CN102038945B - 应用生物反应器工业化生产猪细小病毒疫苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种应用生物反应器工业化生产猪细小病毒疫苗的方法，包括如下步骤：(1)将微载体和生物反应器灭菌后，加入细胞生长液，接种制苗用细胞进行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，接种猪细小病毒，并继续培养，使病毒繁殖；(2)待细胞病变达到80％以上时，停止培养，收获病毒液；(3)对收获的病毒液进行超滤浓缩和病毒灭活；(4)通过柱层析方法纯化灭活的病毒制成疫苗。本发明具有工艺参数可控性好，细胞密度高，病毒效价高，疫苗安全性好、质量稳定可靠，生产效率高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及到兽用生物制品技术领域，具体涉及一种应用生物反应器工业化生产猪细小病毒疫苗的方法。
背景技术
猪细小病毒病(porcine parvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要疾病之一。怀孕母猪主要表现为流产、死胎、木乃伊胎、弱仔等，以头胎母猪最为严重，给全球的养猪业造成巨大的经济损失。目前对猪细小病毒的防治主要是以免疫预防为主，由于PPV血清型单一及其高免疫原性，使得疫苗接种成为控制该病感染的一种行之有效的方法。
目前在我国广泛应用的疫苗为猪细小病毒灭活疫苗，疫苗的生产采用的是传统的转瓶工艺，该工艺在我疫苗行业已经使用了数十年，其操作技术相对简单和成熟。但是每个转瓶均是独立的细胞培养单元，每瓶细胞的质量、病毒产量和滴度都不同，导致疫苗批间差异大，而且操作劳动强度大，生产效率低，隐性污染引起的高内毒素等缺点，已经越来越不适应当前疫苗大规模生产的要求。
发明内容
本发明为了克服猪细小病毒疫苗现有生产方法的缺陷，提供一种应用生物反应器工业化生产猪细小病毒疫苗的方法，其优点是设备占地面积小、生产规模大；自动化控制程度高，生产效率好；培养设备密闭，不易污染；副产物少，疫苗的副反应小；生产的病毒液效价高，疫苗质量稳定。
本发明的技术方案为：
应用生物反应器工业化生产猪细小病毒疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将微载体和生物反应器灭菌后，加入细胞生长液，接种制苗用细胞进行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，接种猪细小病毒，并继续培养，使病毒繁殖；所述的制苗用细胞为对猪细小病毒毒株敏感的细胞，且细胞为IBRS-2、PK-15或ST细胞；(2)待细胞病变达到80％以上时，停止培养，收获病毒液；(3)对收获的病毒液进行超滤浓缩和病毒灭活；(4)通过柱层析方法纯化灭活的病毒制成疫苗。
所述的生物反应器设定参数为：pH 6.5～7.8、温度33～37℃、溶氧30～80％、搅拌速度30～100rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH 6.9～7.3、细胞培养阶段温度设定37℃，病毒培养阶段温度设定35℃、溶氧50％、搅拌速度30～100rpm。
所述病毒的接种量为0.0001～0.1MOI。
所述的微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2～25g/L。
所述的生物反应器为搅拌式生物反应器。
所述的生物反应器容积为14～150L。制苗用细胞可采用14L～40L或14L～40L～150L逐级放大的培养模式，即通过胰酶将14L生物反应器培养的细胞消化下来，作为种子细胞接种到40L的生物反应器，再将40L的反应器内培养的细胞消化下来作为种子细胞接种到150L生物反应器，如此形成生物反应器之间的逐级放大培养过程，从而避免了单纯的用转瓶培养种子细胞而容易造成污染和增加劳动强度的缺陷；或，直接用14L、40L或150L的生物反应器培养病毒。
所述的生物反应器的培养采用批式、流加或灌注培养的方式，灌注的速率根据细胞的密度以每天0.5～4个工作体积。
本发明采用生物反应器微载体培养技术进行细胞的高密度培养，生产猪细小病毒疫苗，与传统的转瓶生产工艺相比，自动化控制程度高，生产可实时监控；节省人力，降低成本；生产用地少，规模易于扩大；生产的病毒滴度高，批间差异小，产品质量稳定，副反应小。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
图2a为细胞接种后4h的微载体细胞图片。
图2b为接毒后细胞状态的微载体细胞图片
图3为细胞生长曲线。
具体实施方式
以下是本发明一个具体的实施方案，以进一步的阐述本发明，但不能解释为限制本发明的范围。
实施例1
生物反应器：美国NBS公司14L和40L生物反应器；
微载体：Cytodex-1(美国通用电气医疗集团生命科学部)；
猪细小病毒：HW-1株；
细胞生长液：含体积浓度为8％小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技术有限公司)；
病毒维持液：含体积浓度为1％小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技术有限公司)；
细胞培养：分别在14L生物反应器内，按照10g/L的浓度加入Cytodex1，水化后，用pH7.2的磷酸盐缓冲液PBS淘洗2遍，灭菌，接种IBRS-2细胞，进行培养；培养的方法参数为：pH7.2、温度37℃、DO50％、搅拌速度30～100rpm；每天定时取样观察细胞生长情况，进行细胞计数，测定葡萄糖的消耗，当细胞的密度达到1.5×106/ml时，开始灌注，灌注的速度依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0.5～4个工作体积，以维持细胞的生长，培养4～5天，细胞的密度达到7×106/ml。
微载体培养的放大：待14L生物反应器细胞的密度达到7×106/ml，将长满细胞的微载体收集到特定密闭容器中，用含质量浓度为0.02％EDTA的pH7.2的PBS缓冲液清洗细胞两次，加入37℃预热的含质量浓度为0.02％EDTA、质量浓度为0.25％胰酶的胰酶消化液，消化8min，排出多余的胰酶溶液，加入细胞生长液，终止残余胰酶的消化，启动容器搅拌使其充分分散消化的细胞，然后将消化分散的细胞悬液接种到40L的生物反应器，按照上述的培养方法进行培养。
病毒繁殖：当40L生物反应器细胞的密度达到8×106/ml，更换成病毒维持液，按照0.01MOI接种猪细小病毒；接毒后6h开始灌注培养，以维持病毒繁殖所必需的营养物质，待细胞病变达到80％以上时，同时收获病毒液，测定病毒含量8.0logTCID50/ml，，将收获的病毒液置于2～8℃中，并保存在-20℃。
病毒浓缩、纯化、配苗：将上述收获的病毒液用10万截留分子量的超滤膜包浓缩10倍，按灭活剂与病毒浓缩液体积比为1∶2000加入质量浓度为37％甲醛溶液灭活剂进行灭活后，再经过凝胶层析柱Sepharose 4FF柱层析得到纯化疫苗；按抗原和油佐剂1∶1比例加入油佐剂，乳化配制成灭活疫苗。油佐剂的配制为94％(V/V)白油、6％(V/V)的Span-80，2％(g/V)硬脂酸铝。
实施例2
生物反应器：美国NBS公司14L和40L生物反应器；
微载体：Cytodex-1(美国通用电气医疗集团生命科学部)；
猪细小病毒：HW-1株；
细胞生长液：含体积浓度为8％小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技术有限公司)；
病毒维持液：含体积浓度为1％小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技术有限公司)；
细胞培养：分别在14L生物反应器内，按照10g/L的浓度加入Cytodex-1，水化后，用pH7.2的磷酸盐缓冲液PBS淘洗2遍，灭菌，接种PK-15细胞，进行培养；培养的方法参数为：pH7.2、温度37℃、DO50％、搅拌速度30～100rpm；每天定时取样观察细胞生长情况，进行细胞计数，测定葡萄糖的消耗，当细胞的密度达到1.5×106/ml时，开始灌注，灌注的速度依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0.5～4个工作体积，以维持细胞的生成，培养4天，细胞的密度达到7×106/ml。
微载体培养的放大：待14L生物反应器细胞的密度达到7×106/ml，将长满细胞的微载体收集到特定密闭容器中，用含质量浓度为0.02％EDTA的pH7.2的PBS缓冲液清洗细胞两次，加入37℃预热的含质量浓度为0.02％EDTA、质量浓度为0.25％胰酶的胰酶消化液，消化10min，排出多余的胰酶溶液，加入细胞生长液，终止残余胰酶的消化，启动容器搅拌使其充分分散消化的细胞，然后将消化分散的细胞悬液接种到40L的生物反应器，按照上述的培养方法进行培养。
病毒繁殖：当40L生物反应器细胞的密度达到8×106/ml，更换成病毒维持液，按照0.01MOI接种猪细小病毒；接毒后6h开始灌注培养，以维持病毒繁殖所必需的营养物质，待细胞病变达到80％以上时，同时收获病毒液，测定病毒含量7.8logTCID50/ml，将收获的病毒液置于2～8℃中，并保存在-20℃。
病毒浓缩、纯化、配苗：将上述收获的病毒液用10万截留分子量的超滤膜包浓缩50倍，按灭活剂与病毒浓缩液体积比为1∶2000加入37％甲醛溶液灭活剂进行灭活后，再经过凝胶层析柱Sepharose 4FF柱层析得到纯化疫苗；按抗原和油佐剂1∶1比例加入油佐剂，乳化配制成灭活疫苗，油佐剂的配制为94％(V/V)白油、6％(V/V)的Span-80，2％(g/V)硬脂酸铝。
实施例3
生物反应器：美国NBS公司14L和40L生物反应器；
微载体：Cytodex-1(美国通用电气医疗集团生命科学部)；
猪细小病毒：HW-1株；
细胞生长液：含体积浓度为8％小牛血清的DMEM/F12；
病毒维持液：含体积浓度为1％小牛血清的DMEM/F12；
细胞培养：分别在14L生物反应器内，按照10g/L的浓度加入Cytodex1，水化后，用pH7.2的磷酸盐缓冲液PBS淘洗2遍，灭菌，接种ST细胞，进行培养；培养的方法参数为：pH7.2、温度37℃、DO50％、搅拌速度30～100rpm；每天定时取样观察细胞生长情况，进行细胞计数，测定葡萄糖的消耗，当细胞的密度达到1～1.5×106/ml时，开始灌注，灌注的速度依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0.5～4个工作体积，培养4d，细胞的密度达到7×106/ml。
微载体培养的放大：待14L生物反应器细胞的密度达到7×106/ml，将长满细胞的微载体收集到特定密闭容器中，用含质量浓度为0.02％EDTA的pH7.2的PBS缓冲液清洗细胞两次，加入37℃预热的含质量浓度为0.02％EDTA、质量浓度为0.25％胰酶的胰酶消化液，消化10min，排出多余的胰酶溶液，加入细胞生长液，终止残余胰酶的消化，启动容器搅拌使其充分分散消化的细胞，然后将消化分散的细胞悬液接种到40L的生物反应器，按照上述的培养方法进行培养。
病毒繁殖：当40L生物反应器细胞的密度达到8×106/ml，更换成病毒维持液，按照0.01MOI接种猪细小病毒；接毒后6h开始灌注培养，以维持病毒繁殖所必需的营养物质，待细胞病变达到80％以上时，同时收获病毒液，测定病毒含量7.8logTCID50/ml，将收获的病毒液置于2～8℃中，并保存在-20℃。
病毒浓缩、纯化、配苗：将上述收获的病毒液用10万截留分子量的超滤膜包浓缩30倍，按灭活剂与病毒浓缩液体积比为1∶2000加入质量浓度为37％甲醛溶液灭活剂进行灭活后，再经过凝胶层析柱Sepharose 4FF柱层析得到纯化疫苗；按抗原和油佐剂1∶1比例加入油佐剂，乳化配制成灭活疫苗。油佐剂的配制为94％(V/V)白油、6％(V/V)的Span-80，2％(g/V)硬脂酸铝。
Claims (2)
1.应用生物反应器工业化生产猪细小病毒疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将微载体和生物反应器灭菌后，加入细胞生长液，接种制苗用细胞进行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，接种猪细小病毒，并继续培养，使病毒繁殖；所述的制苗用细胞为对猪细小病毒毒株敏感的细胞，且细胞为IBRS-2、PK-15或ST细胞；（2）待细胞病变达到80%以上时，停止培养，收获病毒液；（3）对收获的病毒液进行超滤浓缩和病毒灭活；（4）通过柱层析方法纯化灭活的病毒制成疫苗。
2.根据权利要求1所述的应用生物反应器工业化生产猪细小病毒疫苗的方法，其特征在于：所述的生物反应器设定参数为：pH 6.5～7.8、温度33～37℃、溶氧30～80%和搅拌速度30～100rpm。
3、根据权利要求1所述的应用生物反应器工业化生产猪细小病毒疫苗的方法，其特征在于：病毒的接种量为0.0001～0.1MOI。
4、根据权利要求1～3之一所述的应用生物反应器工业化生产猪细小病毒疫苗的方法，其特征在于：所述的生物反应器容积为14～150L；或，制苗用细胞经过14L～40L或14L～40L～150L逐级放大培养后，于40L或150L生物反应器培养狂犬病毒；或，直接用14L、40L或150L的生物反应器培养病毒。
5、根据权利要求1～3之一所述的应用生物反应器工业化生产猪细小病毒疫苗的方法，其特征在于：所述的微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2～25g/L。
6、根据权利要求1～3之一所述的应用生物反应器工业化生产猪细小病毒疫苗的方法，其特征在于：所述的生物反应器为搅拌式生物反应器。
7、根据权利要求1～3之一所述的应用生物反应器工业化生产猪细小病毒疫苗的方法，其特征在于：所述的生物反应器的培养采用批式、流加或灌注培养的方式，灌注的速率根据细胞的密度为每天0.5～4个工作体积。
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