CN110317815B

CN110317815B - 一种调控大青杨不定根发生的基因、检测引物、表达载体及应用

Info

Publication number: CN110317815B
Application number: CN201910624809.4A
Authority: CN
Inventors: 李成浩; 魏明; 许雪梅
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2019-07-11
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2020-11-13
Anticipated expiration: 2039-07-11
Also published as: CN110317815A

Abstract

一种调控大青杨不定根发生的基因PuMYC2、检测引物、表达载体及应用，涉及不定根的发生技术领域。本发明所述基因PuMYC2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将所述基因PuMYC2转导入大青杨植株后，PuMYC2过表达植株不定根数量平均值为10根，在不定根形成时间上，PuMYC2过表达植株大约3d左右开始出现不定根，并且株系的生根率也高于野生型。因此可将调控大青杨不定根发育的关键调节基因PuMYC2应用于林木基因工程领域和无性系林业领域。

Description

一种调控大青杨不定根发生的基因、检测引物、表达载体及应用

技术领域

本发明属于不定根发生技术领域，具体涉及一种调控大青杨不定根发生的基因、检测引物、表达载体及其应用。

背景技术

杨树由于其生长速度快、适应能力强，一直被用作抗旱及防风林营造的重要林木种源。杨树由五大派系组成，分别为青杨派、胡杨派、白杨派、黑杨派以及大叶杨派。大青杨隶属青杨派，是中国东北部的本地树种，在当地是生长速度最快的树种之一，此外，由于大青杨木质白皙致密且不易腐蚀，因此也是造纸和胶合板的重要木材资源，具备一定的经济价值。

植物外植体不定根的形成是植物离体组织存活的关键，也是园艺和林业作物无性系扦插繁殖的重要过程，然而不定根的发生对于林木扦插过程是一个限制因素，并且目前对不定根发生调控的分子机制研究较少。因此，了解诱导不定根形成的分子机制对于林木遗传资源的可持续高效利用具有重要意义。茉莉素(JA)是一类重要的植物激素，在植物生长发育过程中发挥重要作用，也和植物不定根发生密切相关。目前，对茉莉素在不定根发生过程中的作用及调控机制的研究在拟南芥中已开展了较多工作，研究发现，茉莉素抑制拟南芥的不定根发生。

MYC2转录因子作为bHLH IIIe家族中的重要成员，在大量的茉莉素介导的生物代谢调控活动中扮演重要角色，在调控植物生长发育等过程中发挥重要作用，目前对MYC2转录因子功能的研究多以模式植物拟南芥及多数草本经济类作物为核心，而对木本植物研究甚少，这些研究也多围绕叶片发育、果实成熟、次生代谢及胁迫响应等活动展开，对不定根发育的研究甚少。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种调控大青杨不定根发生的基因、检测引物、表达载体及其应用，将PuMYC2基因转入大青杨，过量表达PuMYC2的转基因杨树，明显提早生根，且不定根数量明显增多。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种调控大青杨不定根发生的基因PuMYC2，所述基因PuMYC2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述基因PuMYC2的表达蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种克隆权利要求1所述基因PuMYC2的引物组，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种包含所述基因PuMYC2的表达载体，所述表达载体的基础载体包括pBI121-GFP载体。

本发明还提供了所述基因PuMYC2或所述引物组或所述表达载体在调控大青杨不定根发生中的应用。

优选的，所述调控大青杨不定根发生的方法，包括以下步骤：(1)克隆所述基因PuMYC2；

(2)双酶切所述基因PuMYC2和基础载体，构建表达载体；

(3)利用农杆菌介导的方法将所述表达载体侵染大青杨的叶片组织，共培养后脱菌，得愈伤组织；

(4)将所述愈伤组织经分化和生根培养后，得转基因苗。

优选的，步骤(1)所述克隆的程序为：95℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸90s，循环数为35；68℃延伸7min。

优选的，步骤(2)所述双酶切时所用的酶为SalI和SpeI。

优选的，步骤(3)所述大青杨的叶片组织选自生长3周的大青杨植株自上而下的第3和/或第4片叶片。

优选的，得步骤(4)所述转基因苗后，还包括从DNA和RNA水平上进行转基因检测。

本发明提供了一种调控大青杨不定根发生的基因PuMYC2，所述基因PuMYC2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。在本发明的实施例中，对所述基因PuMYC2的功能进行研究，将WT和PuMYC2过表达转基因大青杨同时通过微扦插的方式放入正常1/2MS培养基中，3周后对WT和PuMYC2过表达转基因大青杨进行观察和分析，对不定根数量统计发现，PuMYC2过表达植株不定根数量平均值为10根，WT不定根数量平均值为7根，说明PuMYC2过表达植株不定根数量多于野生型；在不定根形成时间上，PuMYC2过表达植株不定根发生时间最早，大约3d左右开始出现不定根，并且株系的生根率也高于野生型。因此可将调控大青杨不定根发育的关键调节基因PuMYC2应用于林木基因工程领域和无性系林业领域。

附图说明

图1为PuMYC2基因克隆条带；

图2为在DNA水平上的转基因检测结果图；

图3为获得的转基因植株；

图4为转基因植株的PCR检测结果图；

图5为PuMYC2转基因大青杨RNA水平上的PCR鉴定；

图6为PuMYC2转基因大青杨根系观察结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种调控大青杨不定根发生的基因PuMYC2，所述基因PuMYC2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述基因PuMYC2为JA响应转录因子。本发明所述基因PuMYC2的DNA序列长1476bp，如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述基因PuMYC2的表达蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共编码168个氨基酸。

本发明所述引物组中，所述正向引物命名为PuMYC2-F：CTCGGCGCAGCTGATAGAAT；所述反向引物命名为PuMYC2-R：ACACTTTTAGGGTCAAGATTCCAGT。

本发明所述表达载体为过量表达载体35S::PuMYC2，在所述表达载体中，所述基因PuMYC2位于启动子CaMV35S之后，在启动子CaMV35S的驱动下，PuMYC2可在大青杨体内高效表达，从而调控不定根发生。

本发明所述表达载体的构建方法，优选包括：(1)克隆所述基因PuMYC2；

(2)双酶切所述基因PuMYC2和基础载体，构建表达载体。

本发明在构建所述表达载体时，首先克隆所述基因PuMYC2，所述克隆优选以大青杨的cDNA为模板，以上述引物组为引物进行PCR扩增。本发明所述cDNA优选通过提取大青杨的RNA后反转录而成，在本发明实施例中，利用CTAB法提取扦插3周的大青杨(Populusussurensis kom.)组培苗总RNA，并且反转录成cDNA，本发明对所述反转录的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规市售反转录试剂盒即可。

本发明所述克隆优选使用KOD酶体系进行目的基因的克隆，所述克隆的体系优选为20μL体系，包括：cDNA模板100ng，引物各0.6μL，2×PCRbuffer for KOD 10μL，dNTPs(2mM)4μL，KOD Polymerase 0.4μL，ddH₂O补充至20μL。本发明所述克隆的程序优选为：95℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸90s，循环数为35；最后68℃延伸7min。

本发明在克隆得到所述基因PuMYC2后，优选还包括胶回收目的片段，将回收产物连接到克隆载体，热激法大肠杆菌转化后在含有抗生素的LB平板上进行筛选，挑选单菌落后进行菌液PCR，选择阳性的菌液进行测序，命名为PuMYC2基因，序列如SEQ ID NO.1所示，可编码如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质。本发明所述抗生素优选为卡那霉素。

得所述基因PuMYC2后，本发明双酶切所述基因PuMYC2和基础载体，构建表达载体。本发明所述双酶切时所用的酶优选为SalI和SpeI，在所述正向引物前添加SalI酶切位点(SEQ ID NO.5，GCGTCGACATGGAGGAACTCATTATTTCTCC)，在反向引物前添加SpeI酶切位点(SEQ ID NO.6，GCACTAGTTTCTAGTCTTCCAAGAAGAGCAG)。本发明以所述阳性菌液提取质粒为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示引物组为引物进行PCR，所述PCR的体系优选为20μL体系，包括：模板100ng，引物各0.6μL，2×PCRbuffer for KOD 10μL，dNTPs(2mM)4μL，KODPolymerase 0.4μL，ddH₂O补充至20μL。本发明所述克隆的程序优选为：95℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸90s，循环数为35；最后68℃延伸7min。本发明将所述PCR得到的产物进行双酶切后，再连接到pBI121-GFP载体上，并转入大肠杆菌，经测序检测后，确定载体构建成功，得所述表达载体，命名为pBI121-PuMYC2-GFP。

在本发明中，所述调控大青杨不定根发生的方法，优选包括以下步骤：

(1)克隆所述基因PuMYC2；

(2)双酶切所述基因PuMYC2和基础载体，构建表达载体；

(4)将所述愈伤组织经分化和生根培养后，得转基因苗。

本发明所述步骤(1)与步骤(2)优选与上述命名为pBI121-PuMYC2-GFP的表达载体的构建方法完全相同，在此不再赘述。

得所述表达载体后，本发明利用农杆菌介导的方法将所述表达载体侵染大青杨的叶片组织，共培养后脱菌，得愈伤组织。本发明对所述农杆菌介导的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规农杆菌介导方法即可。本发明在所述侵染后，优选还包括用灭菌的吸水纸轻轻吸取叶片表面水分，放在含有0.02mg/L IBA，0.03mg/L 6-BA和0.0008mg/L TDZ的WPM分化培养基中黑暗条件下共培养2天。本发明将所述共培养2d后的叶盘进行脱菌，所述脱菌前优选还包括用100mL的无菌水洗3次，每次洗3min，期间重新换瓶换水，之后用100mL的加有Cefalexin(Cef，终浓度为200mg/L)的WPM分化液体培养基(头孢终浓度为200mg/L)洗8次，每次6min，期间换瓶换水，脱菌过程中需要水平慢速(100rpm)转圈摇晃。完毕后用灭菌吸水纸轻轻将叶片表面的水吸干，转移至含有50mg/L Kanamycin、200mg/L Timentin和200mg/L Cef的WPM固体分化培养基上，暗培养，约1-2周更换一次培养基，当叶柄位置膨大后，可得愈伤组织。

得愈伤组织后，本发明将所述愈伤组织经分化和生根培养后，得转基因苗。本发明得愈伤组织后，优选的将所述愈伤组织置于光下培养，将来源于同一块愈伤组织的植株视为一个独立转化系。本发明所述光下培养的温度优选为25℃，光照度为46μmol m^-2s^-1。当叶片上长出小芽后，将芽放到含有Kan,Tim和Cef的1/2MS固体培养基进行生根培养，得转基因苗。本发明所述1/2MS固体培养基中Kan浓度优选为50mg/L，所述Tim的浓度优选为200mg/L，所述Cef的浓度优选为200mg/L。本发明得所述转基因苗后，优选还包括在DNA和RNA水平上进行转基因检测，所述检测包括PCR检测。

下面结合实施例对本发明提供的调控大青杨不定根发生的基因、检测引物、表达载体及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

大青杨PuMYC2基因的获得：

1.1目的基因序列的获得

根据毛果杨中PuMYC2序列，设计引物，序列如表1所示。

表1目的基因克隆的引物序列

利用CTAB法提取扦插3周的大青杨(Populus ussurensis kom.)组培苗总RNA，并且反转录成cDNA，以此cDNA为模板，使用KOD酶体系进行目的基因的克隆，反应条件为:95℃预变性3min；98℃变性10s,60℃退火30s,68℃延伸90s，循环数为35；最后68℃延伸7min，1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR体系如表2所示：

表2本发明用于目的基因克隆PCR反应体系

1.2目的基因连接T载体测序

对目的片段产物进行胶回收，将回收产物连接到克隆载体(中美泰和生物技术有限公司)，热激法大肠杆菌转化后在含有抗生素的LB平板上进行筛选，挑选大小适中10个左右菌落放到1mL含有Kanamycin(Kan)的LB液体培养基里，37℃250rpm培养1～2h，之后进行菌液PCR检测。电泳检测后，选择扩增有目的条带的一部分菌液送到生物公司进行测序，最终获得基因全长cDNA序列为1476bp，命名为PuMYC2基因。

所述PuMYC2基因经电泳后PCR产物条带大小和毛果杨条带大小相同，PuMYC2基因长度为1476bp，初步说明PCR结果正确，将PCR产物进行胶回收纯化，并连接到T载体上，将重组质粒转化大肠杆菌，涂布于加Kan的筛选平板上。随机挑选阳性菌落，PCR检验克隆条带如图1。

实施例2

PuMYC2转基因大青杨的获得

2.1过表达载体的构建

首先，根据pBI121-GFP载体多克隆位点和PuMYC2自身序列特点设计酶切位点引物。限制性内切酶选择是SalI和SpeI，引物如表3所示：

表3酶切引物序列

以实施例1得到的阳性菌落提取得到的重组质粒为模板进行PCR。

(1)PCR反应体系，如表4所示：

表4本发明中用于目的基因克隆的PCR反应体系

模板	100ng
		PuMYC2-Sal-F(10μM)	0.6μL
PuMYC2-Spe-R(10μM)	0.6μL
		2×PCRbufferforKOD	10μL
dNTPs(2mM)	4μL
		KODPolymerase	0.4μL
ddH<sub>2</sub>O	to20μL

反应程序：

95℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸90s，循环数35；68℃延伸7min，之后经过电泳、双酶切连接到pBI121-GFP载体，并转入大肠杆菌，经测序检测后，确定载体构建成功，命名为pBI121-PuMYC2-GFP。

2.2农杆菌介导的大青杨转基因株系株的获得

(1)通过液氮法将所构建的pBI121-PuMYC2-GFP过量表达载体转入农杆菌EHA105感受态细胞中，28℃培养2天。挑取单克隆农杆菌到5mL 50mg/L Kan和50mg/L Rif的LB液体中，28℃进行小摇，第二天将500μL小摇菌液加入30mL 50mg/L Kan的LB溶液中28℃继续摇菌。

(2)选取健壮的大青杨植株(生长3周，叶片翠绿)自上而下叶柄粗壮的第3、4片叶子做为转基因材料，尽可能将叶片的叶柄处完整剪下，用镊子夹着叶尖处放入WPM液体分化培养基中备用。

(3)当农杆菌菌液OD₆₀₀为0.7～1.0时，将菌液放入灭菌离心管4000rpm,室温离心5min，用WPM分化液体培养基进行等体积重悬，加入乙酰丁香酮(AS)，加入终浓度为100μM,作为侵染工程菌液。从已经选取好的大青杨叶片从WPM液体分化培养基中取出放在玻璃平皿中(平皿中需提前倒入一些液体防止叶片变干)，用刀片轻轻切断叶柄的头部，留下大约0.5-1.5cm的叶柄。同样的方式将叶片后半部叶子切下，只留包含叶柄在内占有整个叶片的三分之一部分，随即放入侵染工程菌液中，室温70rpm摇20min，侵染完成后，用灭菌的吸水纸轻轻吸取叶片表面水分，放在含有IBA，6-BA和TDZ的WPM分化培养基中黑暗条件下共培养2天。

(4)脱菌，共培养2d后的叶盘用100mL的无菌水洗3次，每次洗3min，期间重新换瓶换水，之后用100mL的加有Cefalexin(Cef)的WPM分化液体培养基(头孢终浓度为200mg/L)洗8次，每次6min，期间换瓶换水，脱菌过程中需要水平慢速转圈摇晃。完毕后用灭菌吸水纸轻轻将叶片表面的水吸干，转移至含有50mg/L Kanamycin、200mg/L Timentin和200mg/LCef的WPM固体分化培养基上，暗培养，约1-2周更换一次培养基。

(5)当叶柄位置膨大以后即可放在光下培养，将来源于同一块愈伤组织的植株视为一个独立转化系。当叶片上长出小芽后，将芽放到含有Kan,Tim和Cef的1/2MS固体培养基进行生根培养。然后在DNA和RNA水平上进行转基因检测，结果如图2所示。

将PuMYC2重组质粒的农杆菌转化到生长状态良好继代培养三周的野生型大青杨。约3周后，大青杨的叶柄处伤口逐渐出现抗性愈伤，将抗性愈伤继续置于WPM分化筛选培养基中继续培养，待各个转基因株系刚分化出芽时转入1/2MS生根培养，获得如图3所示的过表达转基因植株。

2.3转基因大青杨的PCR检测

(1)PuMYC2基因转基因大青杨基因组水平上的PCR鉴定

分别以野生型(WT)和转基因大青杨为材料，CTAB法提取大青杨基因组DNA。以pBI121-GFP空载体为阳性对照，以WT的总DNA为阴性对照，对筛选的转化植株进行PCR检测。检测所用的引物如表5。

表5检测用引物信息

DNA水平上的PCR，片段长度是PuMYC2基因加上GFP标签序列的前146bp，位置在1628bp，如图4所示。

(2)PuMYC2转基因大青杨RNA水平上的PCR鉴定

提取移栽的PuMYC2过表达株系的RNA反转录成cDNA，进行PuMYC2基因的表达量分析，以转基因和野生型大青杨的cDNA为模板，用PuACTIN基因为内参(SEQ ID NO.9～10)，结果见图5，过表达株系的PuMYC2基因的表达量均高于野生型对照。

实施例3

转基因大青杨调控不定根发生的表型观察

生长状态一致的野生型和PuMYC2过表达大青杨转基因株系MYC2-OE1、MYC2-OE3和MYC2-OE8微扦插到正常的1/2MS培养基中，3周后观察不观测不定根的数量，生根时间、生根率和不定根表型。每株系进行3次独立的实验，并且每次实验进行生物学重复60次。

对不定根数量进行统计，结果如图6所示，PuMYC2过表达植株不定根数量平均值为10根，WT不定根数量平均值为7根，说明PuMYC2过表达植株不定根数量多于野生型；在不定根形成时间上，PuMYC2过表达植株不定根发生时间最早，大约3d左右开始出现不定根，并且株系的生根率也高于野生型。

本发明提供了一种调控大青杨不定根发生的基因PuMYC2、检测引物、表达载体及其应用，将所述基因PuMYC2转导入大青杨植株后，PuMYC2过表达植株不定根数量平均值为10根，在不定根形成时间上，PuMYC2过表达植株大约3d左右开始出现不定根，并且株系的生根率也高于野生型。因此可将调控大青杨不定根发育的关键调节基因PuMYC2应用于林木基因工程领域和无性系林业领域。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 东北林业大学

<120> 一种调控大青杨不定根发生的基因、检测引物、表达载体及应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1476

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggaggaac tcattatttc tccatcttca tcatcttcac cggtctcctt atcccaagaa 60

accccaccga ctctccaaca aaggcttcaa ttcatagtcc aaaaccaacc agattggtgg 120

tcttatgcca tattttggca aacatcaaac gatgacagcg gccgaatctt cctaggctgg 180

ggtgatggcc attttcaagg ctctaaagat acttctccca aaccaaacac cttcagcaat 240

agccgcatga cgatatcaaa ctccgagagg aaaagggtca tgatgaaggg aatccaatcc 300

ctgatcggtg actgtcacga tcttgatatg tctctgatgg atggtaacga tgctaccgac 360

tctgagtggt tctatgtcat gtcccttact cgatctttct cacctggaga tggcatcctt 420

ggcaaagctt ataccactgg ttctttgatt tggttaactg gtggccatga acttcaattc 480

tacaactgtg aaagagtcaa agaagcacaa atgcatggca ttgagaccct ggtttgcata 540

cctacatcgt gtggggttct tgaattagga tcctcttctg tgatcagaga aaattggggt 600

cttgttcaac aagccaagtc tctttttggg tcagatctta gcgcttattt ggtgcccaaa 660

ggccctaata actcaagtga agaaccgacc cagtttcttg acaggagcat ttcttttgcg 720

gatatgggca taatagctgg acttcaagaa gattgtgcag ttgatcgtga acagaagaac 780

gctcatgaaa cagaagaagc aaataaacgt aacgctaata aaccaggcct gtcttatttg 840

aactcagagc attcagactc ggactttcct ctacttgcta tgcatatgga gaaaagaatt 900

ccaaagaaaa gagggagaaa gcctggcctg ggcagagacg ccccactgaa ccatgtagag 960

gctgagaggc agcggagaga gaagttgaac caccggtttt acgcgctgcg tgcggtggtc 1020

ccaaacgtgt ctagaatgga caaagcatca ctattatctg atgctgtatc ctacatcaat 1080

gaattgaagg cgaaggtcga tgaattggag tcacaactag aaagggaatc caagaaagtg 1140

aaattggaag ttgccgataa tttggacaat caaagcacca ccacttctgt ggaccaatca 1200

gcctgcaggc cgaatagtgc tggtggcgct gggcttgcac ttgaagttga gatcaagttt 1260

gtgggtaatg atgcaatgat tagagtccaa tcggagaatg tgagctatcc agcttccagg 1320

ttaatgtgtg cactccgtga actggagttt caggttcacc atgctagtat gtcctgtgtt 1380

aacgagctta tgctccaaga tgtggtagtt agggttcctg atggactgag aaccgaagag 1440

gccttgaaat ctgctcttct tggaagacta gaataa 1476

<210> 3

<211> 491

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Glu Glu Leu Ile Ile Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Pro Val Ser

1 5 10 15

Leu Ser Gln Glu Thr Pro Pro Thr Leu Gln Gln Arg Leu Gln Phe Ile

20 25 30

Val Gln Asn Gln Pro Asp Trp Trp Ser Tyr Ala Ile Phe Trp Gln Thr

35 40 45

Ser Asn Asp Asp Ser Gly Arg Ile Phe Leu Gly Trp Gly Asp Gly His

50 55 60

Phe Gln Gly Ser Lys Asp Thr Ser Pro Lys Pro Asn Thr Phe Ser Asn

65 70 75 80

Ser Arg Met Thr Ile Ser Asn Ser Glu Arg Lys Arg Val Met Met Lys

85 90 95

Gly Ile Gln Ser Leu Ile Gly Asp Cys His Asp Leu Asp Met Ser Leu

100 105 110

Met Asp Gly Asn Asp Ala Thr Asp Ser Glu Trp Phe Tyr Val Met Ser

115 120 125

Leu Thr Arg Ser Phe Ser Pro Gly Asp Gly Ile Leu Gly Lys Ala Tyr

130 135 140

Thr Thr Gly Ser Leu Ile Trp Leu Thr Gly Gly His Glu Leu Gln Phe

145 150 155 160

Tyr Asn Cys Glu Arg Val Lys Glu Ala Gln Met His Gly Ile Glu Thr

165 170 175

Leu Val Cys Ile Pro Thr Ser Cys Gly Val Leu Glu Leu Gly Ser Ser

180 185 190

Ser Val Ile Arg Glu Asn Trp Gly Leu Val Gln Gln Ala Lys Ser Leu

195 200 205

Phe Gly Ser Asp Leu Ser Ala Tyr Leu Val Pro Lys Gly Pro Asn Asn

210 215 220

Ser Ser Glu Glu Pro Thr Gln Phe Leu Asp Arg Ser Ile Ser Phe Ala

225 230 235 240

Asp Met Gly Ile Ile Ala Gly Leu Gln Glu Asp Cys Ala Val Asp Arg

245 250 255

Glu Gln Lys Asn Ala His Glu Thr Glu Glu Ala Asn Lys Arg Asn Ala

260 265 270

Asn Lys Pro Gly Leu Ser Tyr Leu Asn Ser Glu His Ser Asp Ser Asp

275 280 285

Phe Pro Leu Leu Ala Met His Met Glu Lys Arg Ile Pro Lys Lys Arg

290 295 300

Gly Arg Lys Pro Gly Leu Gly Arg Asp Ala Pro Leu Asn His Val Glu

305 310 315 320

Ala Glu Arg Gln Arg Arg Glu Lys Leu Asn His Arg Phe Tyr Ala Leu

325 330 335

Arg Ala Val Val Pro Asn Val Ser Arg Met Asp Lys Ala Ser Leu Leu

340 345 350

Ser Asp Ala Val Ser Tyr Ile Asn Glu Leu Lys Ala Lys Val Asp Glu

355 360 365

Leu Glu Ser Gln Leu Glu Arg Glu Ser Lys Lys Val Lys Leu Glu Val

370 375 380

Ala Asp Asn Leu Asp Asn Gln Ser Thr Thr Thr Ser Val Asp Gln Ser

385 390 395 400

Ala Cys Arg Pro Asn Ser Ala Gly Gly Ala Gly Leu Ala Leu Glu Val

405 410 415

Glu Ile Lys Phe Val Gly Asn Asp Ala Met Ile Arg Val Gln Ser Glu

420 425 430

Asn Val Ser Tyr Pro Ala Ser Arg Leu Met Cys Ala Leu Arg Glu Leu

435 440 445

Glu Phe Gln Val His His Ala Ser Met Ser Cys Val Asn Glu Leu Met

450 455 460

Leu Gln Asp Val Val Val Arg Val Pro Asp Gly Leu Arg Thr Glu Glu

465 470 475 480

Ala Leu Lys Ser Ala Leu Leu Gly Arg Leu Glu

485 490

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcggcgcag ctgatagaat 20

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acacttttag ggtcaagatt ccagt 25

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgtcgacat ggaggaactc attatttctc c 31

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcactagttt ctagtcttcc aagaagagca g 31

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggaggaac tcattatttc tcc 23

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagatgaact tcagggtcag c 21

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agggtatgcc cttccacat 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcaagggcaa catatgcaag 20

Claims

1.一种调控大青杨不定根发生的基因PuMYC2，其特征在于，所述基因PuMYC2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述基因PuMYC2的表达蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种克隆权利要求1所述基因PuMYC2的引物组，其特征在于，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

3.一种包含权利要求1所述基因PuMYC2的表达载体，其特征在于，所述表达载体的基础载体包括pBI121-GFP载体。

4.权利要求1所述基因PuMYC2或权利要求2所述引物组或权利要求3所述表达载体在调控大青杨不定根发生中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述调控大青杨不定根发生的方法，包括以下步骤：(1)克隆所述基因PuMYC2；

(2)双酶切所述基因PuMYC2和基础载体，构建表达载体；

(4)将所述愈伤组织经分化和生根培养后，得转基因苗。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，步骤(1)所述克隆的程序为：95℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火30s，68℃延伸90s，循环数为35；68℃延伸7min。

7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，步骤(2)所述双酶切时所用的酶为SalI和SpeI。

8.根据权利要求5所述应用，其特征在于，步骤(3)所述大青杨的叶片组织选自生长3周的大青杨植株自上而下的第3和/或第4片叶片。

9.根据权利要求5所述应用，其特征在于，得步骤(4)所述转基因苗后，还包括从DNA和RNA水平上进行转基因检测。