CN102060919B

CN102060919B - 三个棉花abf/areb/abi5/dpbf类转录因子及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102060919B
Application number: CN 200910158311
Authority: CN
Inventors: 张锐; 郭三堆; 梁成真
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2009-07-06
Filing date: 2009-07-06
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2029-07-06
Also published as: CN102060919A

Abstract

本发明公开了三个新棉花ABF/AREB/ABI5/DPBF类转录因子GhABF2、GhABF3、GhABI5，及其编码基因及其应用。它们的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2、5、8所示。其编码基因GhABF2、GhABF3、GhABI5的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、4、7所示。本发明又公开了编码基因GhABF2、GhABF3、GhABI5读码框区在基因组DNA上的结构特点及RNA剪辑规律。本发明还公开了三个基因在棉花中的表达特性、酵母表达特性及它们均能提高拟南芥抵抗干旱的特性。该类基因对培育抗非生物逆境植物品种提供基因源，对提高植物抗非生物逆境的能力具有重要的意义。

Description

三个棉花ABF/AREB/ABI5/DPBF类转录因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及三个来源于棉花的ABF/AREB/ABI5/DPBF类转录因子，分别命名GhABF2、GhABF3、GhABI5，及其他们的编码基因序列。本发明还涉及这三个基因的表达谱、含有该类基因的表达载体，和利用该类基因培育抗逆植物的方法。

背景技术

干旱、高盐等非生物胁迫是棉花产量和品质的重要限制因子。近年来，自然条件变化的加剧严重影响着棉花产量的稳定，一定程度上影响了我国棉花产业的稳步发展。因此，开展棉花抗逆研究，通过植物基因的工程手段提高其对干旱、高盐等非生物逆境的忍耐能力具有重要意义。

ABA是逆境信号传导最为密切的植物激素，干旱、高盐等非生物逆境条件下，植物体内ABA迅速合成和积累，随着逆境刺激的减轻，ABA又迅速地得到分解(Taylor，I.B.Exp.Bot，2000，51：1563-1574)；ABA是逆境信号传导过程重要的第二信使分子，在植物应答逆境信号传导过程中扮演着重要的角色(Christmann A.Plant Biol，2006，8：314-325)；ABA是交叉适应的主要作用物质之一，Shinozaki等(ShinozakiK，J Exp Bot，2007，58(2)：221-227)对拟南芥逆境胁迫基因的表达调控研究发现，逆境胁迫诱导表达的基因与ABA诱导表达的基因存在着重要的交互作用。逆境胁迫起始信号与基因表达之间存在着依赖ABA和不依赖ABA两种途径(Nakashima K，Plant Physiol，2009，149(1)：88-95)。依赖ABA的逆境信号传导途径中存在一种不需要蛋白质合成的通路，逆境胁迫下通过诱导植物细胞内ABA含量的升高而激活一类具有碱性亮氨酸拉链结构的调节蛋白ABF/AREB/ABI5/DPBF，该类转录因子通过与ABRE基序(pyACGTGGC，ABAresponsive element)特异结合，调控抗旱功能基因的表达。

ABF/AREB/ABI5/DPBF类转录因子属于bZIP类蛋白，该类转录因子N端包含三个保守的结构域，为转录激活结构域，C端包含一个保守的碱性亮氨酸拉链结构，为转录结合结构域(Choi H，PlantPhysiol，2005，139：1750-1761)。目前为止，拟南芥染色体基因组中已经发现了9个ABF/AREB/ABI5/DPBF同族体：AREB1/ABF2，AREB2/ABF4，AREB3/DPBF3，ABF1，ABF3/DPBF5，ABI5/DPBF1，EEL/DPBF4，DPBF2和AT5G42910(Suzuki，M.PlantPhysio1.2003，132：1664-1677)。对拟南芥ABF1、AREB1/ABF2、ABF3/DPBF5、AREB2/ABF4、ABI5/DPBF1等研究发现，它们主要参与了ABA、干旱、盐渍、低温等逆境胁迫应答反应，在依赖ABA的逆境信号传导中起着重要的作用(Takashi F，Pro Natl Acad Sci USA，2006，103(6)：1988-1993)。许多ABA诱导表达基因的启动区均含有ABRE基序，因此，通过导入或改良该一个逆境相关转录因子基因可以调控一系列逆境相关基因的表达，从而提高植物的综合抗逆能力。然而目前尚未见ABF/AREB/ABI5/DPBF类基因在重要经济作物棉花中的报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供棉花中三个ABF/AREB/ABI5/DPBF类转录因子，分别命名为GhABF2、GhABF3、GhABI5，它们分别是具有序列表中SEQ ID NO：2、5、8的氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID NO：2、5、8的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有与序列SEQ IDNO：2、5、8的氨基酸残基序列相同活性的由序列SEQ ID NO：2、5、8衍生的蛋白质。

GhABF2优选的是具有序列表中序列SEQ ID NO：2氨基酸残基序列的蛋白质，由417个氨基酸残基组成；GhABF3优选的是具有序列表中序列SEQ ID NO：5氨基酸残基序列的蛋白质，由407个氨基酸残基组成；GhABI5优选的是具有序列表中序列SEQ ID NO：8氨基酸残基序列的蛋白质，由422个氨基酸残基组成。

本发明的另一个目的是提供三个棉花ABF/AREB/ABI5/DPBF类转录因子GhABF2、GhABF3、GhABI5的编码基因GhABF2、GhABF3、GhABI5，分别是与序列列表中SEQ ID NO：1、4、7，限定DNA序列具有90％以上相似性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

GhABF2优选的是序列列表中SEQ ID NO：1的DNA序列，由2027bp碱基组成，该基因的读码框为自5’端第442位到1692位的1251bp碱基组成的DNA序列；GhABF3优选的是序列列表中SEQ ID NO：3的DNA序列，由1963bp碱基组成，该基因的读码框为自5’端第333位到1553位的1221bp碱基组成的DNA序列；GhABI5优选的是序列列表中SEQ ID NO：7的DNA序列，由1927bp碱基组成，该基因的读码框为自5’端第384位到1649位的1266bp碱基组成的DNA序列。

本发明的再一个目的是提供三个棉花ABF/AREB/ABI5/DPBF类转录因子GhABF2、GhABF3、GhABI5编码基因GhABF2、GhABF3、GhABI5的开放读码结构基因组核苷酸序列，分别是序列列表中SEQ ID NO：3、6、9，限定外显子(Exon)DNA序列具有90％以上相似性，内含子(Intron)DNA具有80％以上相似性。

GhABF2优选的是序列列表中SEQ ID NO：3的DNA序列，由2177bp碱基组成，包含4个Exon和3Intron，Exonl(1～1077)包含1077bp碱基的DNA序列、Exon2(1620～1691)包含72bp碱基的DNA序列、Exon3(1788～1817)包含30bp碱基的DNA序列、Exon4(2106～2177)包含72bp碱基的DNA序列，通过RNA剪辑加工最终形成1251bp碱基序列的开放读码结构。

GhABF3优选的是序列列表中SEQ ID NO：6的DNA序列，由1773bp碱基组成，包含4个Exon和3Intron，Exonl(1～1047)包含1047bp碱基的DNA序列、Exon2(1321～1392)包含72bp碱基的DNA序列、Exon3(1485～1514)包含30bp碱基的DNA序列、Exon4(1705～1776)包含72bp碱基的DNA序列，通过RNA剪辑加工最终形成1221bp碱基序列的开放读码结构。

GhABI5优选的是序列列表中SEQ ID NO：9的DNA序列，由1767bp碱基组成，包含4个Exon和3Intron，Exonl(1～1071)包含1071bp碱基的DNA序列、Exon2(1235～1306)包含72bp碱基的DNA序列、 Exon3(1413～1442)包含30bp碱基的DNA序列、Exon4(1675～1767)包含72bp碱基的DNA序列，通过RNA剪辑加工最终形成1266bp碱基序列的开放读码结构。

本发明的再一个目的是提供含有所提及的GhABF2、GhABF3、GhABI5类转录因子的表达载体(图4)pBI121-GhABF2、pMD18-GhABF3、pMD18-GhABI5(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰路1号院，中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No.3152、CGMCC No 3153、CGMCC No 3154；保藏日期：2009年06月30日；分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli)。可是用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体。含有该发明GhABF2、GhABF3、GhABI5基因的表达载体和细胞系，以及含有该类基因的植物品系种均为本发明的保护范围。

本发明的表达载体可通过使用农杆菌侵染，花粉管通道，基因枪转化等导入植物细胞，可使用本发明的方法转化的植物宿主包括单子叶植物和双子叶植物，例如：棉花、水稻、小麦、玉米、草坪草、杨树、黄瓜、苜蓿等。

附图说明

图1表示GhABF2、GhABF3、GhABI5编码基因开放读码结构分别以基因组DNA及eDNA为模板PCR扩增结果的琼脂糖电泳图。

图2为GhABF2、GhABF3、GhABI5基因结构示意图

图3为PCR结果的电泳图谱，显示GhABF2、GhABF3、GhABI5在棉花不同组织器官中的表达情况。

图4为聚丙烯酰胺电泳图谱，显示GhABF2酵母表达的分子量。

图5为酵母生长图，显示转GhABF2基因酵母在不同PEG6000及NaCl浓度下OD₆₀₀曲线。

图6为GhABF2转基因表达载体的构建示意物理图谱。

图7为转GhABF2、GhABF3、GhABI5基因拟南芥的抗旱实验结果图。

具体实施方式

实施例1 三个棉花ABF/AREB/ABI5/DPBF类转录因子GhABF2、GhABF3、GhABI5编码基因的克隆材料与方法

1)棉花材料：棉花材料选用自选品种Y18R。

2)菌种：大肠杆菌E.coliDH5α，农杆菌LBA4404及毕赤酵母GS115。

3)载体：pMD18-T、pG4AB、pBI121、pJawohl8-RNAi及pPIC9.0K。

4)工具酶和修饰酶：各种限制性内切酶和修饰酶购自TaKaRa公司、NEB公司及Fermentas公司。

5)化学试剂：化学药品均为国内外分析纯。

6)引物合成：由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

7)测序：由华大基因公司完成。

实验步骤

1)总RNA的制备：采用改良的热硼酸法提取陆地面品种Y18R叶片部位的总RNA，用于RT-PCR、 Tail-PCR、3′RACE等。

2)结合生物信息学获取ABF/AREB/ABI5/DPBF类转录因子基因保守片断EST序列：根据GenBank库及专利库收录的ABF/AREB/ABI5/DPBF类转录因子结构特点，结合保守结构域序列设计6条简并引物：

FP1：5′-TGGARGAGTTTYTRGTYAGAGC-3′；

FP2：5′-TKGAGGATTTCTTGGTKAARGC-3′；

RP1：5′-GCYTGTTTTCTKGCTCTAGATC-3′；

RP2：5′-GCCTGCTTSCGDGCCCKTGAYC-3′；

bZIPFP1：5′-AWGATHAARAAYMGVGARTCHGCDGCDMGDTCHMGVGC-3′；

bZIPFP1：5′-GARTCHGCDGCDMGDTCHMGVGCHMGVARRCARGCWYAH-3′；

(M：AorC；K：GorT；W：AorT；R：AorG；Y：CorT；S：CorG；D：AorGorT；H：AorCorT；N：AorCorGorT)

FP1、FP2和RP1、RP2两两组合扩增获得两个目的扩增结果，大小分别为660bp、590bp；bZIPFP1和bZIPFP1与3’RACE引物组合巢式PCR得一个目的扩增结果，大小为553bp；分别回收，与pMD18-T载体连接、16℃过夜，转化受体菌DH5α，菌液PCR及酶切鉴定正确的菌株送华大基因测序，根据BLAST的分析结果分别命名为GhABF2、GhABF3、GhABI5。

3)GhABF2、GhABF3、GhABI5全长cDNA序列的获得：

采用Tail-PCR和3’RACE的方法得到了GhABF2、GhABF3、GhABI5全长cDNA序列，Tail-PCR按TaKaRa公司Genome Walking Kit操作，3′RACE按TaKaRa公司3′-Full RACE Core Set Ver.2.0操作。

用于Tail-PCR的随机引： AD1：5′-NTCGASTWTSGWGTT-3′

AD2：5′-NGTCGASWGANAWGAA-3′

AD3：5′-TCTTICGNACITNGGA-3′

AD4：5′-TTGIAGNACIANAGG-3′

(S：CorG；W：AorT；N：AorCorGorT)

用于TAIL-PCR的特异引物：GhABF2sp1：5′-CCTCCATTTCCCACTAGGCCAACAC-3′

GhABF2sp2：5′-CTTTGCCTATTCCACCCATTGTGC-3′

GhABF2sp3：5′-GGTTTATTACCACCGCCGCCATCAC-3′

GhABF3sp1：5′-CCCACCACTCTGCAGGCCACTAGACTG-3′

GhABF3sp2：5′-GTGGCTGTTGTTTCTGCTGTGAATGTGATG-3′

GhABF3sp3：5′-CACCAACCGGTTGCATATCTTCCCTCAC-3′

GhABI5sp1：5′-GCCATCGACCGTCATTGTAGAGCTC-3′

GhABI5sp2：5′-TCGACGACGCCATATTCGGCGGAG-3′

GhABI5sp3：5′-TCAGTCTTCCCCGAGATGTTGAGC-3′

用于3′RACE引物：

AMVOligo：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′

RACErv1：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′

RACErv2：5′-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3′

用于3’RACE的特异引物：

GhABF2fp1：5′-AGCACCAGTTGGCTCAGCAG-3′

GhABF3fp 1：5′-AGAGAGTCAGCTGCAAGATC-3′

GhABI5fp1：5′-GATAGAGATAGGTGGACTAC-3′

将扩增出的DNA片段用1％的琼脂糖胶分离、回收并连接到pMD18-T easy Vector，转化E.coli DH5α，酶切鉴定正确后送华大基因测序，利用生物软件Vector9.0、Conting对获得的序列进行拼接，获得GhABF2、GhABF3、GhABI5基因的全长cDNA序列，并根据获得的序列设计引物进行验证，3′端引物为RACE rv1和RACE rv2，5′端验证引物：GhABF2fp2：5′-ATTTCATTTAGAAAACTGGGT-3′

GhABF3fp2：5′-GTTGTTTCTGCTGTGAATGTG-3′

GhABI5fp2：5′-AGTGAGAAGAACAAAAGAGGC-3′

最后获得GhABF2、GhABF3、GhABI5基因的全长cDNA序列，分别为序列表中SEQ ID NO：1、4、7，根据eDNA序列推测出其蛋白序列为序列列表中SEQ ID NO：2、5、8。

实施例2 GhABF2、GhABF3、GhABI5转录因子基因结构特点分析

根据所获得GHABF2、GHABF3、GHABI5基因的全长cDNA序列，结合生物信息学预测的转译起始位点及终止位点设计引物，分别以棉花基因组DNA及cDNA做模板进行PCR扩增。

用于PCR的引物：GhABF2fp3：5′-ATGGGGACTAACATGAACTT-3′

GhABF2rv3：5′-CCAAGGACCGGTCTGGGTTC-3′

GhABF3fp3：5′-ATGGGGTCTAATCTGAATTT-3′

GhABF3rv3：5′-CCAAGGGCCTGTCAGTGTTC-3′

GhABI5fp3：5′-ATGGTGGTTGAGAACTCTGA-3′

GhABI5rv3：5′-TAATGGACCACTTAGATTTC-3′

将扩增片断回收、连接到pMD18-T easy Vector，转化E.coli DH5α，酶切鉴定正确后送到华大基因测序，最后获得GhABF2、GhABF3、GhABI5基因的开放读码结构的cDNA序列及基因组DNA序列，分别为序列表中的序列SED ID NO：3、6、9。cDNA及基因组DNA序列比对发现，GhABF2、GhABF3、GhABI5基因的开放读码结构在基因组上均有4个Exon和3个Intron组成，且RNA剪切加工完全符合“GT…AG”的规律(图1中，M：Marker，CK-：阴性对照，A1、B2、C3分别是GhABF2、GhABF3、GhABI5以棉花基因组DNA为模板PCR扩增结果，D4、E5、F6分别是GhABF2、GhABF3、GhABI5以棉花eDNA为模板PCR扩增结果；图2中，GhABF2、GhABF3、GhABI5三个基因结构示意图)

实施例3 GhABF2、GhABF3、GhABI5转录因子基因在棉花中的表达特性分析

1)模板制备：采用改良的热硼酸法从棉花不同器官材料：根、茎、叶、花萼、花瓣、雄蕊、子房、纤维、花蕾、棉铃中提取总RNA，提取的RNA质量由OD₂₆₀/OD₂₈₀比值和0.7％琼脂糖凝胶电泳鉴定。以其为模板按下列方案进行逆转录反应：在一个PCR小管中加入2μg总RNA和1μL Oligo(dT)，65℃温育15min，然后在冰上加入5×MMLV(RNase H^-)Buffter 5μL，dNTP(25mmol/L)5μL，Ribonuclease Inhibitor 20U，MMLV 200U，最后用DEPC处理水补充至总体积25μL，42℃温育1h，95℃水浴5min灭活MMLV，得到的cDNA-20℃保存备用。

2)模板cDNA的相对定量及内标引物的设计：根据GenBank上登录的棉花肌动蛋白基因(Cotton Actinlgene：Accession NO.AY305723)内参引物设计如下：

GhActfp：5′-CTCTCTCTGTATGCCAGTGGTC-3′

GhActrv：5′-TTGTCCGTCAGGCAACTCATAG-3′

以棉花cDNA做模板，用该引物进行PCR扩增将获得321bp的条带。

PCR反应体系：模板1μl，PCR Buffer 5μl，10mMdNTP 3μl，GhActfp 1μl，GhActrv 1μl，Taq 1U，ddH₂O8μl。

PCR条件：94℃，2min；94℃，30Sec；55℃，30Sec；72℃，30Sec；30cycle；72℃，10min。

根据PCR产物的电泳结果对模板cDNA进行稀释，调整模板cDNA的用量，直到GhActfp和GhActrv引物扩增出的DNA条带的量基本一致，使每微升溶液中模板cDNA的含量基本一致。

4)GhABF2、GhABF3、GhABI5基因的PCR扩增：

①GhABF2，涉及PCR扩增的引物如下：

GhABF2fp4：5′-TCCAAATTTGATGGGAACTAG-3′

GhABF2rv4：5′-CTGCTTCCAATTCCATTGTAT-3′

用该引物进行PCR扩增，如果是cDNA做模板可以扩增545bp的条带，如果是基因组DNA做模板可以扩增1087bp的条带(含有的542bp内含子)。

PCR体系：模板1μl，PCR Buffer 5μl，10mMdNTP 3μl，GhABF2fp4 1μl，GhABF2rv4 1μl，Taq 1U，ddH₂O 8μl。

②GhABF3，涉及PCR扩增的引物如下：

GhABF3fp4：5′-TTTGAGTAACAATAACTCAGT-3′

GhABF3rv4：5′-TTTGCAACTTCAGCTTCAAGT-3′

用该引物进行扩增，如果是cDNA做模板可以扩增494bp的条带，如果是基因组DNA做模板可以扩增774bp的条带(含有的273bp内含子)。

PCR体系：模板1μl，PCR Buffer 5μl，10mMdNTP 3μl，GhABF3fp4 1μl，GhABF3rv4 1μl，Taq1U，ddH₂O 8μl。

③GhABI5，涉及PCR扩增的引物如下(扩增564bp，727bp)

GhABI5fp4：5′-CATTCACAACATCAACAACAG-3′

GhABI5rv4：5′-CTGCTTGAGGTGAGTATTCTC-3′

用该引物进行扩增，如果是cDNA做模板可以扩增564bp的条带，如果是基因组DNA做模板可以扩增727bp的条带(含有的163bp内含子)。

PCR体系：模板1μl，PCR Buffer 5μl，10mMdNTP 3μl，GhABI5fp4 1μl，GhABI5rv4 1μl，Taq1U，ddH₂O 8μl。

电泳结果表明：GhABF2在棉花根、茎、叶、花蕾、棉铃中有表达，根茎叶中的表达量稍高，且随着花蕾的发育GhABF2表达量不断升高(图3中，A：CK+、B：CK-、C：根、D：茎、E：叶、F：花萼、G：花瓣、H：雄蕊、I：子房、J：纤维、K：花蕾、L：棉铃；M：CK+、N：CK-、O：棉铃1、P：棉铃2、Q：花蕾1、R：花蕾2、S：花蕾3、T：花蕾4)；GhABF3在棉花中的根、茎、叶、花萼以及花蕾中有表达，根茎叶中的表达量稍高；GhABI5在棉花中的根、茎、叶花、蕾中有表达，棉铃中的表达量稍高。

实施例4 GhABF2转录因子在毕赤酵母中表达分析

1)毕赤酵母GS115感受态细胞制备：挑取毕赤酵母受体菌GS115(His-，Mut+)的单菌落接种于10mLYPD液体培养基中，30℃摇床培养过夜，再以1％的接种量转接于100mL YPD培养基中，30℃培养至OD600＝1.3～1.5；4℃ 5000rpm离心5min，弃去上清，用100mL冰预冷的无菌水将菌体重悬，4℃ 5000rpm离心10min，弃去上清，用50mL冰预冷的无菌水将菌体重悬，4℃ 5000rpm离心10min，再用20mL 1mol/L山梨醇洗涤1次，溶于200μL 1mol/L冰预冷的山梨醇中，以备转化。

2)酵母表达载体构建：将PCR扩增过程中获得的GhABF2基因开放读码结构连接到pUC19载体上，再利用SnaB I和EcoR I双酶切后与SnaB I和EcoR I酶切处理的pPIC9.0K载体相连接，构建成外分泌型酵母表达载体pPIC9.0KGhABF2。

3)酵母的电击转化及重组子的初筛：利用内切酶Sal I线性化表达酵母表达载体pPIC9.0KGhABF2，取80μL感受态细胞与线性化质粒(1～5μg)混合后转移到冰预冷的0.2cm电击杯中，电击转化酵母感受态细胞(2.5KV，5ms)，立即向电击杯中加入1mL冰冷的1mo1/L山梨醇，混匀后，以每板200μL菌液涂布到RDB平板上，30℃培养至长出转化子。

4)酵母重组子甲醇利用型的确定及PCR检测：用无菌牙签挑取上面筛选到的重组子分别点种MM平板和MD平板，同时点种照菌株GS115 Albumin(His4⁺Mut^S)和GS115β-Gal(His4⁺Mut⁺)。在MM和MD上生长一致的，其表型为Mut⁺。在MD上生长正常，在MM上生长缓慢或不长的，其表型为Mut^S。挑取新鲜培养的重组子菌落悬浮于10ul无菌水，加5u15U/ul酵母裂解酶，30℃温育10min，然后液氮冷冻1min，作为模板。所用扩增引物为：

5′AOX I：5′-CGACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′

3′AOX I：5′-GGCAAATGGCATTCTGACATCC-3′

PCR体系：模板1μl，PCR Buffer 5μl，10mMdNTP 3μl，5′AOX I 1μl，3′AOX I 1μl，Taq 1U，ddH₂O8μl。

5)蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：SDS聚丙烯酰胺凝胶配制12％的分离胶溶液(H2O1.6ml、30％丙烯酰胺母液2.0ml、1.5mol/LTris-Cl(pH8.8)1.3ml、10％SDS 0.05ml、10％过硫酸铵0.05ml、TEMED 0.002ml)和浓缩胶溶液(H2O1.4ml、30％丙烯酰胺母液0.33ml、1.0mol/L Tris-Cl(pH6.8)0.25ml、10％SDS 0.02ml、10％过硫酸铵0.02ml、TEMED 0.002ml)，在分离胶上灌注浓缩胶，***梳子，室温聚合45分钟。样品的处理：取1ml培养液于1.5ml微量离心管离心收集菌体，500μl TE(pH8.0)洗一次菌体，加入20μl H2O和20μl 2×样品缓冲液悬浮菌体，100℃煮沸3分钟，于4℃以12000rpm离心10分钟去除细胞碎片，取2μl上清上样电泳。电泳：8v/cm电泳至染料前沿进入分离胶，将电压提高至15v/cm，继续电泳至染料到达分离胶底部，下胶。染色、脱色：加至少5倍体积的染色液浸泡凝胶，放在平缓摇动的摇床上室温染色4小时以上。SDS-PAGE电泳结果表明，GhABF2蛋白大小约为44KD(图4中，M：Marker、A：阴性对照、B：GhABF2蛋白，大小为44KD)。

6)不同浓度PEG600、NaCl对毕赤酵母生长的影响：将GhABF2基因重组菌GS115/GhABF2和对照菌株GS115/pPIC9K分别在表1所示的液体培养基条件下诱导培养，挑取单克隆菌株于BMGY培养基28℃250rpm/min培养48小时，摇瓶装液量为10ml/100ml，然后换BMMY培养基28-30℃250rpm/min培养，每24小时补初始浓度甲醇，培养48小时后检测菌体密度OD₆₀₀。根据测得的菌体密度OD₆₀₀数据，分别绘制不同供氧条件下重组菌GS115/9GhABF2和对照菌株GS115/pPIC9K的生长曲线。

表1 BMMY培养基中PEG6000、NaCl浓度设置

结果表明：PEG6000及浓度大于2.0％NaCl均为酵母生长繁殖的逆境环境，影响酵母菌株的生长，且随着浓度的升高，转GhABF2基因的酵母菌株和转空载菌株均检测OD₆₀₀值下降，说明生长繁殖速度放缓。在PEG6000浓度介于0～4.0％时，随着PEG6000浓度的升高，1、2号转GS115/pPIC9KGhABF2酵母菌株和转GS115/pPIC9K的对照菌株OD₆₀₀值均下降，且转空载的酵母菌株OD₆₀₀值下降更快，在PEG6000浓度达到1.33％时，转GhABF2基因酵母菌株的OD₆₀₀分别为1.381、1.307，转空载酵母菌株OD₆₀₀值为1.095，转目的基因酵母菌株1和2比转空载酵母菌株OD₆₀₀值分别高26.12％、19.36％，二者的差异达到最大值，而后随着PEG6000浓度的继续升高，二者OD₆₀₀值渐渐趋于一致。NaCl浓度介于1.66～5.0％时对于酵母菌株生长的影响和PEG6000相似，随着NaCl浓度的升高，1、2号转GS115/pPIC9KGhABF2酵母菌株和转GS115/pPIC9K的对照菌株OD₆₀₀值均下降，且转空载的酵母菌株OD₆₀₀值下降更快，当NaCl浓度为3.66％时，转GhABF2基因的酵母菌株1和2的OD₆₀₀值分别为0.367、0.349，转空载的酵母菌株OD₆₀₀值为0.212，转目的基因酵母菌株1和2比转空载酵母菌株0D₆₀₀值分别高73.11％、64.62％，二者的差异达到最大值，而后随着PEG6000浓度的继续升高，二者OD₆₀₀值渐渐趋于一致。以上结果可以说明，PEG6000及浓度大于2.0％NaCl均为酵母生长繁殖的逆境环境，而转GhABF2基因的酵母菌株能够一定程度上提高对PEG6000、NaCl逆境环境的忍耐能力(图5中，A：不同浓度PEG6000下酵母生长比较；B：不同浓度NaCl下酵母生长比较)。

实施例5 GhABF2、GhABF3、GhABI5转基因表达载体的构建

1)GhABF2基因植物表达载体构建：把GhABF2、GhABF3、GhABI5构建到植物表达载体pBI121上得到pBI121GhABF2(图6)、pBI121GhABF3、pBI121GhABI5，转化DH5α，提取质粒，酶切鉴定，挑出所需要的克隆，送华大基因测序，并将其转化农杆菌LBA4404。

2)GhABF2、GhABF3、GhABI5基因的拟南芥转化：

农杆菌培养：调鉴定正确的农杆菌单菌落接种在3ml YEB(Kan50mg/L，链霉素50mg/L)，28℃，250rpm培养36h；按1：500转接入200ml新鲜的YEB(Kan50mg/L，链霉素50mg/L)中，28℃，250rpm培养24h，到OD₆₀₀≈1.0；5000rpm，4℃，10min离心收集菌体；重悬菌体于1.5倍体积的渗透液(1/2MS+5％蔗糖，pH6.0，120℃，灭菌15min；用之前加6-BA至终浓度为0.044uM，VB6终浓度为1mg/L，Silwet为0.02％。

拟南芥的培养：拟南芥种子4℃春花处理2-3天，每盆播种4-5棵种子(营养土∶蛭石＝2∶1)；于温室中培养(22℃，光照16h)；待拟南芥抽出初生苔后将其剪去，待其抽出足够的次生苔时，可用于转化。

拟南芥转化：把拟南芥的花蕾浸入渗透液中，抽真空1min；转化完毕后，暗培养24-48h，然后即可正常培养。

种子收集及筛选：称量20g拟南芥种子于1.5mL离心管，加1mL75％的乙醇(含0.05％Tween20)，震荡10分钟，离心去上清，加1mL95％的乙醇洗涤2-3次，在超净台中加0.5mL 100％的乙醇，转移到无菌滤纸上，吹干；吹干后的种子撒播到1/2MS平板(Kan50mg/L)上；4℃，2天后，22℃，16h光照培养；将阳性植株移栽到营养土中培养，收集种子进行T1代筛选。

转基因拟南芥鉴定：提取阳性拟南芥植株的基因组DNA用于PCR检测。

正向引物：35S FP：5’-CACAATCCCACTATCCTTCG-3’

反向引物：GhABF2 rv5：5’-CTTCCCAATCCCATCTGACG-3’

GhABF3rv5：5’-CCCACCACTCTGCAGGCCAC-3’

GhABI5rv5：5’-GCCATCGACCGTCATTGTAG-3’

PCR体系(50ul)：模板(转基因拟南芥DNA)1μl，PCR Buffer 5μl，10mMdNTP 3μl，引物各1ul；加无菌水至50ul。

PCR条件：94℃，2min；94℃，30Sec；55℃，30Sec；72℃，30Sec；30 cycle；72℃，10min。

反应体系：1ul(30ng)；10×Buffer 2ul；Taq酶(0.5ul)；dNTP(3ul)；

实施例6 GhABF2、GhABF3、GhABI5转基因植株抗旱性分析试验

把转基因植株与非转基因拟南芥植株置于正常的生长条件下不给水连续培养12天，结果转基因拟南芥植株的叶片仍表现正常，而野生型拟南芥叶片则都变黄，甚至干枯；复水一周后转基因拟南芥100％的存活下来，非转基因植株存活率不足50％，且出现严重的生长发育滞后。以上结果表明GhABF2、GhABF3、GhABI5能够明显提高拟南芥植株的抗旱性能，结果如图6，A为干旱处理12天的植株，B为复水一周后的植株。

工农业应用

本发明成功的克隆了3个棉花ABF/AREB/ABI5/DPBF类转录因子GhABF2、GhABF3、GhABI5编码基因，并成功地将其导入酵母和拟南芥中，得到了抗干旱等非生物逆境的转基因酵母和转基因拟南芥，为培育抗旱耐盐碱植物新品种提供了基因源，对培育抗非生物逆境植物新品种具有重要的理论及现实意义。

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<160>9

<210>1

<211>2027

<212>DNA

<213>Gossypium hirsutum Y18R

<220>

<221>CDS

<222>(442)..(1692)

<400>1

ATTTCATTTAGAAAACTGGGTTTTCTTTTGAATAATTAATCGACTCAGATGTAGTATTGGATTTTTTTAATGTTTCGGGGGCGGG 85

ATCTGATGTTTTAATTTTTCAAGGGTTTGGCTTGTTAAATTTCTTGAGCACATTGGAATGTTAGGTGTTACTAGCACTTGCAGAA 170

CAAAAAAAAGAAAGAGTTGGTCTTTACTTCCCCTTTTGTGTTTATGTTTTTTTATTGTTTTTCTTAGTTAAAGATTTCCTGTATA 255

GATCTTGATTTTTGGGTTTTTCCTTTTTTTTTTAACGTGTACTTCCCAAATATAGAAATATGTAAATCATTCAAACTGCATGGGA 340

TTTATTTTATCTGTTTTATTTTCATTGAAGTAGTAGTTAAGGACTTTTATATAGCATAGTTTTTAGGATCATTTCTTTGACACTA 425

TTTTATACAGATTTTAATGGGGACTAACATGAACTTTGGAAGTAACCCACCGCCGTCAGGTGATTGCGGCGGGAACAAACCGCCG 510

GGCAATAACCTGTTAACTAGACAGCCGTCAATCTATTCTCTAACCTTTGATGAGTTTCAAAGCACTATGGGTGGAATAGGCAAAG 595

ATTTTGGGTCAATGAACATGGATGAATTGTTGAGGAACATTTGGAGTGCTGAAGAAATTCAAACAATGGCTTCTTCCGGTGGTGT 680

CCTAGAGGGAAATGGAGGGTTACAAAGGCAAGGCTCTTTGACTCTGCCAAGAACACTTAGCCAGAAAACAGTTGATGAAGTCTGG 765

AAAGATATTTCAAAGGAGTATTCATTGGGGAAAGACGGTATTGGAGGTGGAGGAGGCACTAATAATATGCCACAAAGGCAGCAAA 850

CTTTAGGAGAGATGACTTTAGAGGAGTTTTTGGTGAGGGCTGGTGTGGTAAGAGAGGATACCCAATTGGCTGGGAAGGTTAATAA 935

CGGGGGGTTCTTTGGTGGGAATAATACTGGTTTTGAAATTGGGTTTCAACAAGGTGGTAAAGGTCCAAATTTGATGGGAACTAGG 1020

ATTCCTGATGGTGGTAACCAAATTGGTATTCAGGCTTCCAATTTGCATCCTAACGTTAATGGAGTTAGATCAAACCAGCACCAGT 1105

TGGCTCAGCAGCACCAACACCAACAACCAATCTTTCCTAAGCAAACAGGGGTGGGGTATGGAGCTCAGATACCTTTACAAAGTGG 1190

CGGTCAGTTGGGGAGTCCTGGAATTCGGAGTGGAATGCATGGGATTGGGGATCAGGGAATAAGTAATGGTCTGATTCAGGCAGGT 1275

GCACTGCAAGGTGGAGGCATGGGGATGGTTGGTTTAGGAACCGGATCACCTGCTAACCAGGTTTCGTCAGATGGGATTGGGAAGA 1360

GCAGTGGAGATACTTCATCAGTTTCCCCAGTTCCTTATGTGTTTAATGGAAGCATGAGGGGTAGGAAATACAGTGCGGTGGAAAA 1445

GGTTGCTGAGAGGAGGCAAAGGAGAATGATAAAGAACAGAGAATCAGCTGCAAGATCACGAGCTCGCAAGCAGGCTTATACAATG 1530

GAATTGGAAGCAGAAGTTGCAAAGCTAAAAGAGGAGAATCAAGAATTGCGGAAGAAACATGCAGAAATCATGGAAATGCAGAAAA 1615

ATCAGGTCATTGAGATGGTGGATATGCAACAAGGAGCTAAGAAGCGATGCCTACGAAGAACCCAGACCGGTCCTTGGTGAAAGTA 1700

AATCATGTTTACGAAGAAGCCTGTGATTCGTGGTTAAAACTTAAAATTATGCGTGGCAGGTGGTTGTACATATTTAAGTGGCAAG 1785

GATGGTTCCATCTTTAGGTTTGGAGTGATGAATTAGTGCTGTAGCCTGTAGTGTAGAATAAGGATTTTCCAATATTTGCAATAAT 1870

TTTTTTCCTGCTCCCCCAAGGATGATGGTTCATTTAGTTAACCACATCTGTAAATTTCCGAATATCCCCAACATCAATTGGAACT 1955

AATTTGAGTTTATTTCATGAAAAAGCATGGCCCATTTAGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 2027

<210>2

<211>417

<212>PRT

<213>Gossypium hirsutum Y18R

<400>2

Met Gly Thr Asn Met Asn Phe Gly Ser Asn Pro Pro Pro Ser Gly Asp Cys Gly Gly Asn lys Pro 22

Pro Gly Asn Asn Leu Leu Thr Arg Gln Pro Ser Ile Tyr Ser Leu Thr Phe Asp Glu Phe Gln Ser 44

Thr Met Gly Gly Ile Gly Lys Asp Phe Gly Ser Met Asn Met Asp Glu Leu Leu Arg Asn Ile Trp 66

Ser Ala Glu Glu Ile Gln Thr Met Ala Ser Ser Gly Gly Val Leu Glu Gly Asn Gly Gly Leu Gln 88

Arg Gln Gly Ser Leu Thr Leu Pro Arg Thr Leu Ser Gln Lys Thr Val Asp Glu Val Trp Lys Asp 110

Ile Ser Lys Glu Tyr Ser Leu Gly Lys Asp Gly Ile Gly Gly Gly Gly Gly Thr Asn Asn Met Pro 132

Gln Arg Gln Gln Thr Leu Gly Glu Met Thr Leu Glu Glu Phe Leu Val Arg Ala Gly Val Val Arg 154

Glu Asp Thr Gln Leu Ala Gly Lys Val Asn Asn Gly Gly Phe Phe Gly Gly Asn Asn Thr Gly Phe 176

Glu Ile Gly Phe Gln Gln Gly Gly Lys Gly Pro Asn Leu Met Gly Thr Arg Ile Pro Asp Gly Gly 198

Asn Gln Ile Gly Ile Gln Ala Ser Asn Leu His Pro Asn Val Asn Gly Val Arg Ser Asn Gln His 220

Gln Leu Ala Gln Gln His Gln His Gln Gln Pro Ile Phe Pro Lys Gln Thr Gly Val Gly Tyr Gly 242

Ala Gln Ile Pro Leu Gln Ser Gly Gly Gln Leu Gly Ser Pro Gly Ile Arg Ser Gly Met His Gly 264

Ile Gly Asp Gln Gly Ile Ser Asn Gly Leu Ile Gln Ala Gly Ala Leu Gln Gly Gly Gly Met Gly 286

Met Val Gly Leu Gly Thr Gly Ser Pro Ala Asn Gln Val Ser Ser Asp Gly Ile Gly Lys Ser Ser 308

Gly Asp Thr Ser Ser Val Ser Pro Val Pro Tyr Val Phe Asn Gly Ser Met Arg Gly Arg Lys Tyr 330

Ser Ala Val Glu Lys Val Ala Glu Arg Arg Gln Arg Arg Met Ile Lys Asn Arg Glu Ser Ala Ala 352

Arg Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Tyr Thr Met Glu Leu Glu Ala Glu Val Ala Lys Leu Lys Glu 374

Glu Asn Gln Glu Leu Arg Lys Lys His Ala Glu Ile Met Glu Met Gln Lys Asn Gln Val Ile Glu 396

Met Val Asp Met Gln Gln Gly Ala Lys Lys Arg Cys Leu Arg Arg Thr Gln Thr Gly Pro Trp 417

<210>3

<211>2177

<212>DNA

<213>Gossypium hirsutum Y18R

<400>3

ATGGGGACTAACATGAACTTTGGAAGTAACCCACCGCCGTCAGGTGATTGCGGCGGGAACAAACCGCCGGGCAATAACCTGTTAA 85

CTAGACAGCCGTCAATCTATTCTCTAACCTTTGATGAGTTTCAAAGCACTATGGGTGGAATAGGCAAAGATTTTGGGTCAATGAA 170

CATGGATGAATTGTTGAGGAACATTTGGAGTGCTGAAGAAATTCAAACAATGGCTTCTTCCGGTGGTGTCCTAGAGGGAAATGGA 255

GGGTTACAAAGGCAAGGCTCTTTGACTCTGCCAAGAACACTTAGCCAGAAAACAGTTGATGAAGTCTGGAAAGATATTTCAAAGG 340

AGTATTCATTGGGGAAAGACGGTATTGGAGGTGGAGGAGGCACTAATAATATGCCACAAAGGCAGCAAACTTTAGGAGAGATGAC 425

TTTAGAGGAGTTTTTGGTGAGGGCTGGTGTGGTAAGAGAGGATACCCAATTGGCTGGGAAGGTTAATAACGGGGGGTTCTTTGGT 510

GGGAATAATACTGGTTTTGAAATTGGGTTTCAACAAGGTGGTAAAGGTCCAAATTTGATGGGAACTAGGATTCCTGATGGTGGTA 595

ACCAAATTGGTATTCAGGCTTCCAATTTGCATCCTAACGTTAATGGAGTTAGATCAAACCAGCACCAGTTGGCTCAGCAGCACCA 680

ACACCAACAACCAATCTTTCCTAAGCAAACAGGGGTGGGGTATGGAGCTCAGATACCTTTACAAAGTGGCGGTCAGTTGGGGAGT 765

CCTGGAATTCGGAGTGGAATGCATGGGATTGGGGATCAGGGAATAAGTAATGGTCTGATTCAGGCAGGTGCACTGCAAGGTGGAG 850

GCATGGGGATGGTTGGTTTAGGAACCGGATCACCTGCTAACCAGGTTTCGTCAGATGGGATTGGGAAGAGCAGTGGAGATACTTC 935

ATCAGTTTCCCCAGTTCCTTATGTGTTTAATGGAAGCATGAGGGGTAGGAAATACAGTGCGGTGGAAAAGGTTGCTGAGAGGAGG 1020

CAAAGGAGAATGATAAAGAACAGAGAATCAGCTGCAAGATCACGAGCTCGCAAGCAGGTGAATCTATTCTCTAGGTTACTCAAAT 1105

TCGTTTAGCTACTCAATGAACTTCTGGTTGAAATTTTATGCTTTTCCAGGCCATTAAAACGGAACCCACATTAAATTTCCAAAGT 1190

TGAAAAATCAGAATTACCATCCCACCCAGTTTCCTCTTGGTGGGGGGCTTAATGAGTTTTATCAGTCATTGACCTTCTGCTCTTA 1275

TTATCTGTGACTTGGGGCGTACCGAAACTTCATGGAATATTTATGCTGCAGTATGGTAATTTTGATAGCCATCTGACATGACATG 1360

GGAAGTTTTACTAGCTAAATAAAGCATTTGTTTAACAACATGGGAAGTTTGAAGCTGTGCATCGTATACAAACCTAAAAAAACCC 1445

TTTAATTGAGGTTGACATTCTTGACCTTATTGATTTTGGTATAACTATTATCAAGCAAAACGGTTGTATCCCATGGGGGCTTTTA 1530

ACCAGGGAAATTACTGTTGTCTCAAACATGCATTGAAGTTTCTTAATTTTTTTTTTTTTTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCTTC 1615

CTAGGCTTATACAATGGAATTGGAAGCAGAAGTTGCAAAGCTAAAAGAGGAGAATCAAGAATTGCGGAAGAAACATGTATTTTAC 1700

TTTTCTTTCTTTCAATGCACCCCTTATCATTTGCACACAATAGTACTTAATTCATTCTCTTATGGTCTGTACTTTGGTTGTTTGC 1785

AGGCAGAAATCATGGAAATGCAGAAAAATCAGGTGAGGAAGTTGTTTTTGGCACTTCTGTTTTTATTTATATACTAACAACTTAA 1870

GTTATACCCTCTTCAAACACCAGGAAGCATCGTTATTTGCATAATCTTCCATTATGTACCCTATTGCACTACTTGGTTTACTTTG 1955

GAAAGCATTTTTAATTGCCCAATCCACGTGAGCGGTAAACTTTTCTTTTGCCGTATTAAATATTATGCCCGCCCTCACTAGAAAA 2040

TGTGCTTTGAACTTGGCAACCTTTGAATGTTCAATATTCTAAAATCATGCTTAATCTTGCGCAAGGTCATTGAGATGGTGGATAT 2125

GCAACAAGGAGCTAAGAAGCGATGCCTACGAAGAACCCAGACCGGTCCTTGG 2177

<210>4

<211>2056

<212>DNA

<213>Gossypium hirsutum Y18R

<220>

<221>CDS

<222>(333)..(1553)

<400>4

GTTGTTTCTGCTGTGAATGTGATGGAATTTGACGAGCATTTGTTTGGCTATGTGTATGATTGTATGTTTTGTGCTAGTTGTTAGA 85

GAATCTTGAAATTTAGAGATTTGACATGAAAGTTCTAATCTTTATTGGTTCTAATGTATGATCAAGTTACACTTTGCTTTGTTTG 170

GTGATCATTGATTAGATCTCAAGTTAAAGAAAGAAAGAAAAAAAAGTTATATCAAAGGGAAAGTGAATAATGTCATGATCATCTT 255

ATCTACTTCAGTTGATTGGATTTTATAGGGGAATTTGAATTGTGTTCTTTTGTGTTTGTTGCTGTTTGAAACAAGAAATGGGGTC 340

TAATCTGAATTTCAAGAGGTTTGGTGAAGCTCCAAGTATGGAAGGGAGTGGATCAAAGGCAGTGGGCAATTTCCCATTGGCTAGG 425

CAGTCATCGATATACTCGTTGACCTTCGATGAGCTGCAGAACACATTCGGTGGACTCGGCAAGGACTTCGGATCTATGAACATGG 510

ATGAACTCTTGAGGAACATCTCAACTGCTGAAGAGACTCATGGTTTGATGACAGCATCAGTTCCTGGAGGCGAAGGTGTTTCTGG 595

TGGTAATTTGCAGAGGCAAGGTTCATTGACATTGCCAAGGACTCTGAGTCAGAAAACGGTTGAGGAAGTATGGAAAGACTTGTTT 680

AAGGAAAATGATGGTGCTAAAAATGTAAGTAATGGTGGTGGTGGTGGTGGAGCTAATTTGCCACAGAGGCAACAGACATTGAGAG 765

AGATGACTTTGGAGGAGTTCCTGGGGAGGGCAGGTGTTGTGAGGGAAGATATGCAACCGGTTGGTGTGCCGAATAACAATGGATT 850

TTTTGATAACAACTCTGGTTTAGCCCTTCAGTTTCAACAGAGAAATGGAAACAATGGTTTTTTGAGTAACAATAACTCAGTTCTT 935

AATCAGCCTCCAATCTTACCATTAGACGTGAGTGGAGCCAAATCATCACACTCACAGCAGCAACAACAGCCACTCTTTCCCAAGC 1020

AACAAACGGTTGCATTTGCTCCATCTATGCACTTGATAAACACTACACATTTTCCTAGTCCTGGAGCTCAGGGGTCGGTAGTTGA 1105

AACCAGTGACCTTTCAATGAATACTAATCTAGTTCAGTCTAGTGGCCTGCAGAGTGGTGGGATGGGAATAGTTGGTTTACCATCT 1190

CCTGCAAGCCATATATCTCCAGATGTGATTTCAAAGAATAGTGTAGATACAACTTCTTTATCACCGGTTCCTTATTTGCTTGGCC 1275

GGGGAAGAAAACGCAGTGCAGCATTGGAGAAAGTAGTTGAGAGAAGGCAAAGGAGAATGATTAAGAACAGAGAGTCAGCTGCAAG 1360

ATCACGAGCTCGCAAGCAGGCTTATACATTGGAACTTGAAGCTGAAGTTGCAAAACTTAAAGAAATGAATGAAGAATTGCTGAGG 1445

AAACAGGAAGAAGTGATGGAAATGCAGAAAAATCAGATGCTAGAAACACTTAATCCAGCATGGGGAGGTAAAAGACAATGCTTAA 1530

GAAGAACACTGACAGGCCCTTGGTAGAGTTTGAGGAACTGCTGATTGTAAAAAATGTTGCTTTGATACACAATCTTGGTCGGTGC 1615

TACAGTTTAATGATTGGGATCTGCATCCATTATCTATATCTTGATACTGCTTAAGGCTAGATAGCTGTGAATATAGAAGCAAAGG 1700

GTTTTGAGTTGTAAGTTATGAACTTGACAGTATTAGTTTGTAGTTTTGATTTTGTTATTGGCTTGATCTCTGTTTGCCTATCATG 1785

ATCTAACCTTGACAACAAGGGCGGGCTTGTAAGATAACTAGATGGATGCTCCAATATGGTCTTTATGCTCTGCCTACAGACTTGG 1870

TCAGTTTCATCCTGATTTGACTTGTAAATTTAAGACATATCTGTTGTAAGAAATAAGCTATCGGTTTTTGATTCAAAAAAAAAAA 1955

AAAAAAA 1963

<210>5

<211>407

<212>PRT

<213>Gossypium hirsutum Y18R

<400>5

Met Gly Ser Asn Leu Asn Phe Lys Arg Phe Gly Glu Ala Pro Ser Met Glu Gly Ser Gly Ser Lys 22

Ala Val Gly Asn Phe Pro Leu Ala Arg Gln Ser Ser Ile Tyr Ser Leu Thr Phe Asp Glu Leu Gln 44

Asn Thr Phe Gly Gly Leu Gly Lys Asp Phe Gly Ser Met Asn Met Asp Glu Leu Leu Arg Asn Ile 66

Ser Thr Ala Glu Glu Thr His Gly Leu Met Thr Ala Ser Val Pro Gly Gly Glu Gly Val Ser Gly 88

Gly Asn Leu Gln Arg Gln Gly Ser Leu Thr Leu Pro Arg Thr Leu Ser Gln Lys Thr Val Glu Glu 110

Val Trp Lys Asp Leu Phe Lys Glu Asn Asp Gly Ala Lys Asn Val Ser Asn Gly Gly Gly Gly Gly 132

Gly Ala Asn Leu Pro Gln Arg Gln Gln Thr Leu Arg Glu Met Thr Leu Glu Glu Phe Leu Gly Arg 154

Ala Gly Val Val Arg Glu Asp Met Gln Pro Val Gly Val Pro Asn Asn Asn Gly Phe Phe Asp Asn 176

Asn Ser Gly Leu Ala Leu Gln Phe Gln Gln Arg Asn Gly Asn Asn Gly Phe Leu Ser Asn Asn Asn 198

Ser Val Leu Asn Gln Pro Pro Ile Leu Pro Leu Asp Val Ser Gly Ala Lys Ser Ser His Ser Gln 220

Gln Gln Gln Gln Pro Leu Phe Pro Lys Gln Gln Thr Val Ala Phe Ala Pro Ser Met His Leu Ile 242

Asn Thr Thr His Phe Pro Ser Pro Gly Ala Gln Gly Ser Val Val Glu Thr Ser Asp Leu Ser Met 264

Asn Thr Asn Leu Val Gln Ser Ser Gly Leu Gln Ser Gly Gly Met Gly Ile Val Gly Leu Pro Ser 286

Pro Ala Ser His Ile Ser Pro Asp Val Ile Ser Lys Asn Ser Val Asp Thr Thr Ser Leu Ser Pro 308

Val Pro Tyr Leu Leu Gly Arg Gly Arg Lys Arg Ser Ala Ala Leu Glu Lys Val Val Glu Arg Arg 330

Gln Arg Arg Met Ile Lys Asn Arg Glu Ser Ala Ala Arg Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Tyr Thr 352

Leu Glu Leu Glu Ala Glu Val Ala Lys Leu Lys Glu Met Asn Glu Glu Leu Leu Arg Lys Gln Glu 374

Glu Val Met Glu Met Gln Lys Asn Gln Met Leu Glu Thr Leu Asn Pro Ala Trp Gly Gly Lys Arg 396

Gln Cys Leu Arg Arg Thr Leu Thr Gly Pro Trp 407

<210>6

<211>1773

<212>DNA

<213>Gossypium hirsutum Y18R

<400>6

ATGGGGTCTAATCTGAATTTCAAGAGGTTTGGTGAAGCTCCAAGTATGGAAGGGAGTGGATCAAAGGCAGTGGGCAATTTCCCAT 85

TGGCTAGGCAGTCATCGATATACTCGTTGACCTTCGATGAGCTGCAGAACACATTCGGTGGACTCGGCAAGGACTTCGGATCTAT 170

GAACATGGATGAACTCTTGAGGAACATCTCAACTGCTGAAGAGACTCATGGTTTGATGACAGCATCAGTTCCTGGAGGCGAAGGT 255

GTTTCTGGTGGTAATTTGCAGAGGCAAGGTTCATTGACATTGCCAAGGACTCTGAGTCAGAAAACGGTTGAGGAAGTATGGAAAG 340

ACTTGTTTAAGGAAAATGATGGTGCTAAAAATGTAAGTAATGGTGGTGGTGGTGGTGGAGCTAATTTGCCACAGAGGCAACAGAC 425

ATTGAGAGAGATGACTTTGGAGGAGTTCCTGGGGAGGGCAGGTGTTGTGAGGGAAGATATGCAACCGGTTGGTGTGCCGAATAAC 510

AATGGATTTTTTGATAACAACTCTGGTTTAGCCCTTCAGTTTCAACAGAGAAATGGAAACAATGGTTTTTTGAGTAACAATAACT 595

CAGTTCTTAATCAGCCTCCAATCTTACCATTAGACGTGAGTGGAGCCAAATCATCACACTCACAGCAGCAACAACAGCCACTCTT 680

TCCCAAGCAACAAACGGTTGCATTTGCTCCATCTATGCACTTGATAAACACTACACATTTTCCTAGTCCTGGAGCTCGGGGGTCG 765

GTAGTTGAAACCAGTGACCTTTCAATGAATACTAATCTAGTTCAGTCTAGTGGCCTGCAGAGTGGTGGGATGGGAATAGTTGGTT 850

TACCATCTCCTGCAAGCCATATATCTCCAGATGTGATTTCAAAGAATAGTGTAGATACAACTTTATCACCGGTTCCTTATTTGCT 935

TGGCCGGGGAAGAAAACGCAGTGCAGCATTGGAGAAAGTAGTTGAGAGAAGGCAAAGGAGAATGATTAAGAACAGAGAGTCAGCT 1020

GCAAGATCACGAGCTCGCAAGCAGGTGAGTTGAGTGCCACTACACTGTTGTTTCCTTTCCTTCTGAGTTACCAGATCCTATTTCA 1105

TTTCTCCTATAAAATCTTGCTCAGTTGTGTGGATTACTTGTTTAAAAAGTTCATTAGTTTTGAATTTTGTTGCTTTCTACAAACA 1190

TGCCACTCATAATGTTTAGGACAATGCCCCTACATTGCTTGTGTGAAAGTAATGGTTTGGTATGGTTTATAGTTGGCTCAAATCC 1275

AATGCCAAACAAGATTGTATTAATTGCTCTGAGTTCTGGCAGGCTTATACATTGGAACTTGAAGCTGAAGTTGCAAAACTTAAAG 1360

AAATGAATGAAGAATTGCTGAGGAAACAGGTAAGTACTTATCACCTGGACTTCGATTCATCGTATTCTATTGAAACGTTGGTGGA 1445

TCGGCCCTTTTCTTGACAGTGCTTTGGTTGGTGCAGGAAGAAGTGATGGAAATGCAGAAAAATCAGGTAATGCAACATTCCTGCT 1530

GCTTCCATCTTGCATTTATGTTATAGCATTCATATGCAGCAAACTAGCTTTTAGATGGGTTCCAAAGCCTTAAGAACATGGCAAA 1615

CCATGATATATAACATGTTTTGTTCCATGCACATTTATTGAAATGCTTCCTGTTTTTGGTCTGCTCTCTGCTGCCTTTTCAAACA 1700

GATGCTAGAAACACTTAATCCAGCATGGGGAGGTAAAAGACAATGCTTAAGAAGAACACTGACAGGCCCTTGG 1773

<210>7

<211>1927

<212>DNA

<213>Gossypium hirsutum Y18R

<220>

<221>CDS

<222>(384)..(1649)

<400>7

AGTGAGAAGAACAAAAGAGGCAGCAGCAGCAGCACACGCGTTGAGCTAAGAGCAGTAAAGCAAAGCAGAGCAAGCCACATGGCCG 85

AAACGTGTCGATCAAAGCAACGCCGATACCATTTTGGAACTGGGGAGACAGCACAATTACCCAATTTTTATAAAGTTTTCCCTTC 170

CTTTGGGTCGATTCCAATTGACTTTTTTGGACCCCACTGCGCCGGGAAACTTTAAACTCACTTTTACACCCTCTACGTGTTTGTT 255

TATATTCCCCACTGCCTAACCATTTTCTTCAACCACAATAACCCTCTTATTTTTTCATCTTTTTTCAGCTCCAATCATATCTCTT 340

TTCCTTTGTTGAAACCAGTTTAAAGCAAGATTTCATCGCAAAAATGGTGGTTGAGAACTCTGAGGTTGGCGAGGTCGAGTCCACA 425

TTGAAGGAGGTGGACCAGCAGCTAAAGAATCATCCATTATCGGCCCTTGGAAGACAATCCTCAATTTATTCCCTCACTCTCGATG 510

AGTTCCAGCACACGTTATGTGGGAAGAACTTTGGGTCGATGAACATGGACGAGTTCCTTACCAGCATTTGGAATGCTGAAGAAAA 595

CCAAGCTACAAACTCCATTAATAACAATCATCACAACAATGGTGTAAATGAACAGGTTAGCAATCATGTTAACTTATCTTTGAAT 680

GAAACAGCAAGCAGTAAAGGTGTAGCTAGGCAGTCTAGCTTGCCTCGACAAGGCTCGCTTTCACTTCCGGCACCATTGTGTCGGA 765

AAACTGTCGATGAAGTTTGGTCTGAGATACATAAAGTGCAGCAAGGACAAGGACAGAGTAACAAGAGCAATGTGCAGAATGCTGA 850

GAATACTAGTACTCGACAACCGACTTTTGGGGAAATGACCTTGGAAGATTTCTTGGTTAAGGCAGGTGTAGTTCGGGAACCATGC 935

GTACCACCGGCAGTACCGCCGCATTCACAACATCAACAACAGTTCGGGTTGCATCAGGCTAGCAATAACCCTGCAGTGGGTCCGA 1020

GTTTTGTTCCCAGGCCAATTATGGGAATGGGTGGCAGTGGTGGCTTTGGTGGGAGTACATATCAAACAATGCCTCCAAGTGGAGT 1105

CCTTGGTGATTCATCACGCTATCTTAATGATGGTAAGGGGGGTGGCGGCTACCAGCCAGCTGCTGCCCCACCGTCAACAGCCATC 1190

TGTTATAACGGAAAAGTAGGTGCAGCTGGTGGCTTTGGACCGGGACAGGCAATGGGAGTGGTATCACCAATAAGTCCGGTATCAC 1275

CAGATGGGATATGTACCAATCAAGTTGATAATGCAGCCACTCAATTCGGGATAGAGATAGGTGGACTACGAGGAAGGAAAAGAAT 1360

CATTGATGGTCCAATAGAAAAAGTAGTCGAGAGAAGGCAACGCAGGATGATTAAGAATAGGGAATCAGCTGCAAGGTCTAGAGCT 1445

AGAAAACAGGCATATACAGTTGAGCTAGAAGCAGAATTGAACCAATTGAAACAAGAGAATACTCACCTCAAGCAGGCTTTGGTGG 1530

AACTCGAGAGGAAAAGAAAGCAACAGTACTTTGAGGAATGGTCAATGAAAACACAAACCAAAGCCCAGAAAGCTAAAGAGAAACT 1615

AAGGGTAATGAGAAGAAATCTAAGTGGTCCATTATGAGCCAGAAAAGAAGATGCATGCTCAAGGCATTGACGGTGGAAGCTCTCA 1700

AAACCAATGACATAACCTCAAGCTGAAGAACATCATCAAAACACGTTTAGACACATGATAGTTGGTGGATATTTATAAAGAAGGC 1785

TTCTGGGAATATGATTTTTATGAATAATCAAATTTCTGAAGTCTAAACTAATGATATATATATGTATGTATGTATACGGTTTTAA 1870

TGTTCACACAAGTCATGGAAAGGTATGTCGTTGCTTGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 1927

<210>8

<211>422

<212>PRT

<213>Gossypium hirsutum Y18R

<400>8

Met Val Val Glu Asn Ser Glu Val Gly Glu Val Glu Ser Thr Leu Lys Glu Val Asp Gln Gln Leu 22

Lys Asn His Pro Leu Ser Ala Leu Gly Arg Gln Ser Ser Ile Tyr Ser Leu Thr Leu Asp Glu Phe 44

Gln His Thr Leu Cys Gly Lys Asn Phe Gly Ser Met Asn Met Asp Glu Phe Leu Thr Ser Ile Trp 66

Asn Ala Glu Glu Asn Gln Ala Thr Asn Ser Ile Asn Asn Asn His His Asn Asn Gly Val Asn Glu 88

Gln Val Ser Asn His Val Asn Leu Ser Leu Asn Glu Thr Ala Ser Ser Lys Gly Val Val Arg Gln 110

Ser Ser Leu Pro Arg Gln Gly Ser Leu Ser Leu Pro Ala Pro Leu Cys Arg Lys Thr Val Asp Glu 132

Val Trp Ser Glu Ile His Lys Val Gln Gln Gly Gln Gly Gln Ser Asn Lys Ser Asn Val Gln Asn 154

Ala Glu Asn Thr Ser Thr Arg Gln Pro Thr Phe Gly Glu Met Thr Leu Glu Asp Phe Leu Val Lys 176

Ala Gly Val Val Arg Glu Pro Cys Val Pro Pro Ala Val Pro Pro His Ser Gln His Gln Gln Gln 198

Phe Gly Leu His Gln Ala Ser Asn Asn Pro Ala Val Gly Pro Ser Phe Val Pro Arg Pro Ile Met 220

Gly Met Gly Gly Ser Gly Gly Phe Gly Gly Ser Thr Tyr Gln Thr Met Pro Pro Ser Gly Val Leu 242

Gly Asp Ser Ser Arg Tyr Leu Asn Asp Gly Lys Gly Gly Gly Gly Tyr Gln Pro Ala Ala Ala Pro 264

Pro Ser Thr Ala Ile Cys Tyr Asn Gly Lys Val Gly Ala Ala Gly Gly Phe Gly Pro Gly Gln Ala 286

Met Gly Val Val Ser Pro Ile Ser Pro Val Ser Pro Asp Gly Ile Cys Thr Asn Gln Val Asp Asn 308

Ala Ala Thr Gln Phe Gly Ile Glu Ile Gly Gly Leu Arg Gly Arg Lys Arg Ile Ile Asp Gly Pro 330

Ile Glu Lys Val Val Glu Arg Arg Gln Arg Arg Met Ile Lys Asn Arg Glu Ser Ala Ala Arg Ser 352

Arg Ala Arg Lys Gln Ala Tyr Thr Val Glu Leu Glu Ala Glu Leu Asn Gln Leu Lys Gln Glu Asn 374

Thr His Leu Lys Gln Ala Leu Val Glu Leu Glu Arg Lys Arg Lys Gln Gln Tyr Phe Glu Glu Trp 396

Ser Met Lys Thr Gln Thr Lys Ala Gln Lys Ala Lys Glu Lys Leu Arg Val Met Arg Arg Asn Leu 418

Ser Gly Pro Leu 422

<210>9

<211>1767

<212>DNA

<213>Gossypium hirsutum Y18R

<400>9

ATGGTGGTTGAGAACTCTGAGGTTGGCGAGGTCGAGTCCACATTGAAGGAGGTGGACCAGCAGCTAAAGAATCATCCATTATCGG 85

CCCTTGGAAGACAATCCTCAATTTATTCCCTCACTCTCGATGAGTTCCAGCACACGTTATGTGGGAAGAACTTTGGGTCGATGAA 170

CATGGACGAGTTCCTTACCAGCATTTGGAATGCTGAAGAAAACCAAGCTACAAACTCCATTAATAACAATCATCACAACAATGGT 255

GTAAATGAACAGGTTAGCAATCATGTTAACTTATCTTTGAATGAAACAGCAAGCAGTAAAGGTGTAGCTAGGCAGTCTAGCTTGC 340

CTCGACAAGGCTCGCTTTCACTTCCGGCACCATTGTGTCGGAAAACTGTCGATGAAGTTTGGTCTGAGATACATAAAGTGCAGCA 425

AGGACAAGGACAGAGTAACAAGAGCAATGTGCAGAATGCTGAGAATACTAGTACTCGACAACCGACTTTTGGGGAAATGACCTTG 510

GAAGATTTCTTGGTTAAGGCAGGTGTAGTTCGGGAACCATGCGTACCACCGGCAGTACCGCCGCATTCACAACATCAACAACAGT 595

TCGGGTTGCATCAGGCTAGCAATAACCCTGCAGTGGGTCCGAGTTTTGTTCCCAGGCCAATTATGGGAATGGGTGGCAGTGGTGG 680

CTTTGGTGGGAGTACATATCAAACAATGCCTCCAAGTGGAGTCCTTGGTGATTCATCACGCTATCTTAATGATGGTAAGGGGGGT 765

GGCGGCTACCAGCCAGCTGCTGCCCCACCGTCAACAGCCATCTGTTATAACGGAAAAGTAGGTGCAGCTGGTGGCTTTGGACCGG 850

GACAGGCAATGGGAGTGGTATCACCAATAAGTCCGGTATCACCAGATGGGATATGTACCAATCAAGTTGATAATGCAGCCACTCA 935

ATTCGGGATAGAGATAGGTGGACTACGAGGAAGGAAAAGAATCATTGATGGTCCAATAGAAAAAGTAGTCGAGAGAAGGCAACGC 1020

AGGATGATTAAGAATAGGGAATCAGCTGCAAGGTCTAGAGCTAGAAAACAGGTACTACCTACAACTACTGTTTGCTGGAAGTGAA 1105

TGCATATATATGCATGTGTATACAATTATACATATATATTTTCTGGTAGAGAAATAATCTTCTGTTGTGTAGGTCATTAGTATAT 1190

AGGCATAATACTTCAATTCTTACTAGGTTGGTTATATTTAACAGGCATATACAGTTGAGCTAGAAGCAGAATTGAACCAATTGAA 1275

ACAAGAGAATACTCACCTCAAGCAGGCTTTGGTGACATTCGTATTACTTTTCGCATTTATCAAAATTTCAGATCTTGATGTAGCT 1360

TTTATCATATATAATATGGCAGCTTAATCTCATTTTACTTACATTTCAACAGGTGGAACTCGAGAGGAAAAGAAAGCAACAGGTA 1445

AATCATTCAACTGATTACATGTGCTTTACAATGCACCATATGAAGTAGAGAATACAAAAAGATGATCAGAAGGGCAAAGTTATAG 1530

AACTTTATGATGGGGGTAACATGCATAAGAGTAGGAAATATAAGCATTGATGGCTACAAGCATCATACTAGATTCATTTTTTTGC 1615

TTTGTTCATCCTATTTTTGGTGTTTTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTTGTCCTTGCAGTACTTTGAGGAATGGTCAATGAAAAC 1700

ACAAACCAAAGCCCAGAAAGCTAAAGAGAAACTAAGGGTAATGAGAAGAAATCTAAGTGGTCCATTA 1767

Claims

1.棉花bZIP类转录因子，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述的棉花bZIP类转录因子的编码基因，其碱基序列如SEQ ID NO：3所示。