CN105948831B

CN105948831B - 一种利用啤酒糟生产生防肥料的方法

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Publication number: CN105948831B
Application number: CN201610407632.9A
Authority: CN
Inventors: 邱磊; 于卓; 于宪印; 李娇娇
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2016-06-07
Filing date: 2016-06-07
Publication date: 2019-08-27
Anticipated expiration: 2036-06-07
Also published as: CN105948831A

Abstract

本发明涉及一种利用啤酒糟为主要原料生产真菌生防肥料的方法，属于微生物农药和农用肥料技术领域，所述生防真菌菌种为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。本发明还涉及该种生防肥料的生产方法，主要包括4个步骤:种子制备、半固态发酵、固态发酵、后处理技术，其中半固态和固态发酵以啤酒糟为主要碳氮源和载体，制备固体生防肥料。本发明不仅为啤酒糟废弃物的再利用提供了一条新途径，而且生产的生防肥料能够促进植物生长，对多种植物害虫有较好的防治效果。

Description

一种利用啤酒糟生产生防肥料的方法

技术领域

本发明属于农用肥料技术领域，具体涉及一种微生物生防肥料及其制备方法，特别是一种抗虫促生的高效微生物生防肥料。

背景技术

随着中国经济的发展，作为世界上第一大酒精饮料，我国的啤酒消费量也逐步加大。据统计，2014年中国啤酒产量达4921.85万千升，是世界上最大的啤酒生产国。据统计，每生产1吨啤酒，需要产生啤酒糟约0.25吨。啤酒糟主要是啤酒原料麦芽，大米，及啤酒花经过糖化糊化过程后，进行过滤压榨得到的废料。啤酒糟中的水分含量约为50％～85％，同时含有丰富的营养成分，其中，粗蛋白约占干重的25％，粗脂肪约10％，粗纤维约8％，无氮浸出物约55％，以及2％的灰分。但是由于其中水分含量较高，营养丰富，所以极容易发生腐败。目前，啤酒糟多被直接低价销售给周围农民，作为饲养家畜的饲料；另一部分将其直接进行干燥处理，再进行后续饲料加工处理，能源消耗过大；更有甚者将其直接排放，严重污染环境。因此，亟待针对啤酒糟进行开发利用，进一步的提高啤酒糟的附加值。

生防真菌是一种能侵入昆虫体内寄生、使昆虫发病致死的真菌，是一类非常重要的环境微生物，在防治有害生物中具有广阔的发展潜力。球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是一种广谱性的生防真菌，其有效成份是包括孢子或菌丝的侵染体，一般从害虫体壁侵入血腔，利用寄主血腔内营养而繁殖或分泌毒素，害虫因营养衰竭或毒血症而死亡。国内外研究人员利用球孢白僵菌防治玉米螟、松毛虫、小蔗螟、盲椿、谷象、柑桔红蜘蛛和蚜虫等农林害虫。特别是对玉米螟和松毛虫的生物防治，在国内已作为常规手段连年使用。由于球孢白僵菌能有效地控制虫口数量，同时不伤害其他天敌昆虫和有益生物，完全符合有害生物综合治理的宗旨，同时由于其容易大量生产，防治成本较有竞争力，因而其具有广泛的应用前景。此外，经研究发现，球孢白僵菌对油菜菌核病病菌、棉花枯萎病病菌和小麦赤霉病等病原菌的具有一定的拮抗作用。

现有技术中公开过专利为《一种白僵菌的固体培养基以及白僵菌的培养方法》，公开号为103881930A。其中，该发明的固体培养基包括按质量比1：(1～1.2)：(1～1.2)的蛭石、麦麸以及玉米粉，将蛭石、麦麸以及玉米粉混合蒸汽灭菌40min得到；在此基础上，该发明将白僵菌接种液在加有硫酸庆大霉素的液体扩大培养基培养后，再接种于固体培养基中，在25～27℃培养7.5～8d后收获；除此之外还有谢翎,陈红梅等，《利用大米固态发酵生产球孢白僵菌的工艺优化》食品与发酵工业，2007，33(10)。其中，该论文以大米作为固态发酵培养基，接种量为15％(v/w),培养温度25℃,环境湿度前4d为100％，中间3d为80％,后3d为60％,培养10d。

上述专利及论文中，大量使用了大米、麦麸、玉米粉等人畜可食用的农产品，增加了粮食资源的消耗；其中的固体培养基成分繁杂，成本较高；均以白僵菌孢子粉作为最终产物，需进行繁杂的操作步骤对孢子粉进行单独的分离回收，且原有的固体培养基多被再次废弃；且均未涉及植物促生的肥料领域。

因此，如何利用大量的啤酒糟来培养生防真菌成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供了一种利用啤酒废糟生产生防肥料的方法。

本发明以啤酒发酵产生的啤酒糟废料为培养基，培养杀虫效力显著的球孢白僵菌，并且发酵后的肥料具有更丰富的营养物质，能够有效促进植物的生长，同时实现对植物虫害的防治，减少了化学农药在植物种植过程中造成的食品安全问题。

本发明的具体技术方案如下：

一种利用啤酒糟生产生防肥料的方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)种子制备：将球孢白僵菌接入SADY液体培养基中，接种量为1～3％，在25～28℃，150～180r/min的摇床中培养3～7d，获得种子液；

(2)半固态发酵：将发酵罐中加入半固态培养基，其组成为：50～150g的新鲜啤酒糟，5～40g葡萄糖，用水定容至1L。加热煮沸15～30min，以消灭培养基中杂菌。待冷却至室温后，接种0.5～5％种子液，于25～28℃通气好氧培养24～72h，获得半固态发酵培养液；

(3)固态发酵：取新鲜啤酒糟，加入占啤酒糟0.5～2wt％的甘蔗原糖粉充分混匀，于80℃烘烤30～45min，降低啤酒糟湿度至50～65％，冷却备用；

将步骤(2)中获得的生防真菌半固态培养液按照10～20％的比例加入到步骤(3)中获得的固体培养基中，混合均匀；将接种后的固体培养基，放于25～28℃恒温环境中密封培养8～15d，然后进行通风干燥培养3～5d，待培养基含水量低于15％，且存在大量白僵菌孢子粉时，即可获得目的生防肥料。

本步骤中啤酒糟在80℃烘烤30～45min，即可实现灭菌操作；

步骤(1)中所述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)菌种为市售球孢白僵菌菌剂，如江西天人生态股份有限公司的“地将军”球孢白僵菌、厦门多多生物科技有限公司的“多多生物”球孢白僵菌等。

步骤(1)中所述的SADY液体培养基制备方法如下：葡萄糖4g，蛋白胨1g，酵母浸出粉1g，用水定容至100mL，高温灭菌后，冷却至室温备用。

由于步骤(3)中获得的生防肥料为块状，为了方便使用可以将成块的生防肥料进行破碎处理，即可获得生防肥料成品。

本发明的有益效果为：

1.本发明的生防肥料是由啤酒糟经白僵菌发酵而成，能够有效的改善土壤微生态环境，消灭植物虫害，提供植物生长所需的营养物质，为农作物生长提供有益条件。

2.采用啤酒糟作为生防真菌的培养基，主要原因在于其作为微生物培养基，既含有残糖作为微生物生长的碳源，又含有丰富的粗蛋白作为微生物生长所需的氮源，同时也含有微生物生长所需的钙、磷、锰、铁、铜等微量元素，是一种无需额外添加或只需少量添加其他化学药剂的优秀的微生物培养基。此外，经过球抱白僵菌发酵后，啤酒糟中含有的粗蛋白等物质被逐步分解为小分子无机氮，有利于植物直接吸收。同时，啤酒糟中含有的钙、磷、锰、铁、铜等微量元素也是植物生长所必需的营养物质。

3.实验表明，使用本发明的生防肥料可以促进植物种子萌发与生长，经田间实验可提高粮食产量10～35％，提高蔬菜产量15～35％，还可以有效的改善粮食蔬菜的品质与风味。每亩土地使用本发明的肥料约200～300g，是目前施用量较少的微生物生防肥料。具体使用时本发明生防肥料中加入100～200倍水，在22～28℃中活化12h，然后连同原施用化肥(正常使用量的50％)撒入土壤中即可。

综上所述，本发明有效的将啤酒实际生产中大量产生的价格低廉废料——啤酒糟进行资源开发再利用，有效的避免了因为啤酒糟处理不当导致的环境卫生问题，同时，进一步的提高了啤酒糟的附加值，为啤酒糟的高值利用提供了一个新思路；以啤酒糟作为生防真菌培养基，而非使用大米、麦麸、玉米粉等人畜可食用的农产品，减少了粮食资源的消耗；通过啤酒糟发酵生产杀虫强力、持久力强、环境友好、人畜无害的球孢白僵菌，能够作为目前过度使用的化学农药的替代物，有效的减少其使用量，从而避免由于化学农药施用过度导致的土壤、水源、大气等环境污染，以及农药残留等食品安全问题；将发酵后获得的啤酒糟球孢白僵菌混合物进行简单加工，省略了孢子粉回收步骤，其既具有来自啤酒糟的丰富营养物质，又具备生防真菌的杀虫效果，是一种优良的生物肥料。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

1.种子制备：选择球孢白僵菌(Beauveria bassiana)作为生防真菌种子菌株，可选用市售的江西天人生态股份有限公司的“地将军”球孢白僵菌、厦门多多生物科技有限公司的“多多生物”球孢白僵菌等菌剂。将球孢白僵菌接入SADY液体培养基(葡萄糖4g，蛋白胨1g，酵母浸出粉1g，用水定容至100mL，高温灭菌后，冷却至室温，备用)中，接种量为3％；在26℃，150r/min的摇床中培养4d，获得种子液，备用。

2.半固态发酵：将发酵罐中加入半固态培养基，其组成比例为：100g的新鲜啤酒糟，20g葡萄糖，用水定容至1L，加热煮沸30min，对半固态培养基进行灭菌，待冷却至室温后，接种半固态培养基3％种子液，于27℃通气好氧培养24h，获得半固态发酵培养液；

3.固态发酵：取新鲜啤酒糟，加入1wt％甘蔗原糖粉充分混匀，于80℃烘干45min，降低啤酒糟湿度至50％，冷却备用；

获得的生防真菌半固态培养液按照20％的比例加入固体培养基中，混合均匀；将接种后的固体培养基，放于27℃恒温环境中密封培养10d，然后进行通风培养5d，待培养基含水量降至15％以下，且存在大量白僵菌孢子粉时，即可获得目的生防肥料。

4.后续处理：将成块的生防肥料进行破碎处理，即可获得生防肥料成品。

实施例2

1.种子制备：选择球孢白僵菌(Beauveria bassiana)作为生防真菌种子菌株，可选用市售的江西天人生态股份有限公司的“地将军”球孢白僵菌、厦门多多生物科技有限公司的“多多生物”球孢白僵菌等菌剂。将球孢白僵菌接入SADY液体培养基(葡萄糖4g，蛋白胨1g，酵母浸出粉1g，用水定容至100mL，高温灭菌后，冷却至室温，备用)中，接种量为2％，在25℃，160r/min的摇床中培养5d，获得种子液，备用。

2.半固态发酵：将发酵罐中加入半固态培养基，其组成比例为：150g的新鲜啤酒糟，10g葡萄糖，用水定容至1L，加热煮沸20min，对半固态培养基进行灭菌，待冷却至室温后，接种半固态培养基5％种子液，于26℃通气好氧培养24h，获得半固态发酵培养液；

3.固态发酵：取新鲜啤酒糟，加入1.5wt％甘蔗原糖粉充分混匀，于80℃烘干35min，降低啤酒糟湿度至60％，冷却备用；将获得的生防真菌半固态培养液按照15％的比例加入固体培养基中，混合均匀；将接种后的固体培养基，放于26℃恒温环境中密封培养12d，然后进行通风培养3d，待培养基含水量降至15％以下，且存在大量白僵菌孢子粉时，即可获得目的生防肥料。

实施例3

2.半固态态发酵：将发酵罐中加入半固态培养基，其组成比例为：150g的新鲜啤酒糟，10g葡萄糖，用水定容至1L，加热煮沸20min，对半固态培养基进行灭菌，待冷却至室温后，接种半固态培养基5％种子液，于26℃通气好氧培养24h，获得半固态发酵培养液；

3.固态发酵：取新鲜啤酒糟，加入1.5wt％甘蔗原糖粉充分混匀，于80℃烘干35min，降低啤酒糟湿度至60％，冷却备用；将获得的生防真菌半固态培养液按照10％的比例加入固体培养基中，混合均匀；将接种后的固体培养基，放于26℃恒温环境中密封培养14d，然后进行通风培养3d，待培养基含水量降至15％以下，且存在大量白僵菌孢子粉时，即可获得目的生防肥料。

实施例4 生防真菌产孢量检测

分别取实施例1、实施例2、实施例3中获得的生防肥料5g浸没于含有2wt％吐温-80的500ml无菌水中，充分搅拌混合，待30min后，进行一定比例的稀释后在显微镜下使用血球计数板计数，计算其产孢量。由表1可得，本生防肥料中生防真菌产孢量较多，高达8.9×10¹¹个/g，说明了本发明中采用啤酒糟作为固体培养基是十分适合生防真菌生长的，且较高的生防真菌产孢量是杀虫效果的基本保证。

表1生防肥料产孢量检测表

实施例5 生防真菌萌发率检测

表2生防肥料萌发率检测表

分别取实施例1、实施例2、实施例3中获得的生防肥料1g浸没于100ml无菌水中，充分搅拌，显微镜下计数，用无菌水将其菌种浓度稀释到10⁷个/mL。每组生防肥料样品取样5个，分别放置于26℃恒温培养24h，于显微镜下观察其萌发率。实验重复三次，取平均值。由表2可得，本生防肥料产生孢子萌发率达到98％以上，能够有效的萌发生长，说明本固体培养基并不会影响产生的孢子萌发，且较高的萌发率能有效的确保感染害虫的孢子能够起到杀虫的作用。

实施例6 生防真菌毒力检测

取实施例1、实施例2、实施例3中获得的1g生防肥料浸没于100ml无菌水中，充分搅拌，显微镜下计数，用无菌水将其菌种浓度稀释到10⁷个/mL。以大蜡螟作为毒力检测实验对象，取大蜡螟幼虫200只，50只一组，进行分组观察。将每组大蜡螟均浸泡于生防肥料稀释液中10s，取出放于室温，观察记录其每日的存活数，计算每日平均存活率。实验结果可得，本生防肥料半致死时间LT₅₀为3.8d，具有较强的杀虫毒力，能够有效的防治植物害虫。

实施例7 植物促生能力检测

以大豆萌发来检测生防肥料对植物的促进生长作用。取600颗大豆，每100颗作为一组，进行观察。将大豆种子浸泡于60°酒精中10min，取出冲净。分别将实施例1、实施例2、实施例3中获得的1g生防肥料和干啤酒糟浸没于20ml无菌水中，充分搅拌混合，备用，每个实施例的生防肥料均做3组平行试验。然后将大豆按照1粒：3mL的比例分别浸没于水、啤酒糟、肥料浸出液中8h，随后取出后放置于25～26℃恒温培养箱中，避光培养。观察记录每组大豆平均每天胚芽轴长度。实验结果显示，本生防肥料对大豆生长具有一定的促进作用，能够起到促进植物生长的肥料效果，且效果明显。

Claims

1.一种利用啤酒糟生产生防肥料的方法，其特征在于：具体步骤如下：

(2)半固态发酵：将发酵罐中加入半固态培养基，其组成为：50～150g的新鲜啤酒糟，5～40g葡萄糖，用水定容至1L，加热煮沸15～30min，以消灭培养基中杂菌，待冷却至室温后，接种0.5～5％种子液，于25～28℃通气好氧培养24～72h，获得半固态发酵培养液；

将步骤(2)中获得的生防真菌半固态培养液按照10～20％的接种量接入到步骤(3)中获得的固体培养基中，混合均匀；将接种后的固体培养基，放于25～28℃恒温环境中密封培养8～15d，然后进行通风干燥培养3～5d，待培养基含水量低于15％，且存在大量白僵菌孢子粉时，即可获得目的生防肥料。