CN1966076A - 大规模生产狂犬病疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大规模生产狂犬病疫苗的方法，其工艺步骤为：(1)在以Fibra－Cel disks为载体的具有固定床篮式搅拌***的生物反应器中，用细胞增殖培养液培养Vero细胞；(2)在Vero细胞生长至一定密度时，换用细胞维持培养液，接种狂犬病毒并使之感染细胞；(3)使病毒增殖；(4)连续收获病毒；(5)超滤浓缩并用β－丙内酯灭活；(6)用硫酸鱼精蛋白或DNA酶处理以去除Vero细胞DNA；(7)以Sepharose 4 Fast Flow为填料进行层析纯化；(8)加入人血白蛋白、蔗糖为保护剂制成液体制剂，或加入人血白蛋白、蔗糖、明胶作为保护剂和赋型剂制成冻干制剂。采用本发明的方法可实现在较小容量的生物反应器中，连续收获病毒，实现大规模生产。

Description

大规模生产狂犬病疫苗的方法

技术领域

本发明属生物制药技术领域，具体来说是涉及一种大规模生产狂犬病疫苗的方法。

背景技术

狂犬病是一种通过狗、猫、猪、老鼠、和蝙蝠等动物传染的自然疫源性传染病，人一旦被携带狂犬病毒的此类动物咬伤，就会感染发病，其病死率为100％。据不完全统计亚洲狂犬病例每年近3万人左右，我国为狂犬病高发区，80年代每年死亡在5000人以上，进入90年代略有下降，但近年来我国狂犬病发病率有上升趋势。狂犬病没有特殊有效的治疗手段，注射狂犬病疫苗是控制狂犬病流行的唯一有效手段。

从1885年路易·巴斯德证明感染了狂犬病毒固定毒的兔脊髓对暴露后免疫具有显著作用开始，人用狂犬病疫苗的发展史已经历了一百二十年。以培养方式区分，人用狂犬病疫苗可以分成组织培养疫苗和细胞培养疫苗两大类。细胞培养疫苗又可分成人二倍体细胞疫苗(HDCV)、原代细胞培养疫苗以及传代细胞系疫苗三大类。

Vero细胞即维尔博狂犬疫苗，为传代细胞系疫苗的中的一种，它是一种高纯度狂犬疫苗，是目前世界上较为常用的人用狂犬病疫苗。

生产狂犬病疫苗的关键在于培养出足够量的高滴度狂犬病毒。大规模细胞培养是疫苗制品生产工艺中的重要技术环节。在过去十多年来，该技术经历了二代发展，即从第一代使用roller bottle、CellCube等贴壁细胞培养，发展为第二代生物反应器(Bioreactor)进行大规模细胞培养。第一代细胞培养技术的核心问题是难以规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是批量生产容易导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进行生产和质量控制。目前，国外一些疫苗制造公司正在发展第二代大规模动物细胞培养技术，它是疫苗制品工业化生产的方向。国际上动物细胞高密度培养技术的应用多采用Cytodex 1悬浮载体，细胞密度可达到10⁷个/毫升。但是由于在生物反应器中装量较少(3～5克/升)，只能做批次培养，而且产业化规模需要较大体积的生物反应器，一般需达到1000升，装备及配套设施成本较高。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种在较小容量的生物反应器中实现连续收获病毒的大规模生产狂犬病疫苗的方法。

为实现本发明的发明目的所采取的技术方案为：

一种大规模生产狂犬病疫苗的方法，其特征在于其工艺步骤为：

(1)在以Fibra-Cel disks(聚酯片)为载体的具有固定床篮式搅拌***的生物反应器中，用细胞增殖培养液培养Vero细胞；

(2)在Vero细胞生长至一定密度时，换用细胞维持培养液，接种狂犬病毒(CTN-1株、aGV株)，并使之感染细胞；

(3)使病毒增殖；

(4)连续收获病毒；

(5)超滤浓缩并用β-丙内酯灭活；

(6)用硫酸鱼精蛋白或DNA酶处理以去除Vero细胞DNA；

(7)以Sepharose 4 Fast Flow(中文名：琼脂糖凝胶4FF)为填料进行层析纯化；

(8)加入人血白蛋白、蔗糖为保护剂制成液体制剂，或加入人血白蛋白、蔗糖、明胶作为保护剂和赋型剂制成冻干制剂。

Vero细胞是日本学者1962年从非洲绿猴肾建立的猴肾细胞系(即非洲绿猴肾细胞)，其第93代被带到美国国立卫生研究院(NIH)的过敏与传染病研究所热带病毒研究室，第113代被提交给美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号为ATCC NO.CCL-81。经过全面的研究鉴定，Vero细胞具有核学稳定，没有外源因子污染和在一定代次内无致瘤性的优点，完全符合世界卫生组织(WHO)关于用于生物制品的传代细胞的规程要求，并已被WHO批准可用作疫苗生产的基质。本发明使用的Vero细胞种来源于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，并可追溯至ATCC，首先建立Vero细胞主种子库和工作种子库，并对其进行***的检定。在制备疫苗之前，需先进行细胞的复苏、转瓶扩增培养，再以2～5×10⁵/ml的密度接种至生物反应器中，用细胞增殖培养液进行扩增培养，所用的细胞增殖培养液使用199培养基加2～10％牛血清配制而成，为防止细菌污染，在配制细胞增殖培养液的同时可加入适量的硫酸庆大霉素。细胞增殖培养的条件为pH值6.9～7.4(较佳的为7.2)，温度36～38℃(较佳的为37℃)，溶解氧(DO)30～70％(较佳的为50％)，搅拌速度30～150rpm(较佳的为120rpm)。

在本发明的方法中，所用的Celligen Plus、BioFlo 4500和BioFlo Pro生物反应器购自New Brunswick Scientific Co.，Inc.公司，Celligen Plus涵盖的罐体积为2.2升、5升、7.5升、14升，BioFlo4500涵盖的罐体积为20升、30升，BioFlo Pro涵盖的罐体积为75升、150升、300升，均可进行温度、pH值、溶解氧、搅拌速度的自动控制。

Vero细胞为贴壁依赖性细胞，在生物反应器中培养需附着在一定的载体上生长，本发明所用的载体为Fibra-Cel disks(聚酯片)，使用量为每升罐体积30～40克。

Vero细胞在生物反应器中扩增培养6～12天后可接种狂犬病毒，本发明使用的狂犬病毒为CTN-1株和aGV株，CTN-1株来源于中国药品生物制品检定所，aGV株来源于武汉生物制品研究所。接种狂犬病毒前用pH7.6 PBS溶液或199培养基洗涤以洗去残留的牛血清，然后换上细胞维持培养液，所用的细胞维持培养液使用199培养基加0.05％～0.5％人血白蛋白配制而成，狂犬病毒接种量为0.025～0.125MOI感染复数(MOI：用于感染的病毒数目与细胞数目的比值)或终浓度4.5～5.5lgLD₅₀/ml(LD₅₀：半数致死剂量)。细胞维持培养的条件为pH值7.2～8.0(较佳的为7.6)，温度32～36℃较佳的为35℃)，溶解氧(DO)30～70％(较佳的为50％)，搅拌速度30～150rpm(较佳的为120rpm)。狂犬病毒在Vero细胞上的生长繁殖可维持较长时间，使用生物反应器可连续灌注收获，可连续收获20天以上，病毒滴度保持在7lg LD50/ml以上。

收获的病毒液用100K～300K分子量截留的超滤膜浓缩30～100倍，然后用1∶4000 β-丙内酯灭活。

以传代细胞制备生物制品安全性的关键是细胞残留DNA的含量，按WHO规程要求，疫苗的基质DNA必须小于100pg/剂。本发明去除Vero细胞DNA的方法之一是利用硫酸鱼精蛋白和DNA所带电荷相反，相互结合形成沉淀，通过高速离心去除。具体作法是边搅拌边向灭活病毒浓缩液中硫酸鱼精蛋白至终浓度1～2mg/ml，于2～8℃作用2～4小时，然后于2～8℃ 7000～8000rpm，离心15分钟。另一种方法是用DNase(DNA酶)对浓缩液中的Vero细胞DNA进行切割，具体操作中在经灭活的病毒浓缩液中加入终浓度0.5～1.5U/ml的DNase I，室温下作用6～10小时。

用上述两种方法之一去除Vero细胞DNA后以Sepharose 4 FastFlow(中文名：琼脂糖凝胶4FF)为填料进行层析纯化，检测结果表明，经上述处理的纯化后病毒原液总蛋白含量减少约99％以上，牛血清和Vero细胞DNA残余量均符合WHO有关规程要求。

纯化后病毒原液加入人血白蛋白、蔗糖为保护剂制成液体制剂，或加入人血白蛋白、蔗糖、明胶作为保护剂和赋型剂制成冻干制剂。

上述Fibra-Cel disks载体是由英国BIBBY STERILIN COMPANY根据cGMP标准生产，由聚酯无纺纤维和聚丙烯组成。Fibra-Cel disks载体还经过静电处理使得悬浮细胞容易贴附到载体，并在培养过程中一直固定在纤维***内。每克Fibra-Cel disks载体表面积约1200cm²，disks直径6mm，10克disks载体床体积为100ml，所需细胞接种密度2～5×10⁵/ml，可以高压灭菌。

本发明以上述Fibra-Cel disks为细胞载体，并选用具有固定床篮式搅拌***的生物反应器为培养***，具有以下优点：

①贯穿整个床体的压降小。整个床体各个位置保持均一的细胞生长微环境，而且也有利于生物反应器的放大。

②拥有较高的比表面积。增加生物反应器内细胞总量，从而显著增加细胞分泌物的产量。

③细胞所受的剪切力较小。应用固定床技术，细胞深陷于Fibra-Cel disks载体内，屏蔽了搅拌浆旋转和气泡喷射所产生的湍流。

④高效的营养和氧传递。由于固定床内的剪切力很小，可以使用较高的搅拌速度，从而提高营养和氧的传递，使位于固定床底部和顶部的细胞具有同样的活力。

⑤简单高效地分离细胞分泌产物。由于采用固定床，细胞固定于培养载体上，其分泌产物施放至培养液中，因此没有悬浮微载体通常发生的堵塞现象，亦不需要通过过滤将细胞与其分泌产物分离。

⑥细胞贴壁时间短，所需细胞接种密度低。细胞贴壁于传统微载体(Cytodex 1悬浮载体)大约需6小时(接种密度1×10⁶/ml)，而贴壁于Fibra-Cel disks载体只需15-60分钟(接种密度3×10⁵/ml)。

采用本发明的方法可实现在较小容量的生物反应器中，连续收获病毒，实现大规模生产。

下面为用5L、14L、30L生物反应器生产试验：

分别采用5L Celligen Plus生物反应器，每罐装载Fibra-Cel Disks载体192克；14L Celligen Plus生物反应器，每罐装载Fibra-Cel Disks载体500克；30L BioFlo 4500生物反应器，每罐装载Fibra-Cel Disks载体1000克；Vero细胞，本公司自有，经鉴定合乎疫苗生产用细胞基质要求；工作毒株aGV₁₅，本公司自有；细胞增殖培养基：199(Gibco)，加10％新生牛血清，调pH 7.0；细胞维持培养基：199(Gibco)，加0.4％人血白蛋白，调pH 7.5；新生牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；人血白蛋白：深圳光明卫武生物制品有限公司。

采用细胞增殖培养基，设定生物反应器培养条件为pH 7.0，温度37℃，DO 50％，搅拌速度90rpm，以密度5×10⁵/ml接种细胞，用细胞增殖培养9天后，以0.025M.O.I接种病毒，换用细胞维持培养基，设定生物反应器培养条件为pH值7.5，温度35℃，DO 50％，搅拌速度90rpm，连续灌注培养，分别以10L/天、30L/天和60L/天的速度持续加入细胞维持培养基，同时以相同的速度持续收获病毒，连续收毒24天，定期罐内取样测病毒滴度，结果见表1。

表1

不同罐体积生物反应器中，aGV毒株在Vero细胞接种后病毒滴度的变化

病毒滴度(lgLD50/ml)
										收毒天数	1	3	6	9	12	15	18	21	24
5L生物反应器	7.2	7.5	8.0	8.5	8.8	8.2	7.8	7.2	6.8
										14L生物反应器	7.0	7.6	8.1	8.6	8.7	8.1	7.5	7.1	6.5
30L生物反应器	7.0	7.3	7.8	8.3	8.9	8.0	7.6	7.0	6.8

由表1可以看出以0.025M.O.I感染量感染量接种病毒，连续收毒21天不同罐体积的生物反应器均可维持病毒滴度在≥7.0lgLD50/ml，可以预见采用此工艺培养规模可放至更大。

附图说明

图1本发明制备方法的方框流程图。

具体实施方式

实施例1

(1)先将Vero细胞进行细胞的复苏、转瓶扩增培养，再以3.5×10⁵/ml的密度接种至以Fibra-Cel disks为载体的具有固定床篮式搅拌***的Celligen Plus生物反应器罐中(容量可以为2.2升、5升、7.5升或14升)，用细胞增殖培养液进行扩增培养，其中Fibra-Celdisks载体的使用量为每升罐体积30克，所用的细胞增殖培养液使用199培养基加6％牛血清及适量的硫酸庆大霉素。细胞增殖培养的条件为pH值7.2，温度37℃，溶解氧(DO)50％，搅拌速度120rpm。

(2)在Vero细胞生长至一定密度时，一般6～12天，然后换用细胞维持培养液，以0.025～0.125MOI感染复数(MOI：用于感染的病毒数目与细胞数目的比值)或终浓度4.5～5.5lgLD₅₀/ml(LD₅₀：半数致死剂量)接种狂犬病毒CTN-1株，并使之感染，细胞所用的细胞维持培养液使用199培养基加0.1％的人血白蛋白配制而成，细胞维持培养的条件为pH值7.6，温度35℃，溶解氧(DO)50％，搅拌速度120rpm。

连续灌注收获20天，病毒滴度保持在7lgLD50/ml以上。

(3)收获的病毒液用200K分子量截留的超滤膜浓缩30倍，然后用1∶4000 β-丙内酯灭活.

(4)边搅拌边向灭活病毒浓缩液中添加硫酸鱼精蛋白至终浓度1mg/ml，于4℃作用2小时，然后于4℃ 7000rpm条件下，离心15分钟。

(5)随后以Sepharose 4 Fast Flow为填料进行层析纯化。

(6)纯化后病毒原液加入人血白蛋白、蔗糖为保护剂制成液体制剂。

实施例2

(1)先将Vero细胞进行细胞的复苏、转瓶扩增培养，再以5×10⁵/ml的密度接种至以Fibra-Cel disks为载体的具有固定床篮式搅拌***的BioFlo 4500生物反应器罐中(容量可以为20升、30升)，用细胞增殖培养液进行扩增培养，其中Fibra-Cel disks载体的使用量为每升罐体积40克，所用的细胞增殖培养液使用199培养基加2％牛血清及适量的硫酸庆大霉素。细胞增殖培养的条件为pH值6.9，温度36℃，溶解氧(DO)30％，搅拌速度30rpm。

(2)在Vero细胞生长至一定密度时，一般6～12天，然后换用细胞维持培养液，以0.025～0.125MOI感染复数(MOI：用于感染的病毒数目与细胞数目的比值)或终浓度4.5～5.5lgLD₅₀/ml(LD₅₀：半数致死剂量)接种狂犬病毒aGV株，并使之感染，细胞所用的细胞维持培养液使用199培养基加0.05％的人血白蛋白配制而成，细胞维持培养的条件为pH值7.2，温度36℃，溶解氧(DO)70％，搅拌速度30rpm。

连续灌注收获20天，病毒滴度保持在7lgLD50/ml以上。

(3)收获的病毒液用100K分子量截留的超滤膜浓缩60倍，然后用1∶4000 β-丙内酯灭活。

(4)边搅拌边向灭活病毒浓缩液中添DNase(DNA酶)至终浓度0.5～1.5U/ml，室温下作用6～10小时。

(5)随后以Sepharose 4 Fast Flow为填料进行层析纯化。

(6)纯化后病毒原液加入人血白蛋白、蔗糖为保护剂制成液体制剂。

实施例3

(1)先将Vero细胞进行细胞的复苏、转瓶扩增培养，再以25×10⁵/ml的密度接种至以Fibra-Cel disks为载体的具有固定床篮式搅拌***的BioFlo Pro生物反应器罐中(容量可以为75升、150升、300升)，用细胞增殖培养液进行扩增培养，其中Fibra-Cel disks载体的使用量为每升罐体积30克，所用的细胞增殖培养液使用199培养基加10％牛血清及适量的硫酸庆大霉素。细胞增殖培养的条件为pH值7.4，温度38℃，溶解氧(DO)70％，搅拌速度150rpm。

(2)在Vero细胞生长至一定密度时，一般6～12天，然后换用细胞维持培养液，以0.025～0.125MOI感染复数(MOI：用于感染的病毒数目与细胞数目的比值)或终浓度4.5～5.5lgLD₅₀/ml(LD₅₀：半数致死剂量)接种狂犬病毒CTN-1株，并使之感染，细胞所用的细胞维持培养液使用199培养基加0.5％的人血白蛋白配制而成，细胞维持培养的条件为pH值8.0，温度32℃，溶解氧(DO)30％，搅拌速度150rpm。

连续灌注收获20天，病毒滴度保持在7lgLD50/ml以上。

(3)收获的病毒液用300K分子量截留的超滤膜浓缩100倍，然后用1∶4000 β-丙内酯灭活。

(4)边搅拌边向灭活病毒浓缩液中添加硫酸鱼精蛋白至终浓度2mg/ml，于8℃作用2小时，然后于2℃ 8000rpm条件下，离心15分钟。

(5)随后以Sepharose 4 Fast Flow为填料进行层析纯化。

(6)纯化后病毒原液加入人血白蛋白、蔗糖、明胶作为保护剂和赋型剂制成冻干制剂。

上述所用的199培养基选自北京清大天一生物技术有限公司，其具体配制组成为：

成分	含量(mg/L)	成分	含量(mg/L)
				氯化钙	200.00	D-葡萄糖	1000.00
九水硝酸铁	0.70	谷胱甘肽(还原型)	0.05
				氯化钾	400.00	盐酸鸟嘌呤	0.30
无水硫酸镁	97.67	次黄嘌呤	0.30
				磷酸二氢钾	-	酚红	20.00
氯化钠	6800.00	D-核糖	0.50
				无水磷酸二氢钠	121.74	乙酸钠	50.00
磷酸氢二钠	-	胸腺嘧啶	0.30
				L-丙氨酸	25.00	吐温80	20.00
L-精氨酸盐酸盐	70.00	尿嘧啶	0.30
				L-天门冬氨酸	30.00	黄嘌呤	0.30
L-半胱氨酸盐酸盐	0.11	维生素C	0.05
				L-胱氨酸盐酸盐	26.00	维生素E	0.01
L-谷氨酸	75.00	维生素H	0.01
				L-谷氨酰胺	100.00	维生素D2	0.10
甘氨酸	50.00	D-泛酸钙	0.01
				L-组氨酸盐酸盐	21.88	氯化胆碱	0.50
L-羟脯氨酸	10.00	叶酸	0.01
				L-异亮氨酸	40.00	i-肌醇	0.05
L-亮氨酸	60.00	维生素K3	0.01
				L-赖氨酸盐酸盐	70.00	烟酸	0.025

L-蛋氨酸	15.00	烟酰胺	0.025
				L-苯丙氨酸	25.00	对氨基苯甲酸	0.05
L-脯氨酸	40.00	盐酸吡哆醛	0.025
				L-丝氨酸	25.00	盐酸吡哆醇	0.025
L-苏氨酸	30.00	核黄素	0.01
				L-色氨酸	10.00	盐酸硫胺	0.01
L-酪氨酸	40.00	维生素A醋酸酯	0.14
				L-缬氨酸	25.00
硫酸腺嘌呤	10.00	pH(无碳酸氢钠)	4.2±0.3
				腺苷酸	0.20	pH(加碳酸氢钠)	7.3±0.3
三磷酸腺苷二钠	1.00	渗透压(无碳酸氢钠)	250±5％
				胆固醇	0.20	渗透压(加碳酸氢钠)	288±5％
脱氧核糖	0.50

Claims (11)

1、一种大规模生产狂犬病疫苗的方法，其特征在于其工艺步骤为：

(1)在以Fibra-Cel disks为载体的具有固定床篮式搅拌***的生物反应器中，用细胞增殖培养液培养Vero细胞；

(2)在Vero细胞生长至一定密度时，换用细胞维持培养液，接种狂犬病毒，并使之感染细胞；

(3)使病毒增殖；

(4)连续收获病毒；

(5)超滤浓缩并用β-丙内酯灭活；

(6)用硫酸鱼精蛋白或DNA酶处理以去除Vero细胞DNA；

(7)以Sepharose 4 Fast Flow为填料进行层析纯化；

(8)加入人血白蛋白、蔗糖为保护剂制成液体制剂，或加入人血白蛋白、蔗糖、明胶作为保护剂和赋型剂制成冻干制剂。

2、按照权利要求所述的大规模生产狂犬病疫苗的方法，其特征是：所述的具有固定床篮式搅拌***的生物反应器可以选用罐体积为2.2升、5升、7.5升、14升Celligen Plus生物反应器，罐体积为20升、30升的BioFlo 4500生物反应器及罐体积75升、150升、300升的BioFlo Pro生物反应器中的任意一种。

3、按照权利要求1所述的大规模生产狂犬病疫苗的方法，其特征在于上述细胞增殖培养液使用199号培养基加2～10％的牛血清配制而成，其培养条件为pH值6.9～7.4，温度36～38℃，溶解氧30～70％，搅拌速度30～150rpm。

4、按照权利要求1或3所述的大规模生产狂犬病疫苗的方法，其特征在于上述细胞增殖培养液中还加入适量庆大霉素。

5、按照权利要求1所述的大规模生产狂犬病疫苗的方法，其特征在于上述Fibra-Cel disks载体的使用量为每升罐体积30～40克。

6、按照权利要求1所述的大规模生产狂犬病疫苗的方法，其特征在于上述Vero细胞以2～5×10⁵/ml的密度接种在生物反应器，后扩增培养6～12天后可接种狂犬病毒。

7、按照权利要求1所述的大规模生产狂犬病疫苗的方法，其特征在于细胞维持培养液使用199培养基加0.05％～0.5％的人血白蛋白配制而成，其培养条件为pH值7.2～8.0，温度32～36℃，溶解氧30～70％，搅拌速度30～150rpm。

8、按照权利要求1所述的大规模生产狂犬病疫苗的方法，其特征在于选用的狂犬病毒为CTN-1株或aGV株，该狂犬病毒以0.025～0.125MOI的感染复数或终浓度4.5～5.5lgLD₅₀/ml感染所述细胞。

9、按照权利要求1所述的大规模生产狂犬病疫苗的方法，其特征在于所述超滤浓缩是指采用100K～300K分子量截留的超滤膜浓缩30～100倍。

10、按照权利要求1所述的大规模生产狂犬病疫苗的方法，其特征在于所述的用硫酸鱼精蛋白处理以去除Vero细胞DNA的具体过程为：边搅拌边向灭活病毒浓缩液中添加硫酸鱼精蛋白至终浓度1～2mg/ml，于2～8℃下作用2～4小时，然后于2～8℃，7000～8000rpm条件下，离心15分钟。

11、按照权利要求1所述的大规模生产狂犬病疫苗的方法，其特征在于所述的用DNA酶处理以去除Vero细胞DNA的具体过程为：边搅拌边向灭活病毒浓缩液中添加DNA酶至终浓度0.5～1.5U/ml，在室温下作用6～10小时。