CN102038947A

CN102038947A - 应用生物反应器工业化生产动物狂犬病疫苗的方法

Info

Publication number: CN102038947A
Application number: CN 201010282153
Authority: CN
Inventors: 刘汉平; 李伟; 秦红刚; 温文生; 漆世华; 朱薇; 靖志强; 廖园园
Original assignee: WUHAN CHOPPER BIOLOGY CO Ltd
Current assignee: WUHAN CHOPPER BIOLOGY CO Ltd
Priority date: 2010-09-15
Filing date: 2010-09-15
Publication date: 2011-05-04

Abstract

本发明提供一种应用生物反应器工业化生产动物狂犬病疫苗的方法，包括如下步骤：(1)将微载体和生物反应器经灭菌后，加入细胞生长液、接种Vero细胞进行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，接种狂犬病毒，并继续培养，使病毒繁殖；(2)接毒后18h，连续收获病毒液；(3)对收获的病毒液进行超滤浓缩和病毒灭活；(4)通过柱层析方法纯化灭活病毒制备疫苗。本发明采用生物反应器微载体培养技术进行细胞的高密度培养，生产动物狂犬病疫苗，与传统的转瓶生产方法相比，自动化控制程度高，生产可实时监控；节省人力，降低成本；生产用地少，规模易于扩大；生产的病毒滴度高，批间差异小，产品质量稳定，副反应小。

Description

应用生物反应器工业化生产动物狂犬病疫苗的方法

技术领域

本发明涉及到兽用生物制品技术领域，具体涉及到一种应用生物反应器工业化生产动物狂犬病疫苗的方法。

背景技术

狂犬病是由狂犬病毒(Rabies Virus，RV)引起的人畜共患烈性传染病。我国每年大约有5000～8000人死于狂犬病。在我国，患病犬是狂犬病的主要传染源，狂犬病患者感染主要由狂犬病犬(疯犬和带毒犬)咬伤所致，亦可通过消化道、呼吸道粘膜及接触等途径感染。

我国系养犬业大国，而且犬与人日益亲近，如何预防和控制犬的狂犬病，是预防人狂犬病发生的重要课题。

给犬注射狂犬病活疫苗，预防效果较好，但有着潜在的危险，研制安全、有效的犬用狂犬病灭活疫苗有着非常重要的现实意义。目前我国尚未有此类国产疫苗上市。

自80年代以来，人们都在寻求适应于现代疫苗生产的工艺及细胞培养基质，纷纷采用Vero细胞、BHK细胞、原代地鼠肾细胞、原代鸡胚成纤维细胞等。传代细胞系适应大规模生产的需要。但BHK细胞由于存在潜在的致癌特性，因此诸多研究单位将Vero细胞列为研究重点。目前Vero细胞生产的人用狂犬病灭活疫苗在国内外均已上市。

采用Vero细胞生产狂犬病疫苗的关键是如何培养出高滴度的病毒，因此大规模的细胞培养技术成了Vero细胞狂犬病疫苗生产工艺中关键的技术环节。针对Vero细胞狂犬病疫苗的生产工艺，已有相关文献报道。专利公开号为CN1966076 A的专利申请，公开了一种利用Fibra-Cel disks微载体的具有固定床蓝式搅拌***的生物反应器生产狂犬病疫苗的方法；专利公开号为CN101028514A的专利申请，公开了一种利用搅拌式生物反应器生产人用狂犬病疫苗的方法。以上文献均涉及到人用狂犬病疫苗的制备工艺，但是有关动物狂犬病疫苗生产工艺方面的文献却未见报道，本发明利用搅拌式生物反应器，采用逐级放大的倒罐式操作技术，进行细胞的高密度培养，以制备动物狂犬病疫苗。

发明内容

本发明为了克服动物狂犬病疫苗现有生产方法的缺陷，提供一种应用生物反应器工业化生产动物狂犬病疫苗的方法，其优点是设备占地面积小、生产规模大；自动化控制程度高，生产效率好；培养设备密闭，不易污染；副产物少，疫苗的副反应小；生产的病毒液效价高，疫苗质量稳定。

本发明的技术方案为：

应用生物反应器工业化生产动物狂犬病疫苗的方法，按以下步骤进行：(1)将微载体和生物反应器经灭菌后，加入细胞生长液，接种Vero细胞进行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，接种狂犬病毒，并继续培养，使病毒繁殖；(2)接毒后18h，连续收获病毒液；(3)将上述收获的病毒液用30万截留分子量的超滤膜包浓缩10～50倍，按灭活剂与浓缩病毒液的体积比为1∶2000加入质量浓度为37％甲醛溶液进行灭活后，再经过凝胶层析柱Sepharose 4FF柱层析得到纯化病毒液；(4)将纯化病毒液按病毒液和稳定剂7∶1体积比加入稳定剂配制成成品疫苗，所述的稳定剂为：将蔗糖40g、胰蛋白胨8g、甘露醇32g加入双蒸馏水中，并加双蒸馏水至100ml。

所述的病毒的接种量为0.0001～0.1MOI。

所述的生物反应器设定参数为：pH 6.5～7.8、温度33～37℃、溶氧30～80％、搅拌速度30～100rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH 6.8～7.2、细胞培养阶段温度设定37℃，病毒培养阶段温度设定33℃、溶氧50％、搅拌速度30～100rpm。

所述的微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2～25g/L。

所述的生物反应器为搅拌式生物反应器。

所述的生物反应器容积为14～150L。制苗用细胞采用14L～40L或14L～40L～150L逐级放大的培养模式，即通过胰酶将14L生物反应器培养的细胞消化下来，作为种子细胞接种到40L的生物反应器，再将40L的反应器内培养的细胞消化下来作为种子细胞接种到150L生物反应器，如此形成生物反应器之间的逐级放大培养过程，从而避免了单纯的用转瓶培养种子细胞而容易造成污染和增加劳动强度的缺陷；于40L或150L生物反应器培养狂犬病毒；或，直接用14L、40L或150L的生物反应器培养病毒。

所述的生物反应器的培养采用批式、流加或灌注培养的方式，灌注的速率根据细胞的密度为每天0.5～4个工作体积。

本发明采用生物反应器微载体培养技术进行细胞的高密度培养，生产动物狂犬病疫苗，与传统的转瓶生产工艺相比，自动化控制程度高，生产可实时监控；节省人力，降低成本；生产用地少，规模易于扩大；生产的病毒滴度高，批间差异小，产品质量稳定，副反应小。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

图2a为细胞接种后3d的微载体细胞图片。

图2b为接毒后细胞状态的微载体细胞图片。

图3为细胞生长曲线。

具体实施方式

以下是本发明一个具体的实施方案，以进一步的阐述本发明，但不能解释为限制本发明的范围。

实施例1：

生物反应器：美国NBS公司14L和40L生物反应器；

微载体：Cytodex1(通用电气医疗集团生命科学部)；

狂犬病毒：aG株经Vero细胞驯化的适应毒10aGV株；

细胞生长液：含体积浓度为8％小牛血清的M199(北京清大天一生物技术有限公司)；

病毒维持液：含体积浓度为1％小牛血清的M199(北京清大天一生物技术有限公司)；

细胞培养：分别在14L生物反应器内，按照10g/L的浓度加入Cytodex-1，水化后，用pH7.2的磷酸盐缓冲液PBS淘洗2遍，灭菌，加入细胞生长液，接种Vero细胞进行培养；培养的方法参数为：pH7.2、温度37℃、溶氧50％、搅拌速度30～100rpm；每天定时取样观察细胞生长情况，进行细胞计数，测定葡萄糖的消耗，当细胞的密度达到1.5×10⁶/ml时，开始灌注，灌注的速度依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0.5～4个工作体积，以维持细胞的生长，培养4天，细胞的密度达到7×10⁶/ml。

微载体培养的放大：待14L生物反应器细胞的密度达到7×10⁶/ml，将长满细胞的微载体收集到特定密闭容器中，用含质量浓度为0.02％EDTA的pH7.2的PBS缓冲液清洗细胞两次，加入37℃预热的含质量浓度为0.02％EDTA、质量浓度为0.25％胰酶的胰酶消化液，消化8min，排出多余的胰酶溶液，加入细胞生长液，终止残余胰酶的消化，启动容器搅拌使其充分分散消化的细胞，然后将消化分散的细胞悬液接种到40L的生物反应器，按照上述的培养方法进行培养。

病毒繁殖：当40L生物反应器细胞的密度达到7×10⁶/ml，更换成病毒维持液，按照0.01MOI接种狂犬病毒；接毒后6h开始灌注培养，以维持病毒繁殖所必需的营养物质，培养18h后连续收获病毒液，测定病毒含量8.0logTCID₅₀/ml，将收获的病毒液置于2～8℃中，并保存在-20℃。

病毒浓缩、灭活、纯化、配苗：将上述收获的病毒液用30万截留分子量的超滤膜包浓缩10倍，按灭活剂与浓缩病毒液的体积比为1∶2000加入质量浓度为37％甲醛溶液进行灭活后，再经过凝胶层析柱Sepharose 4FF柱层析得到纯化疫苗；按病毒液与稳定剂7∶1体积比加入稳定剂配制成成品疫苗，所述的稳定剂为：将蔗糖40g、胰蛋白胨8g、甘露醇32g加入双蒸馏水中，并加双蒸馏水至100ml。

Claims

1.应用生物反应器工业化生产动物狂犬病疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将微载体和生物反应器经灭菌后，加入细胞生长液，接种Vero细胞进行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，接种狂犬病病毒，并继续培养；(2)接毒后18h，连续收获病毒液；(3)将上述收获的用30万截留分子量的超滤膜包浓缩10～50倍，按灭活剂与浓缩病毒液的体积比为1∶2000加入质量浓度为37％甲醛溶液进行灭活后，再经过凝胶层析柱Sepharose 4FF柱层析得到纯化病毒液；(4)将纯化病毒液按病毒液和稳定剂7∶1体积比加入稳定剂配制成成品疫苗，所述的稳定剂为：将蔗糖40g、胰蛋白胨8g、甘露醇32g加入双蒸馏水中，并加双蒸馏水至100ml。

2.根据权利要求1所述的应用生物反应器工业化生产动物狂犬病疫苗的方法，其特征在于：所述的生物反应器设定参数为：pH 6.5～7.8、温度33～37℃、溶氧30～80％、搅拌速度30～100rpm。

3.根据权利要求1所述的应用生物反应器工业化生产动物狂犬病疫苗的方法，其特征在于：病毒的接种量为0.0001～0.1MOI。

4.根据权利要求1所述的应用生物反应器工业化生产动物狂犬病疫苗的方法，其特征在于：所述的生物反应器容积为14～150L；或，制苗用细胞经过14L～40L或14L～40L～150L逐级放大培养后，于40L或150L生物反应器培养狂犬病毒；或，直接用14L、40L或150L的生物反应器培养病毒。

5.根据权利要求1～4之一所述的应用生物反应器工业化生产动物狂犬病疫苗的方法，其特征在于：所述的微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2～25g/L。

6.根据权利要求1～4之一所述的应用生物反应器工业化生产动物狂犬病疫苗的方法，其特征在于：所述的生物反应器为搅拌式生物反应器。

7.根据权利要求1～4之一所述的应用生物反应器工业化生产动物狂犬病疫苗的方法，其特征在于：所述的生物反应器的培养采用批式、流加或灌注培养的方式，灌注的速率根据细胞的密度为每天0.5～4个工作体积。