CN108893488A - 一种重组质粒、dna疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

一种重组质粒、dna疫苗及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108893488A
CN108893488A CN201810632254.3A CN201810632254A CN108893488A CN 108893488 A CN108893488 A CN 108893488A CN 201810632254 A CN201810632254 A CN 201810632254A CN 108893488 A CN108893488 A CN 108893488A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tnfaip3
group
pvax1
dna vaccination
recombinant plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810632254.3A
Other languages
English (en)
Inventor
胡田勇
胡文会
邱书奇
耿晓瑞
马莉
刘江琦
刘志强
杨平常
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Otorhinolaryngology Institute
Original Assignee
Shenzhen Otorhinolaryngology Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Otorhinolaryngology Institute filed Critical Shenzhen Otorhinolaryngology Institute
Priority to CN201810632254.3A priority Critical patent/CN108893488A/zh
Publication of CN108893488A publication Critical patent/CN108893488A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Abstract

本发明公开了一种特异性治疗IBD的重组质粒、DNA疫苗及其制备方法和应用。本发明的实验过程中，经DNA疫苗给药的治疗组的IBD模型小鼠的结肠黏膜损伤程度明显降低，肠炎疾病活动指数评分低于模型组，而模型组肠道促炎症因子TNF‑α、IL‑6增加，CD4+CD25+Foxp3+的T细胞低于pVAX1‑TNFAIP3治疗组。同时，治疗组相关蛋白的磷酸化水平显著低于模型组，表明pVAX1‑TNFAIP3可以通过抑制相关炎症信号通路的活化，抑制炎症的发生；另外，结肠内Foxp3蛋白上调，表明pVAX1‑TNFAIP3可通过上调调节性T细胞的增加来抑制炎症的发生。这些都证实了pVAX1‑TNFAIP3重组质粒及制得的DNA疫苗对炎性肠病具有良好的治疗效果。

Description

一种重组质粒、DNA疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种重组质粒、DNA疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
炎性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种常见的慢性非特异性肠道疾病，根据临床和病理学特点分为两类：溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)。近年来，随着人民生活水平的提高和环境的污染，IBD发病率和患病率在我国呈明显增长趋势，严重影响患者生活和工作，给社会、经济带来巨大负担。IBD的病因目前尚未明了，一般认为与遗传易感性、免疫炎症、肠道菌群和精神心理因素等有关。其中，发病机制的关键可能是免疫***针对肠道菌群及食物抗原的异常免疫反应，导致大量的炎性因子在肠道局部聚集引起的炎症损伤。
IBD目前的治疗药物包括水杨酸制剂、糖皮质激素及一些免疫抑制剂类药物，但缺乏特异性的治疗手段，因此寻找新的治疗手段已经成为了国内外研究的热点和难点。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性治疗IBD的重组质粒、DNA疫苗及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种重组质粒，包括TNFAIP3基因和真核表达载体pVAX1，所述TNFAIP3基因的GenBank登录号为KJ892292.1。
上述重组质粒的制备方法，具体步骤如下：将包含TNFAIP3基因的片段***到载体pVAX1的EcoR Ⅰ和EcoR V酶切位点间。
上述重组质粒在制备预防和治疗炎性肠病的药物中的应用。
一种DNA疫苗，包括上述重组质粒。
优选的，该DNA疫苗为多相乳液。
优选的，还包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙烯醇。
一种DNA疫苗的制备方法，具体步骤如下：
取聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于有机溶剂中，形成有机相；
取上述重组质粒的溶液，与所述有机相混合形成乳液；
将该乳液与聚乙烯醇水溶液混合，形成多相乳液。
通过该制备方法得到的W1/O/W2型多相乳液可以直接用于结肠给药，直接作用于IBD病理部位，无需肌肉注射。
优选的，该多相乳液加入去离子水，待有机溶剂挥发后，离心，收集沉淀。
上述方法制得的DNA疫苗。
上述DNA疫苗在制备预防和治疗炎性肠病中的应用。
本发明的有益效果是：
经本发明的DNA疫苗给药的IBD模型小鼠的结肠黏膜损伤程度明显降低，肠炎疾病活动指数评分低于模型组，表明pVAX1-TNFAIP3对诱导的结肠炎有预防和治疗作用。模型组肠道促炎症因子TNF-α、IL-6增加，CD4+CD25+Foxp3+的T细胞低于pVAX1-TNFAIP3干预组。同时，干预组相关蛋白的磷酸化水平显著低于模型组，表明pVAX1-TNFAIP3可以通过抑制相关炎症信号通路的活化，抑制炎症的发生；另外，结肠内Foxp3蛋白上调，表明pVAX1-TNFAIP3可通过上调调节性T细胞的增加来抑制炎症的发生。这些都证实了pVAX1-TNFAIP3对炎性肠病具有良好的治疗效果。
附图说明
图1是本发明的一个实施例中IBD模型小鼠的构建及用药时间安排图。
图2是本发明的图1的实施例中pVAX1-TNFAIP3体外质粒构建及纳米包装结果图。其中图1A为双酶切的结果，图1B是测序结果、图1C为纳米包装的电镜结果、图1D(Ⅰ)和图1D(Ⅱ)为体外转染293T细胞的结果。
图3是本发明的图1的实施例中对照组、模型组、干预组、空载组和阳性对照组小鼠的体重变化图。
图4是本发明的图1的实施例中对照组、模型组、干预组、空载组和阳性对照组小鼠的DAI评分结果。
图5是本发明的图1的实施例中的小鼠结肠对比图，从左到右分别是对照组、模型组、干预组、空载组和阳性对照组。
图6是本发明的图1的实施例中的HE染色图(200×)，5A、5B、5C、5D、5E分别代表对照组、模型组、干预组、空载组和阳性对照组。
图7是本发明的图1的实施例中对照组、模型组、干预组、空载组和阳性对照组小鼠的结肠IL-4、IL-6、IFN-γ和TIM1的表达情况图。
图8是本发明的图1的实施例中正常组、模型组、干预组、空载组和阳性对照组小鼠的脾单核细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例图；
图9是本发明的图1的实施例中正常组、模型组、干预组、空载组和阳性对照组小鼠结肠组织中炎症信号通路蛋白表达情况图。
图10是本发明的图1的实施例中正常组、模型组、干预组、空载组和阳性对照组小鼠结肠组织中Foxp3蛋白表达情况图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。
实施例1
1.实验方法
试验动物及分组
选用雌性，6-8周龄，C57BL/6健康小鼠30只，购于广东省医学实验动物中心。随机分成5组，每组6只，分为对照组、模型组、干预组、空载组和阳性对照组，每组试验动物的处理方式如表1所示。每周记录两次体重，观察小鼠粪便，用于评判小鼠DIA指数；每周的第七天(也即7,14,21,42,49天)，收集粪便用于检测隐血实验；最后小鼠眼球取血，用于检测相关的炎症因子，小鼠结肠用于RNA提取、蛋白质提取以及HE染色，本实验采用葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium salt，DSS)(货号：216011080)对小鼠进行造模，具体用量及时间安排见图1。
表1.试验动物分组及处理情况
重组质粒(pVAX1-TNFAIP3真核表达载体)的构建
扩增TNFAIP3(GenBank：KJ892292.1)的基因编码序列，通过EcoRⅠ的酶切位点(GAATTC)和EcoR V的酶切位点(GATATC)构建到pVAX1载体上，最后通过筛选，提取质粒并送测序公司测序，验证pVAX1-TNFAIP3真核表达载体准确性；扩增mCherry-TNFAIP3的基因编码序列，并通过EcoRⅠ的酶切位点(GAATTC)和Xbal的酶切位点(TCTAGA)构建到载体中以建立pVAX1-mcherry-TNFAIP3真核表达载体，最后通过筛选，提取质粒并送测序公司测序，验证pVAX1-mcherry-TNFAIP3真核表达载体准确性。在直肠给16h前，以聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚乙烯醇为包载材料，采用超声乳化法，制备pVAX1-TNFAIP3和pVAX1-mcherry-TNFAIP3纳米粒子；其中pVAX1-TNFAIP3用于治疗，pVAX1-mcherry-TNFAIP3用于体外验证TNFAIP3蛋白可以在细胞内表达。pVAX1-TNFAIP3体外质粒构建结果见图2。
引物根据(GenBank：KJ892292.1)的基因编码序列设计，委上海生工生物工程有限公司合成，具体引物信息见下：
TNFAIP3扩增引物：
上游引物SEQ NO.2：CGGAATTCCACCATGGCTGAACAAGT；
下游引物SEQ NO.3：CCGGATATCTTA GCCATACATCTGC。
mCherry-TNFAIP3扩增引物：
上游引物SEQ NO.4：CGGAATTCCACCATGGCTGAACAAGT；
下游引物SEQ NO.5：GCTCTAGAGCTTACTTGTACAGCTCG。
pVAX1-TNFAIP3和pVAX1-mcherry-TNFAIP3构建过程中的CDS序列分别如SEQNO.6-7。
pVAX1-TNFAIP3 DNA疫苗的制备
取100mg的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于900μL二氯甲烷与100μL丙酮中，形成有机相；取10μL溶于无菌超纯水的pVAX1-TNFAIP3质粒(溶液浓度为1μg/μL)，作为内水相；将有机相和内水相两相混合，在冰水浴中，超声破碎20次(功率为40W，间歇时间/连续工作时间为6s/6s)，形成乳液；在乳液中注入2mL的2％聚乙烯醇水溶液作为外水相，再次超声(功率为40W，间歇时间/连续工作时间为6s/6s)，形成多相复乳(可在搅拌时边加入)。在多项复乳中加入50mL去离子水，室温搅拌(或旋转蒸发)4h至有机溶剂完全挥发；4℃条件下进行20min离心(转速为10000rpm)，收集沉淀，无菌水洗3次；冻干，-80℃保存，待用。pVAX1-TNFAIP3质粒的纳米包装见图2。
IBD模型的制备
对照组小鼠饮用无菌水，除对照组外的其他四组于1、4、7周用2％DSS溶解于无菌水后，自由饮水。第-3、4、18、24、39、45天，通过灌肠器灌进相应的药物(干预组：pVAX1-TNFAIP3 20μg/只，空载组：pVAX1 20μg/只，阳性对照组：按62.5mg/kg用药)，用药时间排表见图1。模型制备中使用的pVAX1-TNFAIP3可以是上文制备过程中的多相乳液，可以将该乳液直接用于结肠给药，直接作用于IBD病理部位，无需肌肉注射。也可以使用沉淀后的纳米粒子进行结肠给药，进行特异性治疗。
2.实验结果
模型构建情况
分别对五组小鼠的体重进行测量，其变化情况如图3所示。对照组小鼠大小便正常、体重增加、毛发有光泽、饮食、活动、精神状态均正常。相较于对照组的小鼠，模型组小鼠则在1、4、7周用药的开始第3天左右出现粘液稀便，且症状逐渐加重，5天左右症状更为严重，可见脓血便、消瘦、体重减轻、毛发无光泽、饮食明显减少、畏寒、懒动等症状，干预组小鼠在5天左右开始出现粘液稀便，并逐渐伴有消瘦、体重减轻、毛发无光泽、饮食明显减少、畏寒、懒动等症状，同时粘液稀便转为脓血便。脓血便、体重减轻、饮食明显减少、畏寒、懒动等结果表明模型组出现明显的结肠炎，表明IBD模型成功建立。
粪便隐血实验
隐血实验评分标准：阴性(-)：3分钟后不显蓝绿色；弱阳性(+)：30-60秒钟内显蓝色；阳性(++)：立即显蓝绿色；强阳性(+++)：立即显深蓝色。
对五组小鼠进行粪便隐血实验，实验结果显示模型组立即显深蓝色，表现为强阳性，而干预组在30秒后显示蓝绿色，表现为弱阳性。结果表明，与对照组相比，模型组和空载组小鼠粪便隐血严重，而干预组和阳性对照组小鼠在经过pVAX1-TNFAIP3以及Sulfasalazine干预后粪便隐血症状明显好转。
小鼠DAI评分
结合上述粪便隐血实验，结肠炎疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分参考Suthceland LR的标准进行，具体评分标准为：成形颗粒状类便，隐血实验阴性评分0；松散不粘附于***的半颗粒状类便，如隐血阴性评分1，隐血实验阳性评分2；粘附于***的液态类便，隐血实验阳性评分3，肉眼可见血便评分4。
对五组小鼠结肠炎损伤严重程度进行评估，每周计算5组小鼠的DAI，结果如图4所示。模型组的疾病活动指数评分显著高于对照组(P<0.01)，而干预组和阳性对照组显著低于模型组(P<0.01)。伴有体重下降的模型组小鼠在造模后第3-5天开始出现懒动、稀便、黏液血便，而干预组的DAI较模型组降低，干预组体重改变较模型组无差异，干预组小鼠的症状改善明显，这表明pVAX1-TNFAIP3能明显改善小鼠的结肠炎损伤。
小鼠结肠观察
在第49天，颈椎脱臼法处死五组小鼠，取整段结肠，对三组小鼠的结肠大体进行形态学观察，结果如图5所示。实验结果显示模型组小鼠结肠显著变短，可见明显充血水肿、有大面积糜烂。与模型组相比，干预组结肠水肿较轻，且糜烂面积小，表明pVAX1-TNFAIP3具有一定的治疗疗效。
HE染色
取五组小鼠结肠部分结肠组织，PBS冲洗干净，用甲酸溶液固定24小时。
1)脱水与透明
脱水过程从低浓度乙醇逐步向高浓度乙醇进行。将标本先置于70％乙醇短暂保存，既可脱水，同时对标本也有继续固定的作用。开始制片时，标本在80％乙醇中过夜后，依次浸入体积分数为95％乙醇Ⅰ、Ⅱ各2h，100％乙醇Ⅰ、Ⅱ各1.5h。二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明两次，各40min/次。透明过程中用肉眼观察透明程度，避免透明不足或过度。
2)包埋与切片
石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ1h，石蜡Ⅲ1.5h，常规浸蜡包埋(包埋蜡熔点58-60℃)，切取5μm厚度蜡片，42℃水浴锅内展片，常规烤片。
3)染色
苏木精﹣伊红(HE)染色：将烤好的蜡片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各10min，无水乙醇，95％乙醇逐步复水至70％乙醇，每级2min，进蒸馏水3min后，苏木精染色15min，1％盐酸酒精分化30s，流水冲洗20min，伊红染色2min，过水，95％乙醇2min，100％乙醇2min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min，中性树胶封片。
组织学评分标准:①炎症：无，0分；轻度，1分，中度，2分；重度，3分。②杯状细胞：未见消失，0分；消失，1分。③病变深度：无，0分；粘膜下层，1分；肌层，2分；浆膜层，3分。④溃疡：无，0分；糜烂，1分；溃疡，2分。⑤隐窝脓肿：无，0分；有，1分。
参见图6，对照组和阳性对照组小鼠结肠黏膜完整连续，腺体排列整齐，无水肿、溃疡及糜烂形成。而模型组和空载组的小鼠结肠黏膜损伤较重，可见明显充血水肿、广泛大面积的糜烂、深层溃疡形成，腺体被破坏排列紊乱，黏膜及黏膜下层可见大量淋巴细胞、嗜中性粒细胞浸润。干预组小鼠镜下黏膜损伤程度明显减轻，结肠黏膜完整，部分可见轻度充血水肿和少量炎性细胞浸润，表明pVAX1-TNFAIP3具有明显的治疗疗效。
反转录聚合酶链式反应
应用RNeasy Mini Kit试剂盒提取小鼠鼻粘膜组织总RNA(n＝3)，紫外分光光度计测定RNA的浓度及纯度。根据TaKaRa PrimeScriptⅡ1st strand cDNA Synthesis kit试剂盒说明书将2μg RNA反转录为cDNA，反应终体系为20μl。使用TaKaRa SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒通过ABI 7500进行RT-PCR扩增，扩增第一步为：95℃，30s；随后是95℃，3s和60℃，30s的40个循环作为第二步。采用Primer 5.0软件设计qPCR引物，以IL-4、IL-6、IFN-γ、TIM1作为目的基因，actin作为内参，并采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。结果显示模型组相比于干预组和阳性对照组IL-4、IL-6、TIM1的表达增加(见图7)，而干预组相比于阳性对照组IL-4、IL-6、TIM1的表达较少。表明pVAX1-TNFAIP3具有一定的治疗效果。
流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+T细胞的比例
断颈处死小鼠，无菌取出小鼠脾脏(n＝6)，将其放入注有小鼠淋巴细胞分离液的培养皿(35mm)中，根据说明书制备脾单核细胞，将细胞浓度稀释为1×106/mL。先用APC RatAnti-Mouse CD4和FITC Rat Anti-Mouse CD25流式抗体染色15min，然后用多久甲醛固定15min，PBS洗三次，最后用含有PE Rat Anti-MouseFoxp3的穿膜液染色过夜，第二天用流式细胞仪检测脾单核细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞的比率，并应用Flowjo软件对数据进行分析。结果显示干预组和阳性对照组较模型组和空载组CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例增加(见图8)，而且干预组相比于阳性对照组CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例更高，由于CD4+CD25+Foxp3+T细胞可以调节炎症的发生，因此本实验结果表明pVAX1-TNFAIP3具有一定的治疗效果。
Western blot检测炎症信号通路磷酸化蛋白的表达
将小鼠结肠组织剪碎后放入预冷的匀浆器中，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液进行研磨，研磨后冰上裂解15min，离心收集上清，-20℃保存备用。根据BCA蛋白定量法测定蛋白浓度，蛋白变性后进行10％SDS-PAGE电泳分离蛋白，电转至PVDF膜上，3％BSA封闭1h，加入p-Erk、Erk、p-p38、p38、p-JNK、JNK、Cox-2、Cox-1、NF-κB、p-NF-κB、IKKβ、p-IKKβ、β-actin和Foxp3单克隆抗体，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10min；加入HRP标记的二抗，室温震荡孵育1h；按上述洗涤方法清洗二抗；采用Pierce ECL化学发光底物试剂盒，以胶片显影、定影。以β-actin(1:1000)作为内参。
结果显示pVAX1-TNFAIP3干预组和阳性对照组ERK、JNK、p38和NF-κB等相关蛋白的磷酸化水平显著低于模型组和空载组(见图9和10)，而干预组又低于阳性对照组，这表明pVAX1-TNFAIP3可以通过抑制相关炎症的信号通路的活化，抑制炎症的发生。
另外，综合上述结果，干预组相比于阳性对照组IL-4、IL-6、TIM1的表达更少，IFN-γ的表达较多，CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例更高，炎症信号通路蛋白的磷酸化水平也有所降低，这预示着本发明的DNA疫苗相比于现有的水杨酸制剂而言，对于炎性肠病的治疗可能会有更好的效果，因而对于预防和治疗炎性肠病也就具有较好的应用前景和实用价值。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市耳鼻咽喉研究所
<120> 一种重组质粒、DNA疫苗及其制备方法和应用
<130> 9
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2373
<212> DNA
<213> TNFAIP3
<400> 1
atggctgaac aagtccttcc tcaggctttg tatttgagca atatgcggaa agctgtgaag 60
atacgggaga gaactccaga agacattttt aaacctacta atgggatcat tcatcatttt 120
aaaaccatgc accgatacac actggaaatg ttcagaactt gccagttttg tcctcagttt 180
cgggagatca tccacaaagc cctcatcgac agaaacatcc aggccaccct ggaaagccag 240
aagaaactca actggtgtcg agaagtccgg aagcttgtgg cgctgaaaac gaacggtgac 300
ggcaattgcc tcatgcatgc cacttctcag tacatgtggg gcgttcagga cacagacttg 360
gtactgagga aggcgctgtt cagcacgctc aaggaaacag acacacgcaa ctttaaattc 420
cgctggcaac tggagtctct caaatctcag gaatttgttg aaacggggct ttgctatgat 480
actcggaact ggaatgatga atgggacaat cttatcaaaa tggcttccac agacacaccc 540
atggcccgaa gtggacttca gtacaactca ctggaagaaa tacacatatt tgtcctttgc 600
aacatcctca gaaggccaat cattgtcatt tcagacaaaa tgctaagaag tttggaatca 660
ggttccaatt tcgccccttt gaaagtgggt ggaatttact tgcctctcca ctggcctgcc 720
caggaatgct acagataccc cattgttctc ggctatgaca gccatcattt tgtacccttg 780
gtgaccctga aggacagtgg gcctgaaatc cgagctgttc cacttgttaa cagagaccgg 840
ggaagatttg aagacttaaa agttcacttt ttgacagatc ctgaaaatga gatgaaggag 900
aagctcttaa aagagtactt aatggtgata gaaatccccg tccaaggctg ggaccatggc 960
acaactcatc tcatcaatgc cgcaaagttg gatgaagcta acttaccaaa agaaatcaat 1020
ctggtagatg attactttga acttgttcag catgagtaca agaaatggca ggaaaacagc 1080
gagcagggga ggagagaggg gcacgcccag aatcccatgg aaccttccgt gccccagctt 1140
tctctcatgg atgtaaaatg tgaaacgccc aactgcccct tcttcatgtc tgtgaacacc 1200
cagcctttat gccatgagtg ctcagagagg cggcaaaaga atcaaaacaa actcccaaag 1260
ctgaactcca agccgggccc tgaggggctc cctggcatgg cgctcggggc ctctcgggga 1320
gaagcctatg agcccttggc gtggaaccct gaggagtcca ctggggggcc tcattcggcc 1380
ccaccgacag cacccagccc ttttctgttc agtgagacca ctgccatgaa gtgcaggagc 1440
cccggctgcc ccttcacact gaatgtgcag cacaacggat tttgtgaacg ttgccacaac 1500
gcccggcaac ttcacgccag ccacgcccca gaccacacaa ggcacttgga tcccgggaag 1560
tgccaagcct gcctccagga tgttaccagg acatttaatg ggatctgcag tacttgcttc 1620
aaaaggacta cagcagaggc ctcctccagc ctcagcacca gcctccctcc ttcctgtcac 1680
cagcgttcca agtcagatcc ctcgcggctc gtccggagcc cctccccgca ttcttgccac 1740
agagctggaa acgacgcccc tgctggctgc ctgtctcaag ctgcacggac tcctggggac 1800
aggacgggga cgagcaagtg cagaaaagcc ggctgcgtgt attttgggac tccagaaaac 1860
aagggctttt gcacactgtg tttcatcgag tacagagaaa acaaacattt tgctgctgcc 1920
tcagggaaag tcagtcccac agcgtccagg ttccagaaca ccattccgtg cctggggagg 1980
gaatgcggca cccttggaag caccatgttt gaaggatact gccagaagtg tttcattgaa 2040
gctcagaatc agagatttca tgaggccaaa aggacagaag agcaactgag atcgagccag 2100
cgcagagatg tgcctcgaac cacacaaagc acctcaaggc ccaagtgcgc ccgggcctcc 2160
tgcaagaaca tcctggcctg ccgcagcgag gagctctgca tggagtgtca gcatcccaac 2220
cagaggatgg gccctggggc ccaccggggt gagcctgccc ccgaagaccc ccccaagcag 2280
cgttgccggg cccccgcctg tgatcatttt ggcaatgcca agtgcaacgg ctactgcaac 2340
gaatgctttc agttcaagca gatgtatggc taa 2373
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cggaattcca ccatggctga acaagt 26
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ccggatatct tagccataca tctgc 25
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
cggaattcca ccatggctga acaagt 26
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gctctagagc ttacttgtac agctcg 26
<210> 6
<211> 2373
<212> DNA
<213> 人工
<400> 6
atggctgaac aagtccttcc tcaggctttg tatttgagca atatgcggaa agctgtgaag 60
atacgggaga gaactccaga agacattttt aaacctacta atgggatcat tcatcatttt 120
aaaaccatgc accgatacac actggaaatg ttcagaactt gccagttttg tcctcagttt 180
cgggagatca tccacaaagc cctcatcgac agaaacatcc aggccaccct ggaaagccag 240
aagaaactca actggtgtcg agaagtccgg aagcttgtgg cgctgaaaac gaacggtgac 300
ggcaattgcc tcatgcatgc cacttctcag tacatgtggg gcgttcagga cacagacttg 360
gtactgagga aggcgctgtt cagcacgctc aaggaaacag acacacgcaa ctttaaattc 420
cgctggcaac tggagtctct caaatctcag gaatttgttg aaacggggct ttgctatgat 480
actcggaact ggaatgatga atgggacaat cttatcaaaa tggcttccac agacacaccc 540
atggcccgaa gtggacttca gtacaactca ctggaagaaa tacacatatt tgtcctttgc 600
aacatcctca gaaggccaat cattgtcatt tcagacaaaa tgctaagaag tttggaatca 660
ggttccaatt tcgccccttt gaaagtgggt ggaatttact tgcctctcca ctggcctgcc 720
caggaatgct acagataccc cattgttctc ggctatgaca gccatcattt tgtacccttg 780
gtgaccctga aggacagtgg gcctgaaatc cgagctgttc cacttgttaa cagagaccgg 840
ggaagatttg aagacttaaa agttcacttt ttgacagatc ctgaaaatga gatgaaggag 900
aagctcttaa aagagtactt aatggtgata gaaatccccg tccaaggctg ggaccatggc 960
acaactcatc tcatcaatgc cgcaaagttg gatgaagcta acttaccaaa agaaatcaat 1020
ctggtagatg attactttga acttgttcag catgagtaca agaaatggca ggaaaacagc 1080
gagcagggga ggagagaggg gcacgcccag aatcccatgg aaccttccgt gccccagctt 1140
tctctcatgg atgtaaaatg tgaaacgccc aactgcccct tcttcatgtc tgtgaacacc 1200
cagcctttat gccatgagtg ctcagagagg cggcaaaaga atcaaaacaa actcccaaag 1260
ctgaactcca agccgggccc tgaggggctc cctggcatgg cgctcggggc ctctcgggga 1320
gaagcctatg agcccttggc gtggaaccct gaggagtcca ctggggggcc tcattcggcc 1380
ccaccgacag cacccagccc ttttctgttc agtgagacca ctgccatgaa gtgcaggagc 1440
cccggctgcc ccttcacact gaatgtgcag cacaacggat tttgtgaacg ttgccacaac 1500
gcccggcaac ttcacgccag ccacgcccca gaccacacaa ggcacttgga tcccgggaag 1560
tgccaagcct gcctccagga tgttaccagg acatttaatg ggatctgcag tacttgcttc 1620
aaaaggacta cagcagaggc ctcctccagc ctcagcacca gcctccctcc ttcctgtcac 1680
cagcgttcca agtcagatcc ctcgcggctc gtccggagcc cctccccgca ttcttgccac 1740
agagctggaa acgacgcccc tgctggctgc ctgtctcaag ctgcacggac tcctggggac 1800
aggacgggga cgagcaagtg cagaaaagcc ggctgcgtgt attttgggac tccagaaaac 1860
aagggctttt gcacactgtg tttcatcgag tacagagaaa acaaacattt tgctgctgcc 1920
tcagggaaag tcagtcccac agcgtccagg ttccagaaca ccattccgtg cctggggagg 1980
gaatgcggca cccttggaag caccatgttt gaaggatact gccagaagtg tttcattgaa 2040
gctcagaatc agagatttca tgaggccaaa aggacagaag agcaactgag atcgagccag 2100
cgcagagatg tgcctcgaac cacacaaagc acctcaaggc ccaagtgcgc ccgggcctcc 2160
tgcaagaaca tcctggcctg ccgcagcgag gagctctgca tggagtgtca gcatcccaac 2220
cagaggatgg gccctggggc ccaccggggt gagcctgccc ccgaagaccc ccccaagcag 2280
cgttgccggg cccccgcctg tgatcatttt ggcaatgcca agtgcaacgg ctactgcaac 2340
gaatgctttc agttcaagca gatgtatggc taa 2373
<210> 7
<211> 3127
<212> DNA
<213> 人工
<400> 7
cgagctgtac aagtagatgg ctgaacaagt ccttcctcag gctttgtatt tgagcaatat 60
gcggaaagct gtgaagatac gggagagaac tccagaagac atttttaaac ctactaatgg 120
gatcattcat cattttaaaa ccatgcaccg atacacactg gaaatgttca gaacttgcca 180
gttttgtcct cagtttcggg agatcatcca caaagccctc atcgacagaa acatccaggc 240
caccctggaa agccagaaga aactcaactg gtgtcgagaa gtccggaagc ttgtggcgct 300
gaaaacgaac ggtgacggca attgcctcat gcatgccact tctcagtaca tgtggggcgt 360
tcaggacaca gacttggtac tgaggaaggc gctgttcagc acgctcaagg aaacagacac 420
acgcaacttt aaattccgct ggcaactgga gtctctcaaa tctcaggaat ttgttgaaac 480
ggggctttgc tatgatactc ggaactggaa tgatgaatgg gacaatctta tcaaaatggc 540
ttccacagac acacccatgg cccgaagtgg acttcagtac aactcactgg aagaaataca 600
catatttgtc ctttgcaaca tcctcagaag gccaatcatt gtcatttcag acaaaatgct 660
aagaagtttg gaatcaggtt ccaatttcgc ccctttgaaa gtgggtggaa tttacttgcc 720
tctccactgg cctgcccagg aatgctacag ataccccatt gttctcggct atgacagcca 780
tcattttgta cccttggtga ccctgaagga cagtgggcct gaaatccgag ctgttccact 840
tgttaacaga gaccggggaa gatttgaaga cttaaaagtt cactttttga cagatcctga 900
aaatgagatg aaggagaagc tcttaaaaga gtacttaatg gtgatagaaa tccccgtcca 960
aggctgggac catggcacaa ctcatctcat caatgccgca aagttggatg aagctaactt 1020
accaaaagaa atcaatctgg tagatgatta ctttgaactt gttcagcatg agtacaagaa 1080
atggcaggaa aacagcgagc aggggaggag agaggggcac gcccagaatc ccatggaacc 1140
ttccgtgccc cagctttctc tcatggatgt aaaatgtgaa acgcccaact gccccttctt 1200
catgtctgtg aacacccagc ctttatgcca tgagtgctca gagaggcggc aaaagaatca 1260
aaacaaactc ccaaagctga actccaagcc gggccctgag gggctccctg gcatggcgct 1320
cggggcctct cggggagaag cctatgagcc cttggcgtgg aaccctgagg agtccactgg 1380
ggggcctcat tcggccccac cgacagcacc cagccctttt ctgttcagtg agaccactgc 1440
catgaagtgc aggagccccg gctgcccctt cacactgaat gtgcagcaca acggattttg 1500
tgaacgttgc cacaacgccc ggcaacttca cgccagccac gccccagacc acacaaggca 1560
cttggatccc gggaagtgcc aagcctgcct ccaggatgtt accaggacat ttaatgggat 1620
ctgcagtact tgcttcaaaa ggactacagc agaggcctcc tccagcctca gcaccagcct 1680
ccctccttcc tgtcaccagc gttccaagtc agatccctcg cggctcgtcc ggagcccctc 1740
cccgcattct tgccacagag ctggaaacga cgcccctgct ggctgcctgt ctcaagctgc 1800
acggactcct ggggacagga cggggacgag caagtgcaga aaagccggct gcgtgtattt 1860
tgggactcca gaaaacaagg gcttttgcac actgtgtttc atcgagtaca gagaaaacaa 1920
acattttgct gctgcctcag ggaaagtcag tcccacagcg tccaggttcc agaacaccat 1980
tccgtgcctg gggagggaat gcggcaccct tggaagcacc atgtttgaag gatactgcca 2040
gaagtgtttc attgaagctc agaatcagag atttcatgag gccaaaagga cagaagagca 2100
actgagatcg agccagcgca gagatgtgcc tcgaaccaca caaagcacct caaggcccaa 2160
gtgcgcccgg gcctcctgca agaacatcct ggcctgccgc agcgaggagc tctgcatgga 2220
gtgtcagcat cccaaccaga ggatgggccc tggggcccac cggggtgagc ctgcccccga 2280
agaccccccc aagcagcgtt gccgggcccc cgcctgtgat cattttggca atgccaagtg 2340
caacggctac tgcaacgaat gctttcagtt caagcagatg tatggcggag gcggaggatc 2400
tggcggaggc ggatctatgg tgagcaaggg cgaggaggat aacatggcca tcatcaagga 2460
gttcatgcgc ttcaaggtgc acatggaggg ctccgtgaac ggccacgagt tcgagatcga 2520
gggcgagggc gagggccgcc cctacgaggg cacccagacc gccaagctga aggtgaccaa 2580
gggtggcccc ctgcccttcg cctgggacat cctgtcccct cagttcatgt acggctccaa 2640
ggcctacgtg aagcaccccg ccgacatccc cgactacttg aagctgtcct tccccgaggg 2700
cttcaagtgg gagcgcgtga tgaacttcga ggacggcggc gtggtgaccg tgacccagga 2760
ctcctccctg caggacggcg agttcatcta caaggtgaag ctgcgcggca ccaacttccc 2820
ctccgacggc cccgtaatgc agaagaagac catgggctgg gaggcctcct ccgagcggat 2880
gtaccccgag gacggcgccc tgaagggcga gatcaagcag aggctgaagc tgaaggacgg 2940
cggccactac gacgctgagg tcaagaccac ctacaaggcc aagaagcccg tgcagctgcc 3000
cggcgcctac aacgtcaaca tcaagttgga catcacctcc cacaacgagg actacaccat 3060
cgtggaacag tacgaacgcg ccgagggccg ccactccacc ggcggcatgg acgagctgta 3120
caagtaa 3127

Claims (10)

1.一种重组质粒，其特征在于，包括TNFAIP3基因和真核表达载体pVAX1，所述TNFAIP3基因的GenBank登录号为KJ892292.1。
2.权利要求1所述的重组质粒的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：将包含TNFAIP3基因的片段***到载体pVAX1的EcoRⅠ和EcoR V酶切位点间。
3.权利要求1所述的重组质粒在制备预防和治疗炎性肠病的药物中的应用。
4.一种DNA疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的重组质粒。
5.根据权利要求4所述的DNA疫苗，其特征在于，所述疫苗为多相乳液。
6.根据权利要求4或5所述的DNA疫苗，其特征在于，还包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙烯醇。
7.一种DNA疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于有机溶剂中，形成有机相；
取权利要求1所述的重组质粒的溶液，与所述有机相混合形成乳液；
将所述乳液与聚乙烯醇水溶液混合，形成多相乳液。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括：将所述多相乳液加入去离子水，待有机溶剂挥发后，离心，收集沉淀。
9.权利要求7-8任一项制得的DNA疫苗。
10.权利要求4-6、9任一项所述的DNA疫苗在制备预防和治疗炎性肠病的药物中的应用。
CN201810632254.3A 2018-06-19 2018-06-19 一种重组质粒、dna疫苗及其制备方法和应用 Pending CN108893488A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810632254.3A CN108893488A (zh) 2018-06-19 2018-06-19 一种重组质粒、dna疫苗及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810632254.3A CN108893488A (zh) 2018-06-19 2018-06-19 一种重组质粒、dna疫苗及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108893488A true CN108893488A (zh) 2018-11-27

Family

ID=64345209

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810632254.3A Pending CN108893488A (zh) 2018-06-19 2018-06-19 一种重组质粒、dna疫苗及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108893488A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109988779A (zh) * 2019-01-30 2019-07-09 刘志强 重组质粒、dna疫苗及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101049508A (zh) * 2007-05-11 2007-10-10 武汉大学 携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗
CN101970689A (zh) * 2007-11-29 2011-02-09 健泰科生物技术公司 炎性肠病的基因表达标志物
CN102639710A (zh) * 2009-07-20 2012-08-15 基因泰克公司 克罗恩病的基因表达标记
CN104644614A (zh) * 2015-02-10 2015-05-27 国家纳米科学中心 一种负载型血红蛋白组合物及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101049508A (zh) * 2007-05-11 2007-10-10 武汉大学 携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗
CN101970689A (zh) * 2007-11-29 2011-02-09 健泰科生物技术公司 炎性肠病的基因表达标志物
CN102639710A (zh) * 2009-07-20 2012-08-15 基因泰克公司 克罗恩病的基因表达标记
CN104644614A (zh) * 2015-02-10 2015-05-27 国家纳米科学中心 一种负载型血红蛋白组合物及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TIANYONG HU等: "pVAX1-A20 alleviates colitis in mice by promoting regulatory T cells", 《DIGESTIVE AND LIVER DISEASE》 *
郑翠芳等: "锌指蛋白A20对树突状细胞的免疫调控及其在炎症性肠病发病机制中的作用", 《临床儿科杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109988779A (zh) * 2019-01-30 2019-07-09 刘志强 重组质粒、dna疫苗及其制备方法和应用
CN109988779B (zh) * 2019-01-30 2023-06-16 刘志强 重组质粒、dna疫苗及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Vanuytsel et al. The role of Haptoglobin and its related protein, Zonulin, in inflammatory bowel disease
Myers et al. The genetic ablation of cyclooxygenase 2 prevents the development of autoimmune arthritis
Kurupati et al. Race-related differences in antibody responses to the inactivated influenza vaccine are linked to distinct pre-vaccination gene expression profiles in blood
Monaco et al. Epidemiology of systemic sclerosis in a district of northern Italy
Hartgring et al. Critical proinflammatory role of thymic stromal lymphopoietin and its receptor in experimental autoimmune arthritis
Iannitti et al. Increased central and peripheral inflammation and inflammatory hyperalgesia in Zucker rat model of leptin receptor deficiency and genetic obesity
Hepler et al. Directing visceral white adipocyte precursors to a thermogenic adipocyte fate improves insulin sensitivity in obese mice
Suleiman et al. Neonatal Fc receptor for IgG (FcRn) expressed in the gastric epithelium regulates bacterial infection in mice
Geesala et al. Loss of RHBDF2 results in an early-onset spontaneous murine colitis
Liao et al. Exosomes derived from T regulatory cells relieve inflammatory bowel disease by transferring miR‐195a‐3p
US11524062B2 (en) Compositions and methods for treating cancer and promoting wound healing
Myers et al. The role of IL-4 in regulation of murine collagen-induced arthritis
Rigoni et al. Cutaneous barrier leakage and gut inflammation drive skin disease in Omenn syndrome
Li et al. Retracted: Evaluation of the circulating MicroRNA‐495 and Stat3 as prognostic and predictive biomarkers for lower extremity deep venous thrombosis
Ni et al. Influence of periodontitis and scaling and root planing on insulin resistance and hepatic CD36 in obese rats
JP2002507723A (ja) リウマチ様関節炎の診断のための方法および組成物
Xie et al. miR-21 antagonist alleviates colitis and angiogenesis via the PTEN/PI3K/AKT pathway in colitis mice induced by TNBS
Liang et al. Engineered M2a macrophages for the treatment of osteoarthritis
Zhang et al. Trifolirhizin regulates the balance of Th17/Treg cells and inflammation in the ulcerative colitis mice through inhibiting the TXNIP‐mediated activation of NLRP3 inflammasome
Li et al. γδT cells contribute to type 2 inflammatory profiles in eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps
Jeong et al. Homeostasis effects of fermented Maillard reaction products by Lactobacillus gasseri 4M13 in dextran sulfate sodium‐induced colitis mice
CN108893488A (zh) 一种重组质粒、dna疫苗及其制备方法和应用
CN109468380A (zh) Il1r2在乳腺癌预后评估与靶向治疗中的应用
CN104725514A (zh) 新型il23拮抗剂
Zhang et al. Imbalanced IL-37/TNF-α/CTSS signaling disrupts corneal epithelial barrier in a dry eye model in vitro

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181127