CN105749270A - 轮状病毒疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种轮状病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：轮状病毒在MRC5细胞上进行适应性培养，连续传1012代；复苏MRC5细胞后，待其生长至致密单层时，按1:31:4进行传代培养34天；在培养基中加入浓度为1015g/L的微载体，接种初始密度为0.52×106cells/ml的经传代培养的MRC5细胞至生物反应器，使其在所述微载体上生长；待MRC5细胞生长至13×107cells/ml时，接种经胰酶激活后的血清型轮状病毒，使其感染MRC5细胞；待CPE达到80％以上时，收获病毒液后，将其制成多价轮状病毒活疫苗。本发明还公开了相应的轮状病毒疫苗。本发明可大幅度提高轮状病毒疫苗安全性、病毒收获量和滴度，节约劳动力成本与时间成本，大大降低生产成本，高效应用于多价轮状病毒疫苗的大规模化生产中。

Description

轮状病毒疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物活细胞制药领域，尤其涉及一种轮状病毒疫苗及其制备方法。
背景技术
轮状病毒主要感染3月龄到5岁的儿童，其感染率可达30％-65％，其中6月龄到2岁的儿童中发生中度和重度感染最多。据世界卫生组织(WHO)报告，在2008年时全球约有45.3万儿童死于轮状病毒胃肠炎(RVGE)，约占全部死亡儿童的5％，5岁以下儿童的死亡率为86/10万。其中，中国轮状病毒腹泻死亡率占全球8％。此外，我国各省、市均有报道轮状病毒爆发流行的记载。轮状病毒腹泻不仅危害人类生命健康，也对社会和家庭造成了巨大的经济损失。因此，在2009年，WHO建议所有成员国将RV疫苗纳入其儿童计划免疫程序中，尤其是腹泻死亡率占5岁以下儿童总死亡率达到10％以上的国家。
由于轮状病毒的血清型别多样，并且优势流行株在不断地更新和变化，不同血清型之间缺乏有效的交叉保护作用。目前市售的轮状病毒疫苗虽然能对重症腹泻起到良好的保护作用，但却不能很好地预防RV感染。因此，研制一种包括人轮状病毒最常见的几个血清型别的多价RV疫苗是当前的主流方向。
多价轮状病毒疫苗研发过程中，如何提高病毒滴度和增加病毒收获量是关键点。一般常用动物细胞进行病毒增殖。目前常用的动物细胞大规模培养方法有转瓶培养、细胞工厂培养和生物反应器培养等。转瓶技术为传统的贴壁细胞培养技术，转瓶培养具有结构简单，投资少，技术成熟，放大只需简单的增加转瓶数量等优点。但也有其缺点：劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，容易被环境污染，细胞生长密度低，瓶间差异和批间差异较难控制等，因而难以产业化或规模化生产，还容易出现被细菌或其它病毒污染而致的疫苗质量隐患，涉及生物安全和公共卫生问题。
细胞工厂(Cell Factory)是一种在有限的空间内利用了最大限度的培养表面，从而节省了大量的厂房空间，无需进行任何厂房改造即可实现扩大产能的目的。丹麦NUNC公司生产的NUNC细胞工厂是目前应用较多的细胞工厂***。可用于如疫苗、单克隆抗体或生物制药等工业规模生产，特别适合于贴壁细胞，也可用于悬浮培养，在从实验室规模进行放大时不会改变细胞生长的动力学条件，可提供1、2、10和40层的规格使放大变得简单易行，低污染风险，节省空间，培养表面经测试保证最有利于细胞贴附和生长。但细胞工厂也有一些使用的不便之处：如消化细胞时由于无法进行吹打或使用刮刀辅助，较难将细胞全部都消化下来；产品价格较贵，消毒需要用钴60照射后再利用，生产成本大大增加；此外，收获量较少，清洗不方便。
微载体培养技术是利用片状或球状微载体使细胞贴在其表面，在生物反应器中培养的技术。高密度的微载体大大增加了细胞培养的表面积，从而实现产能的扩大。微载体适于摇瓶、转瓶、搅拌罐以及WAVE生物反应器等各种培养***。采用微载体培养贴壁细胞是当前最有发展前途的一种培养模式，其优势在于：比表面积大；采用均匀悬浮培养，将悬浮培养与贴壁培养的优点融合，简化了环境因素的检测与控制；培养基利用率高；容易放大；劳动强度小；培养***占用空间小；降低成本和避免污染。然而，现有的采用微载体生物反应器培养轮状病毒疫苗技术均不成熟，难以实现大规模生产。
发明内容
本发明所解决的技术问题是，提供一种轮状病毒疫苗的制备方法，该方法可大幅度提高轮状病毒疫苗安全性、病毒收获量和滴度，节约劳动力成本与时间成本，大大降低生产成本，高效应用于多价轮状病毒疫苗的大规模化生产中。
本发明进一步所解决的技术问题是，提供一种轮状病毒疫苗，该疫苗可大幅度提高轮状病毒疫苗安全性、病毒收获量和滴度，节约劳动力成本与时间成本，大大降低生产成本，高效应用于多价轮状病毒疫苗的大规模化生产中。
为了解决上述技术问题，本发明公开了以下方案：
一种轮状病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，轮状病毒在MRC-5细胞上进行适应性培养，连续传10-12代；
步骤2，复苏MRC-5细胞后，待其生长至致密单层时，按1:3-1:4进行传代培养3-4天；
步骤3，在培养基中加入浓度为10-15g/L的微载体，接种初始密度为0.5-2×106cells/ml的经传代培养的MRC-5细胞至生物反应器，使其在所述微载体上生长；
步骤4，待MRC-5细胞生长至1-3×107cells/ml时，接种经胰酶激活后的血清型轮状病毒，使其感染MRC-5细胞；
步骤5，待CPE达到80％以上时，收获病毒液后，将其制成多价轮状病毒活疫苗。
优选地，所述微载体采用GE公司的Cytodex Ⅰ微载体，所述生物反应器采用美国NBS公司的310型14L细胞培养生物反应器。
优选地，在所述步骤3中，保持所述生物反应器控制参数为：pH值7.0-7.8、温度35℃-37℃、溶氧40％-60％、搅拌速率20-75rpm。
优选地，在所述步骤4中，按照MOI＝0.001-0.05比例接种病毒，将搅拌速率控制在25rpm，使病毒均匀吸附于细胞表面，约1-2小时后，再将搅拌速率控制在50～75rpm。
优选地，所述轮状病毒通过以下步骤进行胰酶激活：
将激活剂加入病毒液中，使得胰酶终浓度为10～30μg/ml，置于37℃水浴中作用70-90分钟，期间摇晃2-3次。
优选地，在所述步骤3中，采用连续灌流式培养。
优选地，所述培养基成分包括BME、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和10％小牛血清。
优选地，上述各步骤中，用Vero细胞替代所述MRC-5细胞；用M199、DMEM、碳酸氢钠和10％小牛血清替代所述培养基成分。
优选地，所述轮状病毒为G1、G2、G3、G4、G9型轮状病毒中的任意至少一种。
相应地，本发明还公开了一种轮状病毒疫苗，根据如上所述的方法制得。
本发明的有益效果是：
本发明的实施例通过采用微载体和生物反应器相结合培养人胚肺成纤维(MRC-5)细胞增殖轮状病毒，从而大幅度提高轮状病毒疫苗安全性、病毒收获量和滴度，节约劳动力成本与时间成本，大大降低生产成本，高效应用于多价轮状病毒疫苗的规模化生产中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的轮状病毒疫苗的制备方法第一实施例中轮状病毒在MRC-5细胞上的适应性培养滴度变化示意图。
图2是本发明的轮状病毒疫苗的制备方法第一实施例中微载体悬浮培养MRC-5细胞在不同时间的生长状态示意图。其中，A为MRC-5细胞贴附微载体24h；B为MRC-5细胞贴附微载体48h；C为MRC-5细胞贴附微载体72h；D为MRC-5细胞贴附微载体96h；E为MRC-5细胞贴附微载体120h；F为MRC-5细胞贴附微载体144h。
图3是本发明的轮状病毒疫苗的制备方法第一实施例中微载体悬浮培养MRC-5细胞增殖轮状病毒感染不同时间的增殖曲线示意图；其中，A为Vero细胞贴附微载体24h；B为Vero细胞贴附微载体48h；C为Vero细胞贴附微载体72h；D为Vero细胞贴附微载体96h；E为Vero细胞贴附微载体120h；F为Vero细胞贴附微载体144h。
图4是本发明的轮状病毒疫苗的制备方法第二实施例中微载体悬浮培养Vero细胞在不同时间的生长状态示意图；其中，A为接种轮状病毒24h后细胞状态；B为接种轮状病毒48h后细胞状态；C为接种轮状病毒72h后细胞状态；D为接种轮状病毒96h后细胞状态。
图5是本发明的轮状病毒疫苗的制备方法第二实施例中接种轮状病毒后不同时间下Vero细胞病变状态示意图。
图6是本发明的轮状病毒疫苗的制备方法第二实施例中微载体悬浮培养轮状病毒感染不同时间的增殖曲线示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明提供的轮状病毒疫苗的制备方法的第一实施例，本实施例实现一次轮状病毒疫苗制备的流程主要包括以下步骤：
在步骤1中，轮状病毒在MRC-5细胞上进行适应性培养，连续传10-12代；
在步骤2中，复苏MRC-5细胞后，待其生长至致密单层时，按1:3-1:4进行传代培养3-4天；
在步骤3中，在培养基中加入浓度为10-15g/L的微载体，接种初始密度为0.5-2×106cells/ml的经传代培养的MRC-5细胞至生物反应器，使其在所述微载体上生长；
在步骤4中，待MRC-5细胞生长至1-3×107cells/ml时，接种经胰酶激活后的各血清型轮状病毒，使其感染MRC-5细胞；
在步骤5中，待CPE达到80％以上时，收获病毒液后，将其制成多价轮状病毒活疫苗。
优选地，所述轮状病毒通过以下步骤进行胰酶激活：
将激活剂加入病毒液中，使得胰酶终浓度为10～30μg/ml，置于37℃水浴中作用70-90分钟，期间摇晃2-3次。
优选地，在所述步骤3中，采用连续灌流式培养。
具体实现时，所述培养基成分可包括BME、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和10％小牛血清。
具体实现时，所述轮状病毒可为G1、G2、G3、G4、G9型等各种血清型轮状病毒。
具体实现时，所述微载体可采用GE公司的Cytodex Ⅰ微载体。CytodexTM系微载体专用于培养各类动物细胞，其培养体积可以从数毫升到6000升以上。应用Cytodex微载体技术，可以实现简单的贴壁细胞悬浮化培养，每毫升培养液可得到数百万细胞。
具体实现时，所述生物反应器可采用美国NBS公司的310型14L细胞培养生物反应器。BLOFLO310型14L细胞培养生物反应器是目前世界上最先进的动、植物细胞培养***，其特点是：适合贴壁培养细胞和悬浮细胞；适合各种动物细胞、昆虫细胞和植物细胞等；灌流式的培养过程；低(无)剪切力搅拌，无气泡通气；通过持续检测摄氧率实时检测细胞浓度；其灌流式培养属于连续培养，细胞保留在反应器***中，收获培养液的同时不断加入新鲜培养基。灌流式培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分，并带走代谢产物。同时，细胞保留在反应器中，可以达到很高的细胞密度。同其他方法相比，灌流式培养的病毒产率可以提高一个数量级，并可以大大降低劳动力的消耗。
进一步地，在所述步骤3中，保持所述生物反应器控制参数为：pH值7.0-7.8、温度35℃-37℃、溶氧40％-60％、搅拌速率20-75rpm。
更进一步地，在所述步骤4中，按照MOI＝0.001-0.05比例接种病毒，将搅拌速率控制在25rpm，使病毒均匀吸附于细胞表面，约1-2小时后，再将搅拌速率控制在50～75rpm。
由图1可以看出，轮状病毒在MRC-5细胞上传代培养，随着代次的增加，表现出毒力与增殖能力增强的趋势。
由图3可以看出，微载体悬浮培养MRC-5细胞扩增轮状病毒，病毒滴度随感染时间的增加而增强，并且，拥有更高的安全性，有成为轮状病毒疫苗生产的细胞基质的应用前景。
下面结合若干实例对本实施例涉及的各种血清型轮状病毒进行详细说明。
实例1
微载体悬浮培养MRC-5细胞增殖轮状病毒
(1)轮状病毒在MRC-5细胞上的适应性培养，连续传10代，检测其滴度变化。
(2)以转瓶进行细胞的传代与增殖：复苏细胞后，待细胞生长至致密单层时，按1:3～1:4进行传代培养，培养3～4天。2个长至致密单层的T225细胞瓶可传到1个3L转瓶。
(3)轮状病毒接种前处理：将激活剂加入病毒液中使得胰酶终浓度为10～30μg/ml，置于37℃水浴中作用70～90min，期间摇晃2～3次。
(4)选用的微载体为GE公司的Cytodex Ⅰ，按5～10g/L加入培养基中，细胞接种生物反应器的初始密度为2～5×105cells/ml，接种后每隔24h取样观察细胞在微载体上的生长状况。
(5)当细胞生长到1～3×106cells/ml时，按MOI＝0.001～0.05比例接种各种血清型轮状病毒，使病毒感染细胞，每隔24h取样观察细胞病变情况。
(6)调节生物反应器控制参数：pH为7.2～7.6、温度为35℃～37℃、溶氧40％～60％、搅拌速率在20～50rpm。
(7)待CPE达到80％以上时收获病毒液，反复冻融数次后，取样进行滴度测定。
实例2
微载体生物反应器悬浮培养MRC-5细胞增殖G1型轮状病毒
(1)轮状病毒在MRC-5细胞上的适应性培养，连续传10代，检测其滴度变化。
(2)以转瓶进行细胞的传代与增殖：复苏细胞后，待细胞生长至致密单层时，按1:3～1:4进行传代培养，培养3～4天。2个长至致密单层的T225细胞瓶可传到1个3L转瓶。
(3)轮状病毒接种前处理：将激活剂加入病毒液中使得胰酶终浓度为10～30μg/ml，置于37℃水浴中作用70～90min，期间摇晃2～3次。
(4)选用的微载体为GE公司的Cytodex Ⅰ，按5～10g/L加入培养基中，细胞接种生物反应器的初始密度为2～5×105cells/ml，接种后每隔24h取样观察细胞在微载体上的生长状况。
(5)当细胞生长到1～3×106cells/ml时，按MOI＝0.001～0.05比例接种各种血清型轮状病毒，使病毒感染细胞，每隔24h取样观察细胞病变情况。
(6)调节生物反应器控制参数：pH为7.2～7.6、温度为35℃～37℃、溶氧40％～60％、搅拌速率在20～50rpm。
(7)待CPE达到80％以上时收获病毒液，反复冻融数次后，取样进行滴度测定。
实例3
微载体生物反应器悬浮培养MRC-5细胞增殖G2型轮状病毒
(1)轮状病毒在MRC-5细胞上的适应性培养，连续传10代，检测其滴度变化。
(2)以转瓶进行细胞的传代与增殖：复苏细胞后，待细胞生长至致密单层时，按1:3～1:4进行传代培养，培养3～4天。2个长至致密单层的T225细胞瓶可传到1个3L转瓶。
(3)轮状病毒接种前处理：将激活剂加入病毒液中使得胰酶终浓度为10～30μg/ml，置于37℃水浴中作用70～90min，期间摇晃2～3次。
(4)选用的微载体为GE公司的Cytodex Ⅰ，按5～10g/L加入培养基中，细胞接种生物反应器的初始密度为2～5×105cells/ml，接种后每隔24h取样观察细胞在微载体上的生长状况。
(5)当细胞生长到1～3×106cells/ml时，按MOI＝0.001～0.05比例接种各种血清型轮状病毒，使病毒感染细胞，每隔24h取样观察细胞病变情况。
(6)调节生物反应器控制参数：pH为7.2～7.6、温度为35℃～37℃、溶氧40％～60％、搅拌速率在20～50rpm。
(7)待CPE达到80％以上时收获病毒液，反复冻融数次后，取样进行滴度测定。
实例4
微载体生物反应器悬浮培养MRC-5细胞增殖G3型轮状病毒
(1)轮状病毒在MRC-5细胞上的适应性培养，连续传10代，检测其滴度变化。
(2)以转瓶进行细胞的传代与增殖：复苏细胞后，待细胞生长至致密单层时，按1:3～1:4进行传代培养，培养3～4天。2个长至致密单层的T225细胞瓶可传到1个3L转瓶。
(3)轮状病毒接种前处理：将激活剂加入病毒液中使得胰酶终浓度为10～30μg/ml，置于37℃水浴中作用70～90min，期间摇晃2～3次。
(4)选用的微载体为GE公司的Cytodex Ⅰ，按5～10g/L加入培养基中，细胞接种生物反应器的初始密度为2～5×105cells/ml，接种后每隔24h取样观察细胞在微载体上的生长状况。
(5)当细胞生长到1～3×106cells/ml时，按MOI＝0.001～0.05比例接种各种血清型轮状病毒，使病毒感染细胞，每隔24h取样观察细胞病变情况。
(6)调节生物反应器控制参数：pH为7.2～7.6、温度为35℃～37℃、溶氧40％～60％、搅拌速率在20～50rpm。
(7)待CPE达到80％以上时收获病毒液，反复冻融数次后，取样进行滴度测定。
实例5
微载体生物反应器悬浮培养MRC-5细胞增殖G4型轮状病毒
(1)轮状病毒在MRC-5细胞上的适应性培养，连续传10代，检测其滴度变化。
(2)以转瓶进行细胞的传代与增殖：复苏细胞后，待细胞生长至致密单层时，按1:3～1:4进行传代培养，培养3～4天。2个长至致密单层的T225细胞瓶可传到1个3L转瓶。
(3)轮状病毒接种前处理：将激活剂加入病毒液中使得胰酶终浓度为10～30μg/ml，置于37℃水浴中作用70～90min，期间摇晃2～3次。
(4)选用的微载体为GE公司的Cytodex Ⅰ，按5～10g/L加入培养基中，细胞接种生物反应器的初始密度为2～5×105cells/ml，接种后每隔24h取样观察细胞在微载体上的生长状况。
(5)当细胞生长到1～3×106cells/ml时，按MOI＝0.001～0.05比例接种各种血清型轮状病毒，使病毒感染细胞，每隔24h取样观察细胞病变情况。
(6)调节生物反应器控制参数：pH为7.2～7.6、温度为35℃～37℃、溶氧40％～60％、搅拌速率在20～50rpm。
(7)待CPE达到80％以上时收获病毒液，反复冻融数次后，取样进行滴度测定。
实例6
微载体生物反应器悬浮培养MRC-5细胞增殖G9型轮状病毒
(1)轮状病毒在MRC-5细胞上的适应性培养，连续传10代，检测其滴度变化。
(2)以转瓶进行细胞的传代与增殖：复苏细胞后，待细胞生长至致密单层时，按1:3～1:4进行传代培养，培养3～4天。2个长至致密单层的T225细胞瓶可传到1个3L转瓶。
(3)轮状病毒接种前处理：将激活剂加入病毒液中使得胰酶终浓度为10～30μg/ml，置于37℃水浴中作用70～90min，期间摇晃2～3次。
(4)选用的微载体为GE公司的Cytodex Ⅰ，按5～10g/L加入培养基中，细胞接种生物反应器的初始密度为2～5×105cells/ml，接种后每隔24h取样观察细胞在微载体上的生长状况。
(5)当细胞生长到1～3×106cells/ml时，按MOI＝0.001～0.05比例接种各种血清型轮状病毒，使病毒感染细胞，每隔24h取样观察细胞病变情况。
(6)调节生物反应器控制参数：pH为7.2～7.6、温度为35℃～37℃、溶氧40％～60％、搅拌速率在20～50rpm。
(7)待CPE达到80％以上时收获病毒液，反复冻融数次后，取样进行滴度测定。
下面参考图4-图6详细描述本发明提供的轮状病毒疫苗的制备方法的第二实施例，本实施例与前述实施例基本相同，其主要区别在于，上述各步骤中，用WHO-Vero细胞替代所述MRC-5细胞，相应地，其培养基成分可用M199、DMEM、碳酸氢钠和10％小牛血清替代。
下面结合若干实例对本实施例涉及的各种血清型轮状病毒进行详细说明。
实例7
微载体生物反应器悬浮培养Vero细胞增殖G1型轮状病毒
(1)以转瓶进行细胞的传代与增殖：复苏细胞后，待细胞生长至致密单层时，按1:3～1:4进行传代培养，培养3～4天。2个长至致密单层的T225细胞瓶可传到1个3L转瓶。
(2)轮状病毒接种前处理：将激活剂加入病毒液中使得胰酶终浓度为10～20μg/ml，置于37℃水浴中作用60～80min，期间摇晃2～3次。
(3)选用的微载体为GE公司的Cytodex Ⅰ，按12～15g/L加入培养基中，细胞接种生物反应器的初始密度为0.5～2×106cells/ml，接种后每隔24h取样观察细胞在微载体上的生长状况。
(4)当细胞生长到1～3×107cells/ml时，按MOI＝0.01～0.05比例接种各种血清型轮状病毒，使病毒感染细胞，每隔24h取样观察细胞病变情况。
(5)调节生物反应器控制参数：pH为7.0～7.8、温度为35℃～37℃、溶氧40％～60％、搅拌速率在20～50rpm。
(6)待CPE达到80％以上时收获病毒液，反复冻融数次后，离心、浓缩、与其它血清型病毒液按一定比例混合加入保护剂等步骤制成多价轮状病毒活疫苗。
实例8
微载体生物反应器悬浮培养Vero细胞增殖G2型轮状病毒
(1)以转瓶进行细胞的传代与增殖：复苏细胞后，待细胞生长至致密单层时，按1:3～1:4进行传代培养，培养3～4天。2个长至致密单层的T225细胞瓶可传到1个3L转瓶。
(2)轮状病毒接种前处理：将激活剂加入病毒液中使得胰酶终浓度为20～30μg/ml，置于37℃水浴中作用60～75min，期间摇晃2～3次。
(3)选用的微载体为GE公司的Cytodex Ⅰ，按12～15g/L加入培养基中，细胞接种生物反应器的初始密度为0.5～2×106cells/ml，接种后每隔24h取样观察细胞在微载体上的生长状况。
(4)当细胞生长到1～3×107cells/ml时，按MOI＝0.004～0.008比例接种各种血清型轮状病毒，使病毒感染细胞，每隔24h取样观察细胞病变情况。
(5)调节生物反应器控制参数：pH为7.0～7.8、温度为35℃～37℃、溶氧40％～60％、搅拌速率在20～50rpm。
(6)待CPE达到80％以上时收获病毒液，反复冻融数次后，离心、浓缩、与其它血清型病毒液按一定比例混合加入保护剂等步骤制成多价轮状病毒活疫苗。
实例9
微载体生物反应器悬浮培养Vero细胞增殖G3型轮状病毒
(1)以转瓶进行细胞的传代与增殖：复苏细胞后，待细胞生长至致密单层时，按1:3～1:4进行传代培养，培养3～4天。2个长至致密单层的T225细胞瓶可传到1个3L转瓶。
(2)轮状病毒接种前处理：将激活剂加入病毒液中使得胰酶终浓度为10～20μg/ml，置于37℃水浴中作用60～75min，期间摇晃2～3次。
(3)选用的微载体为GE公司的Cytodex Ⅰ，按12～15g/L加入培养基中，细胞接种生物反应器的初始密度为0.5～2×106cells/ml，接种后每隔24h取样观察细胞在微载体上的生长状况。
(4)当细胞生长到1～3×107cells/ml时，按MOI＝0.008～0.02比例接种各种血清型轮状病毒，使病毒感染细胞，每隔24h取样观察细胞病变情况。
(5)调节生物反应器控制参数：pH为7.0～7.8、温度为35℃～37℃、溶氧40％～60％、搅拌速率在20～50rpm。
(6)待CPE达到80％以上时收获病毒液，反复冻融数次后，离心、浓缩、与其它血清型病毒液按一定比例混合加入保护剂等步骤制成多价轮状病毒活疫苗。
实例10
微载体生物反应器悬浮培养Vero细胞增殖G4型轮状病毒
(1)以转瓶进行细胞的传代与增殖：复苏细胞后，待细胞生长至致密单层时，按1:3～1:4进行传代培养，培养3～4天。2个长至致密单层的T225细胞瓶可传到1个3L转瓶。
(2)轮状病毒接种前处理：将激活剂加入病毒液中使得胰酶终浓度为20～30μg/ml，置于37℃水浴中作用60～80min，期间摇晃2～3次。
(3)选用的微载体为GE公司的Cytodex Ⅰ，按12～15g/L加入培养基中，细胞接种生物反应器的初始密度为0.5～2×106cells/ml，接种后每隔24h取样观察细胞在微载体上的生长状况。
(4)当细胞生长到1～3×107cells/ml时，按MOI＝0.001～0.04比例接种各种血清型轮状病毒，使病毒感染细胞，每隔24h取样观察细胞病变情况。
(5)调节生物反应器控制参数：pH为7.0～7.8、温度为35℃～37℃、溶氧40％～60％、搅拌速率在20～50rpm。
(6)待CPE达到80％以上时收获病毒液，反复冻融数次后，离心、浓缩、与其它血清型病毒液按一定比例混合加入保护剂等步骤制成多价轮状病毒活疫苗。
实例11
微载体生物反应器悬浮培养Vero细胞增殖G9型轮状病毒
(1)以转瓶进行细胞的传代与增殖：复苏细胞后，待细胞生长至致密单层时，按1:3～1:4进行传代培养，培养3～4天。2个长至致密单层的T225细胞瓶可传到1个3L转瓶。
(2)轮状病毒接种前处理：将激活剂加入病毒液中使得胰酶终浓度为10～20μg/ml，置于37℃水浴中作用70～90min，期间摇晃2～3次。
(3)选用的微载体为GE公司的Cytodex Ⅰ，按12～15g/L加入培养基中，细胞接种生物反应器的初始密度为0.5～2×106cells/ml，接种后每隔24h取样观察细胞在微载体上的生长状况。
(4)当细胞生长到1～3×107cells/ml时，按MOI＝0.01～0.05比例接种各种血清型轮状病毒，使病毒感染细胞，每隔24h取样观察细胞病变情况。
(5)调节生物反应器控制参数：pH为7.0～7.8、温度为35℃～37℃、溶氧40％～60％、搅拌速率在20～50rpm。
(6)待CPE达到80％以上时收获病毒液，反复冻融数次后，离心、浓缩、与其它血清型病毒液按一定比例混合加入保护剂等步骤制成多价轮状病毒活疫苗。
对照例
分别采用3L转瓶、2层细胞工厂和14L微载体生物反应器，对轮状病毒扩增培养，其对比情况见表3。
(1)以转瓶进行细胞的传代与增殖：复苏细胞后，待细胞生长至致密单层时，按1:3～1:4进行传代培养，培养3～4天。2个长至致密单层的T225细胞瓶可传到1个3L转瓶，之后，分别接种至3L转瓶、2层细胞工厂和微载体(12～15g/L)14L生物反应器中，调整细胞密度至5.0×105cells/ml。
(2)轮状病毒接种前处理：将激活剂加入病毒液中使得胰酶终浓度为10～30μg/ml，置于37℃水浴中作用70～90min，期间摇晃2～3次(将G1型轮状病毒作为供试品进行试验)。
(3)当细胞汇合度达到90％以上时，按MOI＝0.001～0.05比例接种各种血清型轮状病毒，使病毒感染细胞，每隔24h取样观察细胞病变情况。
(6)待CPE达到80％以上时收获病毒液，反复冻融数次后，取样进行滴度测定。
表3不同培养技术培养轮状病毒对比情况
由表3可以看出，采用微载体悬浮培养轮状病度，其产毒量大大提高。
本发明提供的轮状病毒疫苗，即根据前述各实施例中描述的方法制得，不再赘述。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种轮状病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，轮状病毒在MRC-5细胞上进行适应性培养，连续传10-12代；
步骤2，复苏MRC-5细胞后，待其生长至致密单层时，按1:3-1:4进行传代培养3-4天；
步骤3，在培养基中加入浓度为10-15g/L的微载体，接种初始密度为0.5-2×106cells/ml的经传代培养的MRC-5细胞至生物反应器，使其在所述微载体上生长；
步骤4，待MRC-5细胞生长至1-3×107cells/ml时，接种经胰酶激活后的血清型轮状病毒，使其感染MRC-5细胞；
步骤5，待CPE达到80％以上，收获病毒液后，将其制成多价轮状病毒活疫苗。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微载体采用GE公司的Cytodex Ⅰ微载体，所述生物反应器采用美国NBS公司的310型14L细胞培养生物反应器。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤3中，保持所述生物反应器控制参数为：pH值7.0-7.8、温度35℃-37℃、溶氧40％-60％、搅拌速率20-75rpm。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述步骤4中，按照MOI＝0.001-0.05比例接种病毒，将搅拌速率控制在25rpm，使病毒均匀吸附于细胞表面，约1-2小时后，再将搅拌速率控制在50～75rpm。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述轮状病毒通过以下步骤进行胰酶激活：
将激活剂加入病毒液中，使得胰酶终浓度为10～30μg/ml，置于37℃水浴中作用70-90分钟，期间摇晃2-3次。
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，在所述步骤3中，采用连续灌流式培养。
7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基成分包括BME、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和10％小牛血清。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，上述各步骤中，用Vero细胞替代所述MRC-5细胞，用M199、DMEM、碳酸氢钠和10％小牛血清代替所述培养基成分。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述轮状病毒为G1、G2、G3、G4、G9型轮状病毒中的任意至少一种。
10.一种轮状病毒疫苗，其特征在于，根据权利要求1-9中任一项所述的方法制得。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106676076A (zh) * 2017-01-20 2017-05-17 江苏中慧元通生物科技有限公司 一种无血清Vero细胞制备轮状病毒疫苗原液的方法以及无血清轮状病毒疫苗制品
CN109055321A (zh) * 2018-08-27 2018-12-21 武汉博沃生物科技有限公司 一种轮状病毒的培养方法
CN110055225A (zh) * 2018-01-18 2019-07-26 北京依生兴业科技有限公司 一种提高轮状病毒产量的方法
CN110170048A (zh) * 2019-05-27 2019-08-27 北京智飞绿竹生物制药有限公司 一种灭活轮状病毒疫苗的制备方法
CN114410592A (zh) * 2021-12-30 2022-04-29 苏州百源基因技术有限公司 一种轮状病毒培养基及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102038945A (zh) * 2010-09-15 2011-05-04 武汉中博生物股份有限公司 应用生物反应器工业化生产猪细小病毒疫苗的方法
CN102657895A (zh) * 2012-05-22 2012-09-12 商洛学院 高吸水性除臭尿不湿的制备方法
CN103773741A (zh) * 2012-10-18 2014-05-07 辽宁成大生物股份有限公司 笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102038945A (zh) * 2010-09-15 2011-05-04 武汉中博生物股份有限公司 应用生物反应器工业化生产猪细小病毒疫苗的方法
CN102657895A (zh) * 2012-05-22 2012-09-12 商洛学院 高吸水性除臭尿不湿的制备方法
CN103773741A (zh) * 2012-10-18 2014-05-07 辽宁成大生物股份有限公司 笼式通气搅拌生物反应器制备流感疫苗的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
周换敏: "《动物细胞工程学》", 30 April 2009, 中国农业出版社 *
张永欣等: "Vero 细胞微载体技术规模化培养轮状病毒", 《中国生物制品学杂志》 *
李苑: "《病毒性腹泻防治手册》", 31 October 2011, 科学技术文献出版社 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106676076A (zh) * 2017-01-20 2017-05-17 江苏中慧元通生物科技有限公司 一种无血清Vero细胞制备轮状病毒疫苗原液的方法以及无血清轮状病毒疫苗制品
CN110055225A (zh) * 2018-01-18 2019-07-26 北京依生兴业科技有限公司 一种提高轮状病毒产量的方法
CN109055321A (zh) * 2018-08-27 2018-12-21 武汉博沃生物科技有限公司 一种轮状病毒的培养方法
CN110170048A (zh) * 2019-05-27 2019-08-27 北京智飞绿竹生物制药有限公司 一种灭活轮状病毒疫苗的制备方法
CN110170048B (zh) * 2019-05-27 2022-05-13 北京智飞绿竹生物制药有限公司 一种灭活轮状病毒疫苗的制备方法
CN114410592A (zh) * 2021-12-30 2022-04-29 苏州百源基因技术有限公司 一种轮状病毒培养基及其应用
CN114410592B (zh) * 2021-12-30 2024-05-24 苏州百源基因技术有限公司 一种轮状病毒培养基及其应用

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