CN103509762B - 一种提高液态漆酶存储稳定性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高液态漆酶存储稳定性的方法，是以2010年9月15日保存于中国典型培养物保藏中心保藏编号为：CCTCC？M2010235的高产漆酶的密孔菌属菌株Pycnoporussp.SYBC-L3为出发菌株，以水稻秸秆为主要原料固态发酵生产制备的液态漆酶为研究对象，在固态发酵产漆酶的培养基中添加一定浓度的硝酸铵后，所制备液态漆酶的存储稳定性明显提高，酶液在30℃存储90天后，酶活保留率高达90％以上，显著提高了酶的稳定性，并且酶的活力提高10％以上，该方法解决了液态漆酶易失活的问题，属于酶制剂技术领域。

Description

一种提高液态漆酶存储稳定性的方法
技术领域
本发明为一种提高液态漆酶存储稳定性的方法，属于酶制剂技术领域。
背景技术
漆酶具有广泛的底物，不仅能催化氧化多种芳香族化合物，还能降解木质素、去除许多有毒酚类物质的毒性，还可以使多种染料脱色及去除石油工业废水的毒性等，因此在纺织印染、造纸、草坪修复、能源再生、饲料、食品、废水处理等领域具有较大的应用价值而受到广泛的关注。
现有研究表明，漆酶的制备多数局限在实验室用各种试剂配成培养基来制备，所制备的成本偏高，我们研究出以水稻秸秆为主要原料固态发酵制备漆酶获得成功，已于2012年1月12日申请国家专利，专利申请号：201210007885.9，该方法大幅度降低了漆酶的生产成本且简便易行投入少，但所制备的液态漆酶易失活，这促使我们去探索研究提高液态漆酶稳定性的方法，本发明就是在这样的指导思想下，经过多次试验获得成功的。
发明内容
本发明研究出一种对液态漆酶存储稳定性十分有效的方法——在产酶培养基中添加一定浓度的硝酸铵溶液，从而使所制备的液态漆酶的存储稳定性大大提高，而且酶的活性也有所提高。
本发明的技术方案：用我们已申请专利的保存于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为：CCTCCM2010235产漆酶的密孔菌属的野生菌株Pycnoporussp.SYBC-L3为生产出发菌株，将水稻秸秆为主要原料固态发酵生产制备的液态漆酶为研究对象，在发酵产漆酶的培养基中添加一定浓度的硝酸铵，具体工艺为：
(1)种子培养
种子培养基：以质量体积浓度计：2％葡萄糖，20％马铃薯。
马铃薯需切成片或块，加水煮20-30分钟，用纱布过滤取其汁并定容。
接种工艺：取斜面菌种一环在PDA平板上点接菌丝，30℃培养7天，切取3块直径大小为0.5CM的菌落接入装有50ml种子培养基的500ml规格的三角瓶中，再加入玻璃珠10-20粒，准备若干份，置于摇床，培养条件：转速200rpm，温度30℃，恒温培养2天，即为发酵产酶的种子液。
(2)发酵产酶培养基
将水稻秸秆切成1厘米左右的小段，称20克放入500ml的三角瓶中，加入用盐酸及氢氧化钠调PH＝3的水40ml，再加入浓度为20g/L的硝酸铵溶液5ml，于121℃灭菌20分钟，冷却后待用。
(3)发酵产酶及酶液提取
灭菌冷却后在发酵产酶培养基中加入20m1种子培养液并充分与秸秆混合，并用8层纱布封口置于30°环境中静止培养8天后，首先再加入400ml水，将结成团的秸秆菌块搅散后进行搅拌或置于摇床在30℃、200rpm条件下继续培养3小时，然后在30°环境中静止12-24小时，最后用离心机离心或用抽滤方法或用纱布进行过滤除去秸秆和菌体即得到漆酶粗酶液，用DMP法测酶活，并计算总酶活除秸秆的重量，得到每克秸秆产漆酶的单位U/g.
(4)酶活的测定方法
3mL反应体系中包括：0.5ml10mmol/L的2，6-二甲氧基酚；2.4mlpH＝3.0的0.1mol/L磷酸氢二钠-柠檬素缓冲液；0.1ml粗酶液——发酵液经冷冻高速离心机10000g离心10分钟得到上清液并视酶活力稀释，以去离子水替代粗酶液溶液作为空白对照，在469nm处测吸光值每隔5s读取一次吸光度值，一般持续进行1min后停止测定，以反应的线性范围计算酶活。酶活力定义：1分钟催化一微摩尔底物所需酶量，酶活性以U·L-1表示。
本发明的有益效果：
本发明具有如下特点：
1、发酵原材料价格低廉，且可变废为宝，绿色环保，没有废弃物。因为菌种为药用真菌，故漆酶过滤后的剩余残存物可用于动物饲料、造纸和生物肥料。
2、发酵生产设备简单，资金投入少。
3、粗酶性质稳定，以DMP为底物时，在酸性环境下能发挥最大催化功效，最适温度为55度，较耐热。
4、作用底物广泛，有广阔的应用前景.
5、生产制备成本低，十分有利于全面展开，符合国家政策。
由于本发明所生产制备出来的漆酶成本低且可广泛应用于纺织印染、造纸、草坪修复、能源再生、饲料、食品、废水处理等方面。因此本发明有广泛的工业使用价值和显著的经济效益前景。
具体实施方式
对照实施例
取斜面菌种一环在PDA平板上点接菌丝，30℃培养7天，切取3块直径大小为0.5CM的菌落接入装有50ml种子培养基的250ml规格的三角瓶中，再加入玻璃珠10粒，准备若干份，置于摇床，培养条件：转速200rpm，温度30℃，恒温培养2天，即为发酵产酶的种子液。
将水稻秸秆切成1厘米左右的小段，称20克放入500ml的三角瓶中，加入用盐酸及氢氧化钠调PH＝3的水20ml，121℃灭菌20分钟，冷却后加入20ml种子培养液并充分混合，30°静止培养8天，再加入400ml水，用棒充分搅散后，将500ml三角瓶置于温度为30°转速为200rpm的摇床上摇3小时，再静止24小时，过滤得到酶液，测酶活每克秸秆可产漆酶81U/g，由于产酶培养中没有加硝酸铵溶液，所制备的液态粗酶液在30℃条件下放置30d和90d，酶活保留率分别为63.12％和26.25％。
实施例1
发酵产酶的种子液培养操作同上对照例。
将水稻秸秆切成1厘米左右的小段，称20克放入500ml的三角瓶中，加入用盐酸及氢氧化钠调PH＝3的水40ml，再加入浓度为20g/L的硝酸铵溶液5ml，121℃灭菌20分钟，冷却后加入20ml种子培养液并充分混合，30°静止培养8天，再加入400ml水，用棒充分搅散后，将500ml三角瓶置于温度为30°转速为200rpm的摇床上摇3小时，再静止24小时，过滤得到酶液，测酶活每克秸秆可产漆酶90U/g，酶活力提高10％，且所制备的液态粗酶液在30℃条件下放置30d和90d，酶活保留率分别为97.24％和90.6％。

Claims (1)

1.一种提高液态漆酶存储稳定性的方法，其特征在于以保藏号为CCTCCNO：M2010235的高产漆酶的密孔菌属菌株Pycnoporussp.SYBC-L3为出发菌株，将水稻秸秆为主要原料固态发酵生产制备液态漆酶，在固态发酵产漆酶的培养基中按培养基总重量的1/12添加浓度为20g/L的硝酸铵溶液后发酵制备液态漆酶：
(1)酶液在30℃环境中存储90天后，酶活保留率高达90％以上，提高了酶的稳定性。
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CN102080046A (zh) * 2010-09-25 2011-06-01 江南大学 一株高产漆酶菌株及发酵产漆酶的方法

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