CN100389193C - 安全连续封闭式细胞培养、病毒生产和灭活的方法 - Google Patents
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Abstract
一种生物工程技术领域的安全连续封闭式细胞培养、病毒生产和灭活的方法，步骤为：1)接种细胞，悬浮培养，实现细胞的初级培养；2)流加新鲜培养基，同时泵出细胞悬浮液，维持细胞培养生物反应器稳定，保证细胞在反应器中的停留时间内扩增，实现细胞的连续培养；3)泵出细胞悬浮液至含有病毒的病毒增殖反应器，实现病毒在细胞中的初级感染增殖；4)随着细胞悬浮液的流入和含病毒上清液的流出，在维持整个***动态平衡的过程中实现病毒的连续培养；5)收集从病毒增殖反应器中泵出的病毒上清液，灭活病毒，实现连续封闭培养细胞和灭活病毒。本发明便于自动化控制，标准化生产，且降低了污染机会和提高了生产安全系数。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物工程技术领域的方法，具体地讲，是一种安全连续封闭式细胞培养、病毒生产和灭活的方法。
背景技术
利用细胞来生产病毒，主要有两种方式：(1)细胞和病毒种子一同培养，在细胞增殖的过程中，复制病毒，达到大量生产病毒的目的，这是模拟生物体内自然生存状态的一种方法；(2)将细胞和病毒的扩增过程分开，即先大量扩增细胞，达到一定程度后再加入病毒种子，维持细胞的活性，通过子代病毒在细胞间的不断感染和复制，来达到大量生产病毒的目的。随着对病毒研究的不断深入，发现细胞扩增过程和病毒在细胞中增殖过程的最优化培养条件有一定的差异，因此，目前主要采用细胞培养过程和病毒在细胞中增殖过程分开的方法制备病毒。在生产病毒时，大量、高密度细胞的培养是产生高滴度病毒的前提，间歇培养和补料培养不能够充分提供足够的营养物质和及时去除有毒的代谢产物，已逐渐被灌注培养的方法所替代。灌流培养是一种在连续动态监测条件下的培养过程，可及时地按需要加入新鲜培养基同时抽出含细胞代谢产物的消耗性培养基，使细胞始终保持在一种相对稳定，有充足营养的生长环境中生长，在细胞生长速度、细胞密度以及细胞形态方面都有良好的效果，因而适用于高密度细胞培养和大规模病毒生产。
经对现有技术的文献检索发现，刘建青等人在《山东医药》2005，45(23)：7～8上发表的“固定床生物反应器生产高滴度乙型脑炎病毒”一文中，提出了一种使用Fibra-Cel Disks为载体的固定床培养Vero细胞生产乙型脑炎病毒的方法。首先，用加有10％新生牛血清的199(Gibco)作为细胞扩增培养基进行灌注培养方式大量扩增Vero细胞，高密度培养，达到一定程度后，去除细胞培养液，用加有0.4％人血白蛋白的199(Gibco)作为细胞维持培养基，接种病毒，采用灌注培养方式大量增殖病毒。检索中还发现，Y.Z.Ghendon等人在《Vaccine》2005，23：4678～4684上发表的“Development of cell culture(MDCK)live cold-adapted(CA)attenuated influenza vaccine”(细胞培养活耐寒减毒流感疫苗的发展，《疫苗》)一文中，提出了一种使用Cytodex-1微载体悬浮培养MDCK细胞生产流感病毒的方法。首先，用Axcevir-MDCK无血清培养基通过灌注培养方式大量扩增MDCK细胞，高密度培养，达到一定程度后，去除细胞培养液，换用加有2μg/mL胰酶的Axcevir-MDCK无血清培养基作为细胞维持液，接种病毒，采用分批培养方式大量增殖病毒。
但是上述的两种方法中，细胞培养和病毒增殖两个过程单独来看有连续生产的，但整个过程是间歇和不封闭进行的，是在前一个过程单元结束后才开始下一个过程单元的，不利于大规模、连续性、安全生产病毒疫苗。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，针对目前病毒疫苗生产中“不连续性和不封闭性”，本发明提供一种安全连续封闭式细胞培养、病毒生产和灭活的方法，用于细胞培养、病毒增殖、病毒灭活，使其能够降低染菌和病毒外泄的风险，同时整套***便于自动化控制，能够安全、高效、大规模增殖病毒用于疫苗生产。
本发明是通过以下技术方案实现的，包含以下步骤：
1)向细胞培养生物反应器中接种1～2×105cells/mL的细胞，悬浮培养，扩增至0.2～1.0×107cells/mL(对于微载体悬浮培养时，微载体上80～90％汇满细胞)，实现细胞的初级培养；
2)根据培养细胞的生长特性和生物反应器体积的大小，以0.3～1.0倍反应器工作体积/天的流速流加新鲜培养基，同时以同样流速泵出细胞悬浮液，维持细胞培养生物反应器稳定的同时，保证细胞在反应器中的停留时间内扩增至0.2～1.0×107cells/mL(对于微载体悬浮培养时，微载体上80～90％汇满细胞)，实现细胞的连续培养；
3)泵出细胞悬浮液至病毒增殖反应器，所述病毒增殖反应器含有感染复数为2～10病毒，实现病毒在细胞中的初级感染增殖；
4)随着细胞悬浮液的不断流入和病毒上清液的不断流出，在维持整个***动态平衡的过程中实现病毒的连续增殖；
5)用病毒收集罐收集从病毒增殖反应器中泵出的病毒上清液，灭活病毒，实现连续封闭培养细胞和灭活病毒。
所述的步骤1)中，细胞的初级培养，具体是指：采用悬浮培养方式进行细胞培养，培养的细胞可以是技术人员熟知的悬浮的、经悬浮培养驯化的或者贴壁的细胞，如鸡胚成纤维细胞，CHO细胞、MDCK细胞、BHK-21细胞、Vero细胞、293细胞等。针对不同的细胞类型，可以采用技术人员熟知的不同类型的培养基，如补加4％~10％血清的DMEM、Eagle MEM、RPMI1640、199等含血清培养基，或无血清培养基，如NCTC135∶F12(1∶1)，alpha MEM∶F12(1∶1)等的组合。针对不同的细胞类型和悬浮培养要求，可以采用技术人员熟知的不同类型的微载体，如葡聚糖、胶原、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、明胶、玻璃、纤维素、聚乙烯等微载体，用量在2～10g/L之间。温度控制在37±0.2℃，pH维持在7.0～7.2之间，溶解氧(DO)25％～60％。接种密度在1～2×105cells/mL之间，可通过分批、补料或灌注等方式将细胞扩增至0.2～1.0×107cells/mL(对于微载体悬浮培养时，微载体上80～90％汇满细胞)，完成初级培养阶段。优选灌注方式，可实现快速细胞扩增。根据葡萄糖的消耗和乳酸的生成情况，一般在接种后的48～72h后开始灌注培养，按照培养细胞种类的不同选择0.5～1.5倍反应器工作体积/天的灌注速率。
所述的步骤2)中，细胞的连续培养，具体是指：初级培养细胞密度达到要求后，进入高密度连续培养细胞阶段。首先结束初级灌注培养，然后按照培养细胞的种类，以0.3～1.0反应器工作体积/天的流速调节流加新鲜培养基(若是微载体培养，培养基中含新鲜微载体)，并以同样的速率泵出细胞悬浮液，在维持细胞培养生物反应器稳定的同时又要保证细胞能够在反应器中的停留时间内扩增至0.2～1.0×107cells/mL(对于微载体悬浮培养时，微载体上80～90％汇满细胞)，维持反应器中的高细胞密度状态，实现细胞的连续培养。以30～90rpm的搅拌转速进行物质混合，特别是微载体悬浮连续培养细胞时，为利于细胞在微载体间通过“珠转珠”方式的转移，转速不能太快。
本发明由于涉及到细胞培养的最佳条件和病毒增殖最佳条件的关联，为提高整个反应***的操作弹性，病毒增殖反应器的体积是细胞培养生物反应器体积的2～5倍，同时将病毒增殖分为初级感染增殖和连续增殖两个阶段，分别采取微分式初期增殖方式和带有细胞、载体回流装置的连续增殖方式进行。
所述的步骤3)中，初级感染增殖，具体是指：所增殖的病毒包括可以在相应宿主细胞中增殖并分泌到细胞外病毒，如狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、出血热病毒、猪流行性腹泻病毒、乙脑病毒、轮状病毒等。病毒增殖培养过程中的pH、温度、溶解氧等培养条件可以根据不同的病毒而选择适当的、该领域技术人员所熟知的培养条件，比如，在pH7.0～7.2，32℃～34℃下用Vero细胞培养流感病毒；在pH7.8、35℃下用Vero细胞生产狂犬病毒，溶解氧控制25％～60％。若细胞培养阶段选用的是含有4％～10％血清的DMEM、Eagle MEM、RPMI1640、Medium199等含血清培养基，在病毒增殖阶段，要用相应基础培养基将血清含量稀释到1％～2％，作为病毒增殖培养基；若细胞培养阶段选用的是无血清培养基，在病毒增殖阶段，可以根据病毒增殖反应器中葡萄糖等营养物质和乳酸等有害代谢产物的含量，以1∶1～5∶1的比例流加该培养基，作为病毒增殖培养基，用以补充营养物质来维持细胞良好的生理状态和病毒增殖活性。同时可以根据不同的病毒而添加该领域技术人员所熟知的其它物质，如用Vero细胞增殖流感病毒，一般要添加1～3μg/mL的胰酶。
所述的步骤3)中，初级感染增殖采用微分式初级增殖方式实现，当细胞悬浮液流入病毒增殖反应器时按上述比例流加基础培养基或无血清培养基，二者混合共同组成病毒增殖培养基，同时，向病毒增殖反应器中接种感染复数为2～10的高滴度病毒。这样做有两个目的，一方面，当细胞悬浮液最初流入病毒增殖反应器时，高的病毒浓度增加了病毒接触感染细胞的机会，可以起到加快病毒增殖过程的作用；另一方面，随着细胞悬浮液的不断流入，病毒增殖反应器中的液体体积不断增加，为维持整个细胞培养及病毒增殖***的稳定性，当液体体积达到病毒增殖反应器的有效体积时，必须要抽出液体以维持***平衡，而在液体体积不断增加的过程中，给了病毒复制增殖的时间，这样，当最初抽出含病毒液体时，不会减少病毒增殖反应器中的病毒量，使接下来病毒连续增殖过程得以顺利进行。
所述的步骤4)中，病毒的连续增殖，具体是指：在病毒增殖反应器中以30～90rpm搅拌转速进行物质混合，从病毒增殖反应器中抽出的含有细胞(微载体培养时是附着有细胞的微载体)和病毒的悬浮液进入一个带有细胞(或附着有细胞的微载体)回流装置的细胞/载体沉降分离器，将含有病毒的上清液抽至病毒收集罐以维持整个操作***的平衡，将沉降下来的细胞(或附着有细胞的微载体)通过回流装置回流到病毒增殖反应器，达到充分利用病毒宿主细胞，提高病毒产量的目的，同时，可以依据***运行情况，将在病毒增殖反应器中停留时间过长的、细胞已大量脱落的陈旧微载体间歇收集至陈旧载体收集罐，可减少陈旧载体对病毒增殖的影响，其中含有的少量病毒上清液并入病毒收集罐一同收集、封闭灭活。
所述的步骤5)中，病毒的封闭灭活，具体是指：病毒收集是通过一系列带有自动液位控制开关的病毒收集罐完成的。每一个收集罐收集满后，通过液位自动控制开关在关闭该收集罐的同时打开其它收集罐收集，把满的收集罐取下，换上空的收集罐，如此反复循环，实现病毒的连续收集，而且，根据病毒生产能力的多少，可以将一组收集罐和另一组收集罐分开，通过液位自动控制开关控制开和关，实现大规模连续生产时连续收集病毒的目的。将收集满病毒的收集罐取下后，采用常规的如β丙内酯、***等方法灭活，然后再通过离心、超滤、层析等纯化方法和加入佐剂和稳定剂等程序制备病毒疫苗，这是该领域技术人员所熟知的。
通过以上说明，可见，本发明将细胞扩增和病毒增殖两个过程关联起来，在连续封闭下完成细胞培养生产/灭活病毒全过程，而且采用相应措施提高了操作弹性，一方面，便于自动化控制，标准化生产，另一方面，降低了污染机会和提高了生产安全系数，是十分适于大规模高效连续生产病毒的新方法。
附图说明
图1本发明方法流程图
具体实施方式
实施例：
以上的描述大致上说明了本发明的内容，下面几个实例将会更直接体现本发明的情况，但应指出，在此列举的实例只是为了加以说明的目的，而不是加以限制。
实例1Vero细胞培养生产/灭活狂犬病毒
培养基：Medium 199(Gibco)，加5％胎牛血清，用碳酸氢钠调至pH7.0～pH7.2。
微载体及其处理：采用Cytodex-1(Pharmacia)作为微载体，基质是交联葡聚糖，使用时将干微载体加入经二甲基二氯硅烷硅化的容器中，用PBS溶液在室温下充分浸泡，弃去上清，用PBS溶液洗涤2次，更换新的PBS，在121℃下灭菌30min，吸去上清，用含5％胎牛血清的Medium 199洗涤1次，更换新培养基，置培养箱中平衡过夜。
1)细胞的初级培养
在自制的经硅化处理的500mL搅拌式生物反应器(Spinner Flasks)中按3g/L加入经处理的微载体，接入Vero细胞，接种密度是1×105cells/mL，补足培养基至所需体积，37℃培养。在开始4h内，采用40rpm、搅拌5min、静止25min的间歇搅拌方式进行培养，然后将搅拌速率保持在60rpm，进行培养，溶解氧50％空气饱和度，48h后灌注培养，灌注速率是400mL/day，定时取样、计数，连续灌注4天后，取样计数，细胞密度达到4.35×106cells/mL，微载体上80％～90％汇集满细胞。
2)细胞的连续培养
按照3g/L的量将经处理的微载体加入到2升含5％胎牛血清的Medium 199细胞培养基中，搅拌转速是80rpm，将含微载体的培养基以250mL/day的速率流加，以同样的速率收集细胞流出液，在3天内定时取样、计数，发现细胞密度可保持在4.08×106cells/mL左右，发现细胞连续培养过程比较平稳。
3)病毒的初级增殖
用自制的经硅化处理的2000mL搅拌式生物反应器(Spinner Flasks)作为病毒增殖反应器，上述细胞悬浮液进入病毒增殖反应器的同时以375mL/day的速率流加无血清Medium 199基础培养基，以10的感染复数接种aG狂犬病毒株，在35℃、pH7.0下培养，溶解氧50％，搅拌速率保持在60rpm。72小时左右，液面开始达到反应器有效标定液面，以大约1000mL/day的流速抽出含微载体、细胞、病毒的混合液至细胞/载体沉降分离器，并以625mL/day的速率抽出含病毒的上清液，开始连续增殖。
4)病毒的连续增殖阶段
按照上面的细胞进样流速、新鲜无血清Medium 199基础培养基进样流速和含病毒的上清液抽出流速，维持稳定的连续病毒增殖，在10天内定时取样，检验病毒滴度和微载体上的细胞脱落情况，发现病毒滴度维持在9lgLD50/mL左右，病毒增殖过程比较平稳。那些在反应器中停留时间过长的细胞已大量脱落的微载体可通过细胞/载体沉降分离器下方的排放口排至陈旧载体收集罐。
5)狂犬病毒的封闭灭活
在步骤2)中抽出的病毒上清夜，用4个2000mL的收集瓶收集，按照1∶4000加入β-丙内酯，4℃搅拌放置24小时，37℃水浴水解2小时，能够完全灭活狂犬病毒。
实例2MDCK细胞培养生产/灭活H3N2流感病毒
参照与实例1基本相同的步骤进行本实施例，采用MDCK细胞培养H3N2流感病毒。
培养基：Axcevir-MDCK无血清培养基(Excele Biotechnologies，France)用碳酸氢钠调至pH7.0～pH7.2
微载体：Cytodex-3，用量5g/L。
细胞培养过程：接种密度1.5×105cells/mL，微载体Cytodex-3，用量5g/L，培养生物反应器是自制的经硅化处理的500mL搅拌式生物反应器(SpinnerFlasks)，37℃培养，溶解氧40％，搅拌转速50rpm，初级速率600mL/day，接种2天后，细胞密度在4.67×106cells/mL左右，开始连续培养，进样速率300mL/day，5天内定时取样、计数，细胞密度维持在4.21×106cells/mL左右，发现细胞连续培养过程比较平稳。
病毒的增殖过程：用自制的经硅化处理的1500mL搅拌式生物反应器(SpinnerFlasks)作为病毒增殖反应器，在上述细胞悬浮液进入病毒增殖反应器的同时以200mL/day的速率流加含有8μg/mL胰酶的Axcevir-MDCK无血清培养基，以5的感染复数接种H3N2流感病毒，在33℃、pH7.1下培养，溶解氧50％，搅拌速率保持在50rpm。液面开始达到反应器有效标定液面，以500mL/day的速率从病毒、细胞沉降分离装置中抽出含病毒的上清液，开始连续增殖9天。
用3个2000mL的收集瓶收集上述抽出的病毒上清夜，加入0.02％的***和0.05mol的柠檬酸钠在4℃搅拌放置20小时，能够完全灭活H3N2流感病毒。
实例3Vero细胞培养生产/灭活法H3N2流感病毒
参照与实例1基本相同的步骤进行本实施例，采用Vero细胞培养H3N2流感病毒。
培养基：Medium 199(Gibco)，加4％胎牛血清，用碳酸氢钠调至pH7.0～pH7.2。
微载体：Cytodex-3，用量10g/L。
细胞培养过程：接种密度2.0×105cells/mL，微载体Cytodex-3，用量10g/L，培养生物反应器是自制的经硅化处理的500mL搅拌式生物反应器(SpinnerFlasks)，37℃培养，溶解氧60％，搅拌转速90rpm，初级速率700mL/day，接种3天后，细胞密度在7.45×106cells/mL左右，开始连续培养，进样速率300mL/day，5天内定时取样、计数，细胞密度维持在7.13×106cells/mL左右，发现细胞连续培养过程比较平稳。
病毒的增殖过程：用自制的经硅化处理的2500mL搅拌式生物反应器(SpinnerFlasks)作为病毒增殖反应器，在上述细胞悬浮液进入病毒增殖反应器的同时以500mL/day的速率流加无血清Medium 199基础培养基，以2的感染复数接种出血热病毒株，在33℃、pH7.1下培养，溶解氧60％，搅拌速率保持在90rpm。75小时左右，液面开始达到反应器有效标定液面，以大约1000mL/day的流速抽出含微载体、细胞、病毒的混合液至细胞/载体沉降分离器，并以800mL/day的速率抽出含病毒的上清液，开始连续增殖，开始连续增殖9天。
用4个2000mL的收集瓶收集上述抽出的病毒上清夜，加入0.02％的***和0.05mol的柠檬酸钠在4℃搅拌放置20小时，能够完全灭活H3N2流感病毒。
实例4Vero细胞培养生产/灭活出血热病毒
参照与实例1基本相同的步骤进行本实施例，采用Vero细胞培养出血热病毒。
培养基：Medium 199(Gibco)，加4％胎牛血清，用碳酸氢钠调至pH7.0～pH7.2。
微载体：Cytodex-1，用量2g/L。
细胞培养过程：接种密度1.0×105cells/mL，微载体Cytodex-1，用量2g/L，培养生物反应器是自制的经硅化处理的500mL搅拌式生物反应器(SpinnerFlasks)，37℃培养，溶解氧30％，搅拌转速90rpm，初级速率250mL/day，接种2.5天后，细胞密度在2.56×106cells/mL左右，开始连续培养，进样速率150mL/day，5天内定时取样、计数，细胞密度维持在2.37×106cells/mL左右，发现细胞连续培养过程比较平稳。
病毒的增殖过程：用自制的经硅化处理的2000mL搅拌式生物反应器(SpinnerFlasks)作为病毒增殖反应器，在上述细胞悬浮液进入病毒增殖反应器的同时以450mL/day的速率流加无血清Medium 199基础培养基，以2的感染复数接种出血热病毒株，在33℃、pH7.0下培养，溶解氧30％，搅拌速率保持在90rpm。80小时左右，液面开始达到反应器有效标定液面，以大约800mL/day的流速抽出含微载体、细胞、病毒的混合液至细胞/载体沉降分离器，并以600mL/day的速率抽出含病毒的上清液，开始连续增殖，开始连续增殖9天。
用3个2000mL的收集瓶收集述抽出的病毒上清液，按照1∶4000加入β-丙内酯，4℃搅拌放置24小时，37℃水浴水解2小时，能够完全灭活出血热病毒。
Claims (10)
1.一种安全连续封闭式细胞培养、病毒生产和灭活的方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)向细胞培养生物反应器中接种1～2×105cells/mL的细胞，悬浮培养，扩增至0.2～1.0×107cells/mL，实现细胞的初级培养；
2)根据培养细胞的生长特性和生物反应器体积的大小，以0.3～1.0倍反应器工作体积/天的流速流加新鲜培养基，同时以同样流速泵出细胞悬浮液，维持细胞培养生物反应器稳定的同时，保证细胞在反应器中的停留时间内扩增至0.2～1.0×107cells/mL，实现细胞的连续培养；
3)泵出细胞悬浮液至病毒增殖反应器，所述病毒增殖反应器含有感染复数为2～10病毒，实现病毒在细胞中的初级感染增殖；
4)随着细胞悬浮液的不断流入和病毒上清液的不断流出，在维持整个***动态平衡的过程中实现病毒的连续增殖；
5)用病毒收集罐收集从病毒增殖反应器中泵出的病毒上清液，灭活病毒，实现连续封闭培养细胞和灭活病毒。
2.根据权利要求1所述的安全连续封闭式细胞培养、病毒生产和灭活的方法，其特征是，所述的步骤1)中，细胞的初级培养，具体是指：采用悬浮培养方式进行细胞培养，培养的细胞是悬浮的、经悬浮培养驯化的或者贴壁的细胞，微载体用量在2～10g/L之间，温度控制在37±0.2℃，pH维持在7.0～7.2之间，溶解氧25％～60％，接种密度在1～2×105cells/mL之间，通过分批、补料或灌注方式将细胞扩增至0.2～1.0×107cells/mL，完成初级培养阶段。
3.根据权利要求1或者2所述的安全连续封闭式细胞培养、病毒生产和灭活的方法，其特征是，培养的细胞是鸡胚成纤维细胞、CHO细胞、MDCK细胞、BHK-21细胞、Vero细胞、293细胞中的一种。
4.根据权利要求1或者2所述的安全连续封闭式细胞培养、病毒生产和灭活的方法，其特征是，所述的步骤1)中，细胞的初级培养，通过灌注方式将细胞扩增至0.2～1.0×107cells/mL，在接种后的48～72h后开始灌注培养，按照培养细胞种类选择0.5～1.5倍反应器工作体积/天的灌注速率。
5.根据权利要求1所述的安全连续封闭式细胞培养、病毒生产和灭活的方法，其特征是，所述的步骤2)中，细胞的连续培养，具体是指：首先结束初级灌注培养，然后按照培养细胞的种类，以0.3～1.0反应器工作体积/天的流速调节流加新鲜培养基，并以同样的速率泵出细胞悬浮液，在维持细胞培养生物反应器稳定的同时保证细胞能够在反应器中的停留时间内扩增至0.2～1.0×107cells/mL，维持反应器中的高细胞密度状态，实现细胞的连续培养。
6.根据权利要求1或者5所述的安全连续封闭式细胞培养、病毒生产和灭活的方法，其特征是，所述的步骤2)中，细胞的连续培养，以30～90rpm的搅拌转速进行物质混合。
7.根据权利要求1所述的安全连续封闭式细胞培养、病毒生产和灭活的方法，其特征是，所述的步骤3)和步骤4)中，病毒增殖反应器的体积是细胞培养生物反应器体积的2～5倍，病毒增殖分为初级感染增殖和连续增殖两个阶段，分别采取微分式初期增殖方式和带有细胞、载体回流装置的连续增殖方式进行。
8.根据权利要求7所述的安全连续封闭式细胞培养、病毒生产和灭活的方法，其特征是，细胞培养过程使用含血清的培养基，步骤3)所述的病毒增殖过程中，补加无血清基础培养基，实现病毒增殖培养基血清含量在1％～2％。
9.根据权利要求7所述的安全连续封闭式细胞培养、病毒生产和灭活的方法，其特征是，所述的步骤4)中，病毒的连续增殖，具体是指：在病毒增殖反应器中以30～90rpm搅拌转速进行物质混合，从病毒增殖反应器中抽出的含有细胞和病毒的悬浮液进入一个带有细胞回流装置的细胞沉降分离器，将含有病毒的上清液抽至病毒收集罐以维持整个操作***的平衡，将沉降下来的细胞通过回流装置回流到病毒增殖反应器。
10.根据权利要求1所述的安全连续封闭式细胞培养、病毒生产和灭活的方法，其特征是，所述的步骤5)中，病毒的封闭灭活，具体是指：病毒收集是通过一系列带有自动液位控制开关的病毒收集罐完成的，每一个收集罐收集满后，通过液位自动控制开关在关闭该收集罐的同时打开另外的收集罐收集，把满的收集罐取下，换上空的收集罐，如此反复循环，实现病毒的连续收集，将收集满病毒的收集罐取下后，进行灭活，然后再制备病毒疫苗。
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Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2927906B1 (fr) * | 2008-02-21 | 2010-04-02 | Eco Solution | Procede et dispositif de culture cellulaire en mode continu ouvert. |
| CN101875917B (zh) * | 2009-04-28 | 2012-07-04 | 北京清大天一科技有限公司 | 生物反应器微载体培养动物细胞生产猪瘟疫苗的方法 |
| CN102038945B (zh) * | 2010-09-15 | 2012-05-23 | 武汉中博生物股份有限公司 | 应用生物反应器工业化生产猪细小病毒疫苗的方法 |
| CN103374547B (zh) * | 2012-07-04 | 2015-11-18 | 北京健翔和牧生物科技有限公司 | 一种***纯化疫苗的制备方法 |
| CN102793917B (zh) * | 2012-07-24 | 2014-09-03 | 北京中联康生物科技有限公司 | 猪乙脑疫苗及其制备方法 |
| EP4234569A3 (en) | 2014-04-15 | 2023-10-18 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Method and use for continuously inactivating a virus during manufacture of a biological product |
| JP6672287B2 (ja) | 2014-10-24 | 2020-03-25 | ジェンザイム・コーポレーション | 滅菌処理用槽からの流体流の統合された連続単離 |
| CN105727277A (zh) * | 2014-12-12 | 2016-07-06 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 一种制备猪伪狂犬病病毒疫苗的方法及疫苗制品 |
| CN109072161A (zh) * | 2016-05-06 | 2018-12-21 | 马克斯·普朗克科学促进学会 | 平推流管式生物反应器，包含该反应器的***及其制备病毒的方法 |
| BE1024230B1 (fr) * | 2016-11-08 | 2017-12-20 | Univercells Sa | Production contenue de cellules et/ou de produits cellulaires |
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| CN113355297A (zh) * | 2021-06-23 | 2021-09-07 | 吉林冠界生物技术有限公司 | 一种灌流式培养全悬浮mdck细胞生产重组禽流感病毒的方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6146891A (en) * | 1997-01-31 | 2000-11-14 | Schering Corporation | Methods for cultivating cells and propagating viruses |
| CN1617923A (zh) * | 2001-12-10 | 2005-05-18 | 巴克斯特健康护理股份有限公司 | 大规模生产甲型肝炎病毒的方法 |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6146891A (en) * | 1997-01-31 | 2000-11-14 | Schering Corporation | Methods for cultivating cells and propagating viruses |
| CN1617923A (zh) * | 2001-12-10 | 2005-05-18 | 巴克斯特健康护理股份有限公司 | 大规模生产甲型肝炎病毒的方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Mathematical Model of Influenza A Virus Productionin Large-Scale Microcarrier Culture. Lars Mohler等.Biotechnology and Bioengineering,Vol.90 No.1. 2005 |
| Mathematical Model of Influenza A Virus Productionin Large-Scale Microcarrier Culture. Lars Mohler等.Biotechnology and Bioengineering,Vol.90 No.1. 2005 * |
| Optimization of microcarrier cell culture process for theinactivated enterovirus type 71 vaccine development. Suh-Chin Wu等.Vaccine,No.22. 2004 |
| Optimization of microcarrier cell culture process for theinactivated enterovirus type 71 vaccine development. Suh-Chin Wu等.Vaccine,No.22. 2004 * |
| 微载体灌注培养制备Vero细胞狂犬病疫苗. 乐威等.中国病毒学，第19卷第4期. 2004 |
| 微载体灌注培养制备Vero细胞狂犬病疫苗. 乐威等.中国病毒学，第19卷第4期. 2004 * |
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Assignee: Yangzhou Youbang Biopharmaceuticals Co., Ltd. Assignor: Shanghai Jiao Tong University Contract fulfillment period: 2008.5.25 to 2013.12.31 Contract record no.: 2009320000681 Denomination of invention: Method for safe continuous enclosed cell culture, virus production/ inactivation Granted publication date: 20080521 License type: Exclusive license Record date: 20090423 |
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| LIC | Patent licence contract for exploitation submitted for record |
Free format text: EXCLUSIVE LICENSE; TIME LIMIT OF IMPLEMENTING CONTACT: 2008.5.25 TO 2013.12.31; CHANGE OF CONTRACT Name of requester: YANGZHOU YOUBANG BIOLOGY PHARMACY CO., LTD. Effective date: 20090423 |
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| EC01 | Cancellation of recordation of patent licensing contract | ||
| EC01 | Cancellation of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Yangzhou uni bio Pharmaceutical Co Ltd Assignor: Shanghai Jiaotong University Contract record no.: 2009320000681 Date of cancellation: 20191106 |
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| EM01 | Change of recordation of patent licensing contract | ||
| EM01 | Change of recordation of patent licensing contract |
Change date: 20191106 Contract record no.: 2009320000681 Assignee after: Yangzhou uni bio Pharmaceutical Co Ltd Assignee before: Yangzhou Youbang Biopharmaceuticals Co., Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20200120 Address after: 201499 room 17, No. 2165, Lane 258, hope road, Shanghai, Fengxian District Patentee after: Shanghai Li Kun biological Polytron Technologies Inc Address before: 200240 Dongchuan Road, Shanghai, No. 800, No. Patentee before: Shanghai Jiaotong University |