CN102048025B - 木聚糖酶联合多菌种的复合发酵剂及发酵秸秆饲料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种木聚糖酶联合多菌种的复合发酵剂及发酵秸秆饲料的方法。它是由木聚糖酶4份；嗜酸乳杆菌2份；丙酸菌2份；酿酒酵母2份；枯草芽孢杆菌3份；植物乳杆菌1份；凝结芽孢杆菌1份组成。其中的木聚糖酶能迅速降解秸秆植物的细胞壁，释放营养物质，协同作用多种微生物，加快发酵速度，缩短发酵周期，增强发酵活性，提高蛋白转化率，降低发酵成本。制备的发酵秸秆饲料纤维素含量低，蛋白含量高，活菌数高，保存期长，感官柔软湿润，酸香浓郁，适口性好，营养价值高。本发明解决了秸秆等农作物资源利用率低的问题，同时减少了环境污染，具有重大的经济效益和社会效益。

Description

木聚糖酶联合多菌种的复合发酵剂及发酵秸秆饲料的方法

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，涉及一种用于发酵秸秆饲料的复合发酵剂，以及应用木聚糖酶联合多菌种发酵制备秸秆饲料的新方法。

背景技术

目前，人类正面临着资源匮乏、能源短缺和环境污染等全球性问题，许多国家都在积极探索和深入研究新能源，而生物质能源一直是人类赖以生存的重要能源，在整个能源***中占有相当重要的地位。我国是一个农业大国，农作物秸秆资源十分丰富，年产量达5.560亿吨。农作物秸秆中大约有65％～80％的干物质能够向动物提供能量，而目前用作饲料的不足10％，绝大部分农作物秸秆仍直接还田或作燃料用，既造成资源浪费，又污染环境。

秸秆是由大量的有机物和少量的矿物质及水构成，其有机物的主要成分为碳水化合物，此外还有少量的粗蛋白质和粗脂肪，但品质较差。碳水化合物由纤维性物质和可溶性物质构成，前者包括半纤维素、纤维素和木质素等，秸秆中很少含有维生素。

秸秆作为饲料由于其粗纤维含量高，蛋白质、矿物质含量低，畜禽消化率低，适口性差，从而限制了它的应用。秸秆的细胞壁非常坚实牢固，细胞壁的结构高度木质化，且细胞壁构成秸秆干物质的80％，而易被家畜利用的可溶性碳水化合物、蛋白质、矿物质和胡萝卜素极少。秸秆细胞壁成为影响其利用的最主要的因素。

近几十年来，国内外一直在寻找降解植物秸秆的最佳途径，微生物发酵是目前采用较多的方法。微生物发酵秸秆饲料是利用高活力微生物菌剂，主要有霉菌、酵母菌及细菌的一些类群，其一是利用霉菌分泌的多种酶类，同时将秸秆中的纤维类物质、淀粉及果胶等转化为各种糖类；二是利用酵母菌和乳酸类细菌将秸秆的某些成分进一步合成营养价值较高或适口性较好的物质，如蛋白质、氨基酸、维生素、有机酸、未知生长因子等。但微生物发酵秸秆面临三大困难，一是秸秆发酵一般需利用十几种微生物共同作用，菌种数量多，彼此间协同作用很难达到预期效果，发酵剂成本过高；二是难以选育适合于秸秆基质发酵纤维素酶类产量仍然高的菌种，一旦纤维素类酶产量低就会影响其他微生物不能达到其最佳发酵效果；三是必须解决秸秆发酵过程中降解终产物对纤维素类酶的合成及其活性产生反馈抑制的问题。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种用于发酵秸秆饲料的复合发酵剂。该复合发酵剂总数≥10⁸cfu/g。

本发明的另一个目的在于提供用于发酵秸秆饲料的复合发酵剂菌粉的制备方法。

本发明还一个目的在于提供一种应用木聚糖酶联合多菌种发酵制备秸秆饲料的新方法。

为实现上述目的本发明提供如下的技术方案：

一种木聚糖酶联合多菌种的复合发酵剂，其特征在于它是木聚糖酶和多菌种联合组成，其各菌粉的重量份数如下：

木聚糖酶3-5份；嗜酸乳杆菌1-2份；丙酸菌1-2份；酿酒酵母2-3份；枯草芽孢杆菌3-4份；植物乳杆菌1-2份；凝结芽孢杆菌1-2份；

其中各组分的活菌含量分别为：木聚糖酶3000IU/g；嗜酸乳杆菌6.2*10⁷cfu/g，丙酸菌2.2*10⁸cfu/g，酿酒酵母1.9*10⁸cfu/g，枯草芽孢杆菌1.4*10¹²cfu/g，植物乳杆菌5.0*10⁸cfu/g，凝结芽孢杆菌5.5*10¹¹cfu/g，复合发酵剂活力总数≥10⁸cfu/g。

本发明所述的菌粉按下步骤进行：斜面菌种→液体种子培养→种子罐发酵→发酵罐发酵→离心分离菌体细胞→真空冷冻干燥→固体菌粉产品；其中各发酵液经管式离心机分离，收集菌泥，采用5％糊***溶液与菌泥混合均匀，真空冷冻干燥，得到固体菌粉。

本发明进一步公开了用于发酵秸秆饲料复合发酵剂的制备方法，它是按以下的步骤进行：

(1)选择地下水位低，地势较高、平坦，排水条件良好，靠近畜舍的地方建窖；高度为1-2米；

(2)在30℃下，将六种菌粉用浓度为5％蔗糖水活化2h，再将固体木聚糖酶粉3-5份，食盐1-2份和玉米粉10％混合其中，拌匀后将其均匀的喷洒在铡成2～4厘米的秸秆上，边喷洒边拌匀；

(3)干农作物秸秆与水的比例为1∶1～1.2，使秸秆中的水分保持在60％～70％；

(4)将拌好的秸秆分层装窖，装窖后充分踩实压紧，秸秆装满后用塑料薄膜封窖，从后向前堆放40～50厘米的厚土压实，四周再用土封严；

(5)发酵秸秆饲料经过7～10天即可在25℃开窖。

本发明采用由木聚糖酶和6株微生物菌种(包括2株产酸菌，1株产酶菌，1株蛋白生产菌，2株抗病保健益生菌)联合发酵制备秸秆饲料。固态发酵生产的木聚糖酶，发酵成品中往往含有其它非淀粉多糖酶(纤维素酶、葡聚糖酶、果胶酶和甘露聚糖酶等)，利用木聚糖酶系迅速降解细胞壁，大量释放细胞壁内的许多可消化营养物质(蛋白质、淀粉等)，同时将农作物秸秆中的大分子化合物降解为小分子的葡萄糖、单糖，从而为其他微生物提供碳源和能量，迅速将其转化为菌体蛋白。由此开发出一种活力稳定，活性高、发酵周期短，制备的发酵秸秆饲料保存期长，纤维素降解率高，柔软湿润，酸香浓郁，适口性好，营养价值高，成本低的新方法。

该发明首先突出木聚糖酶类能迅速降解细胞壁，大量释放细胞壁内的许多可消化营养物质(蛋白质、淀粉等)的特性，将农作物秸秆中的大分子化合物降解为小分子的葡萄糖、单糖，此时在多种微生物参与协同作用下，可加快将其转化为菌体蛋白，使得制备的发酵秸秆饲料保存期长，纤维素降解率高，柔软湿润，酸香浓郁，适口性好，营养价值高。

木聚糖是植物半纤维素的重要组分，在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，约占细胞干重的35％。木聚糖是一种高度异构的杂聚糖，很难被分解，秸秆中大部分木聚糖未被有效利用，造成了极大的资源浪费和环境污染。木聚糖酶能够降解木聚糖生成聚合度为2～10的低聚木糖混合物，产物具有很高的经济价值。

本发明所采用的木聚糖酶是由黑曲霉固态机械发酵获得，解决了固体发酵劳动强度大、易染菌、生产效率低等缺陷；同时具有投资少、成本低、无环境污染等优点，已实现了工业化大生产，木聚糖酶发酵酶活力在3000IU/g以上的粗酶制剂，富含纤维素酶，活性稳定，成本低，活力在30001U/g以上。菌株所产酶系全，适合于饲料用酶。该菌株所产木聚糖酶具有以下几个特点：

(1)除了产木聚糖酶外，还产酸性蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶和淀粉酶等酶类，各酶种在使用过程中起到协同作用的效果。

(2)固体法生产木聚糖酶活力高(3000IU/g)。发酵成熟曲烘干后可直接使用，不需提取，成本很低。

(3)所产酸性木聚糖酶热稳定性、pH稳定性较好。

本发明应用与秸秆饲料发酵的四大类菌种(六菌株)及其主要代谢产物和功能。

(1)产酸菌

嗜酸乳杆菌、费氏丙酸菌，产酸菌加入的目的有以下几方面：一是为了改善饲料口味，增强适口性，如乳酸；二是有机酸的产生，可以抑制杂菌生长，防止饲料腐败变质，延长保存时间；三是有机酸可以降低肠道内的pH值，促进胃肠蠕动，减缓胃肠排空速度，使营养物质有充分的消化时间，并且可以促进胰液、胆汁分泌，更有利于营养物质的消化吸收。乳酸能够抑制肠道内的疾病，如下痢、消化不良等，并能抑制病原菌、腐败菌的生长，具有较强的保健功效，其它有机酸大多不同程度上具有一定的保健作用，挥发性脂肪酸是反刍动物的主要能源，约占总能量的60％～70％，同时挥发性脂肪酸也是动物葡萄糖代谢的主要前体物质，这些物质的存在，能在一定程度上促进生物新陈代谢，促进生长发育。

(2)产酶菌

枯草芽孢杆菌可以产生动物所需的各种酶类，包括淀粉酶、蛋白酶、果胶酶等等，能够将饲料中的大分子物质如淀粉、蛋白质等降解为动物易于消化吸收的糖、氨基酸等，并能有效地促进各种营养物质的消化吸收。

(3)抗病保健益生菌

凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌，这两株菌能够在动物肠道内存活并繁殖，能给有益菌造成合适的微环境，增强免疫力，芽孢杆菌能够产生脂肪酸和蛋白多肽类拮抗物质，能有效拮抗肠道内的病原菌的繁殖，维持和调节肠道微环境的平衡，对生物生长发育有较大的作用，同时，饲用芽孢杆菌可以促进动物肠道结构和机能成熟，可以促进肠道粘膜皱壁增多，绒衣加长，吸收面积增大。有实验表明，芽孢杆菌还可以促进动物对糖原的利用和促进动物糖代谢，并能促进动物对无机盐和维生素的吸收，具有很强的保健作用。

(4)提高有机蛋白的菌株

为了给秸秆饲料增加蛋白质含量，我们选育了一株酿酒酵母。该菌能很好地利用无机氮，合成有机蛋白质。该菌的生长繁殖大大地增加了秸秆饲料的有机蛋白含量，改善了秸秆饲料的品质，增加饲料的适口性，提高牲畜进食速度和进食量，中和部分产酸菌产生的有机酸，并产生乙酸乙酯，己酸乙酯等香味物质，增加牲畜食欲。本发明更加详细的技术方案如下：

本发明利用的木聚糖酶Aspergillus niger采用的生产工艺如下：

(1)斜面菌种培养：

黑曲霉菌种使用斜面培养基(g/L)：土豆200，葡萄糖20，磷酸氢二钾3，七水硫酸镁1.5，pH自然，并加入1.5～2.5％琼脂，接种量5～10％，在28-30℃条件下静止培养20～48小时，放入4℃冰箱保存。

(2)摇瓶二级扩大培养：

黑曲霉菌种于500毫升三角瓶摇床振荡培养，温度28～30℃，转速180～250转/分钟，接种量1～3％，培养48～60h。摇瓶放大培养培养基(g/L)：半纤维素15～20，NH₄NO ₃2～4，酵母粉2～4，KCL0.4～0.6，K₂HPO₄0.5～1.5，FeSO₄0.01～0.03，MgSO₄·7H₂O0.3～0.6，CoCL₂0.01～0.03，吐温0.5～1.5，pH5.5。

按上述培养基成份配比物料分装入三角瓶中，每瓶100毫升，然后置于高压灭菌锅中，121℃，灭菌20分钟，自然冷却后接种黑曲霉菌种。

(3)种子罐放大培养：

黑曲霉菌种于种子罐中增殖培养，发酵罐内温度28～30℃，通风量9～13m³/h，发酵罐压0.02～0.09Mpa，接种量1～3％，时间60～72小时。种子罐放大培养基(g/L)：半纤维素20～30，NH₄NO ₃2～4，玉米浆2～4，KCL0.4～0.6，K₂HPO₄0.5～1.5，FeSO₄0.01～0.03，MgSO₄·7H₂O0.3～0.6，CoCL₂0.01～0.03，吐温0.5～1.5，pH 5.5。

按上述培养基成份配比物料装入种子罐中，经三个大气压121℃灭菌45分钟，使其自然冷却后接种黑曲霉菌种。

(4)物料混合、物料蒸煮灭菌、无菌输料：

固体发酵罐所用的培养基(g/Kg)：玉米芯粉(过20目筛)300～350，麸皮120～140，玉米浆4～6，NH₄NO₃2～4，K₂HPO₄3～5，MgSO₄·7H₂O0.4～0.6，水800～1000，pH 5.0，将固态发酵原料中各成份在蒸球中混合均匀，经三个大气压121℃，灭菌60分钟；将种子罐中将黑曲霉均匀喷洒接种于固态发酵原料中，无菌传送到固态发酵罐中发酵。

(5)固体发酵罐发酵：

发酵罐内温度28～30℃，发酵原料含水量控制：60～70％，空气湿度控制75％～85％，通风量8～12m³/h，固态发酵罐罐压0.01～0.02Mpa，接种量5～10％，发酵时间72～96小时。

(6)浸提：将已固态发酵三～四天的固体发酵物料取出，倾入浸提槽中，加入一定量的水，固体发酵物料∶水＝1∶9(重量/体积比)，进行约3小时的浸提。

(7)过滤：浸提后，上层清液先排放出来，剩余固体进行压榨。将浸提上层清液及压榨液经过板框式过滤机进行过滤。经过板框过滤的过滤液经过线绕式过滤机进行过滤，所得滤液放于储罐中。

(8)膜浓缩：将储罐中滤液进行超滤膜浓缩，超滤压力小于0.1Mpa，浓缩时间3小时/6吨滤液，每批滤液被浓缩成300～400升。

(9)添加载体：向浓缩酶液中加入淀粉作为载体，使其在浓缩酶液中的终浓度达到10％，并于匀浆中充分搅拌混匀。

(10)微颗粒干燥：将已加入淀粉载体的浓缩酶液经过高速离心喷雾干燥机进行喷雾干燥制成木聚糖酶。此时的产品为固体木聚糖酶，除了含有木聚糖酶外，还含有酸性蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶和淀粉酶等酶类，各酶种在秸秆发酵过程中起到协同作用的效果。固体木聚糖酶测定指标如下：

(1)产品酶活力木聚糖酶活力3000IU/g，纤维素酶活力280IU/g。

(2)感官指标：产品为黄色粉剂，色泽均一。

(3)理化指标：制剂能通过3号标准筛；水分：含水量低于8％。

(4)卫生指标：固体酶制剂每克细菌总数小于1万个。本发明利用的各种微生物菌粉采用的生产工艺如下：

多种微生物使用的培养基如下：

(1)嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus

斜面培养基(g/L)：牛肉膏10，蛋白胨10，葡萄糖10，酵母膏5，磷酸氢二钾2，乙酸钠5，柠檬酸二铵2，硫酸镁2，奶粉10，琼脂20，pH值6.0～6.5。

种子培养基(g/L)：牛肉膏10，蛋白胨10，葡萄糖10，酵母膏5，磷酸氢二钾2，乙酸钠5，柠檬酸二铵2，硫酸镁2，奶粉10，pH值6.0～6.5。

发酵培养基(g/L)：牛肉膏10，蛋白胨15，葡萄糖15，酵母膏10，Tween801，乳糖6，磷酸氢二钾2，乙酸钠5，柠檬酸二铵2，硫酸镁2，硫酸锰50ppm，奶粉10，pH值6.0～6.5。

(2)丙酸菌Propionibacterium acidipropionici

斜面培养基(g/L)：蛋白胨5，酵母膏5，蔗糖10，琼脂20，pH值7.2～7.4。

种子培养基(g/L)：蛋白胨5，酵母膏5，蔗糖10，磷酸铵5，pH值7.2～7.4。

发酵培养基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨8，酵母膏2，蔗糖20，氯化钠5，pH值7.4。

(3)枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis

斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠5，琼脂20，pH值为7.2。

种子培养基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，氯化钠5，pH值为7.2。

发酵培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠7，pH值7.4。

(4)酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae

斜面培养基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20，琼脂20，pH值7.2～7.4。

种子培养基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20，pH值7.2～7.4。

发酵培养基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨8，酵母粉3，葡萄糖40，磷酸铵6，硫酸铵6，七水合硫酸镁1.1，pH值7.4。

(5)凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans

斜面培养基(g/L)：蛋白胨20.0，酵母膏3.0，葡萄糖2.0，琼脂2.0，用麸皮水定容至1L，pH 7.0～7.2。

种子培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏10.0，葡萄糖6.0，七水合硫酸镁0.5，CaCO310.0，pH7.2～7.4。

发酵培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏10.0，葡萄糖6.0，七水合硫酸镁1.0，磷酸氢二钾2.0，硫酸锰50ppm，pH 7.0。

(6)植物乳杆菌Lactobacillus acidophilus

斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠5，琼脂20，pH值为7.2。

种子培养基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，氯化钠5，pH值为7.4。

发酵培养基(g/L)：牛肉膏6，蛋白胨12，葡萄糖8，氯化钠4，pH值为7。

各种微生物具体发酵工艺如下：

(1)菌种斜面培养：

嗜酸乳杆菌：吸取1ml菌液，转接到装有10ml 10％牛奶的奶管里，37℃，静止培养8h。

除嗜酸乳杆菌之外，其余相同：取一环菌泥在斜面上划线接种，于30℃下培养24h。

(2)液体种子培养：

嗜酸乳杆菌：以5％的接种量将种子接入装有115ml的发酵培养基的135ml具胶塞瓶中，37℃静止培养24h。

丙酸菌：以5％～10％的接种量将种子接入装有115ml的发酵培养基的135ml三角具胶塞瓶中，30℃静止培养24h

除嗜酸乳杆菌和丙酸菌之外，其余相同：以5％～10％的接种量将种子接入装有40ml的发酵培养基的250ml的三角瓶中，30℃140r/min培养24h。

(3)菌种5L自动发酵罐种子培养：

嗜酸乳杆菌和丙酸菌采用静止培养，每隔2h搅拌一次，每次5min，转速为600r/min。

嗜酸乳杆菌和丙酸菌之外，其余相同：按发酵罐工作体积的5％接入种子，发酵期间主要控制参数如下：①溶氧：1∶0.5～1，150～250r/min；②温度30℃；③pH7.0；

(4)菌种100L和2000L自动发酵罐培养：

嗜酸乳杆菌和丙酸菌采用静止培养，每隔2h搅拌一次，每次5min，转速为600r/min。

除嗜酸乳杆菌和丙酸菌之外，其余相同：按发酵罐工作体积的5％～10％接入种子，发酵期间主要控制参数如下：①溶氧：由空气流速及转数调节1∶0.5～1，150～250r/min；②温度30℃；③pH7.0；

发酵剂菌粉的制备工艺

各发酵液经管式离心机分离，收集菌泥，采用5％糊***溶液与菌泥混合均匀，准备真空冷冻干燥。提前打开真空泵和冷却泵，等冷却室的温度降到-45℃以下后，打开冷却室和真空室的阀门，保持连通状态。当两室温度恒定在-45℃以下后，给冷却室的加热板供电，以缓慢加热已经凝固成固态的菌泥。

本发明更加详细的采用复合发酵剂发酵制备秸秆饲料的方法如下：

选择地下水位低，地势较高、平坦，排水条件良好，靠近畜舍的地方建窖。窖的形状有长方形、正方形和圆形，出入口为斜坡。高度一般为2米。窖底壁用砖、石砂和水泥砌成，窖的周围要挖排水沟。秸秆铡成2～4厘米。提前把六种菌粉用适量的(30℃)蔗糖水(其浓度小于5％)活化2h，然后将固体木聚糖酶粉、少量食盐和玉米粉混合其中，拌匀后将其均匀的喷洒在秸秆上，边喷洒边拌匀。干农作物秸秆与水的比例为1∶1～1.2，半干秸秆要根据原秸秆中水分含量加水。秸秆中含水量的确定方法是抓一把秸秆在手中用力捏，能挤出水但没有水滴流出为宜，使秸秆中的水分保持在60％～70％。将拌好的秸秆分层装窖，装窖后要充分踩实压紧，要特别注意靠近窖壁和角落处不能留空隙。秸秆装满后用塑料薄膜封窖，从后向前堆放40～50厘米的厚土压实，四周再用土封严。发酵秸秆饲料经过7～10天即可开窖(25℃)，取料利用后要将窖重新密封，不可全部打开，防止发霉或二次发酵。

采用本发明所制得的复合发酵剂发酵秸秆饲料的实验效果如下：

(1)发酵后秸秆饲料的性状：

饲料发酵成熟后，外观呈黄褐色，握在手中质地柔软而湿润，不沾手，用力捏没有汁液流淌，松手后捏成的饲料团容易分离，散发出具有芳香酒酸味。粗蛋白含量由发酵前干秸秆的6.11％提高到7.89％，增加了1.78％；粗纤维含量由发酵前干秸秆的33.7％降低到22.8％，降低了10.9％；饲料中有机酸含量达到2.45％，pH由发酵前的7.0降低到3.8；制备而成的秸秆饲料，活菌总数≥10⁸cfu/g。秸秆发酵周期短7～10天，开窖后二次发酵几率降低，保存期超过一周。

(2)秸秆饲料饲喂奶牛效果

秸秆发酵后，饲料没有霉变并产生一定的酸香气味，成为牲畜喜食的秸秆饲料。发酵饲料被牲畜食用后，可使胃内pH值下降，从而激活胃蛋白酶原转化为胃蛋白酶，促进蛋白质的分解，降低胃肠蠕动，减缓排空时间，从而提高消化吸收率。同时秸秆发酵后，饲料中的大分子物质如淀粉、蛋白质等降解为动物易于消化吸收的糖、氨基酸等，有效地促进奶牛对各种营养物质的消化吸收。

下面结合试验进一步说明本发明的复合发酵剂在提高秸秆饲料发酵速度，增加发酵活性方面的应用：

其中对照组为：单一微生物法发酵秸秆；

实验组为：木聚糖酶联合微生物发酵秸秆；

表1

	发酵周期	保存期	活菌总数
				对照组	10-15天	5-7天	≥107cfu/g
试验组	7-10天	7-10天	≥108cfu/g

本发明所提供的采用木聚糖酶联合多菌种发酵制备秸秆饲料的方法与现有技术相比具有如下的特点：

1.以往秸秆饲料化的多采用单一的微生物处理技术，本发明特点之一在于使用酶与微生物菌种联合制备的新工艺，缩短秸秆发酵周期，发酵剂组分少，生产成本低，加快秸秆饲料的产业化进程。

2.该发明的又一特点是采用由木聚糖酶和6株微生物菌种组成(包括2株产酸菌，1株产酶菌，1株蛋白生产菌，2株抗病保健益生菌)的新型发酵剂制备秸秆饲料。首先突出木聚糖酶能迅速降解细胞壁，大量释放细胞壁内的许多可消化营养物质(蛋白质、淀粉等)的特性，将农作物秸秆中的大分子化合物降解为小分子的葡萄糖、单糖，此时在多种微生物参与协同作用下，可加快将其转化为菌体蛋白，解决秸秆发酵过程中降解终产物对纤维素类酶的合成产生反馈抑制的问题，使得制备的发酵秸秆饲料保存期长，纤维素降解率高，柔软湿润，酸香浓郁，适口性好，营养价值高。

3.木聚糖酶由黑曲霉固态机械发酵获得，活力在3000IU/g以上的粗酶制剂，活性稳定，生产成本低，粗酶制剂除了含有木聚糖酶外，还含有酸性蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶和淀粉酶等酶类，各酶种在使用过程中起到协同作用的效果。

4.秸秆经发酵后，粗纤维降低7.1～9.2％。酶联合微生物制备的秸秆饲料，活菌总数≥10⁸cfu/g，达到降低二次发酵机率，保存期超过一周的效果。

具体实施方式

以下结合较佳实施例，对本发明做进一步的描述，特别加以说明的是各菌株来源：

嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，编号IFFI06005；丙酸菌Propionibacterium acidipropionici，编号IFFI.10019；酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，编号AS2.1151；枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，编号AS1.1229；植物乳杆菌Lactobacillus acidophilus，编号AS1557；凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans，编号IFFI10067。

实施例1

1、生产固体木聚糖酶

菌种培养：以黑曲霉(Aspergillus niger)为生产菌种采用试管斜面菌种→摇瓶放大培养方法。

固态机械发酵：由种子罐放大培养，固态机械发酵罐二级发酵，控制罐内温度28～30℃，发酵原料含水量控制：60～70％，空气湿度控制75％～85％，通风量8～12m³/h，罐压0.01～0.02Mpa，接种量5～10％，发酵时间72～96小时；固体发酵罐所用的培养基(g/Kg)：玉米芯粉(过20目筛)300～350克，麸皮120～140克，玉米浆4～6克，NH₄NO ₃2～4克，K₂HPO₄3～5克，MgSO₄·7H₂O0.4～0.6克，水800～1000毫升，pH 5.0，经三个大气压121℃，灭菌60分钟。

提纯：将固体发酵物料加入一定量水浸提、经压榨、超滤膜浓缩、加入载体、微颗粒干燥、制成固体酶制剂。

2、生产多种微生物菌粉

斜面菌种→液体种子培养→种子罐发酵→发酵罐发酵→离心分离菌体细胞→真空冷冻干燥→固体菌粉产品

(1)菌种斜面培养：

嗜酸乳杆菌：吸取1ml菌液，转接到装有10ml 10％牛奶的奶管里，37℃，静止培养8h。

除嗜酸乳杆菌之外，其余相同：取一环菌泥在斜面上划线接种，于30℃下培养24h。

(2)液体种子培养：

嗜酸乳杆菌：以5％的接种量将种子接入装有115ml的发酵培养基的135ml具胶塞瓶中，37℃静止培养24h。

丙酸菌：以5％～10％的接种量将种子接入装有115ml的发酵培养基的135ml三角具胶塞瓶中，30℃静止培养24h

除嗜酸乳杆菌和丙酸菌之外，其余相同：以5％～10％的接种量将种子接入装有40ml的发酵培养基的250ml的三角瓶中，30℃140r/min培养24h。

(3)菌种5L自动发酵罐种子培养：

嗜酸乳杆菌和丙酸菌采用静止培养，每隔2h搅拌一次，每次5min，转速为600r/min。

嗜酸乳杆菌和丙酸菌之外，其余相同：按发酵罐工作体积的5％接入种子，发酵期间主要控制参数如下：①溶氧：1∶0.5～1，150～250r/min；②温度30℃；③pH7.0；

(4)菌种100L和2000L自动发酵罐培养：

嗜酸乳杆菌和丙酸菌采用静止培养，每隔2h搅拌一次，每次5min，转速为600r/min。

除嗜酸乳杆菌和丙酸菌之外，其余相同：按发酵罐工作体积的5％～10％接入种子，发酵期间主要控制参数如下：①溶氧：1∶0.5～1，150～250r/min；②温度30℃；③pH7.0；

3、配比固体木聚糖酶和各种微生物菌粉

组成之一：木聚糖酶4份；嗜酸乳杆菌2份；丙酸菌2份；酿酒酵母2份；枯草芽孢杆菌3份；植物乳杆菌1份；凝结芽孢杆菌1份。

组成之二：木聚糖酶5份；嗜酸乳杆菌1份；丙酸菌2份；酿酒酵母3份；枯草芽孢杆菌3份；植物乳杆菌1份；凝结芽孢杆菌2份。

组成之三：木聚糖酶3份；嗜酸乳杆菌1份；丙酸菌2份；酿酒酵母3份；枯草芽孢杆菌3份；植物乳杆菌1份；凝结芽孢杆菌1份；

其中各组分的活菌含量分别为：木聚糖酶3000IU/g；嗜酸乳杆菌6.2*10⁷cfu/g，丙酸菌2.2*10⁸cfu/g，酿酒酵母1.9*10⁸cfu/g，枯草芽孢杆菌1.4*10¹²cfu/g，植物乳杆菌5.0*10⁸cfu/g，凝结芽孢杆菌5.5*10¹¹cfu/g，复合发酵剂活力总数≥10⁸cfu/g。

发酵剂菌粉的制备工艺

各发酵液经管式离心机分离，收集菌泥，采用5％糊***溶液与菌泥混合均匀，准备真空冷冻干燥。提前打开真空泵和冷却泵，等冷却室的温度降到-45℃以下后，打开冷却室和真空室的阀门，保持连通状态。当两室温度恒定在-45℃以下后，给冷却室的加热板供电，以缓慢加热已经凝固成固态的菌泥。

4、发酵制备秸秆饲料：

选择地下水位低，地势较高、平坦，排水条件良好，靠近畜舍的地方建窖。窖的形状有长方形、正方形和圆形，出入口为斜坡。高度一般为2米。窖底壁用砖、石砂和水泥砌成，窖的周围要挖排水沟。秸秆铡成2～4厘米。提前把六种菌粉用适量的(30℃)蔗糖水(其浓度小于5％)活化2h，然后将固体木聚糖酶粉、少量食盐和玉米粉混合其中，拌匀后将其均匀的喷洒在秸秆上，边喷洒边拌匀。干农作物秸秆与水的比例为1∶1～1.2，半干秸秆要根据原秸秆中水分含量加水。秸秆中含水量的确定方法是抓一把秸秆在手中用力捏，能挤出水但没有水滴流出为宜，使秸秆中的水分保持在60％～70％。将拌好的秸秆分层装窖，装窖后要充分踩实压紧，要特别注意靠近窖壁和角落处不能留空隙。秸秆装满后用塑料薄膜封窖，从后向前堆放40～50厘米的厚土压实，四周再用土封严。发酵秸秆饲料经过7～10天即可开窖(25℃)，取料利用后要将窖重新密封，不可全部打开，防止发霉或二次发酵。

5、测定发酵秸秆性状

粗蛋白含量由发酵前干秸秆的4.11％提高到7.89％，增加了3.78％；粗纤维含量由发酵前干秸秆的36.7％降低到22.8％，降低了13.9％；饲料中有机酸含量达到2.45％，pH由发酵前的7.0降低到3.8；制备而成的秸秆饲料，活菌总数≥10⁸cfu/g。秸秆发酵周期短7～10天，开窖后二次发酵几率降低，保存期超过一周。

6、秸秆饲料饲喂奶牛效果

秸秆发酵后，饲料没有霉变并产生一定的酸香气味，成为牲畜喜食的秸秆饲料。发酵饲料被牲畜食用后，可使胃内pH值下降，从而激活胃蛋白酶原转化为胃蛋白酶，促进蛋白质的分解，降低胃肠蠕动，减缓排空时间，从而提高消化吸收率。同时秸秆发酵后，饲料中的大分子物质如淀粉、蛋白质等降解为动物易于消化吸收的糖、氨基酸等，有效地促进奶牛对各种营养物质的消化吸收。

其中的对照组为饲喂鲜秸秆的泌乳牛；其中的实验组为饲喂发酵秸秆后三天的泌乳牛；实验动物为泌乳期奶牛。

表2

	头均日产奶量/kg	乳脂率/％	乳蛋白/％	全乳固体/％
					对照组	17.92	3.63	2.90	12.04
试验组	19.07	4.39	3.42	12.39

结论：

发酵饲料被牲畜食用后，可使胃内pH值下降，从而激活胃蛋白酶原转化为胃蛋白酶，促进蛋白质的分解，降低胃肠蠕动，减缓排空时间，从而提高消化吸收率。同时秸秆发酵后，饲料中的大分子物质如淀粉、蛋白质等降解为动物易于消化吸收的糖、氨基酸等，有效地促进奶牛对各种营养物质的消化吸收。

Claims (4)

1.木聚糖酶联合多菌种的复合发酵剂，其特征在于它是由重量份数为3-5份木聚糖酶和多菌种联合组成，其各菌粉的重量份数如下：

嗜酸乳杆菌1-2份；丙酸菌1-2份；酿酒酵母2-3份；枯草芽孢杆菌3-4份；植物乳杆菌1-2份；凝结芽孢杆菌1-2份；

其中木聚糖酶活力在3000IU/g，各组分的活菌含量分别为：嗜酸乳杆菌6.2*10⁷cfu/g，丙酸菌2.2*10⁸cfu/g，酿酒酵母1.9*10⁸cfu/g，枯草芽孢杆菌1.4*10¹²cfu/g，植物乳杆菌5.0*10⁸cfu/g，凝结芽孢杆菌5.5*10¹¹cfu/g，复合发酵剂活力总数≥10⁸cfu/g。

2.权利要求1所述复合发酵剂制备方法，其特征在于所述的菌粉按下步骤进行：斜面菌种→液体种子培养→种子罐发酵→发酵罐发酵→离心分离菌体细胞→真空冷冻干燥→固体菌粉产品；其中各发酵液经管式离心机分离，收集菌泥，采用5％糊***溶液与菌泥混合均匀，真空冷冻干燥，得到固体菌粉。

3.一种采用权利要求1所述复合发酵剂发酵秸秆饲料的方法，其特征在于，按以下的步骤进行：

(1)选择地下水位低，地势较高、平坦，排水条件良好，靠近畜舍的地方建窖；高度为1-2米；

(2)在30℃下，将六种菌粉用浓度为5％蔗糖水活化2h，再将固体木聚糖酶粉3-5份，食盐1-2份和玉米粉10％混合其中，拌匀后将其均匀的喷洒在铡成2～4厘米的秸秆上，边喷洒边拌匀；

(3)干农作物秸秆与水的比例为1∶1～1.2，使秸秆中的水分保持在60％～70％；

(4)将拌好的秸秆分层装窖，装窖后充分踩实压紧，秸秆装满后用塑料薄膜封窖，从后向前堆放40～50厘米的厚土压实，四周再用土封严；

(5)发酵秸秆饲料经过7～10天即可在25℃开窖。

4.权利要求1所述的复合发酵剂在提高秸秆饲料发酵速度，增加发酵活性方面的应用。