL9、MEF2D-SS18、MEF2D-DAZAP1、MEF2D-HNRNPUL1、MEF2D-CSF1R、MEF2D-FOXJ2)和9类22种ZNF384的融合基因(TCF3-ZNF384、TAF15-ZNF384、CREBBP-ZNF384、EP300-ZNF384、ARID1B-ZNF384、EWSR1-ZNF384、BMP2K-ZNF384、SYNRG-ZNF384、SMARCA2-ZNF384)。本发明将需要检测融合基因的特异性引物和特异性Taqman探针混合液制备成11管，每管中有多对引物和2条探针，用FAM和HEX进行荧光探针的标记，每管能够检测数目不等的融合基因异构体，依据荧光信号来判断融合基因的类型。此检测方法适用于急性淋巴细胞白血病中MEF2D及ZNF384重排易位形成的融合基因筛查，为Ph-B-ALL的诊断、分型、临床治疗方案的选择、疗效监测提供了重要的临床意义。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法，本发明利用多重荧光RT-PCR技术高准确率、高特异性、高检出率筛查MEF2D基因及ZNF384基因不同断裂位点的融合基因，为B-ALL患者的预后和靶向治疗提供指导。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法，其特征在于：所述的试剂盒来特异性检测MEF2D-BCL9融合基因或CREBBP-ZNF384融合基因，其检测方法具体包括以下步骤：
S1、荧光PCR检测：在20ul的荧光PCR体系中依次加入10ul的荧光PCR反应液、5ul的质粒模板、2ul的引物探针混合液以及3ul的Nuclease-Free Water，在Roche Z480荧光PCR仪上运行程序为：先经过50℃和2min的UNG反应，然后在95℃的温度下反应10min，再经过95℃15sec和60℃30sec，共45个循环，整个扩增过程中仪器会自动收集荧光FAM和HEX信号；
S2、数据收集处理和分析：荧光PCR扩增结束后，首先分析R8中内参基因GAPDH的扩增结果，如果其CT值小于30，表明样本的质量符合实验的要求，且整个检测过程真实有效，如果其CT值大于35，则需要重新检测，来验证样本的质量；
S3、融合基因检测结果分析：通过试剂盒特异性检测MEF2D-BCL9 Variant1融合基因或CREBBP-ZNF384融合基因，并进行分析。
优选的，所述步骤S3中当通过试剂盒特异性检测MEF2D-BCL9 Variant 1融合基因时，其中阳性质控品的内参GAPDH基因的CT值为24.35，MEF2D-BCL9Variant 1融合基因的CT值为22.65，且阴性对照无内参GAPDH基因和MEF2D-BCL9 Variant 1融合基因的扩增荧光信号，满足试剂盒融合基因阴阳性的判断标准，表明利用试剂盒可以特异性地进行MEF2D-BCL9融合基因的荧光PCR检测。
优选的，所述步骤S3中当通过试剂盒特异性检测CREBBP-ZNF384融合基因时，其中阳性质控品的内参GAPDH基因的CT值为28.55，CREBBP-ZNF384Variant 2融合基因的CT值为32.34，且阴性对照无内参GAPDH基因和CREBBP-ZNF384 Variant 2融合基因的扩增荧光信号，满足本试剂盒融合基因阴阳性的判断标准，表明利用本试剂盒可以特异性地进行CREBBP-ZNF384Variant 2融合基因的荧光PCR检测。
优选的，MEF2D类融合基因设计引物探针中所涉及到的基因转录本分别为：MEF2D(NM_005920)、BCL9(NM_004326)、SS18(NM_005637)、DAZAP1(NM_018959)、HNRNPUL1(NM_007040)、CSF1R(NM_005211)和FOXJ2(NM_018416)。
优选的，ZNF384类融合基因设计引物探针中所涉及到的基因转录本分别为：ZNF384(NM_133476)、TCF3(NM_003200)、TAF15(NM_003487)、CREBBP(NM_004380)、EP300(NM_001429)、ARID1B(NM_017519)、EWSR1(NM_013986)、BMP2K(NM_198892)、SYNRG(NM_007247)和SMARCA2(NM_003070)。
优选的，所述检测试剂盒的成分包括：检测用的特异性引物、Taqman探针、cDNA第一链合成试剂、荧光PCR反应液、阴性对照和阳性对照、去离子水。
优选的，所述cDNA第一链合成采用商业化的Promega逆转录试剂盒，试剂成分包括5×Reaction Buffer、PCR Nucleotide Mix、Random Prime、25mM MgCl2、RNARibonuclease Inhibitor、GoScript Reverse Transcriptase以及Nuclease-Free Water。
优选的，所述试剂盒进行荧光PCR扩增的反应体系是20ul，体系成分包括：10ul的荧光PCR反应液、5ul的稀释后cDNA模板、2ul的引物探针混合液以及3ul的Nuclease-FreeWater。
优选的，所述试剂盒提供了进行简便、灵敏和无污染的荧光PCR检测的完整***，荧光反应液包含经过优化的缓冲液、dNTP、Hot Start Taq DNA聚合酶、UNG酶和MgCl2溶液混合物，尤其是UNG酶可以防止PCR过程污染。
优选的，所用到的所有特异性引物工作液浓度是2umol/ml，Taqman探针的工作液浓度是3umol/ml，引物工作液与探针工作液分别加2ul，最终保证反应体系中引物的总量/探针的总量是2:3。
本发明基于Genbank中已知的MEF2D基因、ZNF384基因及相关伙伴基因序列进行比对分析以及参考相关文献资料，选择融合基因断裂位点上游序列和下游序列设计特异性多重引物及Taqman探针，所设计的引物Tm值在55-65℃，GC含量在40％-60％，优化测试后将引物合理的分配到11管中，尽量避免产生引物二聚体。探针Tm值在65-70℃，通常比引物Tm值高5-10℃，避免探针出现非特性序列结合及本身形成DNA折叠和二级结构。
基于以上设计原则，本发明设计的12种MEF2D的融合基因异构体和22种ZNF384的融合基因异构体检测的特异性多重引物和Taqman探针，具体核苷酸序列如下所示：
Figure BDA0002404213460000061
Figure BDA0002404213460000071
Figure BDA0002404213460000081
Figure BDA0002404213460000091
Figure BDA0002404213460000101
基于以上设计的引物探针核苷酸序列，本发明使用的内参基因是稳定表达的GAPDH。扩增GAPDH基因所用到的引物探针序列分别为：GAPDH-F(CCAGGTGGTCTCCTCTGACTTC)、GAPDH-R(GTGGTCGTTGAGGGCAATG)和探针GAPDH-P(HEX-ACAGCGACACCCACTCCTCCACCTT-BHQ1)，内参基因GAPDH的Taqman探针5’端连接荧光报告基团HEX,3’端连接BHQ1报告基团，通过检测内参基因GAPDH来排除样本质量差导致的假阴性结果。
本发明所用到的特异性引物序列以PAGE形式纯化，Taqman探针以HPLC形式纯化。FAM标记的Taqman水解探针的5’端连接荧光报告基团6-FAM,3’端连接BHQ1报告基团；HEX标记的Taqman水解探针的5’端连接荧光报告基团HEX,3’端连接BHQ1报告基团。
本发明利用Promega逆转录试剂盒进行cDNA第一链合成，逆转录需要1～5ug总RNA，试剂盒检测技术流程如下：取1.5ul 50ug/ml的随机引物混合液和15ul的RNA产，70℃反应5min，促使RNA二级结构打开，反应完成后冰上放置至少2min。加入6ul 5×ReactionBuffer、3.8ul 25mM MgCl2、1.5ul PCR Nucleotide Mix、0.3ul RNA RibonucleaseInhibitor、1ul GoScript Reverse Transcriptase、0.9ul Nuclease-Free Water至终体积为30ul。逆转录程序为：25℃5min；42℃60min；70℃15min。逆转录得到的cDNA经稀释后进行MEF2D融合基因及ZNF384融合基因筛查检测。
本发明试剂盒进行荧光PCR检测的时候，会同时做阳性对照(融合基因的阳性质粒)、阴性对照(Nuclease-Free Water)。
本发明检测在Roche Z480荧光PCR仪上运行程序为：先经过50℃2min的UNG反应，然后95℃10min；再然后经过95℃15sec，60℃30sec，共45个循环。
本发明试剂盒采用多重荧光RT-PCR去检测白血病中不同断裂位点产生的MEF2D融合基因及ZNF384融合基因，只有当内参基因GAPDH有HEX正常荧光扩增信号，且其中1管中能够检测出FAM或HEX的荧光信号，阴性对照无荧光信号时，则待测样本结果有效且呈阳性。
(三)有益效果
本发明提供了白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法。具备以下有益效果：
(1)、该白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法，灵敏度高：最低可以检测到5copies/ul的MEF2D融合基因或ZNF384融合基因。
(2)、该白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法，异性高：使用高特异性的引物和Taqman探针，能够保证准确的检出融合基因且假阳性低。
(3)、该白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法，全程监控：同时检测内参基因、阳性对照和阴性对照，保证低的假阴性和假阳性。
(4)、该白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法，低成本高效率：应用成本更低的荧光PCR检测融合基因，多重的检测保证融合基因通量的扩大。
附图说明
图1为本发明代表性的融合基因(MEF2D-BCL9、MEF2D-DAZAP1、MEF2D-HNRNPUL1)不同断裂位点及融合基因异构体结构示意图；
图2为本发明代表性的融合基因(TAF15-ZNF384、CREBBP-ZNF384)不同断裂位点及融合基因异构体结构示意图；
图3为本实施例一中使用本发明检测试剂盒检测MEF2D-BCL9的荧光扩增曲线图；
图4为实施例二中使用本发明检测试剂盒检测CREBBP-ZNF384的荧光扩增曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-4，本发明实施例提供三种技术方案：白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法，具体包括以下实施例：
实施例1
本发明的试剂盒来特异性检测MEF2D-BCL9融合基因。
本实施例以确定含有MEF2D-BCL9融合基因的阳性质控品(含有MEF2D-BCL9Variant 1的阳性质粒)来验证本检测方法的可行性及特异性。本实施例的具体检测方法如下：
S1、荧光PCR检测：在20ul的荧光PCR体系中依次加入10ul的荧光PCR反应液、5ul的质粒模板、2ul的引物探针混合液以及3ul的Nuclease-Free Water。在Roche Z480荧光PCR仪上运行程序为：先经过50℃2min的UNG反应，然后95℃10min；再然后经过95℃15sec，60℃30sec，共45个循环。整个扩增过程中仪器会自动收集荧光FAM和HEX信号；
S2、数据收集处理和分析：荧光PCR扩增结束后，首先分析R8中内参基因GAPDH的扩增结果，如果其CT值小于30，表明样本的质量符合实验的要求，且整个检测过程真实有效；如果其CT值大于35，则需要重新检测，来验证样本的质量的好坏；
S3、融合基因检测结果分析：本试剂盒特异性检测MEF2D-BCL9 Variant 1融合基因的荧光扩增曲线结果见附图3，其中阳性质控品的内参GAPDH基因的CT值为24.35，MEF2D-BCL9 Variant 1融合基因的CT值为22.65，且阴性对照无内参GAPDH基因和MEF2D-BCL9Variant 1融合基因的扩增荧光信号，满足本试剂盒融合基因阴阳性的判断标准，表明利用本试剂盒可以特异性地进行MEF2D-BCL9融合基因的荧光PCR检测。
实施例2
本发明的试剂盒来特异性检测CREBBP-ZNF384融合基因。
本实施例以确定含有CREBBP-ZNF384融合基因的阳性质控品(含有CREBBP-ZNF384Variant 2的阳性质粒)来验证本检测方法的可行性及特异性。本实施例的具体检测方法如下：
S1、荧光PCR检测：在20ul的荧光PCR体系中依次加入10ul的荧光PCR反应液、5ul的质粒模板、2ul的引物探针混合液以及3ul的Nuclease-Free Water，在Roche Z480荧光PCR仪上运行程序为：先经过50℃2min的UNG反应，然后95℃10min；再然后经过95℃15sec，60℃30sec，共45个循环。整个扩增过程中仪器会自动收集荧光FAM和HEX信号；
S2、数据收集处理和分析：荧光PCR扩增结束后，首先分析R8中内参基因GAPDH的扩增结果，如果其CT值小于30，表明样本的质量符合实验的要求，且整个检测过程真实有效；如果其CT值大于35，则需要重新检测，来验证样本的质量的好坏；
S3、融合基因检测结果分析：本试剂盒特异性检测CREBBP-ZNF384融合基因的荧光扩增曲线结果见附图4，其中阳性质控品的内参GAPDH基因的CT值为28.55，CREBBP-ZNF384Variant 2融合基因的CT值为32.34，且阴性对照无内参GAPDH基因和CREBBP-ZNF384Variant 2融合基因的扩增荧光信号，满足本试剂盒融合基因阴阳性的判断标准，表明利用本试剂盒可以特异性地进行CREBBP-ZNF384 Variant 2融合基因的荧光PCR检测。
实施例3
本发明的试剂盒来进行临床B-ALL样本检测。
本实施例采集临床B-ALL患者外周血或骨髓血样本20例，按照本检测试剂盒进行MEF2D及ZNF384融合基因的荧光PCR检测。
利用本发明的试剂盒方法检测B-ALL临床样本，操作步骤包括血液样本中白细胞RNA提取、RNA逆转录为cDNA、多重荧光RT-PCR检测。具体的操作方法如下：
S1、血液样本RNA提取：建议使用Trans RNA Pure Blood Kit试剂盒，按照试剂盒说明书操作来提取血液样本中的总RNA；
S2、RNA逆转录成cDNA：建议使用Promega GoScriptTMReverse Transcriptase试剂盒，取1.5ul 50ug/ml的随机引物混合液和15ul的RNA产，70℃反应5min，促使RNA二级结构打开，反应完成后冰上放置至少2min。加入6ul 5×Reaction Buffer、3.8ul 25mM MgCl2、1.5ul PCR Nucleotide Mix、0.3ul RNA Ribonuclease Inhibitor、1ul GoScriptReverse Transcriptase、0.9ul Nuclease-Free Water至终体积为30ul。逆转录程序为：25℃5min；42℃60min；70℃15min。逆转录得到的cDNA经稀释后进行MEF2D融合基因及ZNF384融合基因筛查检测；
S3、荧光PCR检测：在20ul的荧光PCR体系中依次加入10ul的荧光PCR反应液、5ul的质粒模板、2ul的引物探针混合液以及3ul的Nuclease-Free Water。在Roche Z480荧光PCR仪上运行程序为：先经过50℃2min的UNG反应，然后95℃10min；再然后经过95℃15sec，60℃30sec，共45个循环。整个扩增过程中仪器会自动收集荧光FAM和HEX信号；
S4、数据收集处理和分析：荧光PCR扩增结束后，首先分析R8中内参基因GAPDH的扩增结果，如果其CT值小于30，表明样本的质量符合实验的要求，且整个检测过程真实有效；如果其CT值大于35，则需要重新检测，来验证样本的质量的好坏；
S5、融合基因检测结果分析：20例B-ALL的临床样本经过本试剂盒MEF2D融合基因及ZNF384融合基因的检测，在内参基因GAPDH、阴性对照、阳性对照都正常的情况下，其中2例样本中检测到了MEF2D-BCL9融合基因，1例样本中检测到了EP300-ZNF384融合基因，1例样本中检测到了CREBBP-ZNF384融合基因，其它剩余的16例样本中都是阴性，结果如表1和表2所示。
表1B-ALL患者样本中MEF2D相关融合基因及内参基因CT值检测结果
Figure BDA0002404213460000151
Figure BDA0002404213460000161
Figure BDA0002404213460000171
表2B-ALL患者样本中ZNF384相关融合基因及内参基因CT值检测结果
Figure BDA0002404213460000172
Figure BDA0002404213460000181
综上结果表明，本试剂盒可以高灵敏度、高特异性、高效率、低成本检测B-ALL患者中MEF2D基因及ZNF384基因不同断裂位点的融合基因，为B-ALL患者的诊断分型、临床治疗方案的选择、疗效监测和靶向治疗提供指导，具有广泛的临床应用价值。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法，其特征在于：所述的试剂盒来特异性检测MEF2D-BCL9融合基因或CREBBP-ZNF384融合基因，其检测方法具体包括以下步骤：
S1、荧光PCR检测：在20ul的荧光PCR体系中依次加入10ul的荧光PCR反应液、5ul的质粒模板、2ul的引物探针混合液以及3ul的Nuclease-Free Water，在Roche Z480荧光PCR仪上运行程序为：先经过50℃和2min的UNG反应，然后在95℃的温度下反应10min，再经过95℃15sec和60℃30sec，共45个循环，整个扩增过程中仪器会自动收集荧光FAM和HEX信号；
S2、数据收集处理和分析：荧光PCR扩增结束后，首先分析R8中内参基因GAPDH的扩增结果，如果其CT值小于30，表明样本的质量符合实验的要求，且整个检测过程真实有效，如果其CT值大于35，则需要重新检测，来验证样本的质量；
S3、融合基因检测结果分析：通过试剂盒特异性检测MEF2D-BCL9 Variant1融合基因或CREBBP-ZNF384融合基因，并进行分析。
2.根据权利要求1所述的白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法，其特征在于：所述步骤S3中当通过试剂盒特异性检测MEF2D-BCL9 Variant 1融合基因时，其中阳性质控品的内参GAPDH基因的CT值为24.35，MEF2D-BCL9 Variant 1融合基因的CT值为22.65，且阴性对照无内参GAPDH基因和MEF2D-BCL9 Variant 1融合基因的扩增荧光信号，满足试剂盒融合基因阴阳性的判断标准，表明利用试剂盒可以特异性地进行MEF2D-BCL9融合基因的荧光PCR检测。
3.根据权利要求1所述的白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法，其特征在于：所述步骤S3中当通过试剂盒特异性检测CREBBP-ZNF384融合基因时，其中阳性质控品的内参GAPDH基因的CT值为28.55，CREBBP-ZNF384 Variant 2融合基因的CT值为32.34，且阴性对照无内参GAPDH基因和CREBBP-ZNF384 Variant 2融合基因的扩增荧光信号，满足本试剂盒融合基因阴阳性的判断标准，表明利用本试剂盒可以特异性地进行CREBBP-ZNF384 Variant 2融合基因的荧光PCR检测。
4.根据权利要求1所述的白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法，其特征在于：MEF2D类融合基因设计引物探针中所涉及到的基因转录本分别为：MEF2D(NM_005920)、BCL9(NM_004326)、SS18(NM_005637)、DAZAP1(NM_018959)、HNRNPUL1(NM_007040)、CSF1R(NM_005211)和FOXJ2(NM_018416)。
5.根据权利要求1所述的白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法，其特征在于：ZNF384类融合基因设计引物探针中所涉及到的基因转录本分别为：ZNF384(NM_133476)、TCF3(NM_003200)、TAF15(NM_003487)、CREBBP(NM_004380)、EP300(NM_001429)、ARID1B(NM_017519)、EWSR1(NM_013986)、BMP2K(NM_198892)、SYNRG(NM_007247)和SMARCA2(NM_003070)。
6.根据权利要求1所述的白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法，其特征在于：所述检测试剂盒的成分包括：检测用的特异性引物、Taqman探针、cDNA第一链合成试剂、荧光PCR反应液、阴性对照和阳性对照、去离子水。
7.根据权利要求1所述的白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法，其特征在于：所述cDNA第一链合成采用商业化的Promega逆转录试剂盒，试剂成分包括5×Reaction Buffer、PCR Nucleotide Mix、Random Prime、25mM MgCl2、RNA RibonucleaseInhibitor、GoScript Reverse Transcriptase以及Nuclease-Free Water。
8.根据权利要求1所述的白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法，其特征在于：所述试剂盒进行荧光PCR扩增的反应体系是20ul，体系成分包括：10ul的荧光PCR反应液、5ul的稀释后cDNA模板、2ul的引物探针混合液以及3ul的Nuclease-FreeWater。
9.根据权利要求1所述的白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法，其特征在于：所述荧光反应液包含经过优化的缓冲液、dNTP、Hot Start Taq DNA聚合酶、UNG酶和MgCl2溶液混合物。
10.根据权利要求1所述的白血病MEF2D基因及ZNF384基因的多重荧光RT-PCR检测方法，其特征在于：所用到的所有特异性引物工作液浓度是2umol/ml，Taqman探针的工作液浓度是3umol/ml，引物工作液与探针工作液分别加2ul，最终保证反应体系中引物的总量/探针的总量是2:3。
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