CN102080046A - 一株高产漆酶菌株及发酵产漆酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株高产漆酶的密孔菌属菌株(Pycnoporus sp.SYBC-L3)，已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2010235，保藏日期2010年9月15日。同时还发明了以该菌为出发菌种，经种子培养和以豆粕(或硝酸钠)为氮源、以麦芽糖(或葡萄糖、果糖、纤维二糖)等为碳源发酵生产漆酶的方法，发酵液最高酶活可达60000U/L以上。所产漆酶可广泛应用于食品、农业、工业废水处理等领域，属于生物技术领域。
Description
技术领域
本发明利用一株高产漆酶的菌株(Pycnoporus sp.SYBC-L3)及利用该菌株经种子培养和以豆粕(或硝酸钠)为氮源，以麦芽糖(或葡萄糖、果糖、纤维二糖)等为碳源发酵生产漆酶发酵生产漆酶的方法，所制备的酶能被应用于食品、农业、畜牧业、工业和环境废水处理等方面，属于生物技术领域。
背景技术
漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，具有广泛的底物，不仅能催化氧化多种芳香族化合物，还能降解木质素、去除许多有毒酚类物质如苯氧基类除草剂等的毒性，还可以使多种染料脱色及去除石油工业废水的毒性，因此在造纸、环保、食品、医药卫生、生物检测、改善草坪土壤结构等领域具有较大的研究和应用价值。
漆酶广泛分布于真菌、植物、动物、细菌和昆虫中。但用于生产漆酶的主要是担子菌亚门的白腐真菌。
现有研究表明，漆酶在制浆、织物脱色、生物传感器、食品工业、环保等方面的应用有巨大的潜力。
发明内容
本发明筛选并提供了一株高产漆酶的野生菌株(Pycnoporus sp.SYBC-L3)及利用该菌株经种子培养和以豆粕(或硝酸钠)为氮源，以麦芽糖(或葡萄糖、果糖、纤维二糖)等为碳源发酵生产漆酶的方法，所制备的漆酶可广泛应用于食品、农业、畜牧业、工业和环境废水处理等方面，来替代价格昂贵的进口漆酶。
本发明的技术方案：一种高产漆酶的密孔菌属菌株，其命名为Pycnoporus sp.SYBC-L3，已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010235，保藏日期2010年09月15日。
用该菌为出发菌种，经种子培养和以豆粕(或硝酸钠)为氮源，以麦芽糖(或葡萄糖、果糖、纤维二糖)等为碳源发酵生产漆酶；工艺为：
(1)种子培养
种子培养基：以质量体积浓度计：5％葡萄糖，1％酵母汁，0.5％蛋白胨。接种工艺：取斜面菌种一环在PDA平板上点接菌丝，30℃培养7天，取一平板用10ml无菌水冲洗，并打碎成均匀的孢子悬液.取1ml孢子悬液接入250ml规格的三角瓶，装液量为50ml。
培养条件：转速200rpm，温度30度，恒温培养2d，即为发酵罐发酵产酶的种子。
(2)产酶培养
产酶培养基：培养基(1L)：豆粕(或硝酸钠)6g，麦芽糖(或葡萄糖、果糖、纤维二糖)12g，五水硫酸铜0.4g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钠0.2g，七水硫酸镁0.5g，硫酸锰0.034g.初始pH：自然。
发酵罐：规格为容量5L.实际发酵产酶培养基装液量为3L
发酵参数：转速200r/min.温度30度.通气量1.4L/min.120h。
根据上述条件，在5L发酵罐中进行发酵，发酵液的漆酶活力最高达60000U/L以上。
本发明从广东省采集的枯木中筛选出一种高产漆酶的野生密孔菌属菌株，命名为Pycnoporus sp.SYBC-L3。
1、本菌株的筛选：
1.1平板初筛
样品的处理方法：将材料用少量无菌水30℃浸泡24h，之后采用梯度稀释法稀释至10-8，取1mL均匀涂布在121℃灭菌20min的含有愈创木酚(α-萘酚)0.04％的PDA(马铃薯20％，葡萄糖2％，琼脂2％)平板培养基上30℃恒温培养3d，挑取周边有红色变色圈的菌落划线分离。将分离后的能产生变色圈的菌株重新接种至新的平板，并记录其变色圈直径，筛选出产漆酶活力较高的菌株保藏备用。
1.2摇瓶复筛
将长满菌丝的平板用10mL无菌水冲洗，吸取1mL接入种子培养基(葡萄糖5％，酵母膏1％，蛋白胨0.5％，pH自然，121℃灭菌20min)，种子培养基装液量为250mL三角瓶中装50mL培养基，培养温度30℃、转速200r/min摇床恒温培养48小时，取菌悬液(按接种量10％)接入液态发酵基础培养基(葡萄糖1％，酒石酸铵0.4％，KH2PO4 0.1％，Na2HPO4 0.02％，MgSO4·7H2O 0.05％，CuSO4 0.0007％，MnSO4 0.0034％，121℃灭菌20min)，液态发酵基础培养基装液量为250mL三角瓶中装50mL培养基，培养温度30℃、转速200r/min，摇床恒温培养8天。
1.3经上述两种方法筛选最终筛选到一株漆酶活力相对较高的菌株，平板菌落(图1)，电镜(图2.)，16S rDNA序列鉴定(见序列.)并鉴定确定为密孔菌属，命名为Pycnoporus SP.SYBC-L3。
2、酶活的测定方法
3mL反应体系中包括0.5ml10mmol/LDMP(2，6-二甲氧基酚)，2.4ml0.1mol/L磷酸氢二钠-柠檬素缓冲液(pH3.5)，0.1ml粗酶液(发酵液经冷冻高速离心机12000g、4℃离心10分钟，得到上清液即为粗酶液，视活力稀释)，以去离子水替代粗酶液溶液作为空白对照，在469nm处测吸光值每隔10s读取一次吸光度 值，一般持续进行1min后停止测定，以反应的线性范围计算酶活。酶活力定义：1分钟催化一微摩尔底物所需酶量，酶活性以U·L-1表示。
本发明的有益效果：
首先提供了一株高产漆酶的菌株及用该菌为出发菌株采用液体发酵制备漆酶的方法。本发明的菌种和发酵产酶方法与其它菌种和制备漆酶的方法相比较，具有如下特点：
1、发酵性能稳定，菌体易于培养.
2、产酶周期短，在第5天即可停止发酵.
3、产酶活力高，最高可达60000U/L以上.
4、粗酶液中漆酶含量约占总蛋白含量的80％以上，在胞外成为主导产物，便于分离纯化.
5、粗酶性质稳定，以DMP为底物时，在酸性环境下能发挥最大催化功效，最适温度为55度，较耐热。
6、作用底物广泛，有广阔的应用前景.
因此本发明的菌株和发酵产漆酶的方法所生产出来的漆酶可广泛使用于食品、农业、畜牧业、工业和环境废水处理等方面，并可替代价格昂贵的进口漆酶，因此本发明的菌种和发酵产酶方法有广泛的工业使用价值和显著的经济效益前景。
附图表说明
图1和图2分别为Pycnoporus sp.SYBC-L3菌株平板菌落和扫描电镜形态。
生物材料样品保藏
Pycnoporus sp.SYBC-L3已保存于已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2010235，保藏日期2010年9月15日.
具体实施方式
实施例1
取斜面菌种一环在PDA平板上点接菌丝，30℃培养7天，取一平板用10ml无菌水冲洗，并打碎成均匀的孢子悬液.每1ml孢子悬液接入50ml种子培养基(250ml规格的三角瓶)，准备若干份。培养条件：转速200rpm，温度30度，恒温培养2d，即为发酵产酶的种子。
在5L发酵罐中装入3L产酶培养基，按10％接种量，加入上述发酵产酶种子，培养条件为：转速200r/min.温度30℃.通气量1.4L/hour.培养时间120h，发酵液酶活力达60200U/L。
产酶培养基为豆粕18g，麦芽糖36g，五水硫酸铜1.2g，磷酸二氢钾3g，磷酸氢二钠0.6g，七水硫酸镁1.5g，硫酸锰0.102g.初始pH：自然。
实施例2
发酵产酶种子的培养同例1。
在5L发酵罐中装入3L产酶培养基，按10％接种量，加入上述发酵产酶种子，培养条件为：转速200r/min.温度30℃.通气量1.4L/hour.培养时间120h，发酵液酶活力达48200U/L。
产酶培养基为豆粕18g，葡萄糖36g，五水硫酸铜1.2g，磷酸二氢钾3g，磷酸氢二钠0.6g，七水硫酸镁1.5g，硫酸锰0.102g.初始pH：自然。
实施例3
发酵产酶种子的培养同例1。
在5L发酵罐中装入3L产酶培养基，按10％接种量，加入上述发酵产酶种子，培养条件为：转速200r/min.温度30℃.通气量1.4L/hour.培养时间120h，发酵液酶活力达53000U/L。
产酶培养基为豆粕18g，果糖36g，五水硫酸铜1.2g，磷酸二氢钾3g，磷酸氢二钠0.6g，七水硫酸镁1.5g，硫酸锰0.102g.初始pH：自然。
实施例4
发酵产酶种子的培养同例1。
在5L发酵罐中装入3L产酶培养基，按10％接种量，加入上述发酵产酶种子，培养条件为：转速200r/min.温度30℃.通气量1.4L/hour.培养时间120h，发酵液酶活力达51800U/L。
产酶培养基为硝酸钠18g，麦芽糖36g，五水硫酸铜1.2g，磷酸二氢钾3g，磷酸氢二钠0.6g，七水硫酸镁1.5g，硫酸锰0.102g.初始pH：自然。
序列表
Claims (2)
1.一株高产漆酶的密孔菌属菌株，命名为Pycnoporus sp.SYBC-L3，已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2010235，保藏日期2010年09月15日。
2.用权利要求1所述的菌株发酵生产漆酶的方法，其特征在于用该菌为出发菌种，经种子培养和以豆粕(或硝酸钠)为氮源，以麦芽糖(或葡萄糖、果糖、纤维二糖)等为碳源发酵生产漆酶，工艺为：
(1)种子培养
种子培养基：以质量体积浓度计：5％葡萄糖，1％酵母汁，0.5％蛋白胨。
接种工艺：取斜面菌种一环在PDA平板上点接菌丝，30℃培养7天，取一平板用10ml无菌水冲洗，并打碎成均匀的孢子悬液.取1ml孢子悬液接入250ml规格的三角瓶，装液量为50ml。
培养条件：转速200rpm，温度30℃，恒温培养2天，即为发酵产酶的种子。
(2)产酶培养
产酶培养基：1L培养基计算：豆粕(或硝酸钠)6g，麦芽糖(或葡萄糖、果糖、纤维二糖)12g，五水硫酸铜0.4g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钠0.2g，七水硫酸镁0.5g，硫酸锰0.034g.初始pH：自然。
发酵罐：规格为5L容量.实际发酵产酶培养基装液量为3L。
发酵参数：接种量10％，转速200r/min.温度30度.通气量1.4L/min.培养时间5-8天。
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