CN101970689A - 炎性肠病的基因表达标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及炎性肠病发病机制的基因表达序型分析的方法，其中测定来自哺乳动物受试者的测试样品中一种或多种IBD标志物相对于对照的差异表达，其中测试样品中有差异表达指示获得测试样品的哺乳动物受试者中有IBD。

Description

炎性肠病的基因表达标志物
发明背景
相关申请的交叉引用
本申请要求依据119(e)节的优先权及2007年11月29日提交的美国临时申请流水号60/991,203、2008年9月17日提交的美国临时申请流水号61/192,268、和2008年5月22日提交的国际专利申请流水号PCT/US08/64562的权益，通过述及将其整个公开内容完整收入本文。
发明领域
本发明涉及炎性肠病发病机制中的基因表达序型，包括在炎性肠病的检测和诊断中的用途。
发明背景
免疫相关和炎性疾病是相当复杂的、常常是多个互联的生物学途径的表现或结果，这些生物学途径在正常生理学中对于应答攻击或损伤、启动对攻击或损伤的修复、和发动针对外来生物体的先天性和获得性防御是至关重要的。在这些正常生理学途径引起另外的攻击或损伤时，或是与应答的强度直接相关，作为异常调节或过度刺激的后果，作为与自身的反应，或者作为上述的组合，发生疾病或病理学状况。
尽管这些疾病的起源常常牵涉多步骤途径，而且常常累及多个不同的生物学***/途径，一个或多个这些途径中临界点的干预可具有改善或治疗效果。治疗性干预可以通过有害过程/途径的拮抗作用或有益过程/途径的刺激作用而发生。
许多免疫相关疾病是已知的，而且已经广泛研究。此类疾病包括免疫介导的炎性疾病、非免疫介导的炎性疾病、感染性疾病、免疫缺陷病、瘤形成等。
术语炎性肠病(“IBD”)描述了起因未知的一组慢性炎性病症，其中肠发生炎症，常常引起反复的腹部绞痛或腹泻。IBD在美国的流行程度估计是每100,000人约200例。IBD患者可分成两大组，具有溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis)(“UC”)的和具有克罗恩氏病(Crohn’s disease)的(“CD”)。UC和CD都是慢性复发性疾病，而且是在暴露于尚未明确确定的环境刺激的遗传易感个体中发生的复杂临床表现(Bonen和Cho，Gastroenterology.2003；124：521-536；Gaya et al.Lancet.2006；367：1271-1284)。
尽管IBD的起因仍然未知，但已经知道与几种因素，诸如遗传、感染和免疫学易感性有关。IBD在高加索人(白种人)中常见得多，尤其是犹太人后裔。该状况的慢性炎性性质促使深入研究可能的感染原因。尽管已经找到了激发急性炎症的因素，尚未找到引起与IBD有关的慢性炎症的因素。IBD是自身免疫病的假说得到先前所述IBD的肠外表现有关节炎及用已知遏制免疫应答的药剂诸如肾上腺糖皮质激素、环孢霉素和硫唑嘌呤治疗IBD获得已知积极响应的支持。另外，胃肠道比机体的任何其它器官更多地连续暴露于潜在抗原性物质诸如来自食物的蛋白质、细菌副产物(LPS)等。
UC和CD的诊断标准有足够的交叠，使得有时不可能说清楚具体患者得的是哪种病；然而，通常看到的损害类型是不同的，是局部化的。UC大多出现在结肠中，接近直肠，而特征性的损害是粘膜浅表溃疡；CD可出现在肠的任何部位，偶尔涉及胃、食管和十二指肠，而且损害通常描述为广泛的线性裂隙。
IBD的当前疗法通常涉及施用抗炎剂或免疫抑制剂，诸如柳氮磺吡啶、皮质类固醇、6-巯基嘌呤/硫唑嘌呤、或环孢霉素，通常只带来部分结果。如果抗炎/免疫抑制疗法失败，那么结肠切除术是最后一道防线。不涉及直肠的CD的典型手术是没有造瘘术的切除术(切除患病肠段)和吻合术(重接)。可以切除小肠或大肠节段。约30％的CD患者会在诊断后第一年内需要手术。在后续年份里，比率是每年约5％。不幸的是，CD的特征在于高复发率；在首次手术后每年有约5％的患者需要第二次手术。
改进炎性肠病诊断涉及使用标准分类标准来评估疾病进展状态。IBD中所使用的分类***包括Truelove和Witts指数(Truelove S.C.和Witts，L.J.BrMed J.1955；2：1041-1048)，其将结肠炎分类为轻度、中度、或重度，以及Lennard-Jones(Lennard-Jones JE.Scand J Gastroenterol Suppl 1989；170：2-6)和简单临床结肠炎活动指数(SCCAI)(Walmsley et al.Gut.1998；43：29-32)。这些***跟踪诸如每日肠运动、直肠出血、温度、心率、血红蛋白水平、红细胞沉降率、体重、血细胞比容得分、和血清清蛋白水平等变量。
在大约10-15％的病例中，不能做出确定性的溃疡性结肠炎或克罗恩氏病的诊断，而且此类病例常常称作“不明确的结肠炎(indeterminate colitis)”。有两种抗体检测测试能帮助诊断，每一种测定血液中的抗体。所述抗体是“核周抗嗜中性粒细胞抗体”(pANCA)和“抗酿酒酵母抗体”(ASCA)。大多数溃疡性结肠炎患者具有pANCA抗体但没有ASCA抗体，而大多数克罗恩氏病患者具有ASCA抗体但没有pANCA抗体。然而，这两种测试有缺点，因为一些患者两种抗体都没有，而一些克罗恩氏病患者可以只有pANCA抗体。对于临床实践，一种会基于分子标志物而非变量程度测量来指示IBD的存在和/或进展的可靠测试对于鉴定和/或治疗IBD个体会是有用的。没有假设，连锁和关联研究鉴定了与UC有关的遗传基因座，特别是染色体6上的MHC区(Rioux et al.Am J Hum Genet.2000；66：1863-1870；Stokkers et al.Gut.1999；45：395-401；Van Heel et al.Hum Mol Genet.2004；13：763-770)、染色体12上的IBD2基因座(Parkes et al.Am J Hum Genet.2000；67：1605-1610；Satsangi et al.Nat Genet.1996；14：199-202)和染色体5上的IBD5基因座(Giallourakis et al.AmJ.Hum Genet.2003；73：205-211；Palmieri et al Aliment Pharmacol Ther.2006；23：497-506；Russell et al.Gut.2006；55：1114-1123；Waller et al.Gut.2006；55：809-814)。在鉴定染色体7q上UC关联的推定基因座的全英国连锁扫描之后，进一步的研究将涉及细胞解毒的ABCB1(MDR1)基因的变体与UC联系起来(Satsangi et al.Nat Genet.1996；14：199-202；Brant et al.Am J HumGenet.2003；73：1282-1292；Ho et al.Gastroenterology.2005；128：288-296)。
一种针对导致炎性肠病(IBD)中观察到的慢性肠炎的复杂基因-基因和基因-环境关系的鉴定和理解的补充方法是微阵列基因表达分析。微阵列容许在组织和细胞水平获得基因表达的全面图像，如此帮助理解潜在的病理-生理过程(Stoughton et al.Annu Rev Biochem.2005；74：53-82)。1997年首次将微阵列分析应用于IBD患者，将CD患者的手术切除术中96种基因的表达与类风湿性关节炎患者的滑膜组织比较(Heller et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1997；94：2150-2155)。使用微阵列平台来调查来自IBD患者的手术标本的进一步研究鉴定了比较患病组织与对照时差异调节的多种新基因(Dieckgraefe etal.Physiol Genomics.2000；4：1-11；Lawrance et al.Hum Mol Genet.2001；10：445-456)。
一种针对导致炎性肠病(IBD)中观察到的慢性肠炎的复杂基因-基因和基因-环境关系的鉴定和理解的补充方法是微阵列基因表达分析。微阵列容许在组织和细胞水平获得基因表达的全面图像，如此帮助理解潜在的病理-生理过程(Stoughton et al.Annu Rev Biochem.2005；74：53-82)。1997年首次将微阵列分析应用于IBD患者，将CD患者的手术切除术中96种基因的表达与类风湿性关节炎患者的滑膜组织比较(Heller et al.Proc Natl Acad Sci U S A.1997；94：2150-2155)。使用微阵列平台来调查来自IBD患者的手术标本的进一步研究鉴定了比较患病组织与对照时差异调节的多种新基因(Dieckgraefe etal.Physiol Genomics.2000；4：1-11；Lawrance et al.Hum Mol Genet.2001；10：445-456)。
内窥镜夹取粘膜活检容许调查人员对来自较大范围患者(涵盖病情不太严重的)的组织进行微阵列分析。Langmann等人使用微阵列技术来分析来自结肠和回肠末端宏观上不受影响的区域的活检标本中的22，283种基因(Langmann et al.Gastroenterology.2004；127：26-40)。涉及细胞解毒和生物转化(孕烷X受体和MDR1)的基因在UC患者的结肠中显著下调，然而，这些基因在来自CD患者的活检中的表达没有变化。Costello和同事(Costello et al.PLoS Med.2005；2：e199)查看自健康对照、CD和UC患者获得的内窥镜乙状结肠活检中33792种序列的表达。许多代表新蛋白质的序列受到差异调节，而且芯片分析提示这些蛋白质具有与疾病发病机制有关的推定功能--转录因子、信号传导分子和细胞粘着。
在对UC患者的研究中，Okahara等人(Aliment Pharmacol Ther.2005；21：1091-1097)观察到与不发炎的活检相比，在发炎的活检中迁移抑制因子相关蛋白14(MRP14)、生长相关癌基因γ(GROγ)和血清淀粉状蛋白A1(SAA1)上调而TIMP1和elfin下调。在观察41种趋化因子和21种趋化因子受体时，Puleston等人展示了趋化因子CXCL 1-3和8和CCL20在活动性结肠CD和UC中上调(Aliment Pharmacol Ther.2005；21：109-120)。总之，这些研究例示了早期微阵列平台和组织收集的不均一性。然而，尽管有这些问题，还是一致地观察到了多种基因的差异表达。
尽管有上文鉴定的IBD研究中的进展，还非常需要能够检测哺乳动物中的IBD和有效治疗这种病症的另外的诊断剂和治疗剂。因此，本发明提供了与正常组织相比在IBD中过表达的多核苷酸和多肽，使用那些多肽及其编码核酸来检测或诊断哺乳动物受试者中IBD的存在及随后用合适的IBD治疗剂治疗那些检测有IBD的受试者的方法。
本发明提供了用于检测炎性肠病(IBD)(包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病(CD))的存在和确定其进展的方法。
本文中所公开的发明提供了检查哺乳动物组织或细胞样品中一种或多种基因表达标志物的表达的方法和测定法，其中一种或多种此类生物标志物的表达预示采集组织或细胞样品的哺乳动物受试者是否更有可能具有IBD。在本发明的各种实施方案中，所述方法和测定法检查基因表达标志物(诸如表1、2、和3所列的)的表达并确定表达是否高于或低于对照样品。
本发明的这些和其它实施方案对于本领域普通技术人员会是显而易见的。
发明概述
一方面，本发明关注检测或诊断哺乳动物受试者中的炎性肠病(IBD)的方法，包括确定自受试者获得的生物学样品中(i)编码选自表1、2、或3的一种或多种多肽的一种或多种核酸的，或(ii)选自表1、2、或3的一种或多种基因的RNA转录物或其表达产物的表达水平相对于对照中的表达水平不同，其中表达有差异指示受试者更有可能具有IBD。
在一个实施方案中，所述诊断或检测哺乳动物受试者中IBD的存在的方法包括确定自受试者获得的测试样品中(i)编码选自表1A、2、或3A的一种或多种多肽的一种或多种核酸的；或(ii)选自表1A、2或3A的一种或多种基因的RNA转录物或其表达产物相对于对照中的表达水平较高，其中较高水平的表达指示获得测试样品的受试者中IBD的存在。
在另一个实施方案中，所述诊断或检测哺乳动物受试者中IBD的存在的方法包括确定自受试者获得的测试样品中(i)编码选自表1B或3B的一种或多种多肽的一种或多种核酸的；或(ii)选自表1B或3B的一种或多种基因的RNA转录物或其表达产物相对于对照中的表达水平较低，其中较低水平的表达指示获得测试样品的受试者中IBD的存在。
一方面，所述方法针对诊断或检测先前诊断有IBD且当前处于减退的哺乳动物受试者中IBD的突发(flare-up)。所述受试者可已经完成IBD治疗或当前正在接受IBD治疗。在一个实施方案中，所述方法包括确定自哺乳动物受试者获得的生物学样品中(i)编码选自表1、2、或3的一种或多种多肽的一种或多种核酸的；或(ii)选自表1、2或3的一种或多种基因的RNA转录物或其表达产物的表达水平相对于对照中的表达水平不同，其中表达有差异指示受试者更有可能具有IBD突发。或者，可将所述测试样品与在初始IBD诊断之前、之后、或之时获得的哺乳动物受试者的在先测试样品比较，如果可得的话。
所有方面，所述哺乳动物受试者优选是人受试者，诸如诊断有IBD或有风险形成IBD的人患者。所述受试者还可以是接受过在先IBD治疗但处于IBD复发风险的IBD患者。
对于本发明方法的所有方面，确定本文所述一种或多种基因(或编码由一种或多种此类基因表达的多肽的一种或多种核酸)的表达水平可以通过例如基因表达序型分析的方法来获得。所述基因表达序型分析的方法可以是例如基于PCR的方法。
在各种实施方案中，所述诊断包括(i)编码选自表1、2、或3的一种或多种多肽的一种或多种核酸的；或(ii)选自表1、2或3的一种或多种基因的RNA转录物或其表达产物的表达水平的定量，诸如通过免疫组织化学(IHC)和/或荧光原位杂交(FISH)。
对于本发明的所有方面，所述基因的表达水平可以是相对于一种或多种参照基因或其表达产物的表达水平标准化的。
对于本发明的所有方面，所述方法可进一步包括确定至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八种、十九种、或二十种所述基因或其表达产物的表达水平的证据。
另一方面，本发明的方法还涵盖此类基因(即如本文中所公开的IBD标志物)的集合/集(panel)基于其表达水平的证据的用途。在一些实施方案中，所述IBD标志物集会包括至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种、十七种、十八种、十九种或二十种IBD标志物。所述集合可包括在IBD中相对于对照过表达的IBD标志物、在IBD中相对于对照表达不足的IBD标志物、或在IBD中相对于对照既过表达又表达不足的IBD标志物。此类集合可用于对哺乳动物受试者筛选一种或多种IBD标志物的差异表达以做出受试者中是否存在IBD的决定。
在一个实施方案中，构成所述集合的IBD标志物选自表1、2、和3。在一个优选的实施方案中，所述诊断或检测哺乳动物受试者中IBD的存在的方法包括确定自受试者获得的测试样品中来自IBD标志物集的RNA转录物或其表达产物相对于对照中的表达水平的差异表达水平，其中差异表达水平指示获得测试样品的受试者中IBD的存在。测试样品中的差异表达可以是相对于对照的较高和/或较低，如本文中所讨论的。
对于本发明的所有方面，所述方法可进一步包括创建汇总所述预测的报告的步骤。
对于所有方面，依照本发明方法诊断或检测的IBD是克罗恩氏病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)、或CD和UC二者。
对于本发明的所有方面，自哺乳动物受试者获得的测试样品可衍生自结肠组织活检。在一个优选的实施方案中，所述活检是选自下组的组织：回肠末端、升结肠、降结肠、和乙状结肠。在其它优选的实施方案中，所述活检样品来自发炎的结肠区域或来自不发炎的结肠区域。所述发炎的结肠区域可以是急性发炎的或慢性发炎的。
对于所有方面，确定表达水平可发生超过一次。对于本发明的所有方面，确定表达水平可发生在患者在任何手术之前和/或之后接受任何治疗之前。在一些实施方案中，确定步骤指示手术之后哺乳动物受试者中IBD的复发或指示所述哺乳动物受试者中所述IBD的突发。在一个优选的实施方案中，所述IBD是克罗恩氏病。
另一方面，本发明关注治疗哺乳动物受试者的方法，其中已经通过本文所述方法检测到IBD的存在。例如，在确定自哺乳动物受试者获得的测试样品展现本文所述IBD标志物的一种或多种RNA转录物或相应基因产物相对于对照的差异表达之后，所述哺乳动物受试者可施用IBD治疗剂。
在一个实施方案中，治疗有所需要的哺乳动物受试者中IBD的方法包括(a)确定相对于对照中的表达水平自所述受试者获得的测试样品中(i)编码选自表1、2、或3的一种或多种多肽的一种或多种核酸的；或(ii)选自表1、2或3的一种或多种基因的RNA转录物或其表达产物的差异表达水平，其中所述差异表达水平指示获得测试样品的受试者中IBD的存在；并(b)对所述受试者施用有效量的IBD治疗剂。在一个优选的实施方案中，所述治疗IBD的方法包括(a)确定自受试者获得的测试样品中(i)编码选自表1A、2、或3A的一种或多种多肽的一种或多种核酸的；或(ii)选自表1A、2或3A的一种或多种基因的RNA转录物或其表达产物的表达水平相对于对照中的表达水平较高，其中较高水平的表达指示获得测试样品的受试者中IBD的存在；并(b)对所述受试者施用有效量的IBD治疗剂。在另一个优选的实施方案中，所述治疗IBD的方法包括(a)确定自受试者获得的测试样品中(i)编码选自表1B或3B的一种或多种多肽的一种或多种核酸的；或(ii)选自表1B或3B的一种或多种基因的RNA转录物或其表达产物的表达水平相对于对照中的表达水平较低，其中较低水平的表达指示获得测试样品的受试者中IBD的存在。在一些优选的实施方案中，所述IBD治疗剂是氨基水杨酸盐、皮质类固醇、和免疫抑制剂中一项或多项。
一方面，上文所讨论的IBD标志物集在治疗哺乳动物受试者中的IBD的方法中是有用的。在一个实施方案中，针对所述标志物集筛选所述哺乳动物受试者，并如果确定IBD存在，那么可如本文中所讨论的施用IBD治疗剂。
在一个不同的方面，本发明关注试剂盒，其包含适合于实施本发明方法的下列一项或多项：(1)提取缓冲液/试剂和方案(protocal)；(2)逆转录缓冲液/试剂和方案；和(3)qPCR缓冲液/试剂和适合实施本发明方法的方案。所述试剂盒可包含数据检索(retrieval)和分析软件。
在一个实施方案中，其差异表达指示IBD的基因是GLI1。在另一个实施方案中，所述GLI1基因是GLI1变体。在一个优选的实施方案中，所述GLI1变体是如实施例4中所描述的rs2228226C→G(Q1100E)。
通过述及将本文中所提及的所有出版物收入本文以披露和记载与所引用的出版物有关的方法和/或材料。引用本文中所引用的出版物，以引用它们在本申请的申请日之前公开的内容。这里绝不能解释为承认本发明人没有资格凭借较早的优先权日或在先发明日而早于所述出版物。另外，实际的出版日期可能与所显示的出版日期不同，需要独立的核查。
附图简述
图1显示了来自通过无监督分级聚簇分析(unsupervised hierarchicalclustering)的对照患者的组织学正常活检。
图2显示了溃疡性结肠炎患者和对照中防卫素α5和6的表达。
图3显示了溃疡性结肠炎和对照中基质金属蛋白酶(MMP)3和7的表达。
图4显示了对照和溃疡性结肠炎发炎的和不发炎的乙状结肠活检中SAA1、IL-8、防卫素α5、和防卫素α6的实时PCR表达。
图5显示了对照和溃疡性结肠炎发炎的和不发炎的乙状结肠活检中MMP3、MMP7、S100A8、和TLR4的实时PCR表达。
图6显示了溃疡性结肠炎患者和对照的回肠末端和结肠中防卫素α5的原位杂交。
图7显示了溃疡性结肠炎患者和对照的回肠末端和结肠中防卫素α6的原位杂交。
图8A和8B描绘了编码人DEFA6多肽的核酸序列(SEQ ID NO：1)和人DEFA6多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图9A和9B描绘了编码人DEFA5多肽的核酸序列(SEQ ID NO：3)和人DEFA5多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。图9C和9D描绘了编码人DEFB14多肽的核酸序列(SEQ ID NO：210)和人DEFB14多肽的氨基酸序列(SEQ IDNO：211)。
图10A和10B描绘了编码人IL3RA多肽的核酸序列(SEQ ID NO：5)和人IL3RA多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。
图11A和11B描绘了编码人IL2RA多肽的核酸序列(SEQ ID NO：7)和人IL2RA多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。
图12A和12B描绘了编码人REG3G多肽的核酸序列(SEQ ID NO：9)和人REG3G多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。
图13A和13B描绘了编码人REG1B多肽的核酸序列(SEQ ID NO：11)和人REG1B多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。
图14A和14B描绘了编码人KCND3多肽的核酸序列(SEQ ID NO：13)和人KCND3多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。
图15A和15B描绘了编码人MIP-3a多肽的核酸序列(SEQ ID NO：15)和人MIP-3a多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)。
图16A和16B描绘了编码人ECGF1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：17)和人ECGF1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)。
图17A和17B描绘了编码人IL1B多肽的核酸序列(SEQ ID NO：19)和人IL1B多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)。
图18A和18B描绘了编码人MIP2BGRO-g多肽的核酸序列(SEQ ID NO：21)和人MIP2BGRO-g多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：22)。
图19A和19B描绘了编码人CXCL1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：23)和人CXCL1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：24)。
图20A和20B描绘了编码人IAP1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：25)和人IAP1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：26)。
图21A和21B描绘了编码人CASP5多肽的核酸序列(SEQ ID NO：27)和人CASP5多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：28)。
图22A和22B描绘了编码人DMBT1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：29)和人DMBT1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：30)。
图23A和23B描绘了编码人PCDH17多肽的核酸序列(SEQ ID NO：31)和人PCDH17多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：32)。
图24A和24B描绘了编码人IFITM1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：33)和人IFITM1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：34)。
图25A和25B描绘了编码人PDZK1IP1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：35)和人PDZK1IP1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：36)。
图26A和26B描绘了编码人IRTA2多肽的核酸序列(SEQ ID NO：37)和人IRTA2多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：38)。
图27A和27B描绘了编码人SLC40A1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：39)和人SLC40A1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：40)。
图28A和28B描绘了编码人IGHV4-4多肽的核酸序列(SEQ ID NO：41)和人IGHV4-4多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：42)。
图29A和29B描绘了编码人REG3G多肽的核酸序列(SEQ ID NO：43)和人REG3G多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：44)。
图30A和30B描绘了编码人AQP9多肽的核酸序列(SEQ ID NO：45)和人AQP9多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：46)。
图31A和31B描绘了编码人OLFM4多肽的核酸序列(SEQ ID NO：47)和人OLFM4多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：48)。
图32A和32B描绘了编码人S100A9多肽的核酸序列(SEQ ID NO：49)和人S100A9多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：50)。
图33A和33B描绘了编码人UNC5CL多肽的核酸序列(SEQ ID NO：51)和人UNC5CL多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：52)。
图34A和34B描绘了编码人GPR110多肽的核酸序列(SEQ ID NO：53)和人GPR110多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：54)。
图35A和35B描绘了编码人HLA-G多肽的核酸序列(SEQ ID NO：55)和人HLA-G多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：56)。
图36A和36B描绘了编码人TAP1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：57)和人TAP1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：58)。
图37A和37B描绘了编码人MAP3K8多肽的核酸序列(SEQ ID NO：59)和人MAP3K8多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：60)。
图38A和38B描绘了编码人UBD|GABBR1多肽的核酸序列(SEQ IDNO：61)和人UBD|GABBR1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：62)。
图39A和39B描绘了编码人DHX57多肽的核酸序列(SEQ ID NO：63)和人DHX57多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：64)。
图40A和40B描绘了编码人MA多肽的核酸序列(SEQ ID NO：65)和人MA多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：66)。
图41A和41B描绘了编码人IGLJCOR18多肽的核酸序列(SEQ ID NO：67)和人IGLJCOR18多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：68)。
图42A和42B描绘了编码人HLA-G多肽的核酸序列(SEQ ID NO：69)和人HLA-G多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：70)。
图43A和43B描绘了编码人SAA1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：71)和人SAA1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：72)。
图44A和44B描绘了编码人TAP2多肽的核酸序列(SEQ ID NO：73)和人TAP2多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：74)。
图45A和45B描绘了编码人PCAA17448多肽的核酸序列(SEQ ID NO：75)和人PCAA17448多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：76)。
图46A和46B描绘了编码人LCN2多肽的核酸序列(SEQ ID NO：77)和人LCN2多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：78)。
图47A和47B描绘了编码人ZBP1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：79)和人ZBP1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：80)。
图48A和48B描绘了编码人TNIP3多肽的核酸序列(SEQ ID NO：81)和人TNIP3多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：82)。
图49A和49B描绘了编码人ZC3H12A多肽的核酸序列(SEQ ID NO：83)和人ZC3H12A多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：84)。
图50A和50B描绘了编码人CHI3L1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：85)和人CHI3L1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：86)。
图51A和51B描绘了编码人FCGR3A多肽的核酸序列(SEQ ID NO：87)和人FCGR3A多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：88)。
图52A和52B描绘了编码人SAMD9L多肽的核酸序列(SEQ ID NO：89)和人SAMD9L多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：90)。
图53A和53B描绘了编码人MMP9多肽的核酸序列(SEQ ID NO：91)和人MMP9多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：92)。
图54A和54B描绘了编码人MMP7多肽的核酸序列(SEQ ID NO：93)和人MMP7多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：94)。
图55A和55B描绘了编码人BF多肽的核酸序列(SEQ ID NO：95)和人BF多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：96)。
图56A和56B描绘了编码人S100P多肽的核酸序列(SEQ ID NO：97)和人S100P多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：98)。
图57A和57B描绘了编码人GRO多肽的核酸序列(SEQ ID NO：99)和人GRO多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：100)。
图58A和58B描绘了编码人INDO多肽的核酸序列(SEQ ID NO：101)和人INDO多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：102)。
图59A和59B描绘了编码人TRIM22多肽的核酸序列(SEQ ID NO：103)和人TRIM22多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：104)。
图60A和60B描绘了编码人SAA2多肽的核酸序列(SEQ ID NO：105)和人SAA2多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：106)。
图61A和61B描绘了编码人NEU4多肽的核酸序列(SEQ ID NO：107)和人NEU4多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：108)。
图62A和62B描绘了编码人IRTA2/FCRH5多肽的核酸序列(SEQ IDNO：109)和人IRTA2/FCRH5多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：110)。
图63A和63B描绘了编码人IGLJCOR18多肽的核酸序列(SEQ ID NO：111)和人IGLJCOR18多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：112)。
图64A和64B描绘了编码人IGHV4-4多肽的核酸序列(SEQ ID NO：113)和人IGHV4-4多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：114)。
图65A和65B描绘了编码人MMP9多肽的核酸序列(SEQ ID NO：115)和人MM9多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：116)。
图66A和66B描绘了编码人GRO多肽的核酸序列(SEQ ID NO：117)和人GRO多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：118)。
图67A和67B描绘了编码人MIP2BGRO-g多肽的核酸序列(SEQ IDNO：119)和人MIP2BGRO-g多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：120)。
图68A和68B描绘了编码人IL1B多肽的核酸序列(SEQ ID NO：121)和人IL1B多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：122)。
图69A和69B描绘了编码人IL3RA多肽的核酸序列(SEQ ID NO：123)和人IL3RA多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：124)。
图70A和70B描绘了编码人CASP1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：125)和人CASP1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：126)。
图71A和71B描绘了编码人BV8多肽的核酸序列(SEQ ID NO：127)和人BV8多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：128)。
图72A和72B描绘了编码人用DAC7A多肽的核酸序列(SEQ ID NO：129)和人HDAC7A多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：130)。
图73A和73B描绘了编码人ACVRL1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：131)和人ACVRL1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：132)。
图74A和74B描绘了编码人NR4A1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：133)和人NR4A1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：134)。
图75A和75B描绘了编码人K5B多肽的核酸序列(SEQ ID NO：135)和人K5B多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：136)。
图76A和76B描绘了编码人SILV多肽的核酸序列(SEQ ID NO：137)和人SILV多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：138)。
图77A和77B描绘了编码人IRAK3多肽的核酸序列(SEQ ID NO：139)和人IRAK3多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：140)。
图78A和78B描绘了编码人IL-4多肽的核酸序列(SEQ ID NO：141)和人IL-4多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：142)。
图79A和79B描绘了编码人IL-13多肽的核酸序列(SEQ ID NO：143)和人IL-13多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：144)。
图80A和80B描绘了编码人RAD50多肽的核酸序列(SEQ ID NO：145)和人RAD50多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：146)。
图81A和81B描绘了编码人IL-5多肽的核酸序列(SEQ ID NO：147)和人IL-5多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：148)。
图82A和82B描绘了编码人IRF1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：149)和人IRF1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：150)。
图83A和83B描绘了编码人PDLIM4多肽的核酸序列(SEQ ID NO：151)和人PDLIM4多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：152)。
图84A和84B描绘了编码人CSF2多肽的核酸序列(SEQ ID NO：153)和人CSF2多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：154)。
图85A和85B描绘了编码人IL-3多肽的核酸序列(SEQ ID NO：155)和人IL-3多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：156)。
图86A和86B描绘了编码人MMP3多肽的核酸序列(SEQ ID NO：157)和人MMP3多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：158)。
图87A和87B描绘了编码人IL-8多肽的核酸序列(SEQ ID NO：159)和人IL-8多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：160)。
图88A和88B描绘了编码人TLR4多肽的核酸序列(SEQ ID NO：161)和人TLR4多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：162)。
图89A和89B描绘了编码人HLA-DRB1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：163)和人HLA-DRB1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：164)。
图90A和90B描绘了编码人MMP19多肽的核酸序列(SEQ ID NO：165)和人MMP19多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：166)。
图91A和91B描绘了编码人TIMP1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：167)和人TIMP1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：168)。
图92A和92B描绘了编码人Elfin多肽的核酸序列(SEQ ID NO：169)和人Elfin多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：170)。
图93A和93B描绘了编码人CXCL1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：171)和人CXCL1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：172)。
图94A和94B描绘了编码人DFKZP586A0522多肽的核酸序列(SEQ IDNO：173)和人DFKZP586A0522多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：174)。
图95A和95B描绘了编码人SLC39A5多肽的核酸序列(SEQ ID NO：175)和人SLC39A5多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：176)。
图96A和96B描绘了编码人GLI-1多肽的核酸序列(SEQ ID NO：177)和人GLI-1多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：178)。
图97A和97B描绘了编码人HMGA2多肽的核酸序列(SEQ ID NO：179)和人HMGA2多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：180)。
图98A和98B描绘了编码人SLC22A5多肽的核酸序列(SEQ ID NO：181)和人SLC22A5多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：182)。
图99A和99B描绘了编码人SLC22A4多肽的核酸序列(SEQ ID NO：183)和人SLC22A4多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：184)。
图100A和100B描绘了编码人P4HA2多肽的核酸序列(SEQ ID NO：185)和人P4HA2多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：186)。
图101A和101B描绘了编码人TSLP多肽的核酸序列(SEQ ID NO：187)和人TSLP多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：188)。
图102A和102B描绘了编码人微管蛋白α5/α3多肽的核酸序列(SEQ IDNO：189)和人微管蛋白α5/α3多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：190)。
图103A和103B描绘了编码人微管蛋白α6多肽的核酸序列(SEQ IDNO：191)和人微管蛋白α6多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：192)。
图104显示了使用Mantel-Haenszel法对苏格兰、剑桥和瑞典中非同义(non-synonymous)GLI1 SNP rs2228226的元分析(meta-analysis)。
图105显示了Q1100E破坏GLI1蛋白的保守区并降低GLI1转录活性。
图106显示了健康成人结肠(HC)和溃疡性结肠炎(UC)中Hedgehog(HH)信号传导构件的表达。
图107显示了结果，其中Gli1+/-动物在DSS处理后显示死亡、严重的临床症状、和显著的体重减轻。
图108显示了Gli1+/-动物应答DSS处理展现比WT同窝幼仔更严重的肠炎。
图109显示了DSS处理后的Gli1+/-和WT小鼠的细胞因子分析展现了强烈的促炎性细胞因子激活。
图110A-B显示了(A)编码人含抑制蛋白(arrestin)域的5(ARRDC5)的核酸序列(LOC342959)和(B)人ARRDC5多肽的氨基酸序列。
图111显示了与人共济失调蛋白3样蛋白(ataxin 3-like，ATXN3L)对应的核酸序列。
图112A-B显示了(A)编码人促卵泡激素受体(FSHR)的核酸序列(LOC92552)和(B)人FSHR多肽的氨基酸序列。
图113A-B显示了(A)编码人血小板衍生生长因子受体α多肽(PDGFRA)的核酸序列和(B)人PDGFRA多肽的氨基酸序列。
图114A-B显示了(A)人转化生长因子β3(TGFB3)的核酸序列编码和(B)人TGFB3多肽的氨基酸序列。
图115A-B显示了(A)编码人含钾通道四聚化域的8(potassium channeltetramerisation domain containing 8，KCTD8)的核酸序列和(B)人KCTD8多肽的氨基酸序列。
图116A-B显示了(A)编码人转谷氨酰胺酶4(TGM4)的核酸序列和(B)人TGM4多肽的氨基酸序列。
图117A-B显示了(A)编码人TPD52L3肿瘤蛋白D52样3(NYD-SP25)的核酸序列和(B)人NYD-SP25多肽的氨基酸序列。
图118显示了与misc_RNA(C3orf53)，FLJ33651对应的核酸序列。
图119显示了与染色体10上EMX2相反链(不编码蛋白质)(EMX2OS)对应的核酸序列。
图120A-B显示了(A)编码人无翼型MMTV整合位点家族，成员16(WNT16)的核酸序列和(B)人WNT16多肽的氨基酸序列。
图121A-C显示了(A-B)编码人sprouty相关，含EVH1域的2(SPRED2)的核酸序列和(C)人SPRED2的氨基酸序列。
图122A-C显示了(A-B)编码人染色体16可读框65(C16orf65)的核酸序列和(C)人染色体16可读框65(C16orf65)的氨基酸序列。
图123A-B显示了(A)编码人染色体12可读框2(C12orf2)的核酸序列和(B)人染色体12可读框2(C12orf2)的氨基酸序列。
图124A-B显示了(A)编码人多重PDZ域蛋白(MPDZ)的核酸序列和(B)人MPDZ的氨基酸序列。
图125A-B显示了(A)编码人苯丙氨酸-tRNA合成酶2(FARS2)的核酸序列和(B)人FARS2的氨基酸序列。
图126A-B显示了(A)编码人胱天蛋白酶8，凋亡相关半胱氨酸蛋白酶(CASP8)的核酸序列和(B)人CASP8的氨基酸序列。
图127A-B显示了(A)编码人5′-核苷酸酶，胞外(ecto)(CD73)(NT5E)的核酸序列和(B)人NT5E的氨基酸序列。
图128显示了与人畸胎瘤衍生生长因子3(TDGF3)对应的核酸序列。
图129A-B显示了(A)编码人嗜乳脂蛋白样3(BTNL3)的核酸序列和(B)人BTNL3的氨基酸序列。
图130A-B显示了(A)编码人S100A8的核酸序列和(B)人S100A8的氨基酸序列。
图131A-B显示了(A)编码人CCL20的核酸序列和(B)人CCL20的氨基酸序列。
发明详述
A.定义
除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。以下文献为本领域技术人员提供了本申请中所使用的许多术语的一般性指导：Singleton et al.，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology，第二版，J.Wiley & Sons(New York，N.Y.1994)，和March，Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms andStructure，第四版，John Wiley & Sons(New York，N.Y.1992)。
本领域技术人员会认识到许多与本文中所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料，它们可以在本发明的实践中使用。事实上，本发明绝非限于所描述的方法和材料。为了本发明，下文定义了下列术语。
术语“炎性肠病”或“IBD”用作溃疡性结肠炎和克罗恩氏病的统称。虽然这两种疾病一般认为是两种不同疾病，但是它们的共同特征，诸如表面上皮的斑状坏死、腺隐窝附近白细胞的局灶性积累、及上皮内淋巴细胞(IEL)和慢性巨噬细胞子集的数目增加，有理由认为它们可以作为一个疾病组进行治疗。
术语“克罗恩氏病”或“CD”在本文中用于指涉及胃肠道慢性炎症的疾患。克罗恩氏相关炎症通常影响肠，但是可发生于自口至***的任何部位。CD与UC的不同之处在于炎症穿过肠壁的所有层延伸，而且涉及肠系膜以及***。该疾病常常是不连续的，即严重患病的肠段与表观无病的区域是分开的。在CD中，肠壁也增厚，这能导致闭塞，而且瘘和裂隙的形成是常见的。如本文中所使用的，CD可以是数种CD类型中的一种或多种，包括但不限于回肠结肠炎(影响回肠和大肠)；回肠炎(影响回肠)；胃十二指肠CD(胃和十二指肠中的炎症)；空肠回肠炎(空肠中炎症的斑点样斑)；和克罗恩氏(肉芽肿性)结肠炎(只影响大肠)。
术语“溃疡性结肠炎”或“UC”在本文中用于指涉及大肠和直肠炎症的疾患。在UC患者中，有主要涉及结肠粘膜的炎性反应。该炎症通常是均匀且连续的，没有正常粘膜的居间区域。表面粘膜细胞以及隐窝上皮和粘膜下层涉及具有嗜中性粒细胞浸润的炎性反应。最终，此反应通常进展至上皮损伤和上皮细胞损失，导致结肠的多处溃疡、纤维化、发育异常和纵向退缩(retraction)。
术语“非活动性”IBD在本文中用于表示先前在个体中诊断为IBD但当前处于减退的IBD。这与“活动性”IBD构成对比，在后一种情况中，个体诊断有IBD但尚未接受治疗。另外，活动性IBD可以是先前诊断并治疗的IBD进入减退(即变成非活动性IBD)后的复发。此类复发也可在本文中称作IBD“突发(flare up)”。具有活动性自身免疫性疾病(诸如IBD)的哺乳动物受试者可经受突发，即病情活动加重或相应症状恢复的一段时间。突发可应答严重感染、***反应(allegic reactions)、生理应激(physical stress)、情绪创伤、手术、或环境因素而发生。
术语“调控”在本文中用于表示基因的表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等同RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性上调或下调，使得表达、水平、或活性大于或小于在调控剂不存在的情况中所观察到的。
术语“抑制”、“下调”、“表达不足”和“降低”可互换使用，表示一种基因的表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等同RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性相对于一种或多种对照(诸如例如一种或多种阳性和/或阴性对照)降低。
术语“上调”或“过表达”用于表示一种基因的表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等同RNA分子水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性相对于一种或多种对照(诸如例如一种或多种阳性和/或阴性对照)升高。
术语“诊断”在用于本文时指鉴定分子或病理状态、疾病或疾患，诸如鉴定IBD。
术语“预后”在用于本文时指预测IBD形成或进展的可能性，包括手术后的自身免疫突发和复发。预后因子指那些一旦患者形成IBD，影响患者复发率和结果的，与IBD自然史有关的变量。可能与较差的预后有关的临床参数包括例如腹部包块(abdominal mass)或压痛、皮疹、关节肿胀、口腔溃疡、和腹鸣(肠道有咕噜或溅泼声音)。预后因子可用于将患者归入具有不同基线复发风险的亚组。
IBD的“病理”包括所有危及患者康乐的现象。IBD病理主要归于肠中免疫***的异常激活，这能在没有任何已知外来抗原的情况中导致慢性或急性炎症，及随后的溃疡。在临床上，IBD的特征为多样表现，常常导致慢性的、不可预测的过程。血性腹泻和腹痛常常伴有发热和体重减轻。贫血是常见的，正如严重的疲劳。范围从关节痛到急性关节炎的关节表现以及肝功能异常常常与IBD有关。在IBD急性“攻击”期间，工作和其它正常活动通常是不可能的，而且患者常常住院。
这些疾病的病因未知，而且初始损害尚未清楚确定；然而，表面上皮的斑状坏死、腺隐窝附近白细胞的局灶性积累、及上皮内淋巴细胞和某些巨噬细胞子集的数目增加已经被描述为推定的早期变化，尤其是在克罗恩氏病中。
术语“治疗”或“处理”指针对IBD的治疗性处理及预防性或防范性措施二者，其中目标是预防或减缓(减轻)所针对的病理疾患或病症。需要治疗的受试者包括早就患有IBD的受试者以及以及倾向于患上IBD的受试者或要预防IBD的受试者。一旦通过本文中所公开的方法做出IBD诊断，那么治疗目标就是诱导和维持减退。
适合于用作“IBD治疗剂”的各种药剂是本领域技术人员知道的。如本文中所描述的，此类药剂包括但不限于氨基水杨酸盐、皮质类固醇、和免疫抑制剂。
术语“测试样品”指来自怀疑具有IBD、已知具有IBD、或已知处于IBD减退的哺乳动物受试者的样品。测试样品可源自哺乳动物受试者中的各种来源，包括但不限于血液、***、血清、尿液、骨髓、粘膜、组织、等。
术语“对照”或“对照样品”指预期其中的阴性结果有助于关联测试样品中的阳性结果的阴性对照。适合于本发明的对照包括但不限于已知具有正常水平的基因表达的样品、自已知没有IBD的哺乳动物受试者获得的样品、和自已知正常的哺乳动物受试者获得的样品。对照也可以是自先前诊断有IBD并为IBD接受过治疗、当前处于减退的受试者获得的样品；而且此类对照在确定处于消退的受试者中的任何IBD复发中是有用的。另外，对照可以是含有与测试样品中所含细胞具有相同起源的正常细胞的样品。本领域技术人员会领会适合于在本发明中使用的其它对照。
术语“微阵列”指能杂交的阵列元件，优选多核苷酸探针位于基质上的有序排列。
术语“多核苷酸”当以单数或复数使用时，通常指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA，或者是修饰的RNA或DNA。如此，举例来说，如本文中所定义的多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA、包括单链和双链区的DNA、单链和双链RNA、及包括单链和双链区的RNA、以及包含DNA和RNA的杂合分子，其中的DNA和RNA可以是单链或更通常地是双链或包括单链和双链区。此外，当在本文中使用时，术语“多核苷酸”指包含RNA或DNA或同时包含RNA和DNA的三链区。这种区域中的链可来自相同的分子或不同的分子。该区域可以包括一个或多个所述分子的整个，但更典型地仅是一些所述分子的区域。三股螺旋区的分子之一通常是寡核苷酸。术语“多核苷酸”明确包括cDNA。该术语包括含有一个或多个修饰的碱基的DNA(包括cDNA)和RNA。如此，具有因稳定性或其它原因而被修饰的主链的DNA或RNA是本文中该术语所意指的“多核苷酸”。此外，包含稀有碱基(诸如肌苷)或修饰的碱基(诸如氚化的碱基)的DNA或RNA包括在如本文中所定义的术语“多核苷酸”的范围内。一般而言，术语“多核苷酸”涵盖未修饰的多核苷酸的所有化学、酶和/或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(包括简单细胞和复杂细胞)特有的DNA和RNA的化学形式。
术语“寡核苷酸”指相对较短的多核苷酸，包括但不限于单链脱氧核糖核苷酸、单链或双链核糖核苷酸、RNA：DNA杂合物、及双链DNA。寡核苷酸，诸如单链DNA探针寡核苷酸，常常通过化学方法合成，例如使用商品化的自动化寡核苷酸合成仪。然而，寡核苷酸可通过多种其它方法制备，包括体外重组DNA介导的技术和通过DNA在细胞和生物体中的表达。
术语“差异表达的基因”、“差异的基因表达”和它们的同义词可互换使用，指相对于其在正常或对照受试者中的表达，其在患病(特别是IBD，诸如UC或CD)受试者中的表达被激活至更高或更低水平的基因。该术语还包括其在同一疾病的不同阶段的表达被激活至更高或更低水平的基因。还应当理解的是差异表达的基因可在核酸水平或蛋白质水平上被激活或抑制，或可进行可变剪接以产生不同的多肽产物。这样的差异可通过例如mRNA水平、多肽的表面表达、分泌或其它分配(partitioning)的改变而得以证实。差异的基因表达可包括比较两种或更多种基因或它们的基因产物之间的表达，或比较两种或更多种基因或它们的基因产物之间的表达比率，或甚至比较同一基因的两种不同加工产物，其在正常受试者和患病(特别是IBD)受试者之间或在同一疾病的不同阶段之间是不同的。差异表达包括在例如正常和患病细胞间或在经历了不同疾病事件或疾病阶段的细胞间，基因或其表达产物在时间或细胞表达图式中有定量的以及定性的差异。为了本发明的目的，当在正常和患病受试者中给定基因的表达之间或在患病受试者的不同疾病发展阶段中存在至少约2倍、优选至少约4倍、更优选至少约6倍、最优选至少约10倍差异时，就认为存在“差异的基因表达”。
关于RNA转录物的术语“过表达”用于指通过对参考mRNA水平标准化所确定的转录物水平，所述参考mRNA可以是标本中检测到的所有转录物或是特定的mRNA参考集合。
短语“基因扩增”指在特定细胞或细胞系中形成多拷贝的基因或基因片段的过程。复制区(扩增的DNA的区段)通常称为“扩增子”。一般而言，所产生的信使RNA(mRNA)的量，即基因表达的水平，也按由所表达特定基因形成的拷贝数的比例增加。
一般而言，术语“标志物”或“生物标志物”指染色体上的可鉴定的物理位置，诸如限制性内切核酸酶识别位点或基因，其继承可被监测。标志物可以是称作“基因表达标志物”的基因表达区，或没有已知的编码功能的一些DNA区段。如本文中所使用的，“IBD标志物”指表1、2、和3中所列举的那些基因。
杂交反应的“严格性”容易为本领域普通技术人员所确定，并且通常取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针需要较高的温度用于正确的退火，而较短的探针则需要较低的温度。当互补链存在于低于它们解链温度的环境中时，杂交通常取决于变性DNA重新退火的能力。探针和能杂交的序列之间的期望同源性程度越高，就可使用越高的相对温度。作为结果，更高的相对温度趋向于使反应条件更加严格，而更低的温度则更不严格。对于杂交反应的严格性的补充细节及解释参见Ausubel等的《Current Protocols in Molecular Biology》，Wiley Interscience Publishers，(1995)。
如本文中所定义的，“严格条件”或“高严格条件”通常为：(1)对于洗涤使用低离子强度和高温，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交期间使用变性剂，诸如甲酰胺，例如，50％(v/v)甲酰胺及0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/具有750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，42℃，或(3)使用50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x Denhardt氏溶液，超声处理的鲑精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS和10％硫酸右旋糖苷，42℃，在42℃于0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)，50％甲酰胺中洗涤，然后在55℃由含有EDTA的0.1x SSC组成的高严格洗涤。
“中等严格条件”可规定为如Sambrook等的《Molecular Cloning：ALaboratory Manual》(New York：Cold Spring Harbor Press，1989)所描述的，而且包括使用与上文所述那些相比较不严格的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的一个例子是在含：20％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt氏溶液、10％硫酸右旋糖苷和20mg/ml变性的剪切的鲑精DNA的溶液中于37℃温育过夜，然后于约37-50℃在1x SSC中洗涤滤膜。本领域熟练技术人员应当认识到如何根据适应诸如探针长度等因素的需要来调节温度、离子强度等。
在本发明的语境中，述及任何特定基因集中所列举的“至少一种”、“至少两种”、“至少五种”、等基因意味着所列举的基因的任一组合或任何组合和所有组合。
术语“剪接”和“RNA剪接”可互换使用，指除去内含子并连接外显子以产生成熟mRNA的RNA加工，其中成熟mRNA具有连续编码序列且移入真核细胞的细胞质。
理论上，术语“外显子”指体现在成熟RNA产物中的任何断裂基因区段(B.Lewin.Genes IV Cell Press，Cambridge Mass.1990)。理论上，术语“内含子”指被转录但通过将位于其任一侧的外显子剪接到一起而被从转录物中除去的任何DNA区段。在操作上，外显子序列出现在基因的mRNA序列中，基因通过参见SEQ ID编号来限定。在操作上，内含子序列是位于基因的基因组DNA中的间插序列，其两侧为外显子序列且在它们的5’和3’边界具有GT和AG剪接共有序列。
“干扰RNA”或“小干扰RNA(siRNA)”指长度通常小于约30个核苷酸且降低靶基因表达的双链RNA分子。干扰RNA可使用已知方法来鉴定和合成(Shi Y，Trends in Genetics 19(1)：9-12(2003)；WO 2003/056012；WO2003/064621)，而且siRNA文库可通过商业途径获得，例如Dharmacon，Lafayette，Colorado。
“天然序列”多肽指与衍生自自然界的多肽具有相同氨基酸序列的多肽，包括天然存在或等位变体。此类天然序列多肽可以从自然界分离，或者可通过重组或合成手段生成。如此，天然序列多肽可具有天然存在人多肽、鼠多肽、或来自任何其它哺乳类物种的多肽的氨基酸序列。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。本发明具体涵盖针对本文中所公开的一种或多种IBD标志物的抗体。此类抗体可称作“抗IBD标志物抗体”。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(例如旧大陆猴类(Old World Monkey)、猿等)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化”抗体，以及“人源化抗体”。
非人(例如啮齿类)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。
“完整抗体”在本文中指包含两个抗原结合区及Fc区的抗体。优选的是，完整抗体具有功能性Fc区。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体(diabody)；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变域(VH)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL)，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。
术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institute of Health，Bethesda，MD.(1991))。
术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al.Immunity 13：37-45(2000)；Johnson和Wu，于Methods in Molecular Biology 248：1-25(Lo，ed.，HumanPress，Totowa，NJ，2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al.，Nature363：446-448(1993)及Sheriff et al.，Nature Struct.Biol.3：733-736(1996)。
本文中使用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(CDR)以序列变异性为基础且是最常用的(Kabat et al.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。Chothia CDR-H1环的末端在使用Kabat编号规则编号时在H32与H34之间变化(见下文)，取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案在H35A和H35B处放置***；如果35A和35B都不存在，那么该环在32处结束；如果只有35A存在，那么该环在33处结束；如果35A和35B都存在，那么该环在34处结束)。AbM高变区代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”高变区是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。
环      Kabat          AbM            Chothia            接触
----    -----------    ----------     -----------        ----------
L1      L24-L34        L24-L34        L24-L34            L30-L36
L2      L50-L56        L50-L56        L50-L56            L46-L55
L3      L89-L97        L89-L97        L89-L97            L89-L96
H1      H31-H35B       H26-H35B       H26-H32，33或34    H30-H35B
(Kabat编号)
H1      H31-H35        H26-H35        H26-H32            H30-H35
(Chothia编号)
H2      H50-H65        H50-H58        H52-H56            H47-H58
H3      H95-H102       H95-H102       H95-H102           H93-H101
高变区可包括如下“延伸的高变区”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97(L3)及VH中的26-35B(H1)、50-65、47-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。这些延伸的高变区通常是Kabat和Chothia定义的组合，其可任选进一步包括使用接触定义鉴定的残基。对于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等，见上文编号的。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构造中，每个可变域的三个高变区相互作用而在VH-VL二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个高变区一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。
Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab′的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是作为在成对Fab′片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab′片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联形式。
根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C-端区域，包括天然序列Fc区和变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447，依照EU编号***)可以消除，例如在生产或纯化抗体的过程中，或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程改造。因而，完整抗体组合物可以包括所有K447残基都被消除的抗体群、无一K447残基被消除的抗体群、或者混合了有K447残基的抗体和没有K447残基的抗体的抗体群。
除非另有说明，本文中免疫球蛋白重链的残基编号方式是如Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中的EU索引的编号方式。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号方式。
“天然序列Fc区”包含与在自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区；及其天然存在变体。
“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰(优选一处或多处氨基酸替代)而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。优选的是，变异Fc区与天然序列Fc区相比或与亲本多肽的Fc区相比具有至少一处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代。变异Fc区在本文中优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约80％的同源性，最优选与它们具有至少约90％的同源性，更优选与它们具有至少约95％的同源性。
根据其重链恒定域的氨基酸序列，完整抗体可归入不同的类。完整抗体有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的抗体对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选的是，Fv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见Plückthun，于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页，1994。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。
“裸抗体(裸露的抗体)”指未偶联异源分子诸如小分子或放射性标记物的抗体。
“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。
“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个高变区中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。优选的亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了HVR和/或框架残基的随机诱变：Barbas et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al.，Gene 169：147-155(1995)；Yelton et al.，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al.，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。
“氨基酸序列变体”抗体在本文中指具有与主要种类抗体不同的氨基酸序列的抗体。通常，氨基酸序列变体将与主要种类抗体具有至少约70％的同源性，而且优选的是，它们将是与主要种类抗体至少约80％，更优选至少约90％同源。氨基酸序列变体在主要种类抗体氨基酸序列内部或邻近的某些位置具有替代、删除和/或添加。本文中氨基酸序列变体的例子包括酸性变体(例如脱酰胺抗体变体)、碱性变体、在其一条或两条轻链上具有氨基末端前导延伸(例如VHS-)的抗体、在其一条或两条重链上具有C-末端赖氨酸残基的抗体、等，且包括重链和/或轻链氨基酸序列变异的组合。本文中特别感兴趣的抗体变体是在其一条或两条轻链上包含氨基末端前导延伸的抗体，任选相对于主要种类抗体还包含其它氨基酸序列和/或糖基化差异。
“糖基化变体”抗体在本文中指附着有一种或多种碳水化合物模块且所述碳水化合物与附着于主要种类抗体的一种或多种碳水化合物模块不同的抗体。本文中糖基化变体的例子包括其Fc区附着有G1或G2寡糖结构代替G0寡糖结构的抗体、其一条或两条轻链附着有一种或两种碳水化合物模块的抗体、其一条或两条重链没有附着碳水化合物模块的抗体、等，及糖基化改变的组合。
若抗体具有Fc区，则抗体的一条或两条重链，例如残基299处(298，Eu残基编号)可附着有寡糖结构。对于Pertuzumab，G0是主要的寡糖结构，而在Pertuzumab组合物中找到的其它寡糖结构诸如G0-F、G-1、Man5、Man6、G1-1、G1(1-6)、G1(1-3)和G2的量较少。
除非另有说明，“G1寡糖结构”在本文中包括G1、G1-1、G1(1-6)和G1(1-3)结构。
“氨基末端前导延伸”在本文中指在抗体的任何一条或多条重链或轻链的氨基末端存在的氨基末端前导序列的一个或多个氨基酸残基。例示性的氨基末端前导延伸包含三个氨基酸残基，VHS或由其组成，它们存在于抗体变体的一条或所有两条轻链上。
“脱酰胺”抗体指其中一个或多个天冬酰胺残基衍生成例如天冬氨酸、琥珀酰亚胺或异天冬氨酸的抗体。
B.1本发明的一般描述
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、和生物化学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分解释，诸如“Molecular Cloning：A LaboratoryManual”，第2版(Sambrook et al.，1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编，1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney编，1987)；“Methods inEnzymology”(Academic Press，Inc.)；“Handbook of Experimental Immunology”，第4版(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，Blackwell Science Inc.，1987)；“GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells”(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel et al.编，1987)；及“PCR：The Polymerase Chain Reaction”，(Mullis et al.编，1994)。
如上所述，IBD的检测或诊断当前是通过依赖在患者中观察到的多种变量的各种分类***来获得的。本发明基于与IBD有关的基因的鉴定。因而，此类基因的表达水平可充当诊断标志物来鉴定IBD患者。如实施例中所讨论的，在IBD患者中观察到多种基因的差异表达。如此，依照本发明，表1A-B、2、和3A-B中所列举的基因已经鉴定为在IBD中差异表达。
表1A提供了在IBD中上调的基因的列表。
表1A
Figure BPA00001187298700301
Figure BPA00001187298700321
表1B提供了在IBD中下调的基因的列表。
Figure BPA00001187298700322
Figure BPA00001187298700331
表2提供了在IBD中上调的基因的列表。这些基因是自免疫应答计算机(immune response in silico)(IRIS)基因集合鉴定的(Abbas，A.et al.Genes andImmunity，6：319-331(2005)，通过述及完整收入本文)。
表2
Figure BPA00001187298700332
表3A提供了在IBD中上调且基于实施例2中描述的实验鉴定的基因的列表。在一些情况中，提供了基因的基因座/染色体。
表3A
Figure BPA00001187298700341
表3B提供了在IBD中下调且基于实施例2中描述的实验鉴定的基因的列表。在一些情况中，提供了基因的基因座/染色体。
表3B
Figure BPA00001187298700342
a.本发明的生物标志物
本发明提供了表1A、1B、2、3A、和3B中所列举的针对IBD的多种基因表达标志物或生物标志物。在本发明的一个实施方案中，所述生物标志物适合于在标志物组中使用(如本文中所描述的)。所述组可包括一种或多种来自表1A的标志物；一种或多种来自表1B的标志物；来自表2的标志物；一种或多种来自表3A的标志物；和一种或多种来自表3B的标志物。另外，本发明还涵盖自表1A、1B、2、3A、和3B中两项或更多项选择的标志物组。例如，组可含有一种或多种来自表1A的标志物和一种或多种来自表1B的标志物；或者一种或多种来自表1A的标志物和来自表2的标志物；或者一种或多种来自表1B的标志物和来自表2的标志物；或者一种或多种来自表1A的标志物和一种或多种来自表3A的标志物，等。本领域普通技术人员会领会适合于在本文所述组中使用的来自表1-3的生物标志物的各种组合。
在本发明的一个实施方案中，通过微阵列分析鉴定出的一个优选IBD标志物集包括在IBD中上调的标志物。优选的是，所述上调标志物集包括表1A中的DEFA5(SEQ ID NO：3-4)、DEFA6(SEQ ID NO：1-2)、TNIP3(SEQ IDNO：81-82)、REG3-γ(SEQ ID NO：9-10)、MMP7(SEQ ID NO：93-94)、和SAA1(SEQ ID NO：71-72)；及表3A中的IL-8(SEQ ID NO：159-160)、角蛋白5B(K5B)(SEQ ID NO：135-136)、SLC22A4(SEQ ID NO：183-184)、SLC22A5(SEQ IDNO：181-182)、MMP3(SEQ ID NO：157-158)、和MMP19(SEQ IDNO：165-166)。一种优选的下调标志物是表3B中的GLI-1(SEQ ID NO：175-176)。如本文中所描述的生物标志物组可包括这些标志物中的一种、超过一种、或所有。或者，所述标志物集包括来自表1A的所示标志物中的1、2、3、4、5、6种，和/或来自表3A的所示标志物中的1、2、3、4、5、6种和/或表3B中所示标志物中的1或2种。
作为单一标志物或任何组合的，上文所提供的表的成员优选在本发明的预后和诊断测定法中使用。本发明的IBD标志物是差异表达基因或基因区域。来自哺乳动物受试者的测试样品中一种或多种标志物相对于对照的差异水平的表达可根据通过下文进一步详述的一种或多种方法检测的RNA转录物或表达产物水平来确定。
基于正常细胞和来自具有IBD的哺乳动物受试者的细胞中RNA转录物的差异表达的证据，本发明提供了IBD的基因标志物。本发明提供的IBD标志物及相关信息容许内科医师做出更加明智的治疗决策，及根据患者个体的需要来定制IBD治疗，由此使治疗受益最大化、使患者对不提供任何显著收益且常常由于毒副作用而携带严重风险的不必要治疗的暴露最小化。
多重分析物基因表达测试能测量涉及数种相关生理过程或成分细胞特征中每一种的一种或多种基因的表达水平。在一些情况中，该测试的预测能力，及因此它的效用能通过使用为各基因个体获得的表达值来计算比所述各基因的表达值与结果更加高度相关的得分来提高。例如，美国已公布的专利申请No.20050048542中记载了预测***受体阳性、结节阴性乳腺癌中复发的可能性的定量得分(复发得分)的计算。用于计算此类复发得分的方程可以将基因分组，以使复发得分的预测价值最大化。基因的分组可以至少部分基于关于它们对生理功能或成分细胞特征的贡献的知识来实施，诸如上文所讨论的。另外，小组的形成能便于各表达值对复发得分的贡献的数学加权。代表生理过程或成分细胞特征的基因小组的加权能反映该过程或特征对IBD病理和临床结果的贡献。因而，在一个重要的方面，本发明还提供了本文中所鉴定的特定基因小组，它们在一起时是比所鉴定的基因个体或基因随机组合更加可靠和有力的结果预测物。
另外，基于复发得分的确定，能选择将患者分入复发得分处于任何特定值的亚组，那里该值在给定范围中的所有患者能归类为属于特定风险组。如此，所选择的值会限定具有相应或较高或较低风险的患者亚组。
基因标志物在预测IBD形成或进展中的效用可能不是该标志物独有的。具有与特定测试标志物密切相似的表达样式的备选标志物可替代测试标志物或与测试标志物一起使用，而且对测试的总体预测效用具有很小的影响。两种基因密切相似的表达样式可源自这两种基因都涉及特定过程和/或在共同的调节控制下。本发明具体包括和涵盖此类替代基因或基因集在本发明方法中的使用。
本发明提供的预测IBD形成和/或进展的标志物及相关信息在筛选包括在测试药物化合物用于治疗IBD患者的功效的临床试验中的患者中也具有效用。
本发明提供的预测IBD存在、形成和/或进展的标志物及相关信息作为确定IBD治疗是否适宜的标准是有用的。例如，在测试结果指示IBD标志物在来自个体的测试样品中相对于对照样品差异表达的情况中，IBD治疗可能是适宜的。所述个体可以是已知没有IBD的个体、已知具有IBD的个体、先前诊断有IBD且正在接受IBD治疗的个体、或先前诊断有IBD且接受手术以解决IBD的患者。另外，本发明涵盖治疗IBD的方法。如下所述，本发明的诊断方法可进一步包括对提供测试样品的哺乳动物受试者施用IBD治疗剂的步骤，其中在所述测试样品中观察到一种或多种IBD标志物相对于对照的差异表达。因此，此类治疗方法会包括(a)确定哺乳动物受试者中IBD的存在，及(b)对哺乳动物受试者施用IBD治疗剂。
在另一个实施方案中，使用IBD标志物及相关信息来设计或生成调控基因转录物或其表达产物的活性的试剂。所述试剂可包括但不限于反义RNA、小限制性RNA(siRNA)、核酶、单克隆或多克隆抗体。在又一个实施方案中，在(筛选)测定法中使用所述基因或其转录物，或更特别的，使用所述转录物的表达产物来鉴定药物化合物，其中所述药物化合物用于开发治疗IBD的药物。
在本发明的各种实施方案中，下文所述多种技术办法可用于测定所公开的基因的表达水平。在具体的实施方案中，可以关于基因表达产物的各种特征测定每一种基因的表达水平，包括外显子、内含子、蛋白质表位和蛋白质活性。在其它实施方案中，可以根据基因的结构分析，例如根据基因启动子甲基化样式分析来推断基因的表达水平。
b.本发明的诊断方法
本发明提供了基于IBD标志物的差异表达检测或诊断哺乳动物受试者中的IBD的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使用一组IBD标志物，如上文所讨论的。该组可包括选自表1-3的一种或多种IBD标志物。
在一些实施方案中，所述IBD标志物组会包括至少一种IBD标志物、至少两种IBD标志物、至少三种IBD标志物、至少四种IBD标志物、至少五种IBD标志物、至少6种IBD标志物、至少7种IBD标志物、至少8种IBD标志物、至少9种IBD标志物、至少10种IBD标志物、至少11种IBD标志物、至少12种IBD标志物、至少13种IBD标志物、至少14种IBD标志物、至少15种IBD标志物、至少16种IBD标志物、至少17种IBD标志物、至少18种IBD标志物、至少19种IBD标志物、或至少20种IBD标志物。在一个实施方案中，所述组包括增量为5的标志物。在另一个实施方案中，所述组包括增量为10的标志物。所述组可包括在IBD中相对于对照过表达的IBD标志物、在IBD中相对于对照表达不足的IBD标志物、或在IBD中相对于对照既过表达又表达不足的IBD标志物。在一个优选的实施方案中，所述组包括在CD中上调的一种或多种标志物和在CD中下调的一种或多种标志物。在另一个优选的实施方案中，所述组包括在UC中上调的一种或多种标志物和在UC中下调的一种或多种标志物。
在另一个实施方案中，本发明的组可包括在活动性IBD中相对于对照过表达的IBD标志物、在活动性IBD中相对于对照表达不足的IBD标志物、或在活动性IBD中相对于对照既过表达又表达不足的IBD标志物。在另一个实施方案中，本发明的组可包括在非活动性IBD中相对于对照过表达的IBD标志物、在非活动性IBD中相对于对照表达不足的IBD标志物、或在非活动性IBD中相对于对照既过表达又表达不足的IBD标志物。在一个优选的实施方案中，所述活动性IBD是CD。在另一个优选的实施方案中，所述非活动性IBD是CD。
在一个优选的实施方案中，所述诊断或检测哺乳动物受试者中IBD的存在的方法包括相对于对照中的表达水平确定自受试者中获得的测试样品中来自一组IBD标志物的RNA转录物或其表达产物的差异表达水平，其中差异水平的表达指示获得测试样品的受试者中IBD的存在。测试样品中的差异表达可以是相对于对照较高和/或较低，如本文中所讨论的。
在患者获得的生物学样品中上文列表中提供的一种或多种基因或相应RNA分子或所编码的蛋白质相对于对照的差异表达或活性指示患者中IBD的存在。对照可以是例如相同细胞中存在的、已知在IBD患者中上调(或下调)的基因(阳性对照)。或者/另外，对照可以是相同细胞类型的正常细胞中相同基因的表达水平(阴性对照)。表达水平还可以标准化，例如相对于持家基因诸如甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和/或β-肌动蛋白的表达水平或相对于所测试样品中所有基因的表达水平。在一个实施方案中，若它处于中值或以上，例如与相同类型的其它样品相比，则认为一种或多种上述基因的表达是阳性表达。中值表达水平本质上可以在测量基因表达的同时确定，或者可以在先确定。这些和其它方法是本领域公知的，而且对于本领域技术人员是显而易见的。
本文中提供了用于鉴定IBD的患者的方法。在此患者群中，IBD患者可通过测定包含自患者获得的细胞的生物学样品中一种或多种基因、相应的RNA分子或所编码的蛋白质的表达水平来鉴定。所述生物学样品可以是例如组织活检，如本文中所描述的。
本发明的方法关注IBD诊断测定法和成像方法。在一个实施方案中，所述测定法是使用本文所述抗体实施的。本发明还提供了对于蛋白质的检测和定量有用的各种免疫学测定法。这些测定法是以本领域公知的各种免疫学测定法形式实施的，包括但不限于各种类型的放射免疫测定法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、酶联免疫荧光测定法(ELIFA)、等等。另外，本发明还提供了能够检测以本文所述分子表达为特征的IBD的免疫学成像方法，包括但不限于使用经标记抗体的放射闪烁成像法。此类测定法在临床上在以本文所述一种或多种分子表达为特征的IBD的检测、监测、诊断和预后中是有用的。
本发明的另一个方面涉及用于鉴定表达本文所述分子的细胞的方法。本文所述分子的表达序型使之成为IBD的诊断标志物。因而，所述分子的表达状态提供了对于预测多种因素(包括对疾病晚期的易感性、进展速率、和/或活动性IBD或非活动性IBD中症状突然和严重发作，即突发)有用的信息。
在一个实施方案中，本发明提供了检测IBD的方法。使来自哺乳动物受试者的测试样品和来自已知正常哺乳动物的对照样品各接触抗IBD标志物抗体或其片段。测量IBD标志物表达的水平，而且测试样品中相对于对照样品的差异水平的表达指示获得测试样品的哺乳动物受试者中的IBD。在一些实施方案中，测试样品中IBD标志物表达的水平测定为比对照中的表达水平高，其中较高水平的表达指示获得测试样品的受试者中IBD的存在。在另一个实施方案中，测试样品中IBD标志物表达的水平测定为比对照中的表达水平低，其中较低水平的表达指示获得测试样品的受试者中IBD的存在。
在另一个实施方案中，通过本发明方法检测的IBD是哺乳动物受试者中IBD的复发或突发。
在优选的实施方案中，采用所述方法来检测先前确定为具有IBD且接受IBD治疗(诸如药物疗法或手术规程)的哺乳动物受试者中IBD的突发或IBD的复发。IBD的初始检测后，可以自发现具有IBD的哺乳动物受试者获得别的测试样品。所述别的样品可以在采集初始样品后几小时、几天、几周、或几个月获得。本领域技术人员会领会用于获得此类别的样品(可包括第二、第三、第四、第五、第六、等测试样品)的适宜方案。使初始测试样品和别的样品(或者本文所述对照样品)接触抗IBD标志物抗体。测量IBD标志物表达水平，而且与初始测试样品相比别的测试样品中差异水平的表达指示获得测试样品的哺乳动物受试者中IBD的突发或复发。
一方面，本发明的方法致力于测定步骤。在一个实施方案中，所述测定步骤包括相对于对照测量测试样品中一种或多种IBD标志物的表达水平。典型的是，如本文所述测量IBD标志物表达水平涉及通过实施本文所述一种或多种技术相对于对照对测试样品分析IBD标志物的差异表达。对自测试样品和对照获得的表达水平数据比较差异表达水平。在另一个实施方案中，所述测定步骤进一步包括检查测试样品和对照表达数据以评估获得测试样品的受试者中是否存在IBD。
在一些实施方案中，所述测定步骤包括由合适处理器执行的软件程序的使用，其用于下列目的：(i)测量测试样品和对照中IBD标志物表达的差异水平；和/或(ii)分析自测量测试样品和对照中IBD标志物表达的差异水平获得的数据。适当的软件和程序是本领域已知的，而且可以商购。所述程序可以包含在软件中，而所述软件存储在实体介质上，诸如CD-ROM、软盘、硬盘驱动器、DVD、或与处理器相联的内存，但是本领域普通技术人员会容易地领会，整个程序或其部分可以由处理器以外的装置来执行，和/或以公知方式包含在固件和/或专用硬件中。
例如，在测定步骤之后，通常记录测量结果、发现、诊断、预测和/或治疗建议，并通知技术人员、内科医师和/或患者。在某些实施方案中，会使用电脑将此类信息通知有关当事人，诸如患者和/或主治医师。在一些实施方案中，会在与通知结果或诊断的国家或管辖地区不同的国家或管辖地区中实施测定法或分析测定结果。
在一个优选的实施方案中，在完成测定和得出诊断和/或预测后尽可能快地将根据在具有本文中一种或多种IBD标志物的测试受试者中测量得到的本文中所公开的一种或多种IBD标志物表达水平做出的诊断、预测和/或治疗建议通知受试者。可通过受试者的主治医师将所述结果和/或相关信息通知受试者。或者，可通过任何通讯手段将所述结果直接通知测试受试者，包括书面、电子形式的通讯(诸如电子邮件)、或电话。可通过使用电脑来方便通讯，诸如在电子邮件通讯的情况中。在某些实施方案中，包含诊断测试的结果和/或根据测试得出的结论和/或根据测试得出的治疗建议的通讯可使用电信领域技术人员所熟悉的计算机硬件和软件的组合自动生成并递送至受试者。面向保健的通讯***的一个例子记载于美国专利No.6,283,761；然而，本发明不限于利用这种特定通讯***的方法。在本发明方法的某些实施方案中，所有或一些方法步骤(包括样品的测定、疾病的诊断、和测定结果或诊断的通讯)可以在不同的(例如外国的)管辖地区中进行。
本发明提供了用于检测与胃肠道有关的组织(包括但不限于升结肠组织、降结肠组织、乙状结肠组织、和回肠末端组织)中IBD标志物的差异表达；以及其它生物学样品(诸如血清、***、骨、***、尿液、细胞制备物、等等)中的表达的测定法。用于检测IBD标志物差异表达的方法也是公知的，而且包括例如免疫沉淀、免疫组织化学分析、Western印迹分析、分子结合测定法、ELISA、ELIFA等等。例如，一种检测生物学样品中IBD标志物差异表达的方法包括首先使样品接触抗IBD标志物抗体、其IBD标志物反应性片段、或包含抗IBD标志物抗体之抗原结合区的重组蛋白；然后检测样品中IBD标志物蛋白质的结合。
在本发明的各种实施方案中，多种技术办法可用于测定所公开的基因的表达水平，包括但不限于RT-PCR、微阵列、基因表达连续分析(SAGE)和通过大规模平行签名测序(MPSS)的基因表达分析，它们会在下文详细讨论。在具体的实施方案中，可以关于基因表达产物的各种特征测定每一种基因的表达水平，包括外显子、内含子、蛋白质表位和蛋白质活性。在其它实施方案中，可以根据基因的结构分析，例如根据基因启动子甲基化样式分析来推断基因的表达水平。
c.本发明的治疗方法
本发明提供了治疗有需要的受试者中的IBD的治疗方法，包括通过本文所述诊断方法检测哺乳动物受试者中IBD的存在，然后对哺乳动物受试者施用IBD治疗剂。本领域普通技术人员会领会可适合于在本发明中使用的各种IBD治疗剂(参见St Clair Jones，Hospital Pharmacist，May 2006，Vol.13；pages161-166，通过述及完整收入本文)。本发明涵盖IBD治疗方法，其中对有需要的受试者施用一种或多种IBD治疗剂。在一个实施方案中，所述IBD治疗剂是一种或多种氨基水杨酸盐、皮质类固醇、和免疫抑制剂。在一个优选的实施方案中，所述氨基水杨酸盐是柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、奥沙拉秦(olsalazine)、美沙拉秦(mesalamine)、巴柳氮(balsalazide)、和安萨科(asacol)之一。在另一个优选的实施方案中，共施用多种氨基水杨酸盐，诸如柳氮磺吡啶和奥沙拉秦的组合。在其它优选的实施方案中，所述皮质类固醇可以是布***(budesonide)、***(prednisone)、***龙(prednisolone)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)(6-MP)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、和环孢霉素(cyclosporin)。在其它优选的实施方案中，所述IBD治疗剂可以是抗生素，诸如环丙沙星(ciprofloxacin)和/或甲硝哒唑(metronidazole)；或基于抗体的药剂，诸如英夫利昔单抗
Figure BPA00001187298700421
通常用于治疗患者的、毒性最低的IBD治疗剂是氨基水杨酸盐。通常一天施用四次的柳氮磺吡啶(Azulfidine)由通过氮键连接磺胺吡啶的活性分子氨基水杨酸盐(5-ASA)组成。结肠中的厌氧细菌拆分氮键以释放活性5-ASA。然而，至少20％的患者不能耐受磺胺吡啶，因为它与显著副作用有关，诸如可逆的***异常、消化不良或对磺胺成分的***反应。这些副作用在服用奥沙拉秦的患者中降低。然而，柳氮磺吡啶和奥沙拉秦都不能有效治疗小肠炎症。已经开发了在小肠中释放的其它5-ASA配制剂(例如美沙拉秦和安萨科)。正常情况中5-ASA疗法需要6-8周来显示完全功效。给对5-ASA疗法不响应的患者或具有更严重疾病的患者开皮质类固醇的处方。然而，这是短期疗法，而且不能用作维持疗法。用皮质类固醇在2-4周内实现临床减退，然而副作用是显著的，而且包括Cushing面黄(goldface)、面毛、严重的情绪不稳和失眠。对柳氮磺吡啶和5-氨基水杨酸盐制剂的响应，在CD中是差的，在早期溃疡性结肠炎中是中度到轻度的(fair to mild)，而在重度UC中是差的。如果这些药剂失败了，那么通常尝试有力的免疫抑制剂，诸如环孢霉素、***、6-巯基嘌呤或硫唑嘌呤(在肝中转化成6-巯基嘌呤)。对于CD患者，必须小心监测皮质类固醇和其它免疫抑制剂的使用，因为源自这种疾病中常见的瘘和脓肿的腹内败血症的风险高。大约25％的IBD患者会在疾病过程期间需要手术(结肠切除术)。
IBD治疗可包括手术规程，包括但不限于肠切除术、吻合术、结肠切除术、直肠结肠切除术、和造瘘术，或其任意组合。
在药物医学和手术之外，还尝试了非常规IBD治疗，诸如营养疗法。例如，
Figure BPA00001187298700431
(一种半基本配方(semi-elemental formula))已经显示出像类固醇***龙一样有效。Sanderson et al.，Arch.Dis.Child.51：123-7(1987)。然而，半基本配方相对昂贵且通常味道差，因此它们的使用受到限制。还尝试了掺入整个蛋白质的营养疗法来减轻IBD的症状。Giafer et al.，Lancet 335：816-9(1990)。美国专利No.5,461,033记载了自牛奶分离的酸性酪蛋白和TGF-2的使用。Beattie et al.，Aliment.Pharmacol.Ther.8：1-6(1994)记载了酪蛋白在婴儿配方(奶粉)中在IBD儿童中的使用。U.S.P.5,952,295记载了酪蛋白在用于IBD治疗的肠配制剂中的使用。然而，虽然营养疗法是无毒的，但是它是一种姑息疗法，不治疗引起疾病的原因。
本发明涵盖IBD治疗方法，包括例如体外、回体(ex vivo)和体内治疗方法。本发明提供了在检测受试者中与本文中所公开的一种或多种IBD标志物的表达(诸如升高和/或较低的IBD标志物表达)有关的IBD疾病状态，之后对于治疗有需要的受试者中的IBD有用的方法。在一个优选的实施方案中，所述方法包括(a)确定自所述受试者获得的测试样品中(i)编码选自表1、2、或3的一种或多种多肽的一种或多种核酸；或(ii)表1、2、和3中所列一种或多种基因的RNA转录物或表达产物的表达水平相对于对照中的表达水平较高和/或较低，其中所述较高和/或较低的表达水平指示获得测试样品的受试者中IBD的存在；并(b)对所述受试者施用有效量的IBD治疗剂。所述确定步骤(a)可包括测量多种IBD标志物的表达。
所述治疗方法包括检测IBD及对需要此类治疗的受试者施用有效量的IBD治疗剂。在一些实施方案中，IBD疾病状态与一种或多种IBD标志物表达的升高和/或较低有关。
一方面，本发明提供了用于治疗或预防IBD的方法，该方法包括检测受试者中IBD的存在并对受试者施用有效量的IBD治疗剂。应当理解，可以在所述治疗方法中使用任何合适的IBD治疗剂，包括氨基水杨酸盐、皮质类固醇、和免疫抑制剂，如本文中所讨论的。
在本文中的任何方法中，可以与本文中所讨论的单一IBD治疗剂一起对受试者或患者施用有效量的第二药剂(其中所述本文中的单一IBD治疗剂是第一药剂)，其是能治疗需要治疗的受试者中的疾患的另一种活性剂。例如，氨基水杨酸盐可以与皮质类固醇、免疫抑制剂、或其它氨基水杨酸盐共施用。所述第二药剂的类型取决于多种因素，包括IBD的类型、其严重程度、患者的状况和年龄、所采用的第一药剂的类型和剂量、等。
使用第一和第二药剂的此类治疗包括联合施用(其中在同一配制剂或分开的配制剂中包括两种或更多种药剂)，和分开施用，在这种情况中，第一药剂的施用可以发生在第二药剂的施用之前和/或之后。一般而言，所述第二药剂可以在施用第一药剂后48小时内，或者在第一药剂后24小时内、或12小时内、或3-12小时内施用，或者可以在预先选择的一段时间里施用，其优选是约1-2天、约2-3天、约3-4天、约4-5天、约5-6天、或约6-7天。
第一和第二药剂可以与第一和第二药剂同时、序贯、或交替施用，或者在无响应性时与其它疗法同时、序贯、或交替施用。如此，第二药剂的联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药物配制剂的共施用(同时施用)，及任一次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有(两种或更多种)药剂同时发挥其生物学活性。所有这些第二药剂可以彼此组合或者单独与第一药剂一起使用，因此表述“第二药剂”在用于本文时不意味着它是第一药剂以外的唯一药剂。如此，第二药剂不必是一种药剂，而是可以包含超过一种此类药剂或由其组成。本文所列的这些第二药剂通常以与第一药剂相同的剂量和施用途径或者第一药剂的剂量的大约1-99％使用。如果确实使用此类第二药剂，那么优选它们以低于不存在第一药剂时的量使用，尤其是在第一药剂的初始给药之后的后续给药中，以便消除或降低由此引起的副作用。
在本发明的方法包括施用一种或多种IBD治疗剂来治疗或预防IBD的情况中，可能特别想要联合施药步骤与手术规程，该手术规程也是为了治疗或预防IBD而实施的。本发明所涵盖的IBD手术规程包括但不限于肠切除术、吻合术、结肠切除术、直肠结肠切除术、和造瘘术，或其任意组合。例如，本文所述IBD治疗剂可以与结肠切除术在治疗方案中联合，例如在治疗IBD时。此类联合疗法包括和分开施用，在这种情况中，IBD治疗剂的施用可以发生在手术规程之前和/或之后。
本文所述用一种或多种IBD治疗剂的组合；或一种或多种IBD治疗剂和手术规程的组合进行的治疗优选导致IBD的症状或体征的改善。例如，此类疗法可导致接受IBD治疗剂治疗方案和手术规程的受试者中的改善，如通过IBD病理的严重程度降低所证明的。
IBD治疗剂通过任何合适的手段来施用，包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、和鼻内，及损伤内施用(如果希望局部治疗的话)。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。剂量给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，这部分取决于所述施用是短暂的还是长时间的。
会与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用依照本发明方法使用的IBD治疗剂组合物。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、和医学从业人员知道的其它因素。不是必需而是任选将第一药剂与一种或多种本文所述其它药剂(例如第二、第三、第四、等药剂)一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的第一药剂的量、病症或治疗的类型、和上文讨论的其它因素。这些通常是以与上文所用相同剂量和施用路径使用，或是迄今所用剂量的大约1-99％。
为了预防或治疗IBD，IBD治疗剂(在单独地或与其它药剂组合地使用时)的适当剂量会取决于待治疗疾病的类型、IBD治疗剂的类型、疾病的严重程度和进程、施用所述IBD治疗剂是为了预防还是为了治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对IBD治疗剂的应答、及主治医师的判断。一次性地或在一系列治疗中将所述IBD治疗剂适当施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，对患者施用的初始候选剂量可以是大约1ug/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的IBD治疗剂，例如，或是通过一次或多次分开的施用，或是通过连续输注。一种典型的每日剂量范围可以为大约1ug/kg至100mg/kg或更大，这取决于上文所述因素。对于持续数天或更长时间的反复施用，根据状况，一般会持续治疗，直至发生对疾病症状的期望抑制。一种例示性的IBD治疗剂剂量会在大约0.05mg/kg至大约10mg/kg的范围内。如此，可以对患者施用大约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一剂或多剂。此类剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2剂至约20剂，或例如约6剂IBD治疗剂)。可施用一剂较高的初始加载剂量，后续一剂或多剂较低剂量。例示性剂量给药方案包括施用约4mg/kg的初始加载剂量，后续每周约2mg/kgIBD治疗剂的维持剂量。然而，其它剂量方案也可能是有用的。这种疗法的进程易于通过常规技术和测定法来监测。
B.2.基因表达序型分析
一般而言，基因表达序型分析的方法可分成两大组：基于多核苷酸杂交分析的方法，和其它基于生化检测或多核苷酸测序的方法。本领域中已知用于样品中mRNA表达定量的最常使用的方法包括Northern印迹和原位杂交(Parker & Barnes，Methods in Molecular Biology 106：247-283(1999))；RNA酶保护测定法(Hod，Biotechniques 13：852-854(1992))；及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)(Weis等，Trends in Genetics 8：263-264(1992))。或者，可采用能识别特定双链体(包括DNA双链体、RNA双链体、及DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体)的抗体。用于测定mRNA或蛋白质表达的各种方法包括但不限于基因表达序型分析，聚合酶链式反应(PCR)(包括定量实时PCR(qRT-PCR))，能通过商品化设备、遵循制造商的方案(诸如通过使用Affymetrix GenChip技术)来实施的微阵列分析，基因表达连续分析(SAGE)(Velculescu et al.，Science 270：484-487(1995)；and Velculescu et al.，Cell88：243-51(1997))，MassARRAY，通过大规模平行签名测序(MPSS)的基因表达分析(Brenner et al.，Nature Biotechnology 18：630-634(2000))，蛋白质组学，免疫组织化学(IHC)，等。优选的是，对mRNA定量。此类mRNA分析优选使用聚合酶链式反应(PCR)技术，或通过微阵列分析来实施。在采用PCR的情况中，一种优选的PCR形式是定量实时PCR(qRT-PCR)。
a.逆转录酶PCR(RT-PCR)
在上文所列的技术中，最灵敏且最灵活的定量方法是RT-PCR，其可用于比较不同样品群中的，正常和测试样品组织中的mRNA水平，表征基因表达样式，区分密切相关的mRNA，及分析RNA结构。
第一步是从靶样品分离mRNA。起始材料典型的是分别从结肠组织活检分离的总RNA。如此，可以从多种组织中分离RNA，包括但不限于回肠末端、升结肠、降结肠、和乙状结肠。另外，获得活检的结肠组织可以来自发炎的和/或不发炎的结肠区域。
在一个实施方案中，mRNA是自如上文所定义的活检获得的，其中活检样品是自左结肠或自右结肠获得的。如本文中所使用的，“左结肠”指乙状结肠(sigmoideum)和直肠乙状结肠(rectosigmoideum)，而“右结肠”指“盲肠”。
用于提取mRNA的通用方法是本领域众所周知的，公开于分子生物学的标准教科书中，包括Ausubel等人，《Current Protocols of Molecular Biology》，John Wiley and Sons，1997。具体而言，RNA分离可使用来自商业制造商诸如Qiagen的纯化试剂盒、缓冲液组和蛋白酶依照制造商的说明书进行。来自组织样品的总RNA可使用RNA Stat-60(Tel-Test)分离。从活检制备的RNA可通过例如氯化铯密度梯度离心来分离。
由于RNA不能充当PCR的模板，通过RT-PCR进行基因表达序型分析的第一步是将RNA模板逆转录成cDNA，接着是它在PCR反应中的指数式扩增。最常用的两种逆转录酶是禽类成髓细胞白血病病毒逆转录酶(AMV-RT)和莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)。逆转录步骤典型的使用特异性引物、随机六聚物或oligo-dT引物引发，取决于表达序型分析的境况和目标。例如，提取的RNA可使用GeneAmp RNA PCR试剂盒(Perkin Elmer，CA，USA)遵循制造商的说明书逆转录。然后可将衍生的cDNA作为模板用于后续PCR反应。
尽管PCR步骤可使用多种热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶，典型的采用Taq DNA聚合酶，它具有5′-3′核酸酶活性但缺乏3′-5′校正内切核酸酶活性。如此，
Figure BPA00001187298700471
PCR典型的利用Taq或Tth聚合酶的5′-核酸酶活性来水解与其靶扩增子结合的杂交探针，但是可使用具有等效5′核酸酶活性的任何酶。使用两种寡核苷酸引物来生成扩增子，典型的是PCR反应的。第三种寡核苷酸或探针设计用于检测位于前两种PCR引物之间的核苷酸序列。探针是Taq DNA聚合酶不可延伸的且用报道荧光染料和淬灭荧光染料标记。在两种染料正如它们在探针上的那样位置靠近时，任何激光诱发的来自报道染料的发射受到淬灭染料的淬灭。在扩增反应期间，Taq DNA聚合酶以模板依赖性方式切割探针。所得探针片段在溶液中解离，来自所释放报道染料的信号不再受到第二荧光团的淬灭效应的作用。每合成一个新的分子就释放一个分子的报道染料，未淬灭报道染料的检测提供了数据定量阐述的基础。
Figure BPA00001187298700472
RT-PCR可使用商品化设备进行，诸如例如ABI PRISM
Figure BPA00001187298700473
序列检测***TM(Perkin-Elmer-Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)或Lightcycler(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany)。在一个优选的实施方案中，在实时定量PCR装置上运行5′核酸酶规程，诸如ABI PRISM
Figure BPA00001187298700481
序列检测***TM。该***由热循环仪、激光(器)、电荷耦合装置(CCD)、照相机和计算机组成。该***在热循环仪上以96孔形式扩增样品。在扩增过程中，通过光纤电缆实时收集所有96个孔的激光诱发的荧光信号，并在CCD处检测。该***包括用于运行设备和分析数据的软件。
5′-核酸酶测定法数据最初表述为Ct，或循环阈值(threshold cycle)。正如上文所讨论的，在每个循环期间记录荧光值并代表至扩增反应中该点时扩增的产物的量。首次记录到有统计学意义的荧光信号的点即循环阈值(Ct)。
为了将错误和样品间变异的影响降至最低，通常使用内部标准物进行RT-PCR。理想的内部标准物在不同组织间以恒定水平表达，不受实验处理的影响。最频繁的用于基因表达样式标准化的RNA是持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和P-肌动蛋白的mRNA。
RT-PCR技术的一种最新变异是实时定量PCR，它通过双重标记的荧光生成探针(即
Figure BPA00001187298700482
探针)测量PCR产物积累。实时PCR与定量竞争性PCR(其中使用每种靶序列的内部竞争物来进行标准化)和定量比较性PCR(使用样品内包含的标准化基因或持家基因供RT-PCR之用)都兼容。更多详情参阅例如Held et al.，Genome Research 6：986-994(1996)。
依照本发明的一个方面，PCR引物和探针是基于待扩增基因中存在的内含子序列设计的。在这个实施方案中，引物/探针设计的第一步是描绘基因内的内含子序列。这可通过公众可得到的软件来进行，诸如由Kent，W.J.，Genome Res.12(4)：656-64(2002)开发的DNA BLAT软件或BLAST软件，包括其变异。后续步骤遵循完全建立的PCR引物和探针设计方法。
为了避免非特异性信号，重要的是在设计引物和探针时掩盖(mask)内含子内的重复序列。这可容易的通过使用Repeat Masker程序来实现，该程序可通过贝勒医学院(Baylor College of Medicine)在线获得，它针对重复元件文库筛选DNA序列并返回其中掩盖了重复元件的查询序列。然后可使用任何商品化或通过其它途径公众可获得的引物/探针设计包将掩盖后的内含子序列用于设计引物和探针序列，诸如Primer Express(Applied Biosystems)；MGBassay-by-design(Applied Biosystems)；Primer3(Steve Rozen and Helen J.Skaletsky(2000)Primer3在万维网上供一般用户和生物学家编程员使用。在Krawetz S，Misener S编的《Bioinformatics Methods and Protocols：Methods inMolecular Biology》中，Humana Press，Totowa，N.J.，第365-386页)。
PCR引物设计中考虑的最重要因素包括引物长度、解链温度(meltingtemperature，Tm)、G/C含量、特异性、互补引物序列、和3′-末端序列。一般而言，最佳的PCR引物通常长17-30个碱基，包含约20-80％诸如例如约50-60％G+C碱基。典型的优选Tm在50和80℃之间，例如约50-70℃。
关于PCR引物和探针设计的进一步指导参见例如Dieffenbach C.W.etal.，“General Concepts for PCR Primer Design”(PCR引物设计的一般概念)，在《PCR Primer，A Laboratory Manual》中，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York，1995，第133-155页；Innis and Gelfand，“Optimization ofPCRs”(PCR的优化)，在《PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications》中，CRC Press，London，1994，第5-11页；及Plasterer，T.N.，Primerselect：Primerand probe design.Methods Mol.Biol.70：520-527(1997)，将其完整公开内容明确收入本文作为参考。
更多基于PCR的技术包括例如差异展示(Liang and Pardee，Science257：967-971(1992))；扩增片段长度多态性(iAFLP)(Kawamoto et al.，GenomeRes.12：1305-1312(1999))；BeadArrayTM技术(Illumina，San Diego，CA；Oliphant et al，，Discovery of Markers for Disease(Biotechniques增刊)，2002年6月；Ferguson et al.，Analytical Chemistry 72：5618(2000))；用于检测基因表达的珠阵列(BADGE)，在基因表达快速测定法中使用商品化Luminex100 LabMAP***和多色编码的微球(Luminex Corp.，Austin，TX)(Yang et al.，Genome Res.11：1888-1898(2001))；以及高覆盖表达序型分析(HiCEP)(Fukumura et al.，Nucl.Acids.Res.31(16)e94(2003))。
b.微阵列
差异基因表达也可使用微阵列技术来鉴定或验证。如此，可使用微阵列技术在新鲜的或石蜡包埋的组织中测量IBD相关基因的表达序型。在这种方法中，在微芯片基片上涂布(plate)或排列(array)感兴趣多核苷酸序列(包括cDNA和寡核苷酸)。然后使排列的序列与来自感兴趣细胞或组织的特异性DNA探针杂交。正如在RT-PCR方法中一样，mRNA的来源典型的是从活检组织或自具有IBD的受试者获得细胞衍生的细胞系及相应的正常组织或细胞系分离的总RNA。如此，RNA可以从多种结肠组织或基于结肠组织的细胞系分离。
在微阵列技术的一个具体实施方案中，将PCR扩增的cDNA克隆的***物以密集阵列应用至基片。优选的是，将至少10,000种核苷酸序列应用至基片。以每种10,000个成分固定在微芯片上的微阵列基因适于在严格条件下杂交。荧光标记的cDNA探针可通过从感兴趣组织提取的RNA的逆转录中掺入荧光核苷酸来生成。应用至芯片的经标记cDNA探针与阵列上的每个DNA斑点以特异性发生杂交。严格清洗以除去非特异性结合的探针后，通过共聚焦激光显微镜检术或通过其它检测方法诸如CCD照相机扫描芯片。每种阵列成分的杂交的定量容许评估相应mRNA的丰度。凭借双重有色荧光，将从两种RNA来源生成的分开标记的cDNA探针与阵列成对杂交。如此同时测定来自对应于每种指定基因的两种来源的转录物的相对丰度。小型化规模的杂交提供了大量基因表达样式的便利且快速评估。此类方法已经显示出检测以每个细胞少数拷贝表达的罕见转录物所要求的灵敏度及可再现的检测表达水平的至少约2倍差异(Schena et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(2)：106-149(1996))。微阵列分析可使用商品化设备遵循制造商的方案进行，诸如使用Affymetrix GENCHIP技术、或Incyte的微阵列技术、或Agilent的人类全基因组微阵列技术。
c.基因表达连续分析(SAGE)
基因表达连续分析(SAGE)是容许同时且定量分析大量基因转录物且不需要为每种转录物提供个别杂交探针的一种方法。首先，生成包含足以唯一鉴定一种转录物的信息的一种短序列标签(约10-14bp)，倘若该标签是从每种转录物内的一个唯一位置得到的。然后，将许多转录物连接起来以形成长、连续分子，它们可测序，以同时揭示多种标签的身份(identity)。任何转录物群的表达样式可通过测定个别标签的丰度并鉴定与每种标签对应的基因来定量评估。更多详情参见例如Velculescu et al.，Science 270：484-487(1995)；Velculescu et al.，Cell 88：243-51(1997)。
d.MassARRAY技术
在Sequenom，Inc.(San Diego，CA)开发的基于MassARRAY的基因表达序型分析方法中，在分离RNA并逆转录之后，在所获得的cDNA中掺入合成的DNA分子(竞争物)，其在除单个碱基之外的所有位置与靶向的cDNA区匹配，并充当内部标准物。对该cDNA/竞争物混合物进行PCR扩增并进行PCR后虾碱性磷酸酶(SAP)处理，其导致剩余核苷酸的脱磷酸化。在碱性磷酸酶灭活后，对来自竞争物和cDNA的PCR产物进行引物延伸，其产生对于竞争物-和cDNA-衍生的PCR产物截然不同的大量信号(mass signal)。纯化后，将这些产物分配到芯片阵列上，该芯片阵列预先加载有使用基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析所需要的成分。然后通过分析所产生的质谱中峰面积的比率对反应中存在的cDNA定量。更多详情参见例如Dingand Cantor，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：3059-3064(2003)。
e.通过大量平行签名测序(MPSS)进行的基因表达分析
由Brenner et al.，Nature Biotechnology 18：630-634(2000)记载的这种方法是将不基于凝胶的签名测序与数以百万计的模板在分开的5微米直径微珠上的体外克隆联合起来的一种测序方法。首先，通过体外克隆构建DNA模板的微珠库。接着，在流动槽中以高密度(典型的是大于3x106微珠/cm2)装配含模板微珠的平面阵列。使用不要求将DNA片段分开的基于荧光的签名测序方法，同时分析每个微珠上克隆的模板的游离末端。这种方法已经显示出在单次操作中同时且精确的提供来自酵母cDNA文库的数以十万计的基因签名序列。
多份发表的期刊论文给出了使用固定的、石蜡包埋的组织作为RNA来源用于基因表达序型分析的代表性方案的步骤，包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增(例如Godfrey et al.，J.Molec.Diagnostics 2：84-91(2000)；Spechtet al.，Am.J.Pathol.158：419-29(2001))。简言之，一种代表性方法由切出石蜡包埋的组织样品的约10微米厚切片开始。然后，提取mRNA，并除去蛋白质和DNA。用于提取mRNA的通用方法是本领域众所周知的，公开于分子生物学的标准教科书中，包括Ausubel等人，《Current Protocols of MolecularBiology》，John Wiley and Sons，1997。用于从石蜡包埋组织提取RNA的方法公开于例如Rupp and Locker，Lab Invest.56：A67(1987)；De Andrés et al.，BioTechniques 18：42044(1995)。具体而言，RNA分离可使用来自商业制造商诸如Qiagen的纯化试剂盒、缓冲液组和蛋白酶依照制造商的说明书进行。例如，来自培养细胞的总RNA可使用Qiagen RNeasy微型柱分离。其它商品化RNA分离试剂盒包括完整DNA和RNA纯化试剂盒(Madison，WI)和石蜡块RNA分离试剂盒(Ambion，Inc.)。来自组织样品的总RNA可使用RNA Stat-60(Tel-Test)分离。从组织制备的RNA可通过例如氯化铯密度梯度离心来分离。分析RNA浓度后，在必要时可包括RNA修复和/或扩增步骤，并使用基因特异启动子逆转录RNA，随后是PCR。优选的是，使用与定量竞争性PCR(其中使用每种靶序列的内部竞争物来进行标准化)和定量比较性PCR(使用样品内包含的标准化基因或持家基因供RT-PCR之用)都兼容的实时PCR。更多详情参阅例如“PCR：The PolymeraseChain Reaction”，Mullis et al.，eds.，1994；和Held et al.，Genome Research 6：986-994(1996)。最后，基于在所检验样品中鉴定的特征性基因表达样式，分析数据以鉴定对患者有用的最佳处理选项。
f.免疫组化
免疫组化方法也适用于检测本发明的IBD标志物的表达水平。如此，使用对每种标志物特异性的抗体或抗血清，优选多克隆抗血清，最优选单克隆抗体来检测表达。抗体可通过直接标记抗体自身来检测，例如用放射性标记物、荧光标记物、半抗原标记物诸如生物素、或酶诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。或者，未标记一抗与经标记二抗联合使用，包括对一抗特异性的抗血清、多克隆抗血清或单克隆抗体。免疫组化方案和试剂盒是本领域众所周知的，而且可通过商业途径获得。
也可以在蛋白质水平测定表达水平，例如使用各种类型的免疫测定法或蛋白质组学技术。
在免疫测定法中，通过使用特异性结合标志物的抗体来检测靶诊断性蛋白质标志物。通常会用可检测模块标记抗体。可利用许多标记物，一般可分成以下几类：
放射性同位素，诸如35S、14C、125I、3H和131I。例如，可使用Current Protocolsin Immunology，卷1和2，Coligen等编，Wiley-Interscience，New York，New York，Pubs.1991中描述的技术用放射性同位素标记抗体，并可使用闪烁计数来测量放射性。
荧光标记物，诸如可利用稀士螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹酰、丽丝胺、藻红蛋白和德克萨斯红。例如，可使用Current Protocols in Immunology，见上文中披露的技术使荧光标记物与抗体偶联。可使用荧光计对荧光进行定量。
可利用各种酶-底物标记物且美国专利No.4,275,149中提供了有关它们中的一些的综述。酶一般催化可使用多种技术测量的显色底物的化学改变。例如，酶可以催化可通过分光光度法测量的底物的颜色改变。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。上文描述了用于对荧光改变进行定量的技术。化学发光底物通过化学反应变成电子激发态，然后可发射可测量(例如使用化学发光计)或给荧光受体提供能量的光。酶标记物的例子包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,737,456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮类、苹果酸脱氢酶、尿素酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于使酶与抗体偶联的技术描述于O′Sullivan等(1981)Methods for the Preparation ofEnzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay，Methods inEnzym.，J.Langone和H.Van Vunakis编，Academic Press，New York，73：147-166。
酶-底物组合的例子包括例如：辣根过氧化物酶(HRPO)，其以过氧化氢为底物，其中过氧化氢氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的对硝基苯基磷酸酯；和β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与显色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷)或荧光底物4-甲基伞形基-β-D-半乳糖苷。
本领域技术人员可利用许多其它酶-底物组合。有关它们的一般性综述参见美国专利No.4,275,149和4,318,980。
有时，将标记物与抗体间接偶联。熟练技术人员了解实现这一目的的多种技术。例如，可将抗体与生物素偶联，而且可以将上述三大类标记物中的任一种与亲合素偶联，或反之亦然。生物素选择性结合亲合素，由此标记物可与抗体以这种间接方式偶联。或者，为了实现标记物与抗体的间接偶联，将抗体与小型半抗原(例如地高辛)偶联，并将上述不同类型的标记物之一与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)偶联。由此，可实现标记物与抗体的间接偶联。
在其它多种形式的免疫测定技术中，抗体无需标记，而且可使用结合该抗体的经标记抗体检测其存在。
如此，本文中的诊断性免疫测定法可以是任何已知测定法形式，包括例如竞争性结合测定法、直接和间接夹心式测定法、及免疫沉淀测定法。Zola，Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，pp.147-158，CRC Press，Inc.，1987。
竞争性结合测定法依赖于经标记标准品与测试样品分析物竞争结合有限量的抗体的能力。测试样品中的抗原量与结合至抗体的标准品量成反比。为了便于测定得到结合的标准品的量，一般在竞争之前或之后使抗体不溶解，从而可以方便的将结合至抗体的标准品和分析物与仍然未结合的标准品和分析物分离。
三明治/夹心式测定法涉及使用两种抗体，它们都能够结合待检测蛋白质的不同免疫原性部分或表位。在三明治/夹心式测定法中，测试样品分析物得到固定在固体支持物上的第一抗体的结合，此后第二抗体结合至分析物，如此形成不溶性三元复合物。参见例如美国专利No.4,376,110。第二抗体自身可以是用可检测模块标记的(直接夹心测定法)，或者可以使用经可检测模块标记的抗免疫球蛋白抗体来测量(间接夹心测定法)。例如，一种类型的夹心测定法是ELISA测定法，其中的可检测模块是酶。
g.蛋白质组学
术语“蛋白质组”定义为某一时间点样品(例如组织、生物体或细胞培养物)中存在的蛋白质的全体。蛋白质组学包括研究样品中蛋白质表达的全局变化(也称为“表达蛋白质组学”)等。蛋白质组学典型的包括下列步骤：(1)通过二维凝胶电泳(2-D PAGE)将样品中的各种蛋白质分开；(2)鉴定从凝胶中回收的各种蛋白质，例如通过质谱或N-末端测序；及(3)使用生物信息学分析数据。蛋白质组学方法是其它基因表达序型分析方法的有用补充，可以单独使用或联合其它方法，用于检测本发明的标志物的产物。
h.逆转录的5′-多重基因特异性引发
RT-PCR需要逆转录测试RNA群作为第一步。最常用于逆转录的引物是寡dT，它在RNA完整时运行良好。然而，当RNA高度断裂时，这种引物会是无效的。
本发明包括基因特异性引物的使用，其长度大致为20个碱基，最佳Tm介于约58℃和60℃之间。这些引物也会充当驱动PCR DNA扩增的反向引物。
另一种办法基于使用随机六聚物作为cDNA合成的引物。然而，我们以实验证明使用多种基因特异性引物的方法优于使用随机六聚物的已知办法。
i.启动子甲基化分析
在本文中讨论了多种用于对RNA转录物(基因表达分析)或它们的蛋白质翻译产物定量的方法。还可根据关于染色质结构的信息来推断基因的表达水平，诸如例如基因启动子和其它调节元件的甲基化状态以及组蛋白的乙酰化状态。
具体而言，启动子的甲基化状态影响受该启动子调节的基因的表达水平。特定基因启动子的异常甲基化涉及表达调节，诸如例如肿瘤抑制基因的沉默。如此，对基因启动子甲基化状态的检查可用作RNA水平直接量化的替代物。
已设计出数种用于测量特定DNA元件的甲基化状态的方法，包括甲基化特异性PCR(Herman J.G.et al.(1996)Methylation-specific PCR：a novel PCRassay for methylation status of CpG islands.Proc.Natl Acad.Sci.USA.93，9821-9826)和亚硫酸氢盐DNA测序(Frommer M.et al.(1992)A genomicsequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues inindividual DNA strands.Proc.Natl Acad.Sci.USA.89，1827-1831)。新近，基于微阵列的技术已用于表征启动子甲基化状态(Chen C.M.(2003)Methylation target array for rapid analysis of CpG island hypermethylation inmultiple tissue genomes.Am.J.Pathol.163，37-45)。
j.基因的共表达
本发明的另一个方面是鉴定基因表达聚类(gene expression cluster)。使用本领域已知的统计学分析来分析表达数据，由此可鉴定基因表达聚类，包括基于皮尔逊相关系数的相关性成对分析(Pearson K.and Lee A.(1902)Biometrika 2，357)。
在一个实施方案中，本文中鉴定的表达聚类包括在左结肠中上调的基因(图1)。
在另一个实施方案中，本文中鉴定的表达聚类包括在右结肠中上调的基因(图1)。
在一个实施方案中，本文中鉴定的表达聚类包括在回肠末端中上调的基因(图1)。
在其它实施方案中，本文中鉴定的表达聚类包括在IBD2基因座(表7)或在IBD5基因座(表8)中的基因。
在一些实施方案中，本文中鉴定的表达聚类包括归类在免疫应答下的基因。
在其它实施方案中，本文中鉴定的表达聚类包括归类在创伤应答中的基因。
k.基于内含子的PCR引物和探针的设计
依照本发明的一个方面，PCR引物和探针是基于待扩增基因中存在的内含子序列设计的。因而，引物/探针设计的第一步是描绘基因内的内含子序列。这可通过公众可得到的软件来进行，诸如由Kent，W.J.，Genome Res.12(4)：656-64(2002)开发的DNA BLAT软件或BLAST软件，包括其变异。后续步骤遵循完全建立的PCR引物和探针设计方法。
为了避免非特异性信号，重要的是在设计引物和探针时掩盖(mask)内含子内的重复序列。这可容易的通过使用Repeat Masker程序来实现，该程序可通过贝勒医学院(Baylor College of Medicine)在线获得，它针对重复元件文库筛选DNA序列并返回其中掩盖了重复元件的查询序列。然后可使用任何商品化或通过其它途径公众可获得的引物/探针设计包将掩盖后的内含子序列用于设计引物和探针序列，诸如Primer Express(Applied Biosystems)；MGBassay-by-design(Applied Biosystems)；Primer3(Steve Rozen and Helen J.Skaletsky(2000)Primer3在万维网上供一般用户和生物学家编程员使用。在Krawetz S，Misener S编的《Bioinformatics Methods and Protocols：Methods inMolecular Biology》中，Humana Press，Totowa，N.J.，第365-386页)。
PCR引物设计中考虑的最重要因素包括引物长度、解链温度(meltingtemperature，Tm)、G/C含量、特异性、互补引物序列、和3′-末端序列。一般而言，最佳的PCR引物通常长17-30个碱基，包含约20-80％诸如例如约50-60％G+C碱基。典型的优选Tm在50和80℃之间，例如约50-70℃。
关于PCR引物和探针设计的进一步指导参见例如Dieffenbach C.W.etal.，“General Concepts for PCR Primer Design”(PCR引物设计的一般概念)，在《PCR Primer，A Laboratory Manual》中，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York，1995，第133-155页；Innis and Gelfand，“Optimization ofPCRs”(PCR的优化)，在《PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications》中，CRC Press，London，1994，第5-11页；及Plasterer，T.N.，Primerselect：Primerand probe design.Methods Mol.Biol.70：520-527(1997)，将其完整公开内容明确收入本文作为参考。
l.IBD基因集合、所测定的基因子序列、及基因表达数据的临床应用
本发明的一个重要方面是利用结肠组织某些基因所测定的表达来提供诊断信息。为了该目的，必须校正(标准化)所测定的RNA的量及所使用的RNA的品质变异性的差异。因此，该测定法通常测量并掺入某些标准化用基因，包括众所周知的持家基因，诸如GAPDH和Cyp1的表达。或者，可基于所有被测定的基因或其大型亚集的信号均值或中值(Ct)来标准化(全局标准化方法)。对于各基因，挨个的将所测量的标准化的患者结肠组织mRNA的量与适宜组织参考集合中所存在的量进行比较。该参考集合中组织的数目(N)应当足够高以确保不同的参考集合(总体上)行为表现基本上一致。如果符合该条件，那么存在于特定集合中的单个结肠组织的身份就不会显著影响所测定的基因的相对量。一般而言，组织参考集合由至少约30个、优选至少约40个不同的IBD组织标本组成。除非另有指示，每一mRNA/测试的组织/患者的标准化表达水平应表示为在参考集合中测得的表达水平的百分数。更具体地说，IBD样品数目足够高(例如40个)的参考集合产生了每一mRNA种类标准化水平的分布。在待分析的特定样品中所测量的水平落在该范围内的某一百分位上，其可通过本领域众所周知的方法来测定。以下，除非另有指示，提到基因的表达水平时，尽管并不总是明确地规定，但假定是相对于参考集合的标准化表达。
m.抗体的生成
本发明进一步提供了抗IBD标志物抗体。例示性的抗体包括多克隆、单克隆、人源化、双特异性、和异源偶联抗体。如本文中所讨论的，所述抗体可以在针对IBD的诊断方法中，及在一些情况中，在IBD治疗方法使用。
(1)多克隆抗体
多克隆抗体优选通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。使用双功能或衍生化试剂，例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N＝C＝NR(其中R和R1是不同的烃基)，将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的，例如匙孔
Figure BPA00001187298700571
血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。
通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对抗原、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽或偶联物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateau)。优选的是，将动物用相同抗原但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行加强免疫。偶联物还可在重组细胞培养中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂诸如明矾来增强免疫应答。
(2)单克隆抗体
本领域有多种方法可用于制备本文中的单克隆抗体。例如，单克隆抗体可使用最初由Kohler等，Nature 256：495(1975)记载的杂交瘤方法、通过重组DNA方法(美国专利第4,816,567号)来制备。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，Academic Press，1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的。在这些细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，Rockville，Maryland，USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于生成人单克隆抗体也已有记载(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur等，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1987)。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。
单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等，Anal.Biochem.107：220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定得到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，所述克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，AcademicPress，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。
可通过常规抗体纯化流程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。
编码单克隆抗体的DNA易于使用常规流程分离和测序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。以杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外生成抗体蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.5：256-262(1993)及Plückthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可从使用McCafferty等，Nature 348：552-554(1990)所记载的技术构建的噬菌体抗体库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等，Nature 352：624-628(1991)及Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)分别记载了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物记载了通过链改组(Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，Nuc.Acids Res.21：2265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。
还可以修饰DNA，例如通过替代即用人重链和轻链恒定域的编码序列代替同源鼠序列(美国专利第4,816,567号；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价接合。
典型的是，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
(3)人源化抗体
本领域已经记载了用于将非人抗体人源化的方法。优选的是，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们典型的取自“输入”可变域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法进行(Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534-1536(1988))，通过用高变区序列替代相应的人抗体序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中本质上少于整个人可变域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体典型的是其中一些高变区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。用于治疗IBD的人源化抗体的一个例子是英夫利昔单抗(infliximab)
Figure BPA00001187298700601
一种工程化鼠人嵌合单克隆抗体。该抗体结合细胞因子TNF-α并阻止它结合其受体以触发和维持炎症应答。英夫利昔单抗用于治疗CD和UC二者。
用于构建人源化抗体的人可变域的选择，包括轻链和重链二者，对于降低抗原性非常重要。依照所谓的“最适”(best-fit)方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Sims等，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.151：2623(1993))。
更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目标，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是公众可获得的，且为本领域技术人员所熟悉。可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。一般而言，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。
设想了各种形式的人源化抗体。例如，人源化抗体可以是抗体片段，诸如Fab，它任选与一种或多种细胞毒剂偶联以产生免疫偶联物。或者，人源化抗体可以是完整抗体，诸如完整的IgG1抗体。
(4)人抗体
作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫时生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击时生成人抗体。参见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature 362：255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immuno.7：33(1993)；及美国专利第5,591,669号、第5,589,369号和第5,545,807号。或者，噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature 348：552-553(1990))可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因全集生成人抗体和抗体片段。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行；有关综述参见例如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion inStructural Biology 3：564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature 352：624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库中分离得到大量不同的抗唑酮抗体。可本质上遵循Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)所记载的技术，由未免疫人供体构建V基因全集和分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利第5,565,332号和第5,573,905号。
如上所述，还可通过体外激活B细胞来生成人抗体(参见美国专利第5,567,610号和第5,229,275号)。
(5)抗体片段
已经开发了用于生成包含一个或多个抗原结合区的抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)；Brennan等，Science 229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185；美国专利第5,571,894号；美国专利第5,587,458号。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利第5,641,870号中所记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
(6)双特异性抗体
双特异性抗体指具有对至少两种不同表位的结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合IBD标志物蛋白质的两种不同表位。双特异性抗体还可用于将药剂定位于表达IBD标志物蛋白质的细胞。
这些抗体拥有IBD标志物结合臂和结合药剂(例如氨基水杨酸盐)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。
用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生成基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等，Nature 305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。WO 93/08829及Traunecker等，EMBO J.10：3655-3659(1991)中披露了类似的流程。
依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。融合优选使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域。优选的是，在至少一种融合物中，第一重链恒定区(CH1)包含轻链结合所必需的位点。将编码免疫球蛋白重链融合物和(如果需要)免疫球蛋白轻链的DNA***分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列***同一个表达载体。
在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等，Methodsin Enzymology 121：210(1986)。
依照美国专利第5,731,168号中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分抗体恒定域的CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联的或“异源偶联的”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体建议用于将免疫***细胞靶向不想要的细胞(美国专利第4,676,980号)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许多交联技术一起披露于美国专利第4,676,980号。
文献中还记载了自抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，Science 229：81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)2片段的流程。将这些片段在存在二硫醇络合剂***的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
还记载了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单体，然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，J.Immunol.152：5368(1994)。
设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.147：60(1991)。
(7)其它氨基酸序列修饰
设想了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将适宜的核苷酸变化引入抗体核酸或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或***和/或替代。只要最终的构建物具有期望的特性，可进行删除、***和替代的任意组合以获得最终的构建物。氨基酸变化还可改变抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置。
可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells，Science 244：1081-1085(1989)所记载的。这里，鉴定了一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲那些对替代展现出功能敏感性的氨基酸位置。如此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但是突变本身的性质不需要预先决定。例如，为了分析在给定位点处的突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描诱变或随机诱变，并对所表达的抗体变体筛选期望活性。
氨基酸序列***包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围从一个残基至包含上百个或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它***变体包括在抗体的N-或C-末端融合酶(例如用于ADEPT)或提高抗体血清半衰期的多肽。
另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替换。最感兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但也设想了FR改变。保守替代在表1中显示在标题“优选替代”下。如果此类替代导致生物学活性的改变，那么可以引入下表中称为“例示替代”的更实质性改变，或如下文中关于氨基酸种类的进一步描述，并筛选产物。
  原始残基  例示替代   优选替代
  Ala(A)  val；leu；ile   val
  Arg(R)  lys；gln；asn   lys
  Asn(N)  gln；his；lys；arg   gln
  Asp(D)  glu   glu
  Cys(C)  ser   ser
  Gln(Q)  asn   asn
  Glu(E)  asp   asp
  Gly(G)  pro；ala   ala
  His(H)  asn；gln；lys；arg   arg
  Ile(I)  leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸   leu
  Leu(L)  正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe   ile
  Lys(K)  arg；gln；asn   arg
  Met(M)  leu；phe；ile   leu
  Phe(F)  leu；val；ile；ala；tyr   leu
  Pro(P)  ala   ala
  Ser(S)  thr   thr
  Thr(T)  ser   ser
  Trp(W)  tyr；phe   tyr
  Tyr(Y)  trp；phe；thr；ser   phe
  Val(V)  ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸   leu
对抗体生物学特性的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性，可将氨基酸如下分组(A.L.Lehninger，in：Biochemistry，2nd ed.，pp.73-75，Worth Publishers，New York，1975)：非极性的，Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；不带电荷的、极性的，Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；酸性的，Asp(D)、Glu(E)；和碱性的，Lys(K)、Arg(R)、His(H)。
或者，基于共同的侧链特性，可将天然存在残基如下分组：疏水性的，正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；中性、亲水性的，Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；酸性的，Asp、Glu；碱性的，His、Lys、Arg；影响链取向的残基，Gly、Pro；和芳香族的，Trp、Tyr、Phe。
非保守替代将需要用这些类别之一的一个成员替换另一个类别的。
任何不涉及保持抗体正确构象的半胱氨酸残基也可替代，通常用丝氨酸，以改进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向抗体中添加半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段诸如Fv片段时)。
特别优选的一类替代变体涉及替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改良的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简单的说，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在每个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与每个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体与IBD标志物蛋白质之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位点。一旦产生此类变体，就如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。
还设想了具有三个或更多(优选四个)功能性抗原结合位点的工程改造抗体(美国已公布专利申请号US2002/0004587A1，Miller等)。
编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对早期制备的变体或非变体型式的抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
B.3本发明的试剂盒
用于本发明的方法中的材料适合于制备根据众所周知的规程所产生的试剂盒。如此，本发明提供了包含试剂的试剂盒，所述试剂可包括用于对关于IBD所公开的基因的表达定量的基因特异性或基因选择性探针和/或引物。此类试剂盒可任选地包含用于从样品(特别是固定的、石蜡包埋的组织样品)提取RNA的试剂和/或用于RNA扩增的试剂。此外，试剂盒可任选地包含试剂及鉴别描述或标签或使用说明，关于它们在本发明的方法中的应用。试剂盒可包含容器(包括适用于自动化执行本发明方法的微量滴定板)，每一容器装有一种或多种用于本发明方法的各种试剂(通常以浓缩的形式存在)，包括例如预制的微阵列、缓冲液、适宜的核苷酸三磷酸(例如dATP、dCTP、dGTP和dTTP；或rATP、rCTP、rGTP和UTP)、逆转录酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、以及一种或多种本发明的探针和引物(例如适宜长度的连接至RNA聚合酶起反应的启动子的poly(T)或随机引物)。
B.4本发明的报告
当被实施用于商业化诊断目的时，本发明的方法通常产生一份关于一种或多种选定基因的标准化表达水平的报告或概要。本发明的方法将产生一份报告，其包含诊断有IBD的受试者在任何用于治疗IBD的手术规程之前和之后临床结果的预测。本发明的方法和报告可进一步包括将报告存储于数据库中。或者，该方法可进一步在受试者的数据库中生成一份记录并在该记录中填充数据。在一个实施方案中，报告为纸件报告，在另一个实施方案中，报告为听觉(auditory)报告，在另一个实施方案中，报告为电子记录。涵盖该报告被提供给医师和/或患者。该报告的接收可进一步包括与包含数据和报告的服务器建立网络连接并从该服务器上请求数据和报告。
本发明提供的方法还可在整体上或部分地自动化进行。
还可实施本发明的所有方面，使得在所披露的基因之外和/或代替所披露的基因，在预后或预测试验中包括与所披露的基因共表达的有限数目的别的基因，例如通过高皮尔逊(Pearson)相关系数所证实的基因。
已描述了本发明，通过参考下列实施例将会更容易地理解本发明，所述实施例作为示例提供，部分意图以任何方式限制本发明。
实施例
实施例1：微阵列分析
在临床上，IBD的特征为多样表现，常常导致慢性的、不可预测的过程。血性腹泻和腹痛常常伴有发热和体重减轻。贫血是常见的，正如严重的疲劳。范围从关节痛到急性关节炎的关节表现以及肝功能异常常常与IBD相伴。IBD患者还具有与一般群体相比升高的结肠癌风险。在IBD急性“攻击”期间，工作和其它正常活动通常是不可能的，而且患者常常住院。
尽管IBD的起因仍然未知，但已经发现几种因素，诸如遗传、感染和免疫学易感性与其有关。IBD在高加索人(白种人)中常见得多，尤其是犹太人后裔。该状况的慢性炎症性质促使深入研究可能的感染原因。尽管已经找到了激发急性炎症的因素，尚未找到引起与IBD有关的慢性炎症的因素。IBD是自身免疫病的假说得到先前所述IBD的肠外表现有关节关节炎及用已知遏制免疫应答的药剂诸如肾上腺糖皮质激素、环孢霉素和硫唑嘌呤治疗IBD获得已知积极响应的支持。另外，胃肠道比机体的任何其它器官更多的连续暴露于潜在抗原性物质诸如来自食物的蛋白质、细菌副产物(LPS)等。IBD的亚型有UC和CD。
CD与UC的不同之处在于炎症穿过肠壁的所有层延伸，而且累及肠系膜以及***。CD可影响消化道的任何部位，自口至***。该疾病常常是不连续的，即严重患病的肠段与表观无病的区域是分开的。在CD中，肠壁也增厚，这能导致闭塞。另外，瘘和裂隙的形成是常见的。
UC和CD通常都通过显示受影响区域的内窥镜检查来诊断。然而，微阵列技术的使用为UC的分子病理学带来了曙光。2000年发表的一项研究使用微阵列技术分析了8名UC患者(Dieckgraefe et al.，Physiol.Genomics 2000；4：1-11)。在这项研究中分析了6500种基因，而且结果证实了先前涉及UC发病机制的基因(即IL-1、IL-1RA和IL-8)表达升高。内窥镜检查诊断与采集夹取粘膜活检的能力联合容许调查人员使用微阵列分析进一步诊断UC，且容许调查人员分析受影响组织和正常组织及分析来自具有不同严重程度的较大范围患者的组织。对结肠和回肠末端宏观不受影响的区域的活检进行微阵列分析(Langman et al.，Gastroent.2004；127：26-40)。Langman分析了22,283种基因，而且发现涉及细胞解毒的基因(诸如孕烷X受体和MDR1)在UC患者的结肠中显著下调，但是这些基因在CD患者中的表达没有变化。
常常含有数以千计基因序列的核酸微阵列对于鉴定在患病组织中与它们的正常对应物相比差异表达的基因是有用的。使用核酸微阵列，将来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA样品逆转录和标记以生成cDNA探针。然后将cDNA探针杂交至在固体支持物上固定化的核酸阵列。阵列配置成该阵列每个成员的序列和位置是已知的。例如，可以将已知在某些疾病状态中表达的基因集合排列在固体支持物上。经标记探针对特定阵列成员的杂交指示衍生该探针的样品表达该基因。如果来自测试(例如疾病组织)样品的探针的杂交信号大于来自对照、正常组织样品的探针的杂交信号，那么鉴定出在疾病组织中过表达的基因。此结果的含义在于在疾病组织中过表达的蛋白质不仅作为疾病状况存在的诊断标志物是有用的，而且作为疾病状况治疗的治疗靶物也是有用的。
核酸杂交和微阵列技术的方法学是本领域公知的。在一个例子中，用于杂交的核酸的具体制备及探针、载玻片、和杂交条件都详细记载于2001年3月30日提交的PCT专利申请流水号PCT/US01/10482(通过述及收入本文)。
使用微阵列分析来寻找与正常肠组织相比在CD中过表达的基因。为了这项研究，募集了67名CD患者和31名对照患者接受结肠镜检查。在结肠镜检查时使用简单临床结肠炎活动指数(SCCAI)评估患者症状(Walmsley et al.，Gut.1998；43：29-32)。不显示组织学炎症的静止疾病定义为SCCAI为2或更低。具有组织学急性或慢性炎症的活动性疾病定义为SCCAI大于2。通过Leonard-Jones的标准确定CD自身的严重程度(Lennard-Jones Scand.J.Gastroent.1989；170：2-6)。CD患者提供了有清楚表型的(well phenotyped)活检，用于在分子水平分析CD的炎症途径，如此为治疗性干预鉴定了新候选基因和潜在途径。自每个解剖学位置采集配对活检。
所有活检保存于-70℃，直至准备好分离RNA。将活检在600μl RLT缓冲液(+BME)中匀浆，并使用QiagenTM Rneasy迷你柱(Qiagen)及柱上DNA酶处理遵循制造商的指导分离RNA。分离RNA后，使用RiboGreenTM(MolecularProbes)遵循制造商的指导对RNA定量，并在琼脂糖凝胶上检查完整性。标记适宜量的RNA供微阵列分析用，并在专有的Genentech微阵列和AffymetricsTM微阵列上运行样品。比较其表达在UC组织中比在正常肠中上调的基因，匹配来自相同患者的正常肠和CD组织的活检。这项实验的结果显示如表1A、1B、和2A(上文提供)中所显示的核酸在CD和/或UC组织中与正常组织相比差异表达。
表1A-1B中所列举的基因展现最少1.5倍的表达差异，而且还观察到可接受的探针杂交强度。发现表2中所列举的基因具有大约0.65的最少组内Pearson关联，而且观察到3倍的基因表达上调。
更具体的说，表1A和2中所列举的SEQ ID NO代表在CD和/或UC中显著上调/过表达的多核苷酸及其编码的多肽。
表1B中所列举的SEQ ID NO代表在CD和/或UC中显著下调/表达不足的多核苷酸及其编码的多肽。
表3A中所列举的SEQ ID NO：代表在UC中显著上调/过表达的多核苷酸及其编码的多肽。
表3B中所列举的SEQ ID NO：代表在UC中显著下调/表达不足的多核苷酸及其编码的多肽。
实施例2：通过微阵列分析对溃疡性结肠炎中独特肠基因表达序型的表征
微阵列分析容许在细胞水平获得基因表达的全面图像。这项研究的目的是调查溃疡性结肠炎患者(UC)和对照中的差异肠基因表达。
方法：研究了67名UC和31名对照受试者(23名正常的和8名发炎的非炎性肠病患者)。自5个特定解剖学位置采集配对内窥镜检查活检，供RNA提取和组织学用。使用Agilent平台在215份活检中分析了41058种表达序列标签。通过实时PCR和免疫组织化学进行结果确认。结果：在健康对照活检中，聚类分析(cluster analysis)显示右和左结肠之间基因表达的差异(χ2＝25.1，p＜0.0001)。发育基因HOXA13(p＝2.3x10-16)、HOXB13(p＜1x10-45)、GLI1(p＝4.0x10-24)、和GLI3(p＝2.1x10-28)主要驱动这种分离。在比较所有UC活检和对照活检时，143种序列在UC活检中具有＞1.5的倍数变化(0.01＞p＞10-45)，而54种序列具有＜-1.5的倍数变化(0.01＞p＞10-20)。在UC中差异上调的基因包括SAA1(p＜10-45)、α防卫素、DEFA5和6(分别为p＝0.00003和p＝6.95x10-7)、MMP3(p＝5.6x10-10)和MMP7(p＝2.3x10-7)。通过免疫组织化学和原位杂交将升高的DEFA5和6表达进一步表征至Paneth细胞化生。对IBD2和IBD5基因座及ABC转运蛋白基因的子分析揭示多种在UC活检中差异调节的基因。结论：这些数据涉及多个新基因家族以及UC发病机制中的已确立候选基因，而且可容许表征潜在治疗靶。
当前研究的目的是使用微阵列基因表达分析来调查UC患者和对照的内窥镜检查粘膜活检中的基因组范围表达。为了解决先前的矛盾及进一步描绘UC中的炎症途径，包括比先前研究中显著更多的患者和活检。
材料和方法
患者和对照。募集了67名UC患者和31名对照患者接受结肠镜检查。表4中显示了他们的人口统计学。
表4
  UC
  患者数目   67
  男性/女性   33/34
  诊断时的年龄中值(岁)   37
  跟踪的持续时间中值(年)   7.8
  疾病分组
  新诊断(1)   8
  静止疾病(2)   41
  活动性疾病(3)   18
  内窥镜检查术时的疾病程度
  直肠炎   15
  L侧结肠炎   27
  广泛的结肠炎   25
现时吸烟者   6
IBD家族史   5
5-ASA疗法   40
皮质类固醇疗法   10
免疫抑制疗法(AZA，6MP，MTX，MMF)   11
募集了67名UC患者和31名对照患者接受结肠镜检查(表4)。所有UC患者去位于Western General Hospital(爱丁堡)的门诊部，而且UC的诊断遵循Lennard-Jones的标准(Lennard-Jones JE.Sc和J Gastroenterol Suppl1989；170：2-6)。通过访谈和病例-记录回顾来收集表型数据，包括人口统计学、诊断日期、疾病位置、疾病行为、进展、肠外表现、手术操作、当前药疗、吸烟史、关节症状、家族史和种族。在结肠镜检查时，使用简单临床结肠炎活动指数(SCCAI)评估患者症状(Walmsley et al.Gut.1998；43：29-32)。
如果结肠镜检查在呈现他们的指数时发生且他们接受了少于24小时的口服/IV疗法，那么患者记录为具有UC的“新诊断”。静止的疾病定义为SCCAI为2或更小，且组织学显示没有炎症或轻度慢性炎症，而急性疾病定义为SCCAI大于2且组织学显示急性或慢性炎症。
对照中11名是男性，20名是女性，内窥镜检查时年龄中值43。对照中6人具有结肠癌筛选的正常结肠镜检查，9名对照具有与肠易激综合征一致的症状且具有正常结肠镜检查调查，而7名患者具有另一项指标的结肠镜检查且获得了组织学正常的活检。8名对照患者具有异常的发炎的结肠活检(1例假膜性结肠炎、1例憩室炎、1例阿米巴病、2例微观结肠炎、1例嗜曙红细胞浸润、2例发散状淋巴样聚集物和胃肠炎史)。自所有患者获得了书面知情同意书。洛锡安区地方研究伦理委员会批准了研究方案：REC 04/S1103/22。
活检收集。由有经验的手术者证实解剖位置，内窥镜***距离和内窥镜定位使用Scope GuideTM。自每个解剖位置采集配对活检。一份活检用于组织学检查，而另一份在液氮中快速冷冻，供RNA提取用。由有经验的胃肠病理学家对每份活检在组织学上分级为没有炎症的证据、具有慢性炎症的证据的活检和主要是慢性炎性细胞浸润物或仅仅是有急性炎症和急性炎性细胞浸润物。收集了139份配对UC活检和76份配对对照活检。表5中显示了来自每个解剖位置的、UC患者和对照中的配对活检的数目。
表5
  UC(n＝67)  对照(n＝31)
  配对活检总数   139  76
  回肠末端   4  6
  升结肠   33  17
  降结肠   35  23
  乙状结肠活检   57  27
  自分析中除去   10  3
RNA分离。活检称重介于0.2mg和16.5mg之间，重量中值为5.5mg。使用自动物组织分离总RNA的微量方案(Qiagen，Valencia，CA)依照制造商的指令自每份活检提取总RNA。为了评估纯度和完整性，用Agilent technologies的2100生物分析仪使用Pico LabChip试剂集(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)评估每份样品的1μL总RNA。
微阵列分析。使用低RNA输入荧光线性扩增方案(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)扩增1μg总RNA。进行T7RNA聚合酶单轮线性扩增以将花青-3和花青-5标记物掺入cRNA。使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化cRNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies，Wilmington，Delaware)定量1μl cRNA。
750ng用花青-3标记的通用人参照(Stratagene，La Jolla，CA)cRNA和750ng用花青-5标记的测试样品cRNA于60℃断裂30分钟，之后加载到Agilent全人基因组微阵列(Agilent technologies，Palo Alto，CA)上。将样品于60℃以恒速旋转杂交18小时。依照制造商的方案(Agilent technologies，Palo Alto，CA)，清洗微阵列，干燥，并在Agilent扫描仪上扫描。使用Agilent的7.5版特征提取软件(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)分析微阵列图像文件。将每份样品的log强度的分布绘图，并将离群值(outlier)样品(即距离均值大于2个标准偏差)排除在分析之外。使用这些标准，10份UC样品和3份对照样品被认定为离群值。
实时PCR。对8种基因(SAA1、IL8、DEFA5、DEFA6、MMP3、MMP7、S100A8和TLR4)进行了验证性实时PCR分析。在分层以代表一定范围的SAA1和IL-8表达后，选择10份具有正常组织学的健康对照乙状结肠活检、9份静止UC乙状结肠活检和11份具有急性(6份活检)或慢性(5份活检)炎症细胞浸润物的UC乙状结肠活检来代表不同疾病组。
在RT-PCR分析之前，使用MessageAmpTM II aRNA扩增试剂盒方案(Ambion technologies，Austin，TX)进行1个RNA扩增循环。然后使用StratageneMX4000型(La Jolla，Ca，USA)对50ng RNA实施逆转录PCR。内部(GenentechInc，South San Francisco，CA)制造TaqMan引物和探针。正向探针、反向探针和TaqMan探针的序列如下：
SAA1，正向-agcgatgccagagagaata，反向-ggaagtgattggggtctttg，Taq-ctttggccatggtgcggagg，[SEQ ID NO：235]
IL-8，正向-actcccagtcttgtcattgc，反向-caagtttcaaccagcaagaa，Taq-tgtgttggtagtgctgtgttgaattacgg，[SEQ ID NO：236]
DEFA5，正向-gctacccgtgagtccctct，反向-tcttgcactgctttggtttc，Taq-tgtgtgaaatcagtggccgcct，[SEQ ID NO：237]
DEFA6，正向-agagctttgggctcaacaag，反向-atgacagtgcaggtcccata，Taq-cacttgccattgcagaaggtcctg，[SEQ ID NO：238]
MMP3，正向-aagggaacttgagcgtgaat，反向-gagtgcttccccttctcttg，Taq-ggcattcaaatgggctgctgc，[SEQ ID NO：239]
MMP7，正向-cacttcgatgaggatgaacg，反向-gtcccatacccaaagaatgg，Taq-ctggacggatggtagcagtctaggga，[SEQ ID NO：240]
S100A8，正向-ttgaccgagctggagaaag，反向-tcaggtcatccctgtagacg，Taq-tccctgataaaggggaatttccatgc[SEQ ID NO：241]，及
TLR4，正向-agagccgctggtgtatcttt，反向-ccttctgcaggacaatgaag，Taq-tggcagtttctgagcagtcgtgc[SEQ ID NO：242]。
PCR条件包括48℃30分钟，95℃保持10分钟，接着是40个循环的30秒钟95℃解链和1分钟60℃退火/延伸。通过相对于RPL19标准化来计算产物绝对定量。使用SAS和JMP软件(SAS，North Carolina)分析结果。
防卫素α5的原位杂交。
PCR引物设计成扩增跨越NM_021010 nt 55-372的318bp DEFA5片段(上-5’catcccttgctgccattct[SEQ ID NO：243]和下-5’gaccttgaactgaatcttgc[SEQ IDNO：244])。引物包括编码27个核苷酸的T7或T3 RNA聚合酶启动位点的延伸，以容许自扩增产物分别体外转录有义或反义探针。将内窥镜检查活检在10％中性缓冲***中固定并石蜡包埋。将5μm厚切片去石蜡，在10ug/ml蛋白酶K(Amresco)中于37℃脱蛋白45分钟，并如先前所述为原位杂交进一步加工(Jubb et al.Methods Mol Biol.2006；326：255-264)。将33p-UTP标记的有义和反义探针杂交至切片，即于55℃过夜。如下除去未杂交的探针，即在20μg/mlRNA酶A中于37℃温育30分钟，接着于55℃在0.1X SSC中高严谨清洗2小时，并经由分级乙醇脱水。将载玻片浸泡在NTB核踪迹乳液(Eastman Kodak)中，在装有干燥剂的密封塑料载玻片盒中于4℃曝光4周，显影并用苏木精和曙红复染色。
家兔抗人溶菌酶和家兔抗人防卫素α6的免疫组织化学
将***固定、石蜡包埋的组织切片再水合，之后淬灭内源过氧化物酶活性(KPL，Gathersburg，MD)并阻断亲合素和生物素(Vector，Burlingame，CA)。将切片用含3％BSA的PBS中的10％正常山羊血清封闭30分钟。然后将组织切片与一抗一起于室温温育60分钟，与生物素化的二抗一起温育30分钟，并在ABC试剂(Vector，Burlingame，CA)中温育30分钟，接着在金属增强的DAB(Pierce，Rockford，IL)中温育5分钟。然后将切片用Mayer氏苏木精复染色。所使用的一抗是5.0μg/ml家兔抗人溶菌酶(Dako，Carpinteria，CA)和5.0μg/ml家兔抗人DEFA6(αDiagnostics，SanAntonio，TX)。所使用的二抗是7.5μg/ml生物素化的山羊抗家兔IgG(Vector，Burlingame，CA)。DEFA6α染色要求用靶物修复高pH(Dako，Carpenteria，CA)于99℃预处理20分钟，溶菌酶染色不需要预处理。所有其它步骤于室温实施。
数据分析。使用Rosetta Resolver软件(Rosetta Inpharmatics，Seattle)分析微阵列数据。通过Student氏不配对t检验确定微阵列数据的统计学显著性。p＜0.01和倍数变化大于或小于1.5认为是统计学显著的。使用Rosetta Resolver软件计算倍数变化数据。使用Ingenuity软件(Ingenuity Systems，Mountain View，CA)分析基因本体。使用Mann-Whitney U检验来分析实时PCR数据。p＜0.05认为是显著的。
结果
解剖位置对健康结肠和回肠末端中的基因表达的影响。通过无监督分级聚簇分析56份来自对照患者的组织学正常活检。观察到由解剖位置实现的清楚分离，其中树状图的一侧25/25份活检来自左结肠(降结肠或乙状结肠)，而树状图的另一侧20/31份活检来自升结肠(χ2＝25.1，p＜0.0001)(图1)。6/6份回肠末端活检聚簇在一起。来自患者个体的活检没有聚簇在一起。驱动引起所观察到的聚簇、右和左结肠之间差异表达的基因主要涉及GI道的胚胎发育：HOXA13(FC+4.93，p＝2.3x10-16)，HOXB13(FC+16.96，p＜1x10-45)，GLI1(FC+2.2，p＝4.0x10-24)，和GLI3(FC+2.3，p＝2.1x10-28)在左结肠中都上调。
对UC和对照活检中表达的分析。
使用无监督分级聚簇，我们无法自区分来自UC患者和对照患者的活检。另外，没有观察到基于活检炎症状态的聚簇(clustering)。唯一观察到的聚簇发生于来自回肠末端的活检，而UC和对照活检都聚簇在一起。在比较所有UC活检(129份)和对照活检(73份)时，143种序列在UC活检中具有大于1.5的倍数变化(0.01＞p＞10-45)，而54种序列具有小于1.5的倍数变化(0.01＞p＞10-20)(数据未显示)。
血清淀粉状蛋白A1(SAA1)是上调最多的基因(倍数变化(FC)+8.19，p＜10-45)。其它值得注意的上调基因是S100A8(FC+3.50，p＝2.3x10-17)、S100A9(FC+3.06，p＝4.1x10-13)、α防卫素α5(DEFA5)(FC+3.25，p＝0.00003)和α6(DEFA6)(FC+2.18，p＝6.95x10-7)及基质金属蛋白酶MMP3(FC+2.17，p＝5.6x10-10)和MMP7(FC+2.29，p＝2.3x10-7)。
发现在UC患者中与正常患者相比差异表达的基因的列表可见于表1A、1B、和2A，如上所述。
表6中显示了在超过一项实验间的多种候选基因的差异基因表达。表6显示了倍数变化，而且显示了四项不同实验中多种不同基因的p值。括弧中显示了每项实验中所分析的活检的数目。对此表中的感兴趣基因观察到超过一项实验间表达的显著、一致变化。
Figure BPA00001187298700771
在考虑生物学***时，涉及在UC和对照活检之间差异表达的基因的基因本体分析显示了差异表达的基因的优势(preponderance)涉及免疫应答(总共679种归在免疫应答下的基因中的48种基因，p＝2.1x10-9，OR 2.61，CI1.85-3.56)和对创伤的应答(总共359种归在对创伤的应答下的基因中的30种基因，p＝6.42x10-9，OR 3.14，CI 2.09-4.53)。
对具有静止UC的患者中的乙状结肠活检和不发炎的结肠活检中表达的分析。为了比较没有急性炎症信号的活检中的表达及消除解剖变异的影响，22份来自UC患者的来自没有炎症的组织学证据的乙状结肠的活检与18份组织学正常对照乙状结肠活检比较。102种序列具有大于1.5的倍数变化(0.01＞p＞4.77x10-13)，而84种序列具有小于1.5的倍数变化(0.01＞p＞1.8x10-21)(数据未显示)。
上调的基因包括防卫素β14(FC+2.11，p＝0.00002)和SAA1(FC+2.01，p＝0.00024)。感兴趣的下调的基因包括HLA-DRB1(FC-3.0，p＝0.0010)和TSLP(FC-2.73，p＝2.7x10-10)(表6)。
对具有活动性UC的患者中的乙状结肠活检和发炎的对照活检中的表达的分析。将35份来自UC患者的组织学发炎的乙状结肠活检的表达与8份组织学发炎的对照乙状结肠活检比较。反映UC活检中更加严重的炎症，多种涉及急性炎症应答的基因在UC活检中与对照活检相比上调，SAA1(FC+17.5，p＝2.9x10-21)、MMP3(FC+11.0，p＝1.22x10-37)、MMP7(FC+7.31，p＝4.9x10-24)和IL-8(FC+6.36，p＝9.27x10-17)(表6)。总共623种序列具有大于1.5的倍数变化，而509种序列具有-1.5或更小的倍数变化(p＜0.01)(数据未显示)。
发炎的对不发炎的UC乙状结肠活检。在35份组织学发炎的和22份不发炎的乙状结肠UC活检之间比较表达信号时，在发炎的活检中，700种序列具有大于1.5的倍数变化(0.01＞p＞1x10-45)，而518种序列具有小于1.5的倍数变化(0.01＞p＞1x10-45)(数据未显示)。
显著上调的基因包括SAA1(FC+16.51，p＝＜10-45)、TNFAIP3相互作用蛋白3(TNIP3)(FC+10.5，p＝1x10-38)、DEFA5(FC+8.44，p＝＜10-45)、DEFA6(FC+6.72，p＝4.16x10-19)和再生胰岛衍生的3γ(REG3γ)(FC+6.99，p＝＜10-45)。
对特定基因家族-α防卫素5和6的分析。
进一步分析了多种感兴趣基因的表达，考虑解剖位置和UC样品中炎症的程度。在分析DEFA5和DEFA6时，正常对照和不发炎的UC活检中的表达在不同解剖位置间是相似的，在回肠末端中有高表达，而且表达随着活检位置变得离结肠越来越远而降低(图2)。
在图2中，将每份阵列样品的表达针对Agilent通用参照绘图。每份内窥镜检查活检已经根据患者状态、活检炎症状态和解剖位置分离。每种解剖位置的均值表达水平以蓝色连线。在对照和不发炎的UC样品的回肠末端中看到高α防卫素5(小图A)和6(B)(DEFA5和DEFA6)表达水平。获取活检的结肠越远，这2组中的表达降低越多。在急性和慢性发炎的UC样品中和在程度较低的发炎的对照样品中，DEFA5和DEFA6表达遍及升、降和乙状结肠有显著升高，乙状结肠发炎的对不发炎的UC样品DEFA5(FC+8.44，p＝＜10-45)，DEFA6(FC+6.72，p＝4.16x10-19)。
在急性和慢性发炎的UC活检中，DEFA5和DEFA6表达遍及升、降和乙状结肠有显著上调(表6)。
基质金属蛋白酶3和7。
与不发炎的UC活检相比，在急性和慢性发炎的UC活检中观察到升高的MMP3和MMP7表达，乙状结肠发炎的对不发炎的UC样品MMP3(FC+8.15，p＝2.3x10-35)和MMP7(FC+5.53，p＝1.0x10-23)(图3)。
在图3中，将每份阵列样品的表达针对Agilent通用参照绘图。每份内窥镜检查活检已经根据患者状态、活检炎症状态和解剖位置分离。每种解剖位置的均值表达水平以蓝色连线。与不发炎的UC活检相比，在急性和慢性发炎的UC活检中观察到升高的MMP3(小图A)和MMP7(B)表达，乙状结肠发炎的对不发炎的UC样品MMP3(FC+8.15，p＝2.3x10-35)和MMP7(FC+5.53，p＝1.0x10-23)。相反，在分析发炎的和不发炎的对照样品时，观察到发炎的对照活检中MMP3和MMP7的表达水平降低(分别为FC-1.62，p＝0.012和FC-2.0，p＝0.0002)。
ATP结合盒(ABC)转运蛋白家族和异生素(Xenobiotic)转录调节物。为了进一步调查此基因家族，分析了来自代表48种转录基因及其关键介导物(PXR、FXR、LXR和CAR)的探针的表达样式。在所有UC和对照活检中比较这些基因时，发现7种基因在UC样品中与对照样品相比显著下调，ABCA1(p＝0.01)、ABCA8(p＝0.0064)、ABCB1(p＝0.0091)、ABCC6(p＝0.0050)、ABCB7(p＝0.0068)、ABCF1(p＝0.0005)和ABCF2(p＜0.00001)。只有一种代表ABCB2的探针在UC中显著上调(p＝0.0048)。
发现多种ABC基因在IBD患者中与正常患者相比下调(数据未显示)。在ABCB1表达中观察到的变化表现为主要由发炎的UC活检驱动，它们与乙状结肠中不发炎的UC活检相比显著下调(FC-1.82，p＝5.6x10-6)(表6)。有趣的是，在任何分析(包括疾病定位和活动)中没有观察到UC和对照之间PXR表达的差异。
RT-PCR分析。在8种根据微阵列表达结果有涉及的基因的情况中，使用10份具有正常组织学的健康对照结肠乙状结肠活检、9份静止的UC乙状结肠活检和11份具有急性(6份活检)或慢性(5份活检)炎症细胞浸润物的UC乙状结肠活检进行了验证性实时PCR分析。在发炎的UC乙状结肠活检中观察到与正常对照乙状结肠活检和不发炎的UC乙状结肠活检相比升高的SAA1表达(分别为p＝0.041和p＝0.044)。在发炎的UC乙状结肠活检中也证实了与对照乙状结肠活检相比升高的IL-8表达(p＝0.031)，而且观察到朝向发炎的UC乙状结肠活检中有与不发炎的UC活检相比较高的IL-8表达的趋势(p＝0.089)(图4)。
图4显示了实时PCR表达数据，比较10份具有正常组织学的健康对照乙状结肠活检、9份静止的UC乙状结肠活检和11份具有急性或慢性炎症细胞浸润物的UC乙状结肠活检中的表达。在对照和发炎的和不发炎的UC活检之间比较SAA1(A)、IL-8(B)、防卫素α5(C)和防卫素α(D)的表达。在每幅图中以绿色显示了标准误差条。
在发炎的UC乙状结肠活检中观察到与不发炎的UC乙状结肠活检(分别为p＝0.0008和p＝0.0005)和对照乙状结肠活检(分别为p＝0.0002和p＝0.0001)相比升高的DEFA5和DEFA6表达(图4)。在检查MMP7(p＝0.0005)、S100A8(p＝0.0029)和TLR4(p＝0.019)时，在发炎的UC乙状结肠活检中也观察到与不发炎的UC乙状结肠活检相比升高的表达(图5)。
图5显示了实时PCR表达数据，比较10份具有正常组织学的健康对照乙状结肠活检、9份静止的UC乙状结肠活检和11份具有急性或慢性炎症细胞浸润物的UC乙状结肠活检中的表达。在不同患者组间比较MMP3(A)、MMP7(B)、S100A8(C)和TLR4(D)的表达。在每幅图中以绿色显示了标准误差条。在分析发炎的、不发炎的UC乙状结肠活检和对照乙状结肠活检时，没有观察到MMP3表达的显著变化。
原位杂交和免疫组织化学。
为了进一步调查UC患者的结肠中的过度DEFA5和6表达的细胞定位，在UC患者和对照的一组活检中进行原位杂交和免疫组织化学(图6和7)。
图6显示了DEFA5的回肠末端活检原位杂交，显示了基部隐窝中的强杂交，与Paneth细胞定位一致。在上部小图回肠末端(TI)中，反义探针显示了基部隐窝中的强杂交，与Paneth细胞定位一致。在下部小图回肠末端(TI)中，用有义对照探针没有观察到显著的杂交。小图A显示了不发炎的对照患者的乙状结肠活检。小图B、C、和D显示了UC乙状结肠活检的基部隐窝区域中的强、多灶杂交，与Paneth细胞化生一致。在自乙状结肠采集的UC活检中，观察到这些活检的基部隐窝区域中的强、多灶杂交，而且这会与Paneth细胞化生一致。在不发炎的对照活检中没有观察到这种现象。
图7显示了DEFA6的回肠末端活检原位杂交。在小图A中，回肠末端免疫组织化学显示了基部隐窝中的阳性染色，与Paneth细胞定位一致。在小图B和C中，在不发炎的对照患者中没有观察到显著的染色。在小图D、E、和F中，UC乙状结肠活检的基部隐窝区域中的强、多灶染色，与Paneth细胞化生一致。DEFA6的免疫组织化学证实了在乙状结肠UC活检中，在这些活检的基部隐窝区域中观察到染色，与Paneth细胞化生一致。再次，在发炎的对照活检中没有观察到这种现象(图7)。
IBD2基因座内的基因的表达。使用限定IBD2基因座的标志物，我们鉴定出526种代表染色体12上此基因座内的基因或表达序列标签的Agilent探针。在比较急性和慢性发炎的UC乙状结肠活检与不发炎的UC乙状结肠活检时，12种探针具有倍数变化大于或小于1.5的表达，p＜0.01(表7)。
表7
Figure BPA00001187298700821
对526种位于IBD2基因座内的表达探针的分析鉴定出12种在发炎的UC乙状结肠活检与不发炎的UC乙状结肠活检比较时显著差异调节的探针。
表3A(上文提供)列举了那些发现在IBD患者中与正常患者相比上调的、来自染色体12上IBD2基因座的基因。
表3B(上文提供)列举了那些发现在IBD患者中与正常患者相比下调的、来自染色体12上IBD2基因座的基因。
在发炎的UC乙状结肠样品中受到差异调节的感兴趣的候选基因包括角蛋白5B(FC+2.38，p＝0.0004)、MMP19(FC+1.95，p＝0.0084)、GLI 1(FC-1.54，p＝7.3x10-9)、白介素-1受体相关激酶3(FC+1.74，p＝3.1x10-15)和白介素-1受体相关激酶M(FC+1.71，p＝0.0014)。
当除去急性炎性信号并比较不发炎的UC乙状结肠活检和不发炎的对照乙状结肠活检时，没有序列具有大于或小于1.5的倍数变化。然而，显著下调的基因包括微管蛋白α5(FC-1.32，p＝9.0x10-6)和微管蛋白α6(FC-1.45，p＝1.2x10-5)，即涉及微管细胞骨架和肠屏障完整性的分子。
IBD5基因座内的基因的表达。在健康对照、不发炎的和发炎的UC活检中鉴定和比较代表IBD5基因座内11种基因的Agilent探针(表8)。表8显示了IBD5基因座内的基因的表达的倍数变化，比较对照和根据在他们的乙状结肠活检中观察到的炎症程度已经分层的UC患者。在比较发炎的UC乙状结肠活检与不发炎的UC乙状结肠活检时观察到有机阳离子转运蛋白SLC22A4和SLC22A5的显著下调。
Figure BPA00001187298700841
表3A(上文提供)列举了那些发现上调的、来自染色体5上IBD5基因座的基因。
在比较发炎的和不发炎的UC乙状结肠活检中的IRF1和PDLIM4表达时，观察到表达中不显著但一致的倍数升高(分别为FC+1.12，p＝2.9x10-6和FC+1.14，p＝0.00039)。
表3B(上文提供)列举了那些发现在IBD患者中与正常患者相比下调的、来自染色体5上IBD5基因座的基因。SLC22A5(OCTN2)在UC活检中与对照相比下调(FC-1.26，p＝3.37x10-6)，而且在比较发炎的UC乙状结肠活检与不发炎的UC乙状结肠活检时下调(FC-1.50，p＝2.2x10-6)。SLC22A4(OCTN1)的表达在发炎的UC乙状结肠活检中与不发炎的UC乙状结肠活检相比也下调(FC-1.79，p＝1.5x10-9)，然而，在比较所有UC活检与对照时，没有观察到变化(FC-1.18，p＝0.11)。
基因表达和疾病活性。比较来自接受内窥镜检查的新诊断UC患者的乙状结肠活检(8份活检)和来自具有已确立UC的患者的乙状结肠活检(18份活检)。在新诊断的UC乙状结肠活检中，861种序列上调，倍数变化大于1.5且p＜0.01，而373种序列下调，倍数变化小于1.5且p＜0.01(数据未显示)。
3种在新诊断的患者中上调最多的基因是选择蛋白E(FC+10.95，p＝1.8x10-6)、CCL19(FC+7.42，p＝4.7x10-15)和IL-8(FC+7.32，p＝2.9x10-7)，而下调的基因包括S100P(FC-6.4，p＝2.0x10-9)。
比较来自简单临床结肠炎活动指数(SCCAI)大于2的UC患者的乙状结肠活检(27份活检)与来自SCCAI为2或更小的UC患者的乙状结肠活检(30份活检)。813种序列上调，而444种序列下调。在上调最多的基因中有那些涉及急性炎症应答的，IL-8(FC+8.86，p＝4.4x10-12)、MMP3(FC+6.5，p＝3.2x10-19)、MMP7(FC+5.3，p＝3.4x10-21)和DEFA6(FC+4.5，p＝2.7x10-12)。下调的基因包括UGT2B15(FC-4.5，p＝0.0013)、UGT2B17(FC-2.8，p＝0.0059)和UGT2B10(FC-2.2，p＝0.0038)，UGT家族的所有成员涉及细胞解毒和分泌。
表3A(上文提供)列举了别的在本研究中鉴定出的、观察到在UC患者中与正常患者相比上调的基因，而表3B(上文提供)列举了别的在本研究鉴定出的、观察到在UC患者中与正常患者相比下调的基因。
讨论
本研究呈现了迄今所报告的最严格的微阵列分析，与健康对照以及具有其它结肠炎症起因的患者比较UC患者中的肠基因表达。数据提供了关于健康结肠中基因表达的解剖样式的重要信息，在右和左结肠中有令人感兴趣的差异。此外，已经为UC特征性的失调的基因表达提供了强有力的证据，而且总体上这些数据提供了有价值的关于正常生理稳态中的和UC病理过程期间的基因表达的见解。
此数据集的力量在于所进行的研究的容量、疾病表型的小心评估、每份活检的解剖位置的记档及避免合并样品所致混杂影响。由此，我们已经能够消除妨碍先前研究的相当大量的背景变异性(Marshall E.Science2004；306：630-631；Ioannidis JP.Lancet 2005；365：454-455)。
此外，本研究解决了非特异性急性炎症签名的强度的潜在至关重要的混杂影响。比较了来自UC患者的静止的活检和对照，而且我们能够自这些分析得到有价值的对UC发病机制的见解。另外，本研究提供了对具有新诊断的疾病的患者中一部分的获取，克服了与治疗有关的基因表达改变。我们的研究的另一项力量在于如下的事实，即实时PCR分析一致地证实了除一种以外所有感兴趣候选基因的显著表达变化，强有力地验证了微阵列数据并实质性地提高了与解读数据有关的置信度。
这是首次微阵列研究显示多种基因沿着健康成体结肠的表达梯度。这些结果与来自Costello及其同事的数据形成对比，后者在比较来自盲肠、横结肠、降结肠和乙状结肠的活检时没有观察到表达样式的显著差异(CostelloCM，et al.PLoS Med 2005；2：e199)。在这些数据集中观察到的差异可如下解释，即我们的分析只查看不发炎的对照样品，而Costello调查对照和患病患者。
涉及发育途径的基因(HOX家族和hedgehog信号传导途径)表现为沿着健康结肠的解剖长度受到差异调节最大的。HOXA13已经显示在肛后肠的发育中发挥至关重要的作用，而且该基因中的突变导致泌尿生殖异常(De Santaet al.Development.2002；129：551-561)，而且有趣的是，已经显示HOXB13表达在来自远端左结肠的结肠直肠肿瘤中下调(Jung et al.Br J Cancer.2005；92：2233-2239)。
hedgehog信号传导途径对于人胃肠***的正常生长和发育也是至关重要的，而影响肠的多种先天病是由于涉及此途径的基因中的突变(Lees et al.Gastroenterology.2005；129：1696-1710)。GLI-1是hedgehog信号传导途径的主要效应器分子之一，而且GLI-1基因位于IBD2基因座内，即一个先前显示与UC有关的区域(Parkes et al.Am J Hum Genet.2000；67：1605-1610；Satsangi，etal，Nat.Genet.1996；14：199-202)。来自本研究的数据还会提示GLI-1在发炎的UC活检中与来自UC患者的不发炎的活检相比下调。最近来自我们单位的数据显示GLI-1基因中的突变和UC之间的强关联(Lees et al.Gastroenterology.2006；130：A52)。
另外，最近由Varnat及其同事发表的数据提示PPARβ通过下调Indianhedgehog(hedgehog信号传导途径中的另一种主要效应器分子)的表达来负调节Paneth细胞分化(Vamat et al.Gastroenterology.2006；131：538-553)。我们的数据显示α防卫素5和6在具有发炎的UC的患者的结肠中与来自UC患者和对照的不发炎的活检相比上调，而且免疫组织活性和原位杂交显示这主要是由Paneth细胞化生介导的。感兴趣的是推测在UC患者中Hedgehog信号传导途径中迄今尚未确定的别的缺陷可导致Paneth细胞分化失调、Paneth细胞化生、α防卫素5和6表达升高、和粘膜发炎。
确实，在本研究中最刺激性的观察结果中有显示α防卫素5和6在UC患者中上调的数据。α防卫素5和6是小阳离子蛋白质，它们是先天免疫应答的一部分，而且具有针对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的有力抗微生物特性(Ouellette AJ.Springer Semin Immunopathol.2005；27：133-146)。它们作为分子原存储在Paneth细胞中，Paneth细胞在健康结肠中主要局限于回肠末端，而且在释放入粘膜时被胰蛋白酶切割成有活性的抗微生物肽(Ghosh et al.NatImmunol.2002；3：583-590)。
在我们的数据集中，在不发炎的对照和UC患者的回肠末端活检中观察到高水平的α防卫素表达。对照患者和具有静止的UC的患者中的表达水平随获取活检的位置变得离结肠越来越远(升结肠、降结肠和乙状结肠)而下降。然而，在发炎的UC活检中在每个活检的解剖位置观察到α防卫素5和6二者升高的表达。Lawrance及其同事还记录了防卫素α5和6在UC患者中与对照相比上调(Lawrance et al.Hum Mol Genet.2001；10：445-456)，虽然RNA是自手术切除物提取的而且没有给出关于这些标本的解剖位置的详情。
最近检查CD患者回肠末端中α防卫素5和6表达的数据会提示表达水平与对照回肠末端组织相比降低，不管炎症的程度，而且这可能对在CD中观察到的回肠末端表型负有责任(Wehkamp et al.Proc Natl Acad Sci USA.2005；102：18129-18134)。通过寻找这些基因内与疾病易感性和这些肽改变的功能有关的关键变体，可能解决在我们的数据集中观察到的α防卫素5和6表达的升高是与疾病发病机制有关的原发现象，还是保护先前受损的上皮表面免于微生物侵入的继发现象。
感兴趣的是，许多但非所有我们的结果广泛符合两份关于IBD的里程碑式微阵列论文。与来自Lawrance及其同事(Lawrance et al.Hum Mol Genet.2001；10：445-456)的数据一致，我们显示了UC中S100A8和A9及α防卫素5和6的上调。然而，在本研究中IBD2基因座中差异表达的探针中及在Lawrance中没有观察到交叠。Dieckgraefe及其同事(Dieckgraefe et al.Physiol Genomics.2000；4：1-11)观察到多种MMP基因的上调，与我们的数据一致，而且有趣的是，REG家族的成员显示出在UC患者的结肠中上调，大概是作为Paneth细胞化生的结果。
我们的数据集中ABCB1的下调是特别有意义的，而且与来自Langman、Dieckgraefe和Lawrance及其同事的较早微阵列数据一致(Dieckgraefe et al.Physiol Genomics.2000；4：1-11；Lawrance et al.Hum Mol Genet.2001；10：445-456；Langmann et al.Gastroenterology.2004；127：26-40)。在此之外，我们观察到UC中的ABCB1表达展示降低的梯度，其中基因表达在乙状结肠中最低。这种表达样式或许与联系UC中P-糖蛋白(ABCB1的基因产物)丧失功能的假说一致，而且符合UC的临床呈现。当前的数据例示了ABCB1在UC的疾病发病机制中的重要性，正如最近的遗传和动物功能数据所强调的(Moodie et al.Glucocorticoid access and action in the rat colon：expressionand regulation of multidrug resistance 1a gene(mdr1a)，glucocorticoid receptor(GR)，mineralocorticoid receptor (MR)and 11-beta-hydroxysteroiddehydrogenase type 2(11BHDS2).197 ed.2003)。
ABCB1编码P-糖蛋白170，一种涉及肠屏障防御和异生素代谢的外排上皮转运蛋白。有关的是，在分析与ABCB1共享同源性的整类蛋白质时，ABC转运蛋白的48种基因中另外6种(12.5％)在UC中显著失调；提示此类蛋白质在UC本发病机制中的重要作用。
与由Langmann产生的数据不同，我们没有观察到转录调节物孕烷-X受体的任何表达变化。这些阴性数据与在爱丁堡使用单元型标记法在IBD群体中进行的遗传研究一致，在ABCB1基因和UC之间有关联(Ho et al.Hum MolGenet.2006；15：797-805)，但是在孕烷-X受体和UC之间没有关联(Ho GT et al.Gut.2006；55：1676-1677)。研究设计的各方面可解释在我们的数据和Langmann及其同事的数据之间观察到的此内容中的差异，因为我们的分析考虑了活检的炎症状态和解剖位置。在我们的数据集中，我们没有合并样品，如此进行大量的微阵列，而Langmann及其同事合并回肠末端和结肠活检，而该方法学中的这种差异也可解释不同的结果。
基质金属蛋白酶(MMP)构成超过23种锌依赖性酶的家族，它们是涉及***发生和组织重塑期间胞外基质成分降解的末期效应器分子(Brinckerhoff etal.Nat Rev Mol Cell Biol.2002；3：207-214)。与我们的数据一致，先前IBD患者中的研究显示了发炎的活检中与不发炎的活检和对照活检相比MMP3表达的显著升高(Heuschkel et al.Gut.2000；47：57-62；von LBet al.Gut.2000；47：63-73)。MMP3-/-小鼠的数据也证明了细菌清除延迟、MMP7补偿性升高和CD4+T淋巴细胞募集至固有层减少(Li et al.J Immunol.2004；173：5171-5179)。另外，最近的数据还显示了经由CXCL7介导的MMP3的促炎效应，引起结肠细胞系中剂量依赖性嗜中性粒细胞募集(Kruidenier etal.Gastroenterology.2006；130：127-136)。
在我们的数据集中，我们观察到在我们的发炎的对照中与我们的不发炎的对照相比MMP3表达的降低，提示在UC中观察到的MMP3和MMP7表达的变化可能是疾病特异性的。德国群体中MMP3的5A变体的传递不平衡检验显示了与CD而非UC的关联，这在英国群体中没有再现(Pender et al.J MedGenet.2004；41：e112)。
我们还使用此数据集来分析定位至易感性基因座的基因的相对表达，所述易感性基因座是通过基因组范围分析联系起来的，特别是在IBD2和IBD5内。本数据在基因鉴定、补充精细定位研究的结果、和当前进行的基因组范围病例-对照研究中会是有用的。在此内容中，相当感兴趣的是回顾我们关于IBD5基因座的数据，IBD5基因座跨越一个最初在2000年通过基因组范围扫描发现的、含有多种吸引人的候选基因的细胞因子簇(Rioux et al.Am JHum Genet.2000；66：1863-1870；Ma et al.Inflamm Bowel Dis.1999；5：271-278)。跨越IBD5连锁间距的紧密连锁不平衡限制了先前的遗传研究，而且没有足够的动力来鉴定此区域内的易感性基因(Waller，et al.Gut.2006；55：809-814；Fisher et al.Hum Mutat.2006；27：778-785；Noble et al.Gastroenterology.2005；129：1854-1864)。
在比较UC活检与对照活检时观察到编码有机阳离子转运蛋白SLC22A5(OCTN2)的位置性候选基因的下调，而且在发炎的UC乙状结肠活检中与不发炎的乙状结肠活检相比观察到SLC22A4(OCTN1)和SLC22A5二者下调。这些有争议的数据会提示这些基因降低的表达可能终究涉及UC发病机制，而且这些数据由此可维持对这些基因的兴趣。Peltekova及其同事提出这些基因的两种变体即SLC22A4(1672C→T)和SLC22A5变体(-207G→C)赋予对CD的疾病易感性(Peltekova et al.Nat Genet.2004；36：471-475)，然而，在比较此项研究中为这些突变测定了基因型的少数患者中的表达时没有观察到野生型和TC纯合患者之间表达的任何变化(数据未显示)。IRF-1和PDLIM4(都是IBD5内的似乎可能的候选)的表达也失调，强调了目前与此基因座有关的不确定性。在IBD2基因座内，在本数据集中鉴定出一系列失调的基因，其中只有GLI 1已经进行了详细的突变分析。
总之，这些数据严格地表征了UC患者和对照的回肠末端和结肠中全基因组的表达。该研究提供了关于健康结肠中基因表达的区域性变异的新见解，而且还相当大地延伸了先前关于UC的研究。这些数据鉴定了肠炎症的多种关键调节物，特别是α防卫素家族、hedgehog信号传导分子、和基质金属蛋白酶。
实施例3：免疫组织化学
IBD活检中的DefA6表达。
防卫素α6在正常情况中由小肠隐窝上皮中的Paneth细胞表达，而且在结肠上皮细胞中不表达。我们使用Agilent微阵列及在对活检溶胞物进行的taqman中在溃疡性结肠炎和克罗恩氏病患者中在RNA水平观察到升高的DefA6表达。这些实验评估是否能在***固定的结肠活检中看到升高的DefA6蛋白质表达。
正如预期的，我们的研究显示在来自没有炎症的组织学证据的非IBD对照患者的结肠活检中没有DefA6染色。我们还评估了一例具有微观结肠炎诊断的非IBD对照患者。在该患者中，DefA6存在于乙状结肠隐窝上皮细胞中。
在溃疡性结肠炎患者中，21名患者在乙状结肠、降结肠、横结肠、或直肠的隐窝上皮细胞中具有分散的或聚簇的DefA6染色。21名阳性患者中20人在他们的活检组织中具有慢性或慢性-活动性炎症的组织学证据。剩余患者具有主要是急性的(嗜中性粒细胞的)炎症。在结肠中具有阳性DefA6染色的患者无一具有不发炎的活检。
有18名溃疡性结肠炎患者在结肠上皮中没有DefA6染色的证据。这些患者大多(10)在活检组织中没有炎症的组织学证据。剩余患者中6人具有主要是嗜中性粒细胞的炎症(急性炎症)，2人具有慢性/慢性-活动性炎症。
总之，溃疡性结肠炎中的DefA6表达表现为与在活检中观察到的局部炎症状态有关。不发炎的活检无一具有DefA6染色。另外，具有慢性或慢性-活动性炎症的患者比具有急性炎症的患者更有可能具有阳性DefA6染色。
实验设计：炎症状态的评分基于炎症细胞类型优势：嗜中性粒细胞优势＝急性炎症；嗜中性粒细胞和单个核炎症细胞＝慢性活动性；而主要是单个核炎症细胞＝慢性。
表9显示了组织学发现。DefA6的表达显示为“-”、“+”、或“++”，而且在一些情况中提供了相应的炎症得分。
表9
  患者   HP编号   组织  DefA6   炎症状态
  115   HP-19891   乙状结肠  +   微观结肠炎
  119   HP-19893   降结肠  -
  122   HP-19898   乙状结肠  -
  124   HP-19899   乙状结肠  -
  125   HP-19900   乙状结肠  NA   这是回肠末端的切片
  125   HP-19901   乙状结肠  -
  130   HP-19905   直肠  -
  131   HP-19906   乙状结肠  -
  135   HP-19908   乙状结肠  -
  136   HP-19909   乙状结肠  -
  222   HP-19912   直肠  +   慢性活动性
  223   HP-19914   乙状结肠  +   慢性
  224   HP-19916   乙状结肠  +   最小限度慢性活动性
  225   HP-19919   乙状结肠  -   无炎症
  226   HP-19920   降结肠   -   无炎症
  227   HP-19922   乙状结肠   +   最小限度慢性活动性
  230   HP-19924   乙状结肠   -   无炎症
  230   HP-19925   直肠   -   无炎症
  231   HP-19926   降结肠   -   急性炎症
  233   HP-19927   乙状结肠   -   无炎症
  234   HP-19928   降结肠   -   最小限度慢性活动性HP
  235   HP-19929   直肠   -   急性炎症
  238   HP-19930   乙状结肠   +   慢性活动性
  239   HP-19932   直肠   +   最小限度慢性
  240   HP-19933   直肠   -   最小限度急性
  241   HP-19934   直肠   -   无炎症
  244   HP-19935   乙状结肠   -   无炎症
  246   HP-19936   乙状结肠   +   最小限度慢性
  247   HP-19937   直肠   +   最小限度慢性
  248   HP-19938   直肠   +   最小限度慢性
  249   HP-19939   直肠   +   慢性活动性
  250   HP-19940   乙状结肠   +   慢性活动性
  251   HP-19941   直肠   +   慢性活动性
  253   HP-19942   乙状结肠   +   慢性活动性
  255   HP-19943   乙状结肠   NA   分段切片(fragmented section)
  256   HP-19944   乙状结肠   +   慢性活动性
  257   HP-19947   直肠   ++   慢性活动性
  258   HP-19948   直肠   +   慢性
  259   HP-19949   乙状结肠   ++   慢性活动性
  260   HP-19950   乙状结肠   +   慢性活动性
  261   HP-19951   乙状结肠   -   轻度急性
  262   HP-19952   乙状结肠   -   急性炎症
  262   HP-19953   直肠   -   无炎症
  263   HP-19954   直肠   -   无炎症
 265   HP-19955   乙状结肠   +   慢性活动性
 266   HP-19956   直肠   +   急性炎症
 267   HP-19957   横结肠   ++   慢性活动性
 270   HP-19958   直肠   -   慢性活动性
 245   HP-19965   乙状结肠   -   无炎症
 245   HP-19966   直肠   -   急性炎症
实施例4：对种系GLI1变异的分析
溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病(CD)是与可观的发病率有关的、高度流行的多基因慢性炎性肠病(IBD)。Hedgehog(HH)信号传导途径在胃肠道发育、稳态和恶性中发挥关键作用。我们在IBD患者中鉴定出GLI1中的一项种种系变异(在IBD2连接区内，12q13)。因为这种IBD相关变体编码功能降低的GLI1蛋白，我们测试了Gli1活性降低的小鼠是否对化学诱发结肠炎易感。使用基因范围单元型标记法，在来自北欧(苏格兰、英格兰和瑞典)的三个独立的IBD患者和健康对照群体(总计超过5000名个体)中检查种系GLI1变异。在log-可能性分析中，在苏格兰和英格兰中，GLI1与IBD有关，主要是UC(p＜0.0001)。强烈涉及GLI1外显子12中的一项非同义SNP(rs2228226C→G)(Q1100E)，合并优势比为1.194(C.I.＝1.09-1.31，p＝0.0002)。在体外在萤光素酶测定法中对GLI1变体测试转录活性。Q1100E落在GLI1 C端附近的一个保守基序内；变体GLI蛋白在体外展现降低的反式激活功能。在互补表达研究中，我们注意到UC患者中的结肠HH应答(包括GLI1、PTCH和HHIP)下调。最后，对Gli1+/-小鼠测试对DSS诱发结肠炎的易感性。记录临床响应、组织学和炎性细胞因子表达。与野生型相比，Gli1+/-小鼠迅速形成严重的肠炎，具有可观的发病率和死亡率。局部髓样细胞显示为HH信号的直接靶物，而且细胞因子表达研究揭示了此模型中IL-12、IL-17和IL-23的有力上调。经由GLI1的HH信号传导是对急性炎症挑战的肠响应的正确调控所需要的。降低的GLI1功能倾向于IBD发病机制，提示新的治疗途径。
溃疡性结肠炎(UC；MIM 191390)和克罗恩氏病(CD；MIM 266600)是高度流行的(在北欧和北美每100,000人中有200-400例[Loftus EV，Jr.(2004)Gastroenterology 126：1504-1517])且与可观的发病率有关的慢性复发性炎性肠病(IBD)。尚未了解准确的病因-发病机制，但是数条证据暗示宿主失调的对肠细菌的响应的中枢重要性[Xavier RJ，Podolsky DK(2007)Nature 448：427-434]。流行病学数据、详细的分子研究、和最近的基因组范围关联研究强烈提示UC和CD是相关多基因疾病，它们共享一些易感性基因座(IL-23R、IL-12B、和NKX2.3[Wellcome Trust Case Control Consortium(2007)Nature447：661-678；Duerr et al.(2006)Science 314：1461-1463；Parkes et al.(2007)Nat Genet Jul；39(7)：830-2.Epub 2007 Jun 6])，但是在其它基因座处不同：NOD2、ATG16L1和IRGM是特异性的CD基因；ECM1基因座与UC有关[Parkeset al.(2007)Nat Genet Jul；39(7)：830-2.Epub 2007 Jun 6；Fisher et al.(2008).Nat Genet 40(6)：710-2.Epub 2008 Apr 27；Hampe et al.(2007)Nat Genet 39：207-211；Hugot et al.(2001).Nature 411：599-603；Ogura Y et al.(2001).Nature411：603-606]。染色体12q13上的IBD2基因座(OMIM 601458)最初在UK基因座范围扫描(D12S83处的峰LOD得分为5.47)中鉴定[Satsangi et al.(1996).Nat Genet 14：199-202]，涉及UC和CD患者二者。后来的研究显示IBD2对UC有重大贡献，特别是广泛的疾病，但是对CD易感性的贡献可能是以一种更加次要的方式[Achkar et al.(2006).Am J Gastroenterol 101：572-580；Parkes Met al.(2000)Am J Hum Genet 67：1605-1610]。定位至IBD2基因座的一种强候选基因是GLI1，三种转导分泌hedgehog(HH)信号的相关GLI转录因子之一。HH信号传导在肠发育、稳态和恶性中是关键的，但是尚未在IBD中仔细研究[Lees et al.(2005)Gastroenterology 129：1696-1710]。在正在发育的肠中，Sonic(SHH)和Indian Hedgehog(IHH)提供自上皮至间充质受体patched(PTCH)的旁分泌信号。PTCH经膜蛋白smoothened(SMO)及锌指转录因子GLI1、GLI2、和GLI3控制HH信号转导来指导组织样式和细胞命运[Madison et al.(2005)Development 132：279-289]。慢性损伤、炎症和修复是IBD的关键方面，因此有关的是，HH途径集中涉及数种其它组织中的这些过程，包括肌肉[Pola et al.(2003)Circulation 108：479-485]、肝[Jung et al.(2008)Gastroenterology 134：1532-1543；Omenetti et al.(2008)Gut May；134(5)：1532-43.Epub 2008 Feb14.]、和肺[Stewart et al.(2003)J Pathol 199：488-495；Watkins et al.(2003)Nature 422：313-317]。确实，HH信号传导可在炎症应答中发挥关键作用，因为SHH对于T淋巴细胞发育[El Andaloussi et al.(2006).Nat Immunol 7：418-426]、成人CD4+T细胞活化[Lowrey et al.(2002)J Immunol 169：1869-1875；Stewart et al.(2002)J Immunol 169：5451-5457]、及脾中髓样细胞成熟[Varas et al.，(2008)J Leukoc Biol Jun；83(6)：1476-83.Epub 2008 Mar 11]是至关重要的。在肠的炎性疾病(包括巴雷特氏食管、慢性胃炎和IBD)中没有记录到HH途径的构件的失调[Nielsen et al.，(2004)Lab Invest 84：1631-1642]。使用结肠镜检查活检的微阵列基因表达分析，我们最近证明了GLI1在发炎的UC中的肠粘膜中与不发炎的样品相比下调[Noble et al.(2008)Gut.Oct；57(10)：1398-405.Epub 2008 Jun 3]。为了进一步探索GLI1和IBD易感性之间可能的关联，我们使用基因范围单元型标记法检查了数个北欧群体中GLI1基因座处的单元型变异。我们鉴定出与IBD的显著关联，强烈暗示GLI1C端区中的非同义SNP。有关变体的体外功能分析展现出GLI1反式激活降低50％，证明了这可能是提高疾病风险的功能性变体。这些发现一起使我们假设剂量降低的功能性GLI1蛋白可能在结肠炎症中发挥重要作用。为了直接检验这一点，我们用葡聚糖硫酸钠(DSS)攻击Gli1+/-小鼠及其野生型(WT)同窝幼仔以诱发急性肠炎。Gli1+/-小鼠迅速形成严重的结肠炎，提示功能性Gli1活性对于小鼠和人类中对炎性刺激的响应是至关重要的。
受试者和样品。表10提供了苏格兰和剑桥IBD群体的详细的人口统计学和表型数据(HC-健康对照；CD-克罗恩氏病；UC-溃疡性结肠炎；IC-结肠炎)。
表10
Figure BPA00001187298700961
基因型测定。苏格兰和瑞典：使用如先前所描述的改良的盐析技术和Nucleon试剂盒自血液样品提取基因组DNA。使用Taqman***获得基因型，供等位基因区分用；所述测定法可作为Taqman SNP基因分型测定法(7900HT序列检测***；Applied Biosystems)得自Applied Biosystems，只是SNP rs10783819、rs3809114、rs507562、rs542278、rs730560、rs1669296、rs775322的基因型在Illumina平台上测定。通过5％案例中的重复分析来检查每次Taqman测定法的准确度，一致性100％。对于所有SNP，对照群体中的基因型分布与Hardy-Weinberg平衡一致(p＞0.01)。对于不能通过获得的那四处SNP，通过直接测序获得基因型。剑桥：使用Nucleon试剂盒提取DNA。使用Taqman双等位基因区分***使用ABI 7900HT分析仪(Applied Biosystems)实施CD病例和对照的基因型测定。使用1536 SNP Golden Gate珠阵列(Illumina)实施UC病例的基因型测定。通过对92个UC病例测定SNP rs2228224和rs2228226的基因型来评估各平台间的一致性，一致率分别为100％和97.9％，而且没有各平台间***性偏倚的证据。对于所有SNP，病例和对照群体中的基因型分布与Hardy-Weinberg平衡一致(p＞0.01)。
通过微阵列和QPCR得到的基因表达。微阵列研究中所使用的患者组由67名UC患者、53名CD患者和31名健康对照(HC)组成。关于人口统计学、微阵列数据集的生成和QPCR方法学，参见[Noble et al.(2008)Gut.Oct；57(10)：1398-405.Epub 2008 Jun 3]。
DSS诱发的结肠炎的诱发和组织学分析。给混合笼中的多组2-4只野生型Gli1+/lacZ或野生型同窝幼仔对照(背景为C57BL/6)在饮水中施用3％DSS4-6天。DSS的消耗量在WT和Gli1+/-动物之间没有显著差异(数据未显示)。Gli1+/-动物趋于比它们的WT同窝幼仔更重(Gli1+/-动物的均值为28g，而WT动物为24g)。因此，与Gli1+/-动物和WT同窝幼仔一起测试用DSS处理的、重量匹配的WT C57B1/6动物(n＝4)。在WT同窝幼仔和重量匹配的C57B1/6之间没有明显差异。每天对所有动物监测腹泻、血便、和体重减轻。临床评分如下：0＝没有症状，1＝腹泻，2＝血便，4＝严重直肠出血和发病到不动/死亡的程度。对于组织学，将所有动物相同长度和位置的一段大肠组织在4％低聚甲醛中固定过夜，脱水，用石蜡渗漏，并以5μm切片。将载玻片用苏木精/曙红染色，并由对组织来源不知情的胃肠病理学家(HA)在组织学上评分。
蛋白质诱变和萤光素酶测定法。自Image克隆#3531657扩增GLI1 E1100，并克隆入pCMVTag2b。GLI1 Q1100是使用QuikChange II定点诱变试剂盒(Stratagene)遵循制造商的方案通过诱导点突变获得的。编码8xGli-萤光素酶、m8x Gli-萤光素酶(突变的Gli位点)和Gli2ΔN的质粒是Andrzej Dlugosz博士的礼物。将293T细胞在12孔板中铺板，用0.7μg/孔转录因子、0.4μg/孔报道质粒、和2ng/孔pRL-TK Renilla(Promega)转染，并在转染后36小时使用双重萤光素酶报道试剂盒(Promega)遵循制造商的方案分析萤光素酶表达。将各孔萤火虫萤光素酶表达相对于Renilla标准化，并通过与单独转染的8xGli-萤光素酶比较来计算倍数变化。
细胞因子表达QPCR。使用Trizol收集全结肠mRNA，接着使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)用DNA酶消化进行RNA清洁。使用iScript cDNA合成试剂盒(Biorad)合成cDNA，并在Biorad iCycler机器上实施SybrGreen QPCR。将表达水平相对于GAPDH标准化，并使用Student氏T检验实施统计分析。
统计分析。使用最大期望算法(expectation-maximization algorithm)推断tSNP的单元型频率，而且这些用于检验单元型频率在病例和对照中是否不同，正如EH和PM程序中所执行的。计算检验统计量2*(In(L病例)+In(L对照)-In(L病例/L对照))，其具有自由度为n-1的χ2分布(其中n＝可能的单元型的数目)，并通过改变数据次序10,000次获得经验p值。使用Haploview程序v3.2(www.hapmap.org)检查单元型。使用χ2或Fisher氏精确检验实施个体SNP分析，在适当时给出双尾p值和以95％置信区间(C.I.)呈现优势比(OR)。使用Mantel-Haenszel法使用固定效应模型(fixed effects model)(R-软件包)实施对SNP rs2228226的元分析(meta-analysis)。在补充方法中提供假阳性报告概率的计算的详情。使用Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis检验分析表达序型，假设所有数据集为非参数分布(GraphPad Prism 4，GraphPad SoftwareInc.)。
结果
GLI1中的基因范围变异与IBD有关，而且可归于苏格兰群体中的非同义SNP(rs2228226)。
鉴定出四项多标志物标记单核苷酸多态性(tSNP；r2≥0.8)(rs3817474，rs2228225，rs2228224，和rs2228226)来描述GLI1的单元型变异，检测频率＞1％的单元型。我们测定了由474名UC和335名CD病例及1364名较好匹配的健康对照组成的苏格兰IBD群体中这4项tSNP的基因型(表10)。然后我们使用无模型分析[Zhao et al.(2000)Hum Hered 50：133-139]来检验GLI1和IBD易感性的关联。在苏格兰群体中，我们证明了IBD(p＜0.0001)和UC(p＜0.0001)中高度显著的关联，及具有边界显著性的与CD的关联(p＝0.03)。在Haploview中的个体估算单元型频率的分析上，描述了3种常见单元型(数据未显示)。通过测定166名CD和170名UC患者中选自II期HapMap数据的另外7项单元型标记SNP的基因型来标记毗邻的块，我们证实了这种效果局限于GLI1基因。这证实了不延伸入毗邻基因(INHBE和ARHGAP9)中的跨越单元型块的GLI1的存在(数据未显示)。
表11显示了苏格兰、英格兰、和瑞典健康对照(HC)、炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)中GLI1非同义SNP rs2228226(tSNP4)的次要等位基因频率。
表11
Figure BPA00001187298700981
Figure BPA00001187298700991
给出了这三个群体每一个中IBD对HC、UC对HC和CD对HC的χ2分析的优势比和双尾p值。图1呈现了这些数据的元分析。补充材料(补充表1和2)详述了所有三个群体中的估算单元型频率和苏格兰群体的全基因型数据。
单元型检验和log-可能性分析的关联很大程度可归于GLI1外显子12中的非同义SNP(rs2228226C→G；tSNP4)。rs2228226与IBD(等位基因频率OR＝1.23，C.I.1.07-1.40，p＝0.0026；纯合子OR＝1.56，C.I.1.15-2.11，p＝0.0047)、CD(等位基因频率OR＝1.30，C.I.1.08-1.55，p＝0.0053，纯合子OR＝1.79，C.I.1.21-2.65，p＝0.0048)和UC(等位基因频率OR＝1.19，C.I.1.01-1.39，p＝0.04)有关(表11和未显示的数据)。这些数据提示优势比纯合子比杂合子患者大的等位基因特异性剂量应答。直接测序对GLI1编码区的突变筛选未能鉴定任何新SNP。来自dbSNP的7种另外的GLI1变体和IBD之间没有关联(数据未显示)。
GLI1关联在两个独立北欧IBD组和元分析中的再现。然后我们试图在其他群体中再现这些发现。在一个来自英格兰剑桥的较大IBD组(n＝928例UC，737例CD，83例不明确的结肠炎和589例HC)中，通过log-可能性分析在IBD(p＝0.009)和UC(p＜0.0001)中再现了与GLI1的关联。在此群体中，rs2228226与IBD(OR 1.17，C.I.1.00-1.36，p＝0.042)和UC(OR 1.21，C.I.1.03-1.42，p＝0.017)有关，但是与CD无关(表11)。正如在苏格兰中的情况，与tSNPs1-3没有关联(数据未显示)。在较小的瑞典组(n＝770)中，有rs2228226与IBD关联的非显著趋向(OR 1.14，C.I.0.90-1.45)(表11)。
图104显示了使用Mantel-Haenszel法以固定效果模型对苏格兰、英格兰和瑞典中的IBD病例和健康对照进行的元分析，证实了与rs2228226的关联(OR 1.194，C.I.1.089-1.309，p＝0.0002)。该元分析使用Mantel-Haenszel法，关于苏格兰、剑桥和瑞典中的非同义GLI1 SNP rs2228226(tSNP4)(n＝5352名个体)。没有3个组之间rs2228226贡献不均一性的证据(p＝0.825)。认识到当前关于遗传关联研究中假阳性发现发表的问题，通过采用Wacholder et al.(2004)J Natl Cancer Inst 96：434-442记载的假阳性报告概率(FPRP)法，我们评估了与GLI1 SNP rs2228226的元分析中找到的疾病风险的关联代表真(而非假阳性)关联的概率。这给出这些发现代表真发现的估算概率为92％(FPRP＜0.08)。这种方法设计成避免过度解读不太可能表示真阳性的统计显著发现，但在我们的研究中给出清楚的支持来解读这些数据。
由rs2228226编码的GLI1变体在体外在激活GLI响应性转录方面是功能缺陷的。rs2228226C-→G是GLI1外显子12中的一项错义突变，编码谷氨酰胺到谷氨酸的变化(Q1100E)。
图105显示了Q1100E破坏GLI1蛋白的保守区且降低GLI1转录活性。A)Gli1蛋白中已知功能域的保守性。示意性显示了先前记载的Sufu结合、DNA结合、和反式激活域[Yoon et al.(1998)J Biol Chem 273：3496-3501；27Kinzler et al.(1988)Nature 332：371-374；Kogerman et al.(1999)Nat Cell Biol 1：312-319]。以数字及通过结构域下面的条的阴影呈现了每个结构域的氨基酸保守性。红框指示已知调节GLI1蛋白质稳定性的区[Huntzicker et al.(2006)Genes Dev 20：276-281]。包括Q1100E的保守C端域毗邻已知的反式激活域。B)哺乳类Gli1蛋白C端的比对。此区(AA 1080-1106)在哺乳类谱系中高度保守。C，D)GLI1 Q1100和E1100在293T细胞中具有相似的细胞定位。E)与GLI1 Q1100相比，GLI1 E1100在驱动激活8xGli-萤光素酶报道物方面是缺陷的。Gli2ΔN是8xGli-萤光素酶的强激活物且充当GLI1激活的阳性对照。m8xGli-萤光素酶构建物只含有突变型Gli结合位点且充当阴性对照。自6项一式三份实验显示的数据是使用两种不同质粒制备物进行的(N＝18)。
突变落在哺乳类GLI1蛋白C端、公认的反式激活域附近的很保守的基序内(图105a)[Yoon et al.(1998)J Biol Chem 273：3496-3501]。Q1100残基自身在所检查的所有哺乳动物中100％保守(图105b)。为了评估Q1100E突变的功能后果，我们将GLI1 Q1100或变体GLI1 E1100转染入293T细胞中。在这些GLI1变体间没有检测到表达水平或细胞定位的差异；这两种蛋白质都易于在转染细胞的核中检测到(图105c-d)。我们进一步评估每种变体激活已充分表征的GLI报道物8xGli-萤光素酶的能力[Saitsu et al.(2005)Dev Dyn 232：282-292]。我们利用GliΔ2N(8xGli-萤光素酶的强激活物)作为GLI1转录活性的阳性对照[Roessler et al.(2005)Hum Mol Genet 14：2181-2188]。虽然这两种GLI1变体都激活8xGli-萤光素酶到基线以上，但是WT GLI1 Q1100作为转录激活物比变体GLI1 E1100更有效两倍多(图105e)。
Hedgehog途径活性在结肠炎症中失调。我们先前报告了在人类中GLI1表达远端结肠比近端结肠高[Noble et al.(2008)Gut.Oct；57(10)：1398-405.Epub 2008 Jun 3]。
图106显示了健康成人结肠(HC)和溃疡性结肠炎(UC)中的Hedgehog(HH)信号传导构件表达。A)Patched(PTCH)、Hedgehog相互作用蛋白(HHIP)、和GLI1 mRNA水平沿着健康成人结肠的长度，自升结肠(AC)至降结肠(DC)和乙状结肠(SC)而升高。B)内腔表面终末分化的肠细胞中的HH蛋白质表达在远端结肠中比在近端中大。C)对Indian hedgehog(IHH)、PTCH、GLI1、和HHIP在UC中的mRNA水平的定量分析，与不发炎的HC相比。为了说明沿着健康结肠(a-b)的长度鉴定出的梯度，只显示了来自SC的数据。呈现IHH的QPCR数据，因为Agilent微阵列芯片上没有此基因。将疾病标本细分成不发炎的(N-I)和发炎的(I)组织。DHH、PTCH2、GLI2、GLI3、SUFU或DISP1在UC或CD中的水平与HC或非IBD炎症相比没有变化(数据未显示)。对SHHmRNA的分析证明了与炎症有关的表达水平的轻度升高，与SHH在炎症细胞中的已知表达一致(数据未显示)[Lowrey et al.(2002)J Immunol 169：1869-1875]。
将各数据点绘图，水平线代表每个数据集的中值。所呈现的P值是自Kruskal-Wallis检验(比较AC、DC和SC中的水平)和Mann-Whitney U检验(UC对HC(N-I))得出的。
对此微阵列数据集的延伸计算机分析现在证明了PTCH和HHIP的mRNA转录物以及HH蛋白反映了这种表达梯度(图106a-b)。GLI1、PTCH和HHIP是途径应答元件，其表达水平预测途径活性。GLI1(p＝0.0003)、PTCH(p＝0.002)、和HHIP(p＝0.0003)在发炎的UC中与来自同等位置的HC相比较低(图106c)。IHH在UC中较低，不管炎症(p＝0.02)。GLI1表达在CD中比HC低(p＝0.004)，不管炎症状态(数据未显示)，鉴于GLI1变异也与苏格兰中的CD有关，这是一项值得注意的发现。PTCH在发炎的CD中与不发炎的CD和HC相比较低(p＝0.007)。GLI1和PTCH二者在非IBD炎症中比HC较低(数据未显示)。这些数据证明了结肠炎症区域中HH途径活性(包括GLI1、PTCH、和HHIP)的总体下调。
Gli1+/-动物响应由3％DSS处理诱发的肠炎展现死亡和升高的发病率。对GLI1 1100E变体的体外分析证明了与WT GLI1相比反式激活功能缺陷50％，而且我们的遗传分析证明了等位基因特异性剂量应答，提示GLI1功能的中等降低足以倾向于肠炎性疾病。为了专门检测这种假说，我们将Gli1+/-小鼠[Park et al.(2000)Development 127：1593-1605]及其WT同窝幼仔用3％DSS处理6天以诱发急性肠炎。Gli1+/-动物受到DSS处理的迅速且严重影响。
图107显示了结果，其中Gli1+/-动物在DSS处理后显示死亡、严重的临床症状、和显著的体重减轻。A)WT动物在6天处理期里100％存活(N＝14)。几乎50％的Gli1+/-动物(4/9)响应6天3％DSS处理死亡。B)Gli1+/-动物在4或6天3％DSS处理后展现比WT动物显著更加严重的症状。1＝腹泻，2＝血性腹泻，4＝严重的出血/死亡。每个点代表动物个体，而实线显示在每个组中观察到的均值。C)Gli1+/-动物(N＝9)比它们的WT同窝幼仔(N＝10)更加迅速地减轻体重。*＝p＜0.05。
6天后，9只中4只死亡，而且幸存者中3只表现严重的发病，有显著的直肠出血和几乎完全不动(图107a)。相反，WT动物(N＝14)在处理后第5和6天无一死亡，都能活动且显示较少的发病。Gli1+/-动物到第4天出现血性腹泻和显著的体重减轻，而WT动物直到第6天才形成临床体征或可测量的体重减轻(图107b-c)。
Gli1+/-动物响应DSS处理形成比WT同窝幼仔更加严重的结肠病理。我们检查了来自Gli1+/-和WT动物、4和6天DSS处理后采集的结肠组织。Gli1+/-动物比WT更加迅速地形成严重的组织损害。
图108显示了Gli1+/-动物响应DSS处理表现比WT同窝幼仔更加严重的肠炎。A)WT动物(N＝4)在4天DSS处理内表现轻度结肠炎症但不形成实质性的上皮或溃疡性炎性病理。B)Gli1+/-动物(N＝4)在4天DSS处理内形成显著的炎性浸润、上皮损伤、和溃疡。C-D)Gli1+/-动物响应3％DSS处理形成广泛的肠炎，在它们的很长一段结肠粘膜中有严重的上皮损伤(N＝9)。E)6天DSS处理后在不知情的情况下对结肠损伤进行的组织学评分。在每只动物中对来自中部结肠和远端降结肠的标准长度的组织评分。Gli1+/-动物(N＝6)具有比WT动物(N＝6)更多的总体炎性病灶和更多的长病灶(10+隐窝单位受影响)。每个点代表在动物个体中观察到的病灶数目；实线显示在每个组中观察到的均值。红点指示分析细胞因子表达的动物。F)固有的粘膜髓样细胞直接响应Hh信号传导且在Gli1+/-动物的稳态结肠中表达LacZ。箭头指示具有LacZ阳性核和Cd11b膜的细胞。
4天后，WT结肠显示炎症变化的证据，但有少数破坏性损害(图108a)，而Gli1+/-小鼠中有显著的广泛炎性浸润和破坏性结肠溃疡(图108b)。6天后，幸存的Gli1+/-动物中的炎症显著地更加严重。Gli1+/-动物中的炎症损害数目(图108e)、尺寸和侵入性(图108c-e)显著更大。总之，这些结果证明了单个Gli1等位基因的损失导致对DSS处理的敏感性升高，反映为严重的肠炎病理和明显的临床体征。
肠髓样细胞直接响应HH信号。我们证明了HH信号传导专门在鼠肠和结肠中旁分泌[Madison et al.(2005)Development 132：279-28914]。利用容许容易显现Hh响应性细胞的Gli1+/lacZ动物，在此我们证实了Gli1在小鼠中的炎症细胞中表达[Park et al.(2000)Development 127：1593-1605]。在静止的成体结肠中，驻留固有层的CD11b阳性髓样细胞表达LacZ，且因此直接响应Hh信号(图108e)。
Gli1+/-动物具有升高的IL-23p19和促炎细胞因子表达。
图109显示了DSS处理后Gli1+/-和WT小鼠的细胞因子分析证明强烈的促炎细胞因子激活。A)6天3％DSS处理后WT和Gli1+/-动物(N＝4)中的细胞因子表达。将相对于GAPDH标准化的细胞因子表达在Y轴(Gli1+/-小鼠)和X轴(WT动物)上绘图。用星号显示了以统计学显著方式变化的基因表达水平。虚线对角线趋势线指示WT和Gli1+/-小鼠之间相同的表达水平。B)显示Gli1+/-动物中与WT对照相比的平均细胞因子表达、标准偏差、和倍数变化的表(*＝p＜0.05)。数种促炎细胞因子在Gli1+/-动物中上调，但是抗炎细胞因子大多没变化。
对6天DSS后采集的全结肠组织进行的细胞因子表达QPCR检查证实了组织学和临床数据；Gli1+/-动物与WT相比展现非常显著的炎症(图109)。我们检测在Gli1+/-动物中检测到TH1细胞因子(包括IFNγ)的强烈表达，鉴于这些动物中炎症的严重程度和DSS诱发的结肠炎中TH1细胞的突出性，这并不令人惊讶。我们没有检测到Gli1+/-和WT动物之间TGFβ和IL-10的显著差异，提示抗炎细胞因子的下调不是此模型中炎症增强的主要机制。Gli1+/-动物中最高度表达的细胞因子是IL-23p19，已知它驱动TH17淋巴细胞的分化，TH17淋巴细胞是数种***(包括IBD)中炎症的关键介导物[Hue et al.(2006)J Exp Med 203：2473-2483；Yen et al.(2006)J Clin Invest 116：1310-1316]。IL-12和IL-17(与IL-23密切相关的细胞因子)在Gli1+/-动物中也上调。这些数据是特别重要的，因为最近将IL-23途径与人类[Duerr et al.(2006)Science 314：1461-1463]和小鼠[Yen et al.(2006)J Clin Invest 116：1310-1316]二者中的IBD发病机制有力地联系起来。我们的数据提供了这种关键炎症途径与用降低的GLI1剂量或功能看到的强烈炎症之间的潜在联系。
讨论
在此呈现的数据提供了第一条证据来证明完整的HH信号传导在哺乳动物对炎症挑战的肠响应中是至关重要的，而且降低的GLI1功能涉及IBD发病机制。我们证实了HH信号传导途径在人类中的结肠炎症中下调。我们鉴定了一种与UC/IBD高度相关的具体GLI1变体，而且证明了该变体蛋白质在体外作为转录激活物是功能缺陷的。最后，我们证明了鼠Gli1降低50％导致升高的对DSS的肠炎应答，伴有IL-23途径显著上调。这些发现不仅清楚暗示对IBD发病机制的理解及治疗性干扰的可能，它们还首次清楚描述了HH信号传导和GLI1在肠炎中的功能作用。在苏格兰和英格兰二者中，GLI1基因中我们检测到的继承变异与IBD和UC有关，通过对超过5000名个体的元分析证实了关于rs2228226的发现，优势比为1.19。在本研究中看到了在CD中的影响的证据，但是主要的影响清楚地与UC有关。这种关联的程度完全符合多项最近的复杂疾病遗传学研究(包括CD、结肠直肠癌[Tenesa et al.(2008)NatGenet 40：631-637]、和腹部疾病[Hunt et al.(2008)Nat Genet 40：395-402])中记录的影响大小。所获得的显著性水平满足为基因-中心研究提议的标准，p＜10-4-10-6[Burton et al.(2007)Nat Genet 39：1329-1337；Thomas et al.(2004)J Natl Cancer Inst 96：421-423]。所研究的三个北欧群体先前证明了其它IBD易感性基因/基因座的相似贡献，包括NOD2和IBD5[Gaya et al.(2006)Lancet367：1271-1284]。虽然这项SNP的次要等位基因频率在苏格兰和瑞典中非常相似(30.3％和30.6％)，但它们在苏格兰和剑桥之间相差3.9％(30.3％和26.4％)。这种差异与对最近的WTCCC研究中为群体分层而分析的多项SNP所记录到的一致[Wellcome Trust Case Control Consortium(2007)Nature 447：661-678]。虽然我们再次测序的努力将rs2228226鉴定为与IBD有关的唯一编码变体，但是单元型分析和log-可能性分析提出了其它种系变体也可促成IBD风险的可能性。这些需要正式探索-具体是内含子变体、远程启动子效应和/或拷贝数变异。在此语境中，数种复杂疾病基因(包括NOD2[Hugot etal.(2001).Nature 411：599-603；Ogura Y et al.(2001).Nature 411：603-606])具有赋予疾病风险的多项独立突变，一些疾病基因在编码序列中没有原因性质的突变(例如CD中的IRGM[Parkes et al.Am J Hum Genet.2000；67：1605-16105])，而且同义SNP可能与功能效果有关[Kimchi-Sarfaty etal.(2007)Science 315：525-528]。rs2228226C→G编码谷氨酰胺变成谷氨酸的变化(Q1100E)。我们的体外数据证明了GLI1 1100E与WT GLI1相比是次功能性转录激活物，尽管它是适当合成和定位的。Q1100E突变引起紧临GLI1已知反式激活区的保守区中的显著电荷变化；这种变化能直接改变反式激活活性，破坏反式激活域的结构，或影响蛋白质稳定化[Huntzicker et al.(2006)Genes Dev 20：276-281]，从而降低活性。我们的数据提示GLI1活性或量的降低也产生有力的表型。只有Gli1 WT水平50％的Gli1+/-动物响应中等刺激迅速形成严重的炎症。这些数据(就我们所知，是对Gli1功能降低的表型的首次描述)[Park et al.(2000)Development 127：1593-1605]证明了Hh应答的完全补足在免于炎性疾病的保护中发挥的关键作用。另外，我们的体外数据证明了GLI1 E1100能够激活一些Gli应答，提示在稳态条件下，GLI1 E1100能充分执行。然而，与Gli1+/-动物中的情况相似，在炎症应激的条件下，GLI1 E1100只能发挥WT GLI1水平50％的功能。还不清楚这些***中对炎症的素因是炎症细胞内HH信号转导降低的直接结果，抑或反映较低HH信号对基质靶细胞的效果，基质靶细胞继而释放影响上皮层完整性的信号。解决这个问题会是未来研究的一条关键途径。我们显示了HH途径可经由达到髓样靶细胞的信号传导直接改变先天免疫应答。这项发现与最近证明Hh信号传导在脾中髓样细胞成熟中的关键作用的数据一致[Varas et al.，(2008)J Leukoc BiolJun；83(6)：1476-83.Epub 2008 Mar 1123]。有趣的是，髓样细胞群能经由对IL-23/IL-17途径的重大影响来差异改变肠炎环境[Denning et al.(2007)NatImmunol 8：1086-1094]。总之，我们的证明Gli1/-动物中DSS处理后先天免疫群的直接HH应答和升高的IL-23的发现提示HH信号传导在正常情况中可在粘膜髓样细胞中促进致耐受性表型；降低的HH信号转导可改为在这些细胞中触发炎症应答。
总之，我们在此首次证明了IBD中发育信号传导途径的改变的表达，打开了新的研究路线。此外，我们显示了这些效果是部分由遗传决定的，有证据暗示GLI1是IBD2基因，而且鉴定了一种具有降低的转录活性的特定变体。Gli1的功能相关性通过在已建立的小鼠结肠炎模型中面对Gli1浓度降低50％时形成的严重肠炎得到了证明。综合起来，这些数据强烈支持有力的HH途径激活在肠粘膜对炎性刺激的保护应答中的重要性。这些发现对UC的发病机制及可能对其它形式的慢性炎症有重要暗示[Lees et al.(2006)Gastroenterology 131：1657-1658]。
实施例5：来自全血样品的IBD基因表达序型
来自人内窥镜检查结肠活检的基因组范围表达序型开始帮助在细胞水平剖析IBD中的致病炎症途径(Noble CL et al.Gut，2008 Jun 3.[电子公开在印刷之前])。全血基因组范围表达序型可补充常规内窥镜检查技术来帮助IBD-克罗恩氏病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)的诊断。这项研究的目的是调查全血基因表达序型来试图区分IBD-CD、UC患者和对照(HC)。
患者。研究了21名UC、19名CD、和10名对照(HC)。UC患者中2人是新诊断的，15人具有静止疾病，4人具有活动性疾病。在CD中，调查了1例新诊断、11例静止疾病和7例活动性疾病。
方法。使用Agilent平台在50份全血样品中分析了41058种表达序列标签(代表33296种基因)。使用自动物组织分离总RNA的微量方案(Qiagen，Valencia，CA)自血液提取总RNA。进行T7RNA聚合酶单轮线性扩增以将花青-3和花青-5标记物掺入cRNA。将样品于60℃在恒速旋转中杂交18小时。依照制造商的方案，清洗微阵列，干燥，并在Agilent扫描仪上扫描。使用Agilent的7.5版特征提取软件分析微阵列图像文件。使用Stratagene通用人类参照将基因标准化。
对所有IBD和HC患者、及表达的倍数变化＞或＜1.5的探针使用聚簇分析，HC患者在树形图的一侧上更流行，1/21比9/29(p＝0.02 OR 1.8)(数据未显示)。没有观察到CD和UC样品分布的差异。在将所有IBD样品与对照比较时，493种序列具有大于1.5的倍数变化(1.7x10-41＜p＜0.01)，而595种序列具有小于1.5的倍数变化(4.0x10-40＜p＜0.01)。在比较CD和UC时，293种序列具有大于1.5的倍数变化(5.4x10-27＜p＜0.01)，而301种序列具有小于1.5的倍数变化(5.2x10-18＜p＜0.01)。
通过使用一组10种上调的和下调的基因序列，我们能够以＞90％的灵敏度自对照预测IBD样品。下文表12列举了20中与对照相比在IBD中差异调节的基因。
表12
  序列名称   序列代码   倍数变化   P值
  LOC342959(AARDC5)   A_32_P30271   4.92527   8.62E-18
  A_24_P910246(ATXN3L)   A_24_P910246   2.92405   1.41E-07
  LOC92552(FSHR)   A_23_P361744   2.78494   4.12E-13
  PDGFRA   A_23_P332536   2.7178   0.00004
  TGFB3   A_24_P373096   2.67234   5.89E-09
  KCTD8   A_23_P94902   2.65574   0.00005
  TGM4   A_23_P41241   2.64262   0.0005
  NYD-SP25   A_24_P309216   2.62905   7.76E-15
  FLJ33651   A_24_P306032   2.62873   0.0034
  EMX2OS   A_24_P892472   2.55683   0.00029
  WNT16   A_23_P134601   -2.96773   3.46E-10
  SPRED2   A_24_P315535   -2.97751   3.12E-16
  MGC50721(C16orf65)   A_23_P412508   -3.06148   0.0088
  C12orf2   A_24_P78556   -3.17916   0.0129
  MPDZ   A_23_P396328   -3.19437   1.87E-40
  FARS2   A_24_P456422   -3.35391   0.00097
  CASP8   A_24_P157087   -3.41412   3.90E-09
  NT5E   A_24_P316430   -3.63046   0
  TDGF3   A_24_P179646   -3.71928   7.31E-23
  BTNL3   A_23_P158297   -5.22514   2.09E-12
全血基因组范围表达签名为区分IBD患者和对照提供起点，而且这可提供IBD诊断的补充诊断证据。

Claims (45)

1.一种诊断哺乳动物受试者中炎性肠病(IBD)的存在的方法，包括确定自所述受试者获得的测试样品中编码SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、194、197、199、201、203、205、207、和230任一所示多肽的核酸的表达水平相对于对照中的表达水平较高，其中所述较高水平的表达指示获得测试样品的受试者中IBD的存在。
2.一种诊断哺乳动物受试者中炎性肠病(IBD)的存在的方法，包括确定自所述受试者获得的测试样品中编码SEQ ID NO：108、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、211、213、215、217、219、221、223、225、和228任一所示多肽的核酸的表达水平相对于对照中的表达水平较低，其中所述较低水平的表达指示获得测试样品的受试者中IBD的存在。
3.权利要求1或2的方法，其中所述哺乳动物受试者是人受试者。
4.权利要求3的方法，其中所述表达水平的证据是通过基因表达序型分析的方法获得的。
5.权利要求3的方法，其中所述方法是基于PCR的方法。
6.权利要求4的方法，其中所述表达水平是相对于一种或多种参照基因或其表达产物的表达水平标准化的。
7.权利要求1或2的方法，包括确定至少两种所述基因或其表达产物的表达水平的证据。
8.权利要求1或2的方法，包括确定至少三种所述基因或其表达产物的表达水平的证据。
9.权利要求1或2的方法，包括确定至少四种所述基因或其表达产物的表达水平的证据。
10.权利要求1或2的方法，包括确定至少五种所述基因或其表达产物的表达水平的证据。
11.权利要求1或2的方法，进一步包括创建汇总所述IBD检测的报告的步骤。
12.权利要求1或2的方法，其中所述IBD是溃疡性结肠炎。
13.权利要求1或2的方法，其中所述IBD是克罗恩氏病。
14.权利要求1或2的方法，其中所述IBD是溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。
15.权利要求1或2的方法，其中所述测试样品来自结肠组织活检。
16.权利要求15的方法，其中所述活检来自选自下组的组织：回肠末端、升结肠、降结肠、和乙状结肠。
17.权利要求15的方法，其中所述活检来自发炎的结肠区域。
18.权利要求15的方法，其中所述活检来自不发炎的结肠区域。
19.权利要求1或2的方法，其中所述确定步骤指示所述哺乳动物受试者中IBD的复发，且其中所述哺乳动物受试者先前诊断有IBD并为所述先前诊断的IBD接受过治疗。
20.权利要求19的方法，其中所述治疗包括手术。
21.权利要求1或2的方法，其中所述确定步骤指示所述哺乳动物受试者中所述IBD的突发。
22.一种治疗有所需要的哺乳动物受试者中炎性肠病(IBD)的方法，该方法包括下列步骤：
(a)确定自所述受试者获得的测试样品中编码SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、194、197、199、201、203、205、207、和230任一所示多肽的核酸的表达水平相对于对照中的表达水平较高，其中所述较高水平的表达指示获得测试样品的受试者中IBD的存在；并
(b)对所述受试者施用有效量的IBD治疗剂。
23.一种治疗有所需要的哺乳动物受试者中炎性肠病(IBD)的方法，该方法包括下列步骤：
(a)确定自所述受试者获得的测试样品中编码SEQ ID NO：108、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、211、213、215、217、219、221、223、225、和228任一所示多肽的核酸的表达水平相对于对照中的表达水平较低，其中所述较低水平的表达指示获得测试样品的受试者中IBD的存在；并
(b)对所述受试者施用有效量的IBD治疗剂。
24.权利要求22或23的方法，其中所述哺乳动物受试者是人受试者。
25.权利要求24的方法，其中所述表达水平的证据是通过基因表达序型分析的方法获得的。
26.权利要求24的方法，其中所述方法是基于PCR的方法。
27.权利要求25的方法，其中所述表达水平是相对于一种或多种参照基因或其表达产物的表达水平标准化的。
28.权利要求22或23的方法，包括确定至少两种所述基因或其表达产物的表达水平的证据。
29.权利要求22或23的方法，包括确定至少三种所述基因或其表达产物的表达水平的证据。
30.权利要求22或23的方法，包括确定至少四种所述基因或其表达产物的表达水平的证据。
31.权利要求22或23的方法，包括确定至少五种所述基因或其表达产物的表达水平的证据。
32.权利要求22或23的方法，进一步包括创建汇总所述IBD检测的报告的步骤。
33.权利要求22或23的方法，其中所述IBD是溃疡性结肠炎。
34.权利要求22或23的方法，其中所述IBD是克罗恩氏病。
35.权利要求22或23的方法，其中所述IBD是溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。
36.权利要求22或23的方法，其中所述测试样品来自结肠组织活检。
37.权利要求36的方法，其中所述活检来自选自下组的组织：回肠末端、升结肠、降结肠、和乙状结肠。
38.权利要求36的方法，其中所述活检来自发炎的结肠区域。
39.权利要求36的方法，其中所述活检来自不发炎的结肠区域。
40.权利要求22或23的方法，其中所述确定步骤指示所述哺乳动物受试者中IBD的复发，且其中所述哺乳动物受试者先前诊断有IBD并为所述先前诊断的IBD接受过治疗。
41.权利要求40的方法，其中所述治疗包括手术。
42.权利要求22或23的方法，其中所述确定步骤指示所述哺乳动物受试者中所述IBD的突发。
43.权利要求22或23的方法，其中所述IBD治疗剂是氨基水杨酸盐。
44.权利要求22或23的方法，其中所述IBD治疗剂是皮质类固醇。
45.权利要求22或23的方法，其中所述IBD治疗剂是免疫抑制剂。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103336914A (zh) * 2013-05-31 2013-10-02 中国人民解放军国防科学技术大学 一种提取荟萃生物标志物的方法及装置
CN108893488A (zh) * 2018-06-19 2018-11-27 刘志强 一种重组质粒、dna疫苗及其制备方法和应用
CN109477145A (zh) * 2016-07-05 2019-03-15 剑桥企业有限公司 炎症性肠病的生物标志物
CN110241116A (zh) * 2019-05-21 2019-09-17 中国医学科学院放射医学研究所 一种环状rna及在促进dna损伤修复中的应用
CN110577953A (zh) * 2018-06-11 2019-12-17 深圳华大生命科学研究院 基因突变体及其应用
WO2020000436A1 (zh) * 2018-06-29 2020-01-02 深圳市博奥康生物科技有限公司 一种特异靶向人INDO基因的gRNA导向序列及其应用
CN110719960A (zh) * 2017-03-23 2020-01-21 梅哈里医学院 用于诊断和治疗炎性肠病的方法
CN111936508A (zh) * 2018-03-29 2020-11-13 横向知识产权私人有限公司 环肽及其用途

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2768711A1 (en) * 2009-07-20 2011-01-27 Genentech, Inc. Gene expression markers for crohn's disease
WO2011042030A1 (en) * 2009-10-06 2011-04-14 Tallinn University Of Technology Inhibition or activation of serine/threonine ulk3 kinase activity
WO2011127351A1 (en) * 2010-04-09 2011-10-13 Exagen Diagnostics, Inc. Biomarkers for ulcerative colitis and crohn's disease
MX2012014096A (es) * 2010-06-04 2013-04-19 Nestec Sa Métodos para mejorar el diagnóstico de enfermedad intestinal inflamatoria.
KR101394197B1 (ko) * 2012-08-17 2014-05-30 관동대학교산학협력단 염증성 장 질환과 연관된 단일염기다형성 정보를 제공하는 방법
WO2014139182A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Shenzhen Hightide Biopharmaceutical, Ltd. Compositions and methods of using islet neogenesis peptides and analogs thereof
EP3736340A1 (en) * 2014-08-28 2020-11-11 The Provost, Fellows, Foundation Scholars, and The Other Members of Board, of The College of The Holy and Undivided Trinity of Queen Elizabeth Methods and kit for identification of cancer
JP6192177B2 (ja) * 2015-05-25 2017-09-06 ヤマサ醤油株式会社 炎症性腸疾患のバイオマーカーとしてのｓ１００ａ９の使用
KR102464372B1 (ko) * 2016-03-17 2022-11-04 세다르스-신나이 메디칼 센터 Rnaset2를 통한 염증성 장 질환의 진단 방법
US20210278417A1 (en) * 2017-06-20 2021-09-09 Meharry Medical College Targeted hd5 antibody and assay methods for diagnosing and treating inflammatory bowel disease
US20210262032A1 (en) * 2018-07-15 2021-08-26 Rambam Med-Tech Ltd. Determining responders to inflammation treatment
US20210057050A1 (en) 2019-08-23 2021-02-25 Insilico Medicine Ip Limited Workflow for generating compounds with biological activity against a specific biological target

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001029269A2 (en) * 1999-10-21 2001-04-26 Case Western Reserve University Gene expression profiling of inflammatory bowel disease
US20030198640A1 (en) * 1994-11-07 2003-10-23 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for treating inflammatory bowel diseases relating to human tumor necrosis factor-gamma-beta
WO2006063133A2 (en) * 2004-12-06 2006-06-15 The Johns Hopkins University Biomarker for inflammatory bowel disease

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
DE69029036T2 (de) 1989-06-29 1997-05-22 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
CA2102511A1 (en) 1991-05-14 1992-11-15 Paul J. Higgins Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
ATE160486T1 (de) 1991-08-12 1997-12-15 Nestle Sa Nahrungsmittelzusammensetzung
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
DE69333082T2 (de) 1992-02-11 2004-05-06 Cell Genesys, Inc., Foster City Erzielen von homozygotem durch zielgerichtete genetische ereignisse
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
AU668423B2 (en) 1992-08-17 1996-05-02 Genentech Inc. Bispecific immunoadhesins
US6283761B1 (en) 1992-09-08 2001-09-04 Raymond Anthony Joao Apparatus and method for processing and/or for providing healthcare information and/or healthcare-related information
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
CA2223198A1 (en) 1997-01-14 1998-07-14 Societe Des Produits Nestle S.A. Composition and method for treatment of inflammatory conditions of the gastro-intestinal tract
US20010010924A1 (en) * 1997-03-14 2001-08-02 Keith Charles Deen Tumor necrosis factor related receptor, tr6 polynecleotides
JP2003512020A (ja) * 1999-03-04 2003-04-02 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド 腫瘍壊死因子レセプター６αおよび腫瘍壊死因子レセプター６β
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
GB0130955D0 (en) 2001-12-24 2002-02-13 Cancer Res Ventures Expression system
WO2003064621A2 (en) 2002-02-01 2003-08-07 Ambion, Inc. HIGH POTENCY siRNAS FOR REDUCING THE EXPRESSION OF TARGET GENES
US7526387B2 (en) 2003-07-10 2009-04-28 Genomic Health, Inc. Expression profile algorithm and test for cancer prognosis
WO2007081486A2 (en) * 2005-12-15 2007-07-19 Ventria Bioscience Oral administration of defensins to treat intestinal diseases
US20110177502A1 (en) * 2008-02-19 2011-07-21 Hakon Hakonarson Identification of pediatric onset inflammatory disease loci and methods of use thereof for the diagnosis and treatment of the same

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030198640A1 (en) * 1994-11-07 2003-10-23 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for treating inflammatory bowel diseases relating to human tumor necrosis factor-gamma-beta
WO2001029269A2 (en) * 1999-10-21 2001-04-26 Case Western Reserve University Gene expression profiling of inflammatory bowel disease
WO2006063133A2 (en) * 2004-12-06 2006-06-15 The Johns Hopkins University Biomarker for inflammatory bowel disease

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CLAUDIO ET AL: "Expression of the genes dualoxidase2,lipocalin 2 and regenerating islet-derived 1 alpha in Crohn’s disease", 《SCAND J GASTROENTEROL》 *
LAWRANCE I C ET AL: "Ulcerative colitis and Crohn"s disease:distinctive gene expression profiles and novel susceptibility candidate genes", 《HUMAN MOLECULAR GENETICS》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103336914A (zh) * 2013-05-31 2013-10-02 中国人民解放军国防科学技术大学 一种提取荟萃生物标志物的方法及装置
CN103336914B (zh) * 2013-05-31 2016-05-25 中国人民解放军国防科学技术大学 一种提取荟萃生物标志物的方法及装置
CN109477145B (zh) * 2016-07-05 2021-04-09 剑桥企业有限公司 炎症性肠病的生物标志物
CN109477145A (zh) * 2016-07-05 2019-03-15 剑桥企业有限公司 炎症性肠病的生物标志物
CN110719960A (zh) * 2017-03-23 2020-01-21 梅哈里医学院 用于诊断和治疗炎性肠病的方法
CN110719960B (zh) * 2017-03-23 2024-03-08 梅哈里医学院 用于诊断和治疗炎性肠病的方法
CN111936508A (zh) * 2018-03-29 2020-11-13 横向知识产权私人有限公司 环肽及其用途
CN110577953A (zh) * 2018-06-11 2019-12-17 深圳华大生命科学研究院 基因突变体及其应用
CN110577953B (zh) * 2018-06-11 2024-02-20 深圳华大生命科学研究院 基因突变体及其应用
CN108893488A (zh) * 2018-06-19 2018-11-27 刘志强 一种重组质粒、dna疫苗及其制备方法和应用
WO2020000436A1 (zh) * 2018-06-29 2020-01-02 深圳市博奥康生物科技有限公司 一种特异靶向人INDO基因的gRNA导向序列及其应用
CN110241116A (zh) * 2019-05-21 2019-09-17 中国医学科学院放射医学研究所 一种环状rna及在促进dna损伤修复中的应用
CN110241116B (zh) * 2019-05-21 2023-02-07 中国医学科学院放射医学研究所 一种环状rna及在促进dna损伤修复中的应用

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