CN101951893A - 包含纯化的微生物脂肪酶颗粒的药物组合物及其用于预防或治疗消化紊乱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含含有至少一种重组生产的纯化的微生物脂肪酶的颗粒的药物组合物,涉及使用所述药物组合物用于制备预防或治疗特定疾病和紊乱例如胰腺分泌不足的药物的用途,涉及所述药物组合物的制备方法。
Description
本发明涉及包含含有重组生产的纯化的微生物脂肪酶的颗粒的药物组合物,涉及所述药物组合物用于预防或治疗疾病和紊乱例如消化紊乱的用途,涉及通过将所述药物组合物施用于需要其的动物特别是人用以预防和治疗疾病和紊乱的方法,涉及所述药物组合物的制备方法和通过所述方法可获得的药物组合物。
酶,包括脂肪酶,已知用于各种工业应用,例如在洗涤剂或食品工业中。以颗粒配制工业酶(诸如酶颗粒剂或酶丸粒剂)的一般性理由,包括针对周围潜在的有害环境保护所述酶,直到该活性化合物将释放的时刻。另一个理由涉及减少可以是在操作中由酶产生的潜在的有害粉尘。
美国专利号4,689,297揭示了用于洗衣剂的包含无尘酶的颗粒的制备方法。所述包含酶的颗粒通过用酶包覆能水合的核芯颗粒来制备。
文献WO 91/06638揭示了由含有酶的发酵液制备干燥和无尘酶颗粒剂的工序,特别是用于洗涤剂和食品应用。发酵液通常是通过微生物工艺由其生产酶的液体。它通常除所生产的特定酶以外还含有不定数的例如寡糖和多糖作为副产物。
更复杂的配制剂通常应用于酶用于制药用途。一些以胰酶补充剂形式的商业药物已知用于治疗在动物,如人由消化酶不足引起的疾病或紊乱。这些产品的活性成分特别是消化酶,即一般在胰腺产生并分泌到小肠上部的淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶。用于这些药物的酶经常是提取于动物的胰腺,典型地提取于牛或猪的胰腺。
欧洲专利EP 0 583 726 B1教导生产含有胰酶的微丸粒剂的挤出工艺和通过该工艺获得的微丸粒剂。
在WO 2007/02026012中描述了通过挤出工艺生产的,适用于肠溶包衣的胰酶微丸粒核芯。
US 4,079,125揭示了用于制备尤其含有脂肪酶的消化酶组合物的工艺。所述组合物可以包含空白丸芯种子。
文献WO 93/07263揭示颗粒状的酶组合物,其用于洗涤剂的用途,且尤其具有减轻形成粉尘并剩下残渣的趋势。所述颗粒组合物包含核芯、酶层和外包衣层。
用于制药用途的包含胰酶的制剂的备选配制方法例如揭示于US4,447,412。
特定的微生物脂肪酶的制药用途与其生产和提纯方法一起描述于WO 2006/136159A2。
由于药物的注册过程是非常严格的,并且必须提供对于其所有活性成分以及对于副产品(如降解产物)的安全数据。因此优选生产具有高纯度、具有高含量活性成分和具有尽量最低含量副产品,例如来自活性成分降解的副产品的药物。现今发现纯化的脂肪酶,特别是纯化的重组生产的微生物脂肪酶,其需要特别小心地加工为药物施用形式,例如用于制药用途的颗粒。例如,加工纯化的脂肪酶,特别是重组生产的纯化的微生物脂肪酶,通过常规的挤出技术可能导致在所得产品中形成肽杂质,并且因此在重组生产使用的纯化的微生物脂肪酶中损失蛋白质纯度。该肽杂质可以例如由降解重组生产的纯化的微生物脂肪酶本身引起,例如由于在挤出工艺中的机械压力。在此使用的术语“肽杂质”涉及重组生产的纯化的微生物脂肪酶本身的降解产物总和,并且进一步包括在特定样本或产品中的所有其它肽的和/或蛋白质衍生的副产品。
因此,令人惊讶地,本文所描述的制备方法(其中将包含重组生产的纯化的微生物脂肪酶的溶液包衣在适宜的制药可接受的核芯颗粒上)导致在成品药物组合物中包含特别高蛋白纯度的重组生产的纯化的微生物脂肪酶的颗粒。
因此,本发明的一个目的是,提供包含至少一种高含量、高蛋白纯度和具有尽量最低含量的副产品的重组生产的纯化的微生物脂肪酶的药物。
相应地,本发明的一个实施方式涉及包含颗粒的药物组合物,所述颗粒含有以下物质或由它们组成:
a)制药可接受的核芯颗粒和
b)包衣在核芯颗粒上的至少一个包衣层,所述包衣层包含至少一种重组生产的纯化的微生物脂肪酶。
其中所述的重组生产的纯化的微生物脂肪酶具有蛋白纯度至少在90%区域(w/w)和蛋白质含量至少60%(w/w)。
本文所描述的“颗粒”通常以球形或近似球形的颗粒获得,所述形状主要归因于相应的制备工艺。颗粒的大小可以在大范围内变化,但通常使用至少100,优选至少200微米的直径,特别是对于制药用途的颗粒。更优选用于制药用途的是直径200至4,000微米的颗粒,而更优选的是300至3,000微米,还更优选的是400至2,000微米。
对于这里描述的药物组合物的优选的制药用途是预防或治疗消化紊乱、胰腺分泌不足、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。
本文所描述的药物组合物的“核芯颗粒”,其本身通常是没有药物活性的并仅起到药物组合物的活性药物成分的载体的作用,活性药物成分即重组生产的纯化的微生物脂肪酶。可以使用本领域已知的任何类型的用于该目的的制药可接受的核芯颗粒,例如,所谓“空白丸芯种子”,其有时也被称为“中性丸粒剂”和“起始丸粒剂”。所述核芯颗粒可以由任何制药可接受的有机或无机材料(其适应如本文描述的颗粒制备工艺的条件)或所述材料的混合物。用于核芯颗粒的适宜无机材料是例如二氧化硅,特别是粗糙级的二氧化硅。用于核芯颗粒的适宜有机材料是例如纤维素,特别是微晶纤维素(“MCC”),淀粉和/或碳水化合物像蔗糖和乳糖。优选有机材料,特别是纤维素,用于核芯颗粒。最优选MCC。典型地使用球形或近似球形的且不同大小的核芯颗粒。对于制药用途,通常使用直径至少是50微米,例如直径50至2,000微米,优选150至1,500微米,例如从200到700微米的核芯颗粒。
本文所描述的药物组合物的颗粒还包含至少一个“包衣层”。所述包衣层包含至少一种重组生产的纯化的微生物脂肪酶,但也可以包含两种或更多种所述脂肪酶(所述“重组生产的纯化的微生物脂肪酶包衣层”)。优选每个包衣层一种重组生产的纯化的微生物脂肪酶。此外,本文描述的所述包衣层或药物组合物的其它成分可以任选地包含如下描述的稳定剂和/或粘合剂。进一步地,本文描述的所述包衣层或药物组合物的其它成分可以任选地包含另外的如下描述的常规药物助剂和/或赋形剂。所述包衣层的厚度可以在大范围变化,且可以例如是50至4,000微米,优选100至3,000微米,更优选200至2,000微米。所述包衣层通常通过一般的包衣技术应用于核芯颗粒,并且如本领域已知,可以应用几层,例如,以二、三、四、五或更多层,相互覆盖。优选一个重组生产的纯化的微生物脂肪酶包衣层。
本文所描述的药物组合物的颗粒,除“重组生产的纯化的微生物脂肪酶包衣层”之外,还可以进一步包含一个或多个(即,二、三、四、五、六、七、八、九、十或更多)附加的包衣层。在颗粒中包含一个、两个或更多个重组生产的纯化的微生物脂肪酶包衣层的情况下,所述颗粒可以任选地包含一个或多个附加的包衣层,例如,用于将重组生产的纯化的微生物脂肪酶包衣层与核芯颗粒表面和/或与其它重组生产的纯化的微生物脂肪酶包衣层(“分隔层”)分开,或者用于提供顶包衣(“顶包衣层”),其施加于重组生产的纯化的微生物脂肪酶包衣层的表面以保护其免于直接接触周围环境。在本发明优选的实施方式中,所述顶包衣层包含功能性包衣(例如肠溶包衣)或由其组成。在另一实施方式中,所述顶包衣层包含非功能性包衣或由其组成。在所述药物组合物的颗粒包含两个或更多个包衣层的情况下,如本文描述的,所述两个或更多个的包衣层可以施用i)直接相互接触的或ii)可以通过施用两个或更多个附加的包衣层(即,分隔层)相互分开。有不同的途径制备含有多于一个包衣层的颗粒。一种选择是分步包衣所述颗粒,即向颗粒添加第一包衣层,然后向颗粒添加第二包衣层。在每个包衣步骤之后,也许干燥所述被包衣的颗粒是必需的。在需要多于两个包衣层的情况下,进一步的包衣层也以同样或类似的方式分步添加。
可以使用在本领域已知的常规附加的包衣层和方法,例如,如描述于文献DK 200200473,DK 200101930,WO 89/08694,WO 89/08695,和/或WO 00/01793。其它常规包衣材料的实例可以在US 4,106,991,EP170360,EP 304332,EP 304331,EP 458849,EP 458845,WO 97/39116,WO 92/12645A,WO 89/08695,WO 89/08694,WO 87/07292,WO 91/06638,WO 92/13030,WO 93/07260,WO 93/07263,WO 96/38527,WO 96/16151,WO 97/23605,WO 01/25412,WO 02/20746,WO 02/28369,US 5,879,920,US 5,324,649,US 4,689,297,US 6,348,442,EP 206417,EP 193829,DE 4344215,DE 4322229A,DE 263790,JP 61162185A和/或JP 58179492中找到,所有引用文献公开的内容通过参考以整体并入本文。
适用于所述包衣层或本文描述的药物组合物的其它成分的“酶稳定剂”可以例如是非还原性试剂,特别是非还原性碳水化合物。优选的酶稳定剂是选自由蔗糖、海藻糖和麦芽糖醇组成的组。通常所述酶稳定剂以0-100%(w/w)每纯化的脂肪酶重量的量使用。优选以10-100%(w/w)的量使用。优选地酶稳定剂用于包衣层。
适用于所述包衣层或本文描述的药物组合物的其它成分的“粘合剂”可以例如是具有高熔点或根本没有熔点和任选地非蜡质性质的试剂。例如,纤维素衍生物可以作为适宜的粘合剂使用,特别是羟丙基甲基纤维素(“羟丙甲纤维素”),羟丙基纤维素,甲基纤维素或羧甲基纤维素。此外,适宜的粘合剂可以选自聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)、糊精、和聚乙烯醇。通常所述粘合剂以总量0-20%(w/w)每纯化的脂肪酶重量使用,优选以总量2.5-10%(w/w)。优选地酶粘合剂用于包衣层。
本文所描述的用于根据本发明的药物组合物的“重组生产的纯化的微生物脂肪酶”,通常具有蛋白质纯度至少90面积%,91面积%,92面积%,93面积%,94面积%,95面积%,96面积%,97面积%,98面积%,99面积%,优选地至少99.1面积%,99.2面积%,99.3面积%,99.4面积%,99.5面积%,99.6面积%,99.7面积%,99.8面积%或99.9面积%。本文所描述的术语“蛋白质纯度”被理解为,在特定样本或产品中(例如在重组生产的纯化的微生物脂肪酶中)存在的基于总蛋白质量的重组生产的纯化的微生物脂肪酶的百分比。所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶的蛋白质纯度,如本文描述的,可以通过色谱方法测量。所获得的色谱峰用面积%法量化且面积%脂肪酶峰表示为所有被检测到的峰的总面积的百分比。优选地,所述蛋白质纯度通过逆相高效液相色谱法(“RP-HPLC”)测量,且更优选地通过梯度RP-HPLC测量。梯度RP-HPLC用适宜的溶剂进行,优选由乙腈、水和三氟乙酸(“TFA”)组成。所述分离在适宜的HPLC柱上进行,优选在YMC ProteinRP,S-5μm柱,125×3mm I.D.(YMC Europe公司,Schermbeck,德国)上通过运行适宜的梯度,优选梯度从0至90%乙腈/TFA0.05%,在适宜的时间内,优选50分钟内,以适宜的流速,优选以1.0ml/min的流速进行。所述检测在适宜的波长进行,优选在波长214nm。待测样本溶于适宜的溶剂中,优选于2%(w/w)的氯化钠水溶液。所述柱在适宜的温度,优选在40℃下操作。例如,当作为起始材料使用以生产根据本发明的药物组合物颗粒,所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶可以具有至少90面积%和与99.9面积%一样高的蛋白质纯度。该蛋白质纯度通常将在制备工艺中降低,降低的程度取决于应用的制备工艺。由于在工艺期间非常温和的条件,如本文描述的,制备所述包含重组生产的纯化的微生物脂肪酶的颗粒,在所述配制工艺期间蛋白质纯度的损失是异常低的,例如低于0.5%。例如,如果使用99.9面积%蛋白质纯度的重组生产的纯化的微生物脂肪酶作为起始材料,在如本文描述的工艺中制备包含重组生产的纯化的微生物脂肪酶的颗粒,在所得颗粒中所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶的蛋白质纯度可以典型地是像99.6面积%一样高。
在优选的实施方式中如本文描述的重组生产的纯化的微生物脂肪酶的比活性至少是其最大比活性(如下面描述的)的80%。在另一优选实施方式中,所述如本文描述的重组生产的纯化的微生物脂肪酶的比活性至少分别是其最大比活性的81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,或97%。酶(这里:脂肪酶)的“比活性”是基于酶蛋白总重量的酶活性(这里:分解脂肪的活性)。
在还另一优选的实施方式中,所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶以固体形式使用,例如,以粉末、结晶、微晶等。
术语“总蛋白质量”被理解为,重组生产的纯化的微生物脂肪酶和肽和/或蛋白质衍生物杂质的总量,包括所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶的降解产物。所述总蛋白质量不包含任何添加的蛋白质,如其它的酶(非脂肪酶)、肽赋形剂和/或蛋白质衍生物赋形剂。
所期望的重组生产的纯化的微生物脂肪酶的蛋白质纯度可以如以下更具体描述地达到。
本文所描述的重组生产的纯化的微生物脂肪酶,具有蛋白质含量至少60%(w/w)、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、92%、93%、94%或95%。
本文所描述的术语“蛋白质含量”被理解为,基于脂肪酶制剂总量的脂肪酶蛋白质量的百分比,所述脂肪酶制剂包含脂肪酶蛋白质和非肽组分,例如寡糖类、多糖类、盐类、余量水等。用于获得重组生产的纯化的微生物脂肪酶的粗制脂肪酶制剂通常是以已知方式从发酵液获得的,如果期望或需要,对脂肪酶制剂用随后的进一步纯化和/或干燥步骤。如果重组生产的纯化的微生物脂肪酶的蛋白质含量60%(w/w)或更高是所期望的,所述脂肪酶制剂通常在它从发酵液中回收后干燥。在一实施方式中,待干燥的脂肪酶制剂可以是液体脂肪酶浓缩物。干燥通常通过喷雾干燥法或冻冷冻干燥法进行。优选喷雾干燥法。例如,当作为起始材料以生产根据本发明的药物组合物颗粒时,所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶可以具有蛋白质含量至少60%、65%、70%、75%、76%、77%、78%、79%(w/w每种情况),或至少80%(w/w)。在优选的实施方式中,所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶具有蛋白质含量至少80%(w/w)。如果涉及根据本发明的药物组合物,则其中任何定义的蛋白质含量将典型地低于,在作为起始材料以生产根据本发明的药物组合物颗粒的重组生产的纯化的微生物脂肪酶中存在的蛋白质含量。这归因于附加的物质的存在,像在所述药物组合物颗粒中的药物助剂和/或赋形剂。
所述蛋白质含量可以通过“外标法”测定,即相对于待独立测定的具有基于特定脂肪酶的氨基酸组成的确定蛋白质含量的“脂肪酶蛋白质参考标准”(“LRS”)溶液,(具体见实施例6)。根据“分析程序和方法验证”(通过美国食品和药物管理局提供的指导,2000年8月),由美国药典(USP)/National Formulary(NF)的参考标准和其它官方资源不需要进一步地表征。非获自官方资源的参考标准,应该是通过合理的努力可以获得的最高纯度,且其应该彻底地表征,以保证其同一性、强度、品质、纯度和效能。用于表征参考标准的定性和定量的分析程序是期望不同于那些用于控制药物物质或药物产品的同一性、强度、品质、纯度和效能的,且较之更广泛的。然而,对于例如新的分子实体的药物施用,不太可能备有国际或国家的标准。因此,制造商应该建立适当表征的内部初级参考材料。用于测试生产批量的内部执行的参考材料应该对照该初级参考材料校准。在酶领域,参考标准通过具有的最高可获得的纯度表征(例如高于99.9%)。由于其非常高的纯度,当在对所述特异性酶适用的标准条件下测定时,酶参考标准的比活性通常象征该特异性酶的“最大比活性”(或近似最大比活性,由于通常在最大比活性和近似最大比活性之间的数值偏差非常低,对于实际目的其通常被视为与最大比活性等同)。
所期望的纯化的脂肪酶的蛋白质含量,特别是重组生产的纯化的微生物脂肪酶可以如以下更具体的描述达到。
在优选的实施方式中,所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶具有比活性至少1Mio U/g。脂肪酶的比活性可以例如是如描述于实施例8地测定。脂肪酶活性单位“U/g”被理解为“单位每克酶蛋白”。一单位(U)被定义为在pH7.0,37℃,特定条件下,一分钟内,水解1μ当量可滴定的脂肪酸的酶活性。脂肪酶活性(同义使用的表达是“酶活性”、“酶的活性”和“分解脂肪的活性”)被理解为每单位时间转变的摩尔,如在实施例7中定义的。
就本发明的目的,“脂肪酶”表示羧酸酯水解酶类EC 3.1.1.-,其包括活性诸如EC 3.1.1.3三酰基甘油脂酶,EC 3.1.1.4磷脂酶A1,EC3.1.1.5溶血磷脂酶,EC 3.1.1.26半乳糖脂酶,EC 3.1.1.32磷脂酶A1,EC 3.1.1.73阿魏酸酯酶。在特别的实施方式中,所述脂肪酶是EC3.1.1.3三酰基甘油脂酶。EC数涉及酶命名法1992分别自NC-IUBMB,Academic Press,San Diego,California,包括补编1-5发表于Eur.J.25Biochem.1994,223,1-5;Eur.J.Biochem.1995,232,1-6;Eur.J.Biochem.1996,237,1-5;Eur.J.Biochem.1997,250,1-6;和Eur.J.Biochem.1999,264,610-650。所述命名法是有规律地补充和更新的;见例如环球网于
http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.
脂肪酶可以是源于植物或动物的,特别是源于哺乳动物、真菌或细菌。任选地,所述生产真菌脂肪酶或细菌脂肪酶的真菌或细菌是重组的真菌或细菌。例如,微生物脂肪酶可以从发酵液回收,并且哺乳动物脂肪酶可以从猪或牛的胰腺提取物通过常规的工序回收,包括但不限于,离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
根据本发明,可以使用任何适宜用于制药用途的重组生产的纯化的微生物脂肪酶。特别是用于本发明背景下的脂肪酶应该是适宜预防或治疗疾病和紊乱的,优选消化紊乱、胰腺分泌不足、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。
重组生产的微生物脂肪酶是通过重组DNA技术的方式生产的酶,所述脂肪酶源于微生物,即获得自真菌或细菌。在本发明背景下适宜的脂肪酶是重组生产的微生物脂肪酶,其拥有分解脂肪的活性,优选在相对低pH下。所述重组生产的微生物脂肪酶可以是酶变体或突变酶,其是与天然存在的脂肪酶功能上等价的或具有相似的结构特征。酶变体或突变酶是通过改变亲本基因或其衍生物的DNA序列能得到的。当编码相应的酶的DNA核苷酸序列***到适宜宿主生物中的适宜载体中时,可以表达和生产所述酶变体或突变酶。所述宿主生物不是必然地必须与亲本基因所起源的生物相同。向基因中引入突变的方法是在本领域众所周知的,见例如专利申请EP 0 407 225。
优选用于本发明目的的重组生产的纯化的微生物脂肪酶是源自真菌,例如源自腐质霉属(Humicola)、根毛霉菌属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、地丝菌属(Geotrichum)或念珠菌属(Candida)的种,特别是Humicola lanuginosa(细毛嗜热霉)(Thermomyceslanuginosa),米赫根毛霉(Rhizomucor miehei),瓜哇根霉(Rhizopusjavanicus),无须根霉菌(Rhizopus arrhizus),稻根霉菌,Rhizopusdelamar,Candida cylindracea,皱褶念珠菌(Candida rugosa )或念珠地丝菌(Geotrichum candidum);或可以源自细菌,例如源自单胞菌属(Pseudomonas)、伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)或芽孢杆菌属(Bacillus)的种,特别是洋葱伯霍尔德杆菌(Burkholderia cepacia)。更优选地是源自Humicola lanuginosa(细毛嗜热霉)(Thermomyceslanuginosa)或米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)菌株的脂肪酶。最优选地是源自Humicola lanuginosa(细毛嗜热霉)(Thermomyceslanuginosa)菌株的脂肪酶。
源于微生物的脂肪酶,其可以在本发明的背景下使用,并且其通过例如描述于例如EP公开号0600868,0238023,0305216,0828509,0550450,1261368,0973878和0592478的重组技术生产,其中这里的出版物包括于参考。EP公开号0600868(US 5614189)尤其描述了在胰酶替代疗法中使用所述源自Humicula lanuginosa的脂肪酶。所述脂肪酶是源自Humicula lanuginosa DSM 4109的并且具有SEQ ID NO:2的1-269氨基酸的氨基酸序列。
在本发明的特定实施方式中,源自Humicola lanuginosa的脂肪酶,其包含具有与SEQ ID NO:2的1-269氨基酸至少80%一致性的氨基酸序列,可以用于制备重组生产的纯化的微生物脂肪酶。
在本发明另一特定实施方式中,源自Humicola lanuginosa的脂肪酶,其具有与SEQ ID NO:2的1-269氨基酸至少80%一致性,可以用于制备重组生产的纯化的微生物脂肪酶。
在本发明另一特定实施方式中,源自Humicola lanuginose具有SEQID NO:2的脂肪酶可以用于制备重组生产的纯化的微生物脂肪酶。
特别是,在WO 2006/136159中和/或在国际专利申请WO2008/079685(PCT/US07/87168)中揭示的用作药物的脂肪酶,优选如公布在各自权利要求中那些,可以根据本发明使用。文献WO 2006/136159和WO 2008/079685所公开的内容这两者都通过参考以其整体并入本文。
相应地,在本发明背景下的实施方式中使用的所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶
(a)具有与SEQ ID NO:2的1-269氨基酸至少50%的一致性,优选60%,70%,80%或90%的一致性
(b)具有脂肪酶活性;和
(c)任选地,与SEQ ID NO:2的1-269氨基酸的序列相比,包含,
(d)任选地,与SEQ ID NO:2的1-269氨基酸的序列相比,包含,
(i)置换T231R和N233R;或
(ii)置换N33Q,T231R,和N233R;或
(ii)置换N33Q,T231R,和N233R;以及至少一种选自以下的附加的置换:
E1*,D,N;Q4H,P,R;D5E;N8L,Q;Q9H;F10L;N11C,D,H,L,P,Q,R,S;G23E;N26A,H,I;D27I,N,Q,R,S,V;P29T;A30T,V;T37K,M;G38A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,Y;N39H,S;E43K;K46M;A49T;L52I,R;E56K,Q,R,S;D57G,N;V60E,S;G61R;V63R;A68V;L69I;N71I,S;N73Q,Y;I76T;R84E;I86F,L;E87A,H,K,R;I90L,V;G91A,C,E,F,K,L,M,N,S,T,V,W,Y;L93*,F;N94*,K,Q,R,S;F95*;D96*,E,G,N,R,S,W,Y;L97M,Q;K98I,T;E99D;N101Q;D102E,G,Y;R108M;G109A;D111A,E,N,S;G112A;T114I;S115L;W117C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y;D122E,N;Q126L;V128A;D130H;H135D;P136H;Y138F;V141E,L;A150V;V154F,I,L;A155V;G156R;G161A,E;N162G,S,T;G163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;D167E;V168M;V176A,D,F,G,H,I,K,M,N,Q,T,W;G177A;R179T;L185M;G190C,D;N200Q,S;R205I;L206F;E210D,R,V,Y;S216P;E219D;G225P;T226N;L227F,G;P229R;E239D;G240L;D242E;T244S;G246A;Q249R;N251Q,S;D254A,G,I,K,L,M,N,R,Q,S,Y;I 255A,F;P256A,F,G,H,I,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y;和L269F,H。
在本发明背景下的特定实施方式中使用的重组生产的纯化的微生物脂肪酶具有于SEQ ID NO:1的氨基酸1-269至少90%的一致性。SEQID NO:1与SEQ ID NO:2的氨基酸1-269不同之处在于双置换T231R+N233R。表达在SEQ ID NO:1中的“双置换T231R+N233R”涉及,变体SEQ ID NO:1是SEQ ID NO:2的变体的事实,其中在231位的苏氨酸(Thr,或T)残基和在233位的天冬酰胺(Asn,或N)残基各为或被置换为精氨酸(Arg,或R)。术语“位”涉及在序列表的SEQ ID NO:1中的正的(positive)氨基酸残基数。该两种置换不是保守的,如下文描述的(因为它们用两个极性氨基酸置换了两个碱性氨基酸)。
在本发明的另一优选的实施方式中所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶与SEQ ID NO:1至少81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,或至少99%一致。
在特别的实施方式中,所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶
a)包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-269,或
b)是SEQ ID NO:1的氨基酸1-269的变体,其中所述变体与SEQ IDNO:1的氨基酸1-269不超过25个氨基酸差异,并且其中:
(i)所述变体与SEQ ID NO:1的氨基酸1-269相比包含至少一个保守置换和/或***一个或多个氨基酸;和/或
(ii)所述变体与SEQ ID NO:1的氨基酸1-269相比包含至少一个小删除;和/或
(iii)所述变体与SEQ ID NO:1的氨基酸1-269相比包含至少一个小的N或C末端延长。
(iv)所述变体是具有SEQ ID NO:1的氨基酸1-269的脂肪酶片段。
包含保守的置换、***、删除、N末端延长和/或C末端延长,以及与SEQ ID NO:1的氨基酸1-269的序列相比的脂肪酶片段的脂肪酶可以从该分子通过任何本领域已知的方法制备,诸如定点诱变、随机诱变、共有序列派生方法(EP 897985)和基因改组(WO 95/22625,WO 96/00343)等。这些脂肪酶也可以是杂种或嵌合的酶。
在本发明该实施方式中使用的变体脂肪酶当然具有脂肪酶活性。在特别的实施方式中,所述变体脂肪酶的比活性是具有SEQ ID NO:1的氨基酸1-269的脂肪酶比活性的至少50%。在另一特别的实施方式中,所述变体脂肪酶的比活性是具有SEQ ID NO:1的氨基酸1-269的脂肪酶比活性的至少60、70、75、80、85、90或至少95%,其中所述比活性可以利用如本文描述的实施例8的脂肪酶分析测量,或利用如WO2006/136159实施例1列举的任何一种脂肪酶分析。对于该对比,优选地,所述比活性以U/mg酶蛋白利用WO 2006/136159实施例1的LU-分析测量,并且通过如描述于WO 2006/136159实施例5的氨基酸分析测定酶蛋白含量。
对于所述SEQ ID NO:1脂肪酶变体允许的氨基酸改变是较少自然的,保守氨基酸置换或***不显著影响蛋白质的折叠和/或活性,优选小数量的这样的置换或***;小的删除;小的氨基或羧基末端延长,诸如氨基末端甲硫氨酸残基;小的连接肽;或通过改变净电荷或其它功能有助纯化的小的延长,诸如多组氨酸区域,抗原表位或结合区域。
在上文中,术语“小”独立地指定数目直至25个的氨基酸残基。在优选的实施方式中,术语“小”独立地指定直至24,23,22,21,或直至20个氨基酸残基。在另一优选的实施方式中,术语“小”独立地指定直至19,18,17,16,15,14,13,12,11,或直至10个氨基酸残基。在另外的优选的实施方式中,术语“小”独立地指定直至9,8,7,6,5,4,3,2,或直至1个氨基酸残基。在备选的实施方式中,术语“小”独立地指定直至40,39,38,37,36,35,34,33,32,31,30,29,28,27,26,或直至25个氨基酸残基。
在优选的实施方式中,所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶具有与SEQ ID NO:1的氨基酸1-269不多于25,24,23,22,21,20,19,18,17,16,15,14,13,12,或不多于11个氨基酸差异的氨基酸序列;或,其与SEQ ID NO:1的氨基酸1-269不多于10,9,8,7,6,5,4,3,2,或不多于1个氨基酸差异的;在任一情况下,优选地,除了如上所述在SEQ ID NO:1中双置换R231T+R233N以外的。在备选的实施方式中,在本发明背景下使用的脂肪酶具有与SEQ ID NO:1的氨基酸1-269不多于40,39,38,37,36,35,34,33,32,31,30,29,28,27,或不多于26个氨基酸差异的氨基酸序列,优选地,除了如上所述在SEQ ID NO:1中双置换R231T+R233N以外的。
保守置换的实例是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸),酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸),极性氨基酸(丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺),疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和丙氨酸),芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸),和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸)的组内置换。
备选的保守置换的实例是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸),酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸),极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺),疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸),芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸),和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的组内置换。不广泛地改变比活性的氨基酸置换是在本领域已知的和例如,由H.Neurath和R.L.Hill,1979,In描述于TheProteins,Academic Press,New York。最通常发生的交换是Ala/Ser,Val/Ile,Asp/Glu,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,Tyr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,Leu/Val,Ala/Glu,和Asp/Gly。
可以在本发明背景下使用的变体脂肪酶的另一优选的实例包含保守置换(用一个极性氨基酸交换另一个极性氨基酸)是SEQ ID NO:1的氨基酸1-269的变体Asn33G1n(N33Q)。这是非糖基化的变体,其对于本发明的目的,与SEQ ID NO:1一样有效。本发明也涉及该变体脂肪酶本身的用途,以及SEQ ID NO:1的-5-269,-4-269,-3-269,和2-269氨基酸的相应置换的变体。
在优选的实施方式中,在所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶的变体脂肪酶中的每个置换都是保守的。
可以在本发明中使用的变体脂肪酶的实例包含小的N末端延长是SEQ ID NO:1的氨基酸-5-269(-5至+269),-4-269(-4至+269),和-3-269(-3至+269),即分别地具有SPI..,PIR..,和IRR..的N末端(见实施例11)。
可以在本发明中使用的变体脂肪酶的实例是SEQ ID NO:1的氨基酸1-269的片段,是具有SEQ ID NO:1的氨基酸2-269(+2至+269)的氨基酸序列的变体,即具有VSQ的N末端(见实施例11)。
具有以下氨基酸序列的脂肪酶是在本发明背景下使用的纯化的脂肪酶的优选实例:(i)SEQ ID NO:1的氨基酸+1至+269,(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸-5至+269,(iii)SEQ ID NO:1的氨基酸-4至+269;(iv)SEQID NO:1的氨基酸-3至+269;(v)SEQ ID NO:1的氨基酸-2至+269;(vi)SEQ ID NO:1的氨基酸-1至+269,(vii)SEQ ID NO:1的氨基酸+2至+269,以及(viii)两种或更多的(i)-(vii)脂肪酶的任何混合物。在特别的实施方式中,根据本发明使用的脂肪酶是选自(i),(ii),和(i)与(i i)的任何混合物的脂肪酶。优选的(i)与(ii)的混合物包含至少5%,优选地至少10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,或至少95%的脂肪酶(i),所述百分比通过如在实施例11中描述的利用Edman方法通过N末端测序测定。其它优选的混合物为:(a)组合物,其包含35-75%,优选地40-70%,更优选地45-65%的脂肪酶(ii);(b)组合物,其包含20-60%,优选地25-55%,更优选地30-50%,最优选地35-47%的脂肪酶(i);(c)组合物,其包含直至30%,优选地直至25%,更优选地直至20%,最优选地直至16%的脂肪酶(vii);和(d)(a),(b),和/或(c)的任何组合,如包含45-65%的脂肪酶(ii),35-47%的脂肪酶(i),和直至16%的脂肪酶(vii)的组合物。
在本发明背景下使用的所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶也可以是具有SEQ ID NO:1的氨基酸1-269的脂肪酶的片段,其中所述片段仍然具有脂肪酶活性。术语片段本文定义为从SEQ ID NO:1的氨基和/或羧基末端删除一个或多个氨基酸的多肽,优选从其成熟部分(其氨基酸1-269)。优选地,删除小数目的氨基酸,小被定义为如上文解释的。更优选地,片段含有至少244,245,246,247,248,249,或至少250个氨基酸残基。最优选地,片段含有至少251,252,253,254,255,256,257,258,259,260,261,262,263,264,265,266,267,或至少268个氨基酸残基。在备选的实施方式中,片段含有至少239,240,241,242,或至少243个氨基酸残基。
在另一优选的实施方式中,在本发明背景下作为重组生产的纯化的微生物脂肪酶使用的脂肪酶为揭示于还未公开的国际专利申请PCT/US07/87168亲本脂肪酶的变体,其
(a)具有与SEQ ID NO:2的氨基酸1至269至少50%的一致性。
(b)具有脂肪酶活性;和其
(c)与SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的序列相比,包含置换N33Q,T231R,和N233R,以及至少一个附加的选自下面的置换:
E1*,D,N;Q4H,P,R;D5E;N8L,Q;Q9H;F10L;N11C,D,H,L,P,Q,R,S;G23E;N26A,H,I;D27I,N,Q,R,S,V;P29T;A30T,V;T37K,M;G38A,D,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,Y;N39H,S;E43K;K46M;A49T;L52I,R;E56K,Q,R,S;D57G,N;V60E,S;G61R;V63R;A68V;L69I;N71I,S;N73Q,Y;I76T;R84E;I86F,L;E87A,H,K,R;I90L,V;G91A,C,E,F,K,L,M,N,S,T,V,W,Y;L93*,F;N94*,K,Q,R,S;F95*;D96*,E,G,N,R,S,W,Y;L97M,Q;K98I,T;E99D;N101Q;D102E,G,Y;R108M;G109A;D111A,E,N,S;G112A;T114I;S115L;W117C,D,E,F,G,H,I,K,L,P,S,T,V,Y;D122E,N;Q126L;V128A;D130H;H135D;P136H;Y138F;V141E,L;A150V;V154F,I,L;A155V;G156R;G161A,E;N162G,S,T;G163A,C,D,E,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;D167E;V168M;V176A,D,F,G,H,I,K,M,N,Q,T,W;G177A;R179T;L185M;G190C,D;N200Q,S;R205I;L206F;E210D,R,V,Y;S216P;E219D;G225P;T226N;L227F,G;P229R;E239D;G240L;D242E;T244S;G246A;Q249R;N251Q,S;D254A,G,I,K,L,M,N,R,Q,S,Y;I 255A,F;P256A,F,G,H,I,L,M,N,Q,S,T,V,W,Y;和L269F,H。
在另一优选的实施方式中,在本发明背景下作为重组生产的纯化的微生物脂肪酶使用的脂肪酶为亲本脂肪酶的变体,其
(a)具有与SEQ ID NO:2的氨基酸1至269至少50%的一致性。
(b)具有脂肪酶活性;和其
(c)与SEQ ID NO:2的氨基酸1-269的序列相比,包含一组选自下面的置换:
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+E210D+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
N33Q+E219D+T231R+N233R;
N33Q+W117L+T231R+N233R;
D27Q+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T231R+N233R;
D27S+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
Q4R+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D96W+T231R+N233R;
D27V+N33Q+V60S+D96W+T231R+N233R+Q249R;
D27V+N33Q+V60S+T231R+N233R+Q249R;
Q9H+N33Q+D102E+T231R+N233R;
N33Q+D111E+T231R+N233R;
N33Q+D122E+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+D167E+T231R+N233R;
N33Q+G91N+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91A+L93*+N94*+F95*+D96*+D111A+T231R+N233R+P256T;
N11R+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+N39H+T231R+N233R;
N33Q+P229R+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+G163K+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+T231R+N233R+P256T;
N33Q+E87A+T231R+N233R;
N33Q+E56Q+T231R+N233R;
N33Q+E210V+T231R+N233R;
N33Q+E56K+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254G;
N33Q+D96S+T231R+N233R;
N33Q+D122N+T231R+N233R;
N26A+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+N162T+T231R+N233R;
N33Q+A150V+N 162G+T231R+N233R;
N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+G240L;
D27R+N33Q+G91A+D96E+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T;
D27R+N33Q+G91A+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+N200S+T231R+N233R;
N33Q+N39S+T231R+N233R;
N33Q+E210R+T231R+N233R;
N33Q+N39H+T231R+N233R+D254R;
N33Q+T231R+N233R+D254R;
N33Q+N94R+T231R+N233R;
N33Q+D96R+T231R+N233R;
D27N+N33Q+T231R+N233R;
D27N+N33Q+E56R+T231R+N233R;
N33Q+L227F+T231R+N233R;
N33Q+N73Y+G225P+T231R+N233R;
N33Q+G225P+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254S;
N33Q+D96G+T231R+N233R;
N33Q+D96N+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+D254G;
N33Q+D130H+T231R+N233R;
N33Q+E87A+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+E239D;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254G;
N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E210V+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254G;
N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R;
Q4R+D27R+N33Q+G91T+N94S+D111A+E210D+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G177A+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+G246A;
D27N+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27Q+N33Q+G91T+G163K+E219D+T231R+N233R;
N33Q+G91T+E219D+T231R+N233R;
K98I+T231R+N233R+N251S;
N33Q+G163R+T231R+N233R;
N33Q+G 163N+T231R+N233R;
N33Q+G163C+T231R+N233R;
N33Q+G163Q+T231R+N233R;
N33Q+G163E+T231R+N233R;
N33Q+G163H+T231R+N233R;
N33Q+G163I+T231R+N233R;
N33Q+G 163P+T231R+N233R;
N33Q+G163D+T231R+N233R;
N33Q+G91K+T231R+N233R;
N33Q+G91M+T231R+N233R;
N33Q+G91F+T231R+N233R;
N33Q+G91S+T231R+N233R;
N33Q+G91W+T231R+N233R;
N33Q+G91Y+T231R+N233R;
N33Q+G163T+T231R+N233R;
N33Q+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G 163Y+T231R+N233R;
N33Q+G163V+T231R+N233R;
N33Q+G91C+T231R+N233R;
N33Q+G91Y+Q126L+T231R+N233R;
N33Q+G91M+G161E+T231R+N233R;
N33Q+V128A+T231R+N233R;
N33Q+G163V+L185M+T231R+N233R;
N33Q+G38A+T231R+N233R;
N33Q+G163A+T231R+N233R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
N33Q+G163M+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+D111A+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91A+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254G+P256T;
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R;
N33Q+W117L+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+P256T;
N33Q+T231R+N233R+D242E;
N33Q+E87R+T231R+N233R;
N33Q+E56R+T231R+N233R;
N33Q+N162G+T231R+N233R;
N33Q+G91L+T231R+N233R;
N33Q+E87H+T231R+N233R;
N33Q+D96N+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+L227F+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+G163A+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+G91T+N94R+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+D254A;
N33Q+T231R+N233R+D254N;
N33Q+T231R+N233R+D254Q;
N33Q+T231R+N233R+D254I;
N33Q+T231R+N233R+D254L;
N33Q+T231R+N233R+D254K;
N33Q+T231R+N233R+D254M;
N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27V+N33Q+V60S+G91T+D96W+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D96N+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27Q+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D5E+N33Q+W117L+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27Q+N33Q+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+D96E+E219D+L227G+T231R+N233R+Q249R;
D27R+N33Q+E56K+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+
N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+A155V+S216P+L227G+T231R+N233R+
D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+D111A+T231R+N233R+D254S;
N33Q+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S;
N33Q+T231R+N233R+P256A;
N33Q+T231R+N233R+P256N;
N33Q+T231R+N233R+P256G;
N33Q+T231R+N233R+P256H;
N33Q+T231R+N233R+P256L;
N33Q+T231R+N233R+P256M;
N33Q+T231R+N233R+P256S;
N33Q+T231R+N233R+P256W;
N33Q+T231R+N233R+P256Y;
N33Q+T231R+N233R+P256F;
N33Q+T231R+N233R+P256V;
N33Q+G91M+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R;
N33Q+G91M+G163D+T231R+N233R;
N33Q+G91K+G163W+T231R+N233R;
N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R;
N33Q+V176N+T231R+N233R;
N33Q+V176D+T231R+N233R;
N33Q+W117F+T231R+N233R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+V176I+T231R+N233R;
N33Q+D111N+T231R+N233R;
N33Q+D111N+G225P+T231R+N233R;
N33Q+D111N+S216P+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R;
N33Q+G91M+G163P+T231R+N233R;
N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R;
N33Q+W117D+T231R+N233R;
N33Q+W117H+T231R+N233R;
N33Q+W117C+T231R+N233R;
N33Q+W117K+T231R+N233R;
N33Q+W117V+T231R+N233R;
N11S+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+W117E+V176K+T231R+N233R;
N33Q+W117G+T231R+N233R;
N33Q+W117P+T231R+N233R;
N33Q+W117S+T231R+N233R;
N33Q+W117T+T231R+N233R;
N33Q+W117I+T231R+N233R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+S115L+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+V176M+T231R+N233R;
N33Q+V176H+T231R+N233R;
N33Q+V176A+T231R+N233R;
D27V+N33Q+L227F+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+W 117Y+T231R+N233R;
N33Q+W117Y+V176D+T231R+N233R;
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
D27V+N33Q+G91A+N94R+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
D27R+N33Q+P136H+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N11R+N33Q+T231R+N233R+T244S;
N33Q+G91T+D96N+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94S+D111A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G161A+T231R+N233R;
N33Q+G38I+G 177A+T231R+N233R;
N33Q+N101Q+T231R+N233R;
N33Q+N94Q+T231R+N233R;
N33Q+G 161A+T231R+N233R;
N11Q+N33Q+T231R+N233R;
N8Q+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+T231R+N233R+N251Q;
N33Q+N200Q+T231R+N233R;
N33Q+G177A+T231R+N233R;
N33Q+N73Q+T231R+N233R;
N33Q+I86L+T231R+N233R;
N33Q+K98I+G163K+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+S216P+L227G+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+K98I+G163K+N200Q+T231R+N233R+N251S;
N33Q+G38S+G163K+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q G38Y T231R N233R;
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91T+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G38N+N73Q+T231R+N233R;
N33Q+G38D+R84E+T231R+N233R;
N33Q+G38Q+T231R+N233R;
N33Q+G38I+T231R+N233R;
N33Q+G38K+T231R+N233R;
N33Q+G38F+T231R+N233R;
N33Q+G38H+N200Q+T231R+N233R+N251S;
N33Q+G38L+T231R+N233R;
N33Q+G38M+T231R+N233R;
N33Q+G38F+T231R+N233R;
N33Q+G38P+T231R+N233R;
N33Q+G38T+T231R+N233R;
N11R+N33Q+G91T+W1171+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G91T+W117I+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163A+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R+P256A;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+P256A;
N33Q+W117I+V176Q+T231R+N233R;
N33Q+G177A+T231R+N233R+G246A;
E1N+N33Q+T231R+N233R;
N33Q G38H T231R N233R;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
D27R+N33Q+W117I+V176Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G 163W+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+T231R+N233R+D254S+P256T;
N33Q+T231R+N233R+D254Q;
N11R+N33Q+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S;
N 11R+N33Q+G91T+G163K+V176W+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G163D+T231R+N233R;
N33Q+G163P+T231R+N233R;
E1D+N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R;
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+L206F+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T;
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+W117S+T231R+N233R;
N33Q+G61R+V63R+G156R+V176W+T231R+N233R+P256I;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R;
N33Q+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+G163T+V176W+T231R+N233R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+S115L+G163T+V176I+T231R+N233R;
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+
L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+
T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+
T231R+N233R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+
N233R+D242E+D254S+P256T;
D27R+N33Q+G38A+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+
T231R+N233R+D254S+P256T;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+E210D+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256L;
N33Q+G38A+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G38A+G163A+T231R+N233R+D254I;
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R;
N11R+N33Q+I90L+G163L+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
N11R+D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G112A+G163A+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+E210D+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254I;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91M+G163T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163K+V176D+T231R+N233R+D254S;
N33Q+E56Q+G156R+V176W+T231R+N233R;
E1D+N33Q+G38A+G91T+N94R+D111A+W117L+V176W+T231R+N233R;
N33Q+G163K+G177A+T231R+N233R+G246A;
N11R+N33Q+E56Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+I90L+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+L227G+T231R+
N233R+Q249R+D254S+P256T;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+S216P+E219D+L227G+
T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+I90L+G91T+N94S+D96E+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+V176Q+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163A+V176T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+V176T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163P+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S+P256N;
D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163T+S216P+L227G+
T231R+N233R+Q249R+D254S+P256T;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+G163A+E210V+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256L;
Q4R+D27Q+N33Q+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256L;
N33Q+E210Y+T231R+N233R+D254Y+I255F;
N33Q+L93F+D102Y+T231R+N233R;
D27R+N33Q+L227G+T231R+N233R+Q249R+D254S;
N11S+N33Q+T231R+N233R;
N11R+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G38A+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+W117Y+V176T+T231R+N233R;
N8L+N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254A+P256F;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+P256F;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256F;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G156R+G163K+V176T+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91K+D96S+G163T+T231R+N233R+Q249R;
N11R+N33Q+G91T+G163N+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163W+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91K+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+G23E+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+V141E+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+L52R+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+V141L+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+T37K+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+A68V+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163A+V176I+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+T37M+G91T+G163P+V176T+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163L+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S+P256I;
N33Q+G38S+G156R+G163K+V176W+T231R+N233R;
N11R+D27R+N33Q+E56Q+D57N+G91N+N94R+D111S+G163K+S216P+
L227G+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163Q+V176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G38A+G91T+G163T+V176G+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G38A+G91T+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
E1*+N11R+N33Q+G38A+G91N+N94R+G163P+V176G+T231R+N233R+D254S;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+F10L+N11R+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S;
E1N+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+L227F+T231R+N233R+D254S;
E1N+N33Q+G38A+G91T+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S+I255A+P256Q;
E1N+N11R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163P+V176F+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G 156R+V176W+T231R+N233R+P256I;
N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176W+T231R+N233R;
N33Q+G91T+N94S+D111A+G156R+G163T+V176I+T231R+N233R;
N11R+N33Q+G38A+G91T+D102G+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11R+N33Q+G38A+G91T+S115L+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
E1N+N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+G246A+D254S;
N11R+D27R+N33Q+D57G+G91T+D96E+D111A+G163K+T231R+N233R+
D254S+P256T;
N33Q+D96N+G156R+V176W+T231R+N233R+Q249R;
N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F+L269F;
N33Q+I86F+L93F+D102Y+E210Y+L227F+T231R+N233R+D254Y+I255F;
N11C+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11L+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11H+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11D+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+D96W+G163K+T231R+N233R+D254S;
D27R+N33Q+G91T+D96E+L97Q+D111A+G163K+T231R+N233R+D254S+P256T;
N11P+N33Q+G91T+G163K+T231R+N233R+D254S;
Q4R+D27N+N33Q+G38A+G91T+N94S+E99D+D111A+V176I+E210V+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256L;
N11R+N33Q+E56Q+G163K+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163A+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163P+T231R+N233R+D254S;
N11R+N33Q+G91T+G163K+L227G+P229R+T231R+N233R+D254S;
N33Q+E87K+T231R+N233R;
N33Q+N94K+T231R+N233R;
N33Q+D96Y+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
A30V+N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+E87K+D96E+T231R+N233R;
N26I+N33Q+T231R+N233R;
A30T+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+G91A+T231R+N233R;
N33Q+G91V+L97M+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+L69I+G91E+T231R+N233R;
P29T+N33Q+T231R+N233R;
N33Q+G91V+T231R+N233R;
N33Q+K98I+T231R+N233R;
N33Q+G91E+T231R+N233R;
N33Q+N94K+T231R+N233R;
D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+N162S+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T;
D27R+N33Q+T37K+N71I+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T;
D27R+N33Q+N39S+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+I76T+G91N+N94R+R108M+D111A+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T;
D27R+N33Q+L52I+V60E+G91N+N94R+D111A+T114I+V168M+E210D+
S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
Q4P+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+R205I+L206F+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256T;
Q4H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154L+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154I+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+N71S+G91N+N94R+D111A+H135D+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+K98I+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+L97M+D111A+S216P+T226N+L227G+T231R+
N233R+P256T+L269H;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+T114I+R179T+S216P+L227G+T231R+
N233R+P256T;
D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+T231R+N233R
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+A30V+N33Q+G91N+N94R+G109A+D111A+G190D+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+A49T+G91N+N94R+D111A+Y138F+G163R+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256T;
N26H+D27R+N33Q+G91N+N94R+D111A+V154F+G190C+S216P+L227G+
T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163S+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+T231R+N233R+G163S;
N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R;
N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+D254G+P256A;
D27R+N33Q+G91T+T114I+G163W+E210D+T231R+N233R;
D27N+N33Q+G91T+T114I+G163S+E210D+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R;
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210V+T231R+N233R;
N33Q+G38W+G91T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T;
D27I+N33Q+G91T+D96E+K98T+T114I+G163K+E210D+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+T114I+E210V+T231R+N233R+D254K+P256A;
N33Q+G91A+N94K+D111A+G163K+L227F+T231R+N233R+Q249R;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T;
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T;
N33Q+G91T+K98I+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S;
N33Q+G91T+K98I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L;
N33Q+G91T+T114I+G163K+T231R+N233R+D254S+P256L;
G23E+D27R+N33Q+L52R+G91N+N94R+D111A+T114I+V141E+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T;和
D27R+N33Q+E43K+K46M+I90V+G91N+N94R+D111A+T114I+S216P+
L227G+T231R+N233R+P256T.
在另一优选的实施方式中,在本发明背景下作为重组生产的纯化的微生物脂肪酶使用的脂肪酶为亲本脂肪酶的变体,其
(a)具有与SEQ ID NO:2的氨基酸1至269至少50%的一致性;和
(b)具有脂肪酶活性;和
(c)包含至少一个置换,其选自下面的置换:N26I,D27Q,D27R,D27Y,P29T,A30T,A30V,T32I,N33Q,N33T,N33Y,P42L,E43D,E43K,E43M,E43V,A49T,E56A,E56C,E56K,E56R,E56S,D57A,D57G,D57N,V60L,L69I,E87K,G91A,G91E,G91N,G91R,G91S,G91T,G91V,G91W,L93F,N94K,N94R,N94S,D96E,D96G,D96L,D96N,D96S,D96V,D96W,D96Y,L97M,L97Q,K98I,E99D,E99K,E99P,E99S,E99T,D111A,D111S,T114I,L147S,G163K,E210D,S216P,L227G,T231R,N233R,D234K,E239V,Q249R,N251S,D254N,P256T,G263Q,L264A,I265T,G266D,T267A,和L269N,其中每个位置对应于SEQ ID NO:2的氨基酸1至269的位置。
在还另一优选的实施方式中,在本发明背景下作为重组生产的纯化的微生物脂肪酶使用的脂肪酶为亲本脂肪酶的变体,其
(a)具有与SEQ ID NO:2的氨基酸1至269至少50%的一致性;和
(b)具有脂肪酶活性;和
(c)与SEQ ID NO:2的序列相比,包含一组选自下面的置换:
G91A+D96W+E99K+G263Q+L264A+I265T+G266D+T267A+L269N;
N33Q+D96S+T231R+N233R+Q249R;
D27R+G91A+D111A+S216P+L227G+P256T;
D27R+G91N+N94R+D111A+S216P+L227G+P256T;
D27R+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+P256T;
D27R+G91S+D111A+S216P+L227G+P256T;
D27R+G91T+D96N+D111A+S216P+L227G+P256T;
N33Q+G163K+T231R+N233R;
T32I+G91V+T231R+N233R;
K98I+T231R+N233R;
G91A+T231R+N233R;
G91V+T231R+N233R;
N33Y+G91W+N94K+T231R+N233R;
P42L+D57N+G91E+T231R+N233R;
K98I+T231R+N233R;
V60L+G91V+T231R+N233R;
D57G+L93F+T231R+N233R;
A49T+E56R+E87K+E99S+T231R+N233R;
E99T+T114I+D254N+T231R+N233R;
D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R;
E43K+E56S+E87K+T231R+N233R;
E56S+E87K+D96L+E99D+T231R+N233R;
E56A+D57A+T114I+T231R+N233R;
G91E+T231R+N233R;
E56K+D96G+D111A+T231R+N233R;
E87K+D111S+T231R+N233R;
E43V+G91R+T231R+N233R;
E56S+E87K+T231R+N233R;
E87K+G91E+T231R+N233R;
D27Y+E87K+T231R+N233R;
E43M+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R;
E56K+E87K+D111A+T231R+N233R;
E87K+E99P+T231R+N233R;
E87K+D96L+E99P+T231R+N233R;
E56C+E87K+T231R+N233R;
E56R+E87K+D96L+T231R+N233R;
E43D+E56A+D57A+E87K+D111A+T231R+N233R;
E56K+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R;
E87K+L147S+T231R+N233R;
D27Y+E87K+D96L+E99P+T231R+N233R;
E43D+E87K+D96L+E99P+E239V+T231R+N233R;
E43K+E56A+E87K+D234K+T231R+N233R;
D96V+D111A+T231R+N233R;和
N33T+E43V+E56K+D96G+T231R+N233R.
在本发明中,氨基酸使用一字母符号(例如S、P、I、R等)和/或三字母符号(例如Ser、Pro、Ile、Arg等),如在Voet&Voet,Biochemistry,3rd Edition,John Wiley & Sons Inc中列出的,缩略。
描述两个氨基酸序列之间的亲缘关系的术语“等位基因的变体”和参数“一致性”,本文根据在国际专利申请PCT/DK2006/00352(以WO2006/136159公开)中列举的定义使用。
分离、纯化和浓缩脂肪酶以达到本文所描述的重组生产的纯化的微生物脂肪酶可以通过常规的方法执行。例如,如本文所描述的重组生产的纯化的微生物脂肪酶可以通过在第一步骤中从发酵液中回收重组生产的微生物脂肪酶制备,其通过常规工序包括但不限于,离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀;并且随后在第二步骤中通过一种或多种本领域已知的纯化方法纯化所回收的重组生产的微生物脂肪酶。适宜的纯化方法可以例如是选自色谱法(例如,离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、色谱聚焦和分子筛析色谱法),电泳工序(例如,制备性等电位聚焦),微分溶解度(例如,硫酸铵沉淀法),SDS-PAGE,结晶法,萃取法(见例如,Protein Purification(蛋白质纯化),J.-C.Janson和Lars Ryden,editors,VCH Publishers,New York,1989)和上述纯化技术和方法的任何组合。结晶法和/或色谱法是优选用于商业规模的制备。结晶法是最优选的。
例如,SEQ ID NO:2的微生物脂肪酶可以,例如基于美国专利号5,869,438制备(其中SEQ ID NO:1是编码如本文定义的SEQ ID NO:2脂肪酶的DNA序列),即,通过在适宜宿主细胞重组表达US专利的SEQID NO:1的DNA序列。
例如,所述SEQ ID NO:1的脂肪酶可以例如基于美国专利号5,869,438制备(其中SEQ ID NO:1是编码相似的只在氨基酸位点数目231和233不同的脂肪酶的DNA序列),即,通过在适宜宿主细胞中重组表达美国专利的SEQ ID NO:1的修饰的DNA序列,其反应两个氨基酸的差异。
例如,所述如优选使用于本文的SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2微生物脂肪酶变体,可以例如基于美国专利号5,869,438制备(其中SEQID NO:1是编码如本文定义的SEQ ID NO:2脂肪酶的DNA序列),即通过在适宜的宿主细胞重组表达DNA序列,其DNA序列是美国专利的SEQID NO:1的修饰,所述修饰反应所期望的脂肪酶变体和本文SEQ ID NO:2脂肪酶的氨基酸之间的差异。该修饰可以通过本领域已知的定点诱变制备。
在特别的实施方式中,所述SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的微生物脂肪酶变体通过向稻曲霉菌菌株ToC1512转入编码所述脂肪酶变体的DNA制备(描述于WO2005070962A1),使用描述于美国专利号5,869,438实施例22中的方法,除了使用PyrG筛选(描述于WO2004069872A1)代替AMDS筛选。从琼脂斜面上取稻曲霉菌宿主的孢子并用于在10ml YPM(10g酵母提取物,Difco+20g蛋白胨,Difco,加水至1L,高压灭菌;加入无菌过滤的麦芽糖至2%(w/w))接种。接种管在30℃New Brunswick Scientific Innova 2300摇床于180rpm孵育三天。上清液通过用Mira-Cloth(Calbiochem)过滤培养物随后用0.45um(微米)过滤器无菌过滤来收集。脂肪酶变体如常规描述于美国专利号5,869,438的实施例23地进一步纯化。
在特别的实施方式中,制备每种重组生产的纯化的微生物脂肪酶的浓缩的固体或液体配制。
在另外的特定实施方式中,所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶以固体浓缩物的形式使用。所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶可以通过本领域已知的各种方法制成固态。例如,固态可以是结晶,其中脂肪酶分子以高秩序的形式排列,或固态是沉淀,其中脂肪酶分子以低秩序或无秩序形式排列。各种沉淀方法是本领域已知的,包括用盐沉淀,如硫酸铵,和/或硫酸钠;用有机溶剂,如乙醇,和/或异丙醇;或用聚合物,如PEG(聚乙二醇)沉淀。备选地,所述脂肪酶可以通过本领域的各种方法从溶液中通过除去溶剂(典型地水)来沉淀,例如,冻干法、蒸发法(例如在减压下),冷冻干燥和/或喷雾干燥。
在优选的实施方式中,结晶法可以用作纯化脂肪酶的方法,以取得重组生产的纯化的微生物脂肪酶。结晶法可以,例如,在接近所述脂肪酶等电点(“pI”)的pH和低导电性下进行,例如10mS/cm或更低,如描述于EP 691982。在特别的实施方式中,根据本发明使用的脂肪酶是结晶脂肪酶,其可以通过描述于EP 600868B1的实施例1制备。此外所述脂肪酶结晶可以交联,如描述于WO 2006/044529。
在一个实施方式中,参考固体浓缩物总蛋白质的量,所述脂肪酶的固体浓缩物具有至少50%(w/w)的活性酶蛋白的蛋白质纯度。在另一特别的实施方式中,相对于固体浓缩物的总蛋白质量,所述活性酶蛋白的蛋白质纯度是至少55、60、65、70、75、80、85、90,或至少95%(w/w)。所述蛋白质纯度通过本领域已知的例如通过光密度计扫描考马斯染色的SDS-PAGE凝胶测量,例如,使用BIO-RAD的GS-800刻度光密度计;通过使用商品化试剂盒,如蛋白质分析ESL(Protein Assay ESL),Roche的商购可得的订单号1767003。或基于描述于WO 01/58276实施例8的方法。优选地,所述脂肪酶蛋白组成至少50%的,更优选地至少55、60、65、70、75、80、85、90、92、94、95、96,或至少97%的用于根据本发明使用的所述固体脂肪酶的蛋白质波普,如通过光密度计扫描考马斯染色的SDS-PAGE凝胶测量。这些酶可以是指定的“经分离的”、“经纯化的”或“经纯化和分离的”酶或多肽。用于在曲霉属(Aspergillus)表达并包含如解释于WO 2006/136159实施例5的SEQ ID NO:1不同的N末端形式的混合物的脂肪酶,在SDS-PAGE凝胶上相关的条带相应位于分子量34-40kDa。对于SEQ ID NO:1非糖基化的变体N33Q,相关的条带位于大概30kDa。
在一优选的实施方式中,重组生产的纯化的微生物脂肪酶是由重组生产的微生物脂肪酶生产的,特别是由源自Humicula lanuginosa的脂肪酶。对于该目的,重组生产的微生物脂肪酶,特别是自Humiculalanuginosa的脂肪酶,通过如上文描述的常规工序从发酵液回收,并且以液体脂肪酶浓缩物获得。固体脂肪酶浓缩物通过常规的沉淀法或干燥方法,优选喷雾干燥,由所述的液体脂肪酶浓缩物生产。如果使用源自Humicula lanuginosa的脂肪酶,通过描述的方法获得的固体脂肪酶浓缩物典型地具有大约50%(w/w)的蛋白质含量和大约95面积%的蛋白质纯度。所述固体脂肪酶浓缩物可以进一步通过所期望或需要的方法纯化。
如果使用源自Humicula lanuginosa的脂肪酶,优选通过如上所述的结晶法进一步纯化所述固体脂肪酶浓缩物。例如,自Humiculalanuginosa的固体脂肪酶浓缩物可以在适宜的结晶缓冲液在接近其等电点pI的pH且在低导电性下结晶纯化。然后结晶的脂肪酶可以通过常规的分离方法从结晶缓冲液中分离,优选通过离心,并且可以在更高的pH重新溶解。如果期望,可以执行进一步纯化的方法循环以获得特定或所期望的蛋白质纯度和/或蛋白质含量。如此得到的纯化的液体脂肪酶浓缩物,然后可以通过常规的沉淀或干燥方法优选喷雾干燥转化到纯化的固体脂肪酶浓缩物。所述固体脂肪酶浓缩物和所述纯化的固体脂肪酶浓缩物可以它们本身是适宜作为根据本发明纯化的脂肪酶,取决于其蛋白质含量和/或蛋白质纯度。
根据本发明使用的重组生产的纯化的微生物脂肪酶可以方便地具有残留含水量1%至7%,通过常规方法测定,优选通过如描述于US6,355,461的Karl Fischer的方法。
现今发现,具有蛋白质含量低于60%(w/w),例如大约50%(w/w)的重组生产的纯化的微生物脂肪酶可以通过常规的挤出技术加工为适宜的药物施用形式,不显著地损失所使用的纯化的脂肪酶的蛋白质纯度。但是,如果使用具有至少60%(w/w),例如具有80%(w/w)的高蛋白质含量的重组生产的纯化的微生物脂肪酶,这些不可以通过常规的挤出技术加工为适宜的药物施用形式,而在加工之后不显著损失蛋白质纯度。
在本发明中,使用显示非常高纯度的脂肪酶参考标准,在优选的实施方式中,使用最高可得到的纯度,并显示近似最大比活性(或近似比活性,见上文),在优选的实施方式中,显示对于各种脂肪酶的最大比活性。对于每种重组生产的纯化的微生物脂肪酶制备脂肪酶参考标准,其中所述脂肪酶参考标准的氨基酸序列和重组生产的纯化的微生物脂肪酶的相同,即,两者是同样的脂肪酶,但通过不同的方法纯化:
a)制备重组生产的纯化的微生物脂肪酶
未经纯化的脂肪酶(例如,通过发酵获得的)通过结晶技术在如本文所描述的定义的pH值下纯化。
b)制备脂肪酶参考标准
所述未经纯化的脂肪酶(例如,通过发酵获得的)使用目前本领域已知的最有效的纯化方法纯化。在优选的实施方式中,使用色谱法纯化所述脂肪酶,在更优选的实施方式中,使用包含疏水作用层析(HIC),离子交换色谱法和分子筛析色谱法(SEC)的三种复合色谱法;在尤其更加优选的实施方式中,使用纯化在第一步骤通过HIC,第二步骤通过离子交换色谱法和第三步骤通过SEC;以达到非常高纯度的脂肪酶,在优选的实施方式中达到最高可得到纯度的脂肪酶。
在一优选的实施方式中,脂肪酶参考标准是通过如下方法制备的:起始材料悬浮于适宜的液体,优选水,更优选调节为定义的pH的水,优选至pH6。加入定义体积的缓冲介质,优选定义体积的丁二酸/NaOH溶液和定义体积的溶解渗透性活性试剂,优选定义体积的NaCl溶液,并调节pH至适宜pH,优选至pH6。然后,通过适宜的过滤单元,优选0.22μm过滤单元,过滤混合物。定义体积的滤液施加于适宜的分离柱,优选施加于适宜的疏水作用层析分离柱,更优选施加于使平衡于具有适宜pH的适宜平衡缓冲液中的乙酰化癸基胺琼脂糖(癸基-琼脂糖)柱,优选在丁二酸NaOH/溶液、具有适宜pH的NaCl的溶液中,优选具有pH6。所述柱用平衡缓冲液清洗。随后,用具有适宜pH的适宜洗脱液分步地洗脱所述柱,优选用具有适宜pH含有异丙醇的H3BO3/NaOH溶液,优选具有pH9。该步骤重复定义的次数,优选19次(共20次)。将所有洗脱液合并并用适宜液体,优选水,稀释至定义体积。经稀释的脂肪酶施加于适宜的分离柱,优选施加于适宜的离子交换色谱柱,更优选Q-琼脂糖FF柱,使平衡于适宜的平衡缓冲液,优选施加于具有适宜pH(优选具有pH9)的H3BO3/NaOH溶液。用平衡缓冲液清洗所述柱。随后用适宜的洗脱液洗脱所述柱,优选线性梯度液体,更优选线性NaCl梯度(0→0.5M)超过适宜倍数的柱体积,优选3倍柱体积。经洗脱的脂肪酶峰转移至适宜溶液,优选具有适宜pH的HEPES/NaOH,NaCl溶液,CaCl2溶液,优选具有pH7,通过在适宜分离柱上交换缓冲液,优选在分子筛析色谱柱上,更优选葡聚糖凝胶G25柱。通过适宜的过滤单元,优选0.22μm过滤单元,过滤经缓冲液交换的脂肪酶。通过该方法获得的脂肪酶溶液作为脂肪酶参考标准使用。表征所述脂肪酶参考标准的蛋白质纯度,蛋白质含量和比活性。通过该纯化方法获得的脂肪酶参考标准显示高的或非常高的纯度,在优选的实施方式中,纯度高于99.9%(即,少于0.1%的杂质)。
本发明的另一实施方式涉及包含含有重组生产的纯化的微生物脂肪酶颗粒和任选地另外的常规药物助剂和/或赋形剂的药物组合物。对于所述药物组合物,包含纯化的脂肪酶的颗粒可以单独使用或与适合的常规药物助剂和/或赋形剂结合使用,优选与常规载体如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉;与赋形剂如结晶纤维素或微晶纤维素、纤维素衍生物、***胶、玉米淀粉或明胶;崩解剂,如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠;润滑剂,如加拿巴蜡、白蜡、虫胶、无水胶体二氧化硅、聚乙二醇(PEG,也已知为术语macrogo1)1500至20000,特别是PEG 4000,PEG 6000,PEG 8000,聚维酮,滑石粉、甘油单油酸酯(monolein)或硬脂酸镁;并且如果期望,与另外的助剂和/或赋形剂,像稀释剂、佐剂、缓冲试剂、湿润试剂、防腐剂如对羟基苯甲酸甲酯(E218),着色剂如二氧化钛(E171),和/或矫味剂如糖精,橙油、柠檬油和/或香草醛。根据本发明另外的常规药物助剂和/或赋形剂可以是选自材料如(i)一种或多种载体和/或赋形剂;或(ii)一种或多种载体、赋形剂、稀释剂和/或佐剂。
一般地,取决于涉及的医学适应症,所述本发明的药物组合物可以设计用于本领域已知的各种方式,包括肠内施用(通过消化道)和口服施用。优选口服施用形式。因此,所述药物组合物通常是固体形式,如胶囊、颗粒、微丸粒、微片剂、丸粒、丸剂、粉末、微球和/或片剂。优选胶囊、颗粒、微片剂、丸剂、粉末和/或片剂。对于本发明的目的,前缀“微”是用于命名口服药物剂型,如果所述口服药物剂型的直径或其尺寸(长度、高度、宽度)是等于或小于5mm的。医师将知道选择最适宜的用药途径和避免潜在的危险的或其它不便的用药途径。
根据本发明另外优选的实施方式,发明的药物组合物可以任选地另外装于一个或多个选自下组的包装:袋、泡罩(blister)或瓶。
在本发明一个优选的实施方式中,所述口服药物剂型是包含含有本发明的颗粒的药物组合物的胶囊。这些颗粒由以下物质组成:(1)10-90重量%的重组生产的纯化的微生物脂肪酶;(2)1-50重量%的蔗糖,(3)0-25重量%的羟丙基纤维素,和(4)10-90重量%的由微晶纤维素构成的空白丸心小球。更特别地,所述微丸粒或微球由以下物质组成:(1)20-50重量%的重组生产的纯化的微生物脂肪酶;(2)5-25重量%的蔗糖,(3)0-5重量%的羟丙基纤维素,和(4)30-60重量%的由微晶纤维素构成的空白丸心小球。
在药物组合物中重组生产的纯化的微生物脂肪酶总量可以在适用于本发明背景下的脂肪酶组内变化。通常在所得的本发明的药物组合物或药物中,重组生产的纯化的微生物脂肪酶的量必须是对预防或治疗疾病和紊乱有治疗效果的,优选疾病和紊乱选自包含消化紊乱、胰腺分泌不足、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的组。预期的每日临床剂量的实例如下(全都以mg纯化的脂肪酶蛋白每kg体重):0.01-1000,0.05-500,0.1-250,0.5-100,或1.0-50mg/kg体重。
本发明的还另一实施方式涉及包含含有重组生产的纯化的微生物脂肪酶的颗粒的新颖药物组合物,用作药物,特别是用于预防和治疗疾病和紊乱的药物,优选消化紊乱、胰腺分泌不足、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。
本发明的另一实施方式涉及包含含有重组生产的纯化的微生物脂肪酶的颗粒的新颖药物组合物用于预防和治疗疾病和紊乱,优选消化紊乱、胰腺分泌不足、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。
本发明的还另一实施方式涉及预防或治疗疾病和紊乱的方法,优选通过施用于需要其的哺乳动物,特别是人的消化紊乱、胰腺分泌不足、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病,治疗有效量的i)具有蛋白质纯度至少90面积%(w/w)和蛋白质含量至少60%(w/w)的重组生产的纯化的微生物脂肪酶,或ii)如本文所描述的药物组合物。
使用源自微生物的酶也允许相应的酶的单独定量。通过对每个酶使用适宜的装置,所述剂量可以适合于具体病人、病人群体或病人亚群的个别需求。如果例如给定病人的生理条件需要施用高量的脂肪酶活性,可以配制包含更多脂肪酶的颗粒,而给予的包含蛋白酶和/或淀粉酶的颗粒数量(和因此蛋白酶和/或淀粉酶活性)保持相同。在优选的实施方式中,适宜的装置是用于定量的装置。在另外的优选的实施方式中,适宜的装置是用于药物使用的一般的分注器。
根据本发明,发明的药物组合物的优选实施方式包含颗粒,特别是核芯颗粒和包衣层也适用于所述药物组合物。
本发明另外的实施方式涉及制备包含含有纯化的脂肪酶的颗粒的新颖药物组合物的工艺,包含以下步骤或由以下步骤组成:
a)提供制药学可接受的核芯颗粒,
b)提供包衣溶液,其包含至少一种具有纯度至少90面积%和蛋白质含量至少60%(w/w)的重组生产的纯化的微生物脂肪酶,
c)用步骤b)的包衣溶液包衣步骤a)的核芯颗粒一次或多次,以得到含有至少一种重组生产的纯化的微生物脂肪酶的颗粒,和
d)任选地向适宜的药物组合物中混合入步骤c)的颗粒。
在工艺步骤a),提供如上文所描述的制药可接受的核芯颗粒。
优选通过在适宜用于所述目的的溶剂中,优选在水中,更优选在纯化的(药物级别)水中分散或溶解固体形式的重组生产的纯化的微生物脂肪酶,获得步骤b)的包衣溶液。优选在工艺步骤b)中仅使用一种重组生产的纯化的微生物脂肪酶。可以向悬浮液或溶液添加如上文所描述的一种或多种酶稳定试剂和/或一种或多种粘合剂。如果期望,也可以添加另外的药物助剂和/或赋形剂。如果需要,所述包含重组生产的纯化的微生物脂肪酶的包衣溶液优选在如不会负面影响酶活性和抑制微生物生长的低温贮藏。优选地,所述包衣溶液贮藏在大约0℃至10℃,更优选地大约2℃至8℃,更优选地大约5℃。
在制备工艺的优选实施方式中,包衣步骤c)是在包衣室进行的,优选在流化床设备中。如果使用流化床包衣机,这可以例如是沃斯特设备(Wurster apparatus)。流化床包衣机优选装备有双-流体-喷嘴(two-fluid-nozzle)。然后称量需要或期望的核芯颗粒量并以本身已知的方式置入反应室,预热核芯颗粒至适宜包衣的温度。
然后在步骤c)通过本身已知的方式将来自步骤b)的包含重组生产的纯化的微生物脂肪酶的溶液喷雾于核芯颗粒上,包衣核芯颗粒,其中包含重组生产的纯化的微生物脂肪酶的溶液的温度优选保持在不负面影响酶活性的温度或温度范围,即所述温度通常保持在100℃以下,优选90℃以下。
所述包衣颗粒的产品温度优选控制在不超过负面影响所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶的酶活性的温度。据此,所述包衣颗粒的温度控制在不超过大约30℃至90℃的温度范围,优选大约45℃至70℃,优选大约49℃。所述产品温度可以以本身已知的方式例如通过干燥用空气的温度控制。
一旦所有包含步骤b)的重组生产的纯化的微生物脂肪酶所希望的包衣溶液被喷雾于核芯颗粒上,优选关闭反应室的加热装置并且终止所述过程。如果需要,可以随即将所得颗粒以常规方法干燥。如果期望,包衣过程可以重复一次或多次,以便对核芯颗粒施加一个或多个额外的包衣层。所述额外的包衣层可以包含相同的或不同的重组生产的纯化的微生物脂肪酶。在优选的实施方式中,所述附加的包衣层包含相同的重组生产的纯化的微生物脂肪酶。为了达到所期望厚度的包衣层,所述包衣过程可以连续地或非连续地进行。
在另外的实施方式中,本发明涉及含有包含重组生产的纯化的微生物脂肪酶的颗粒或由其组成的药物组合物,所述药物组合物可通过本文所描述的制备新颖药物组合物的工艺得到。
本文所描述的和主张的本发明,不限于本文特定实施方式所揭示的范围,因为这些实施方式意欲作为本发明几方面的例证。任何等价的实施方式是意欲在本发明范围内的。实际上,除了本文显示和描述的以外,由以上的描述,各种修改将是对于本领域技术人员显而易见的。这些修改也是意欲在附属的权利要求范围之内的。在争端的情况下,以本申请公开的内容包括定义来确定。
本文引用的各种参考,所公开的内容通过参考以其整体并入。
实施例:
1.回收和纯化重组生产的微生物脂肪酶
a)回收源自Humicula lanuginosa的脂肪酶
SEQ ID NO:1的脂肪酶表达于稻曲霉菌,并且如描述于美国专利号5,869,438实施例22和23地从发酵液中纯化。所述脂肪酶被识别为大约30kDa的主要蛋白质条带。通过光密度扫描考马斯染色的SDS-PAGE的凝胶发现,该条带构成蛋白质谱的92-97%。所述光密度计是来自BIO-RAD的GS-800标刻度的光密度计。该蛋白质条带的表征如描述于实施例11地进行。
将喷雾干燥获得的液体脂肪酶浓缩物喷雾干燥,以获得固体脂肪酶浓缩物。
回收的固体脂肪酶浓缩物的比活性可以如描述于实施例8地测定。其是至少1Mio U/g。
回收的固体脂肪酶浓缩物的蛋白质含量如描述于实施例6地测定。所述蛋白质含量是至少50%(w/w)。
回收的固体脂肪酶浓缩物的蛋白质纯度如描述于实施例10地测定。所述蛋白质纯度是大约94面积%
b)纯化源自Humicula lanuginosa的脂肪酶
在干燥之前,将在上文步骤a)获得的脂肪酶在接近其pI的pH和低导电性下结晶。通过离心重复分离所述结晶,用缓冲溶液清洗并再次通过离心分离(共2-3次)。通过加入NaOH提高pH以溶解所述脂肪酶结晶,并且如果期望,过滤所得的纯化的液体脂肪酶浓缩物。
喷雾干燥所获得的纯化的液体脂肪酶浓缩物,以获得纯化的固体脂肪酶浓缩物。
获得的固体脂肪酶浓缩物的蛋白质含量如描述于实施例6地测定。所述蛋白质含量是大约80%(w/w)。
获得的固体脂肪酶浓缩物的蛋白质纯度如描述于实施例10地测定。所述蛋白质纯度是大约99面积%。
2.从重组生产的纯化的微生物脂肪酶制备根据本发明的颗粒
称量900g蔗糖和150g羟丙基纤维素,并搅拌入17kg纯化水中。使用0.71mm滤网筛选如获得自实施例1的所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶(=纯化的固体脂肪酶浓缩物)3-kg-级分,并搅拌入制备的蔗糖/羟丙基纤维素溶液中。装备有双流体喷嘴的流化床包衣机和沃斯特设备预热至大约50℃。称量3kg具有500μm平均直径的微晶纤维素丸粒,并置入流化床包衣机,并且预热至大约50℃的产品温度。通过本身已知的方式在所述丸粒上喷雾所述纯化的脂肪酶溶液包衣所述丸粒。在喷雾期间,所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶溶液保持在5±3℃。通过控制干燥用空气的温度,将产品温度控制在不超过55℃,优选大约49℃。一旦所有重组生产的纯化的微生物脂肪酶溶液被喷雾于丸粒上,就关闭流化床干燥机的加热器,并在另外五分钟后终止所述过程。包装并测试所述产品。
3.用重组生产的纯化的微生物脂肪酶(50mg)包衣的丸粒的包囊
将要填充入胶囊的用重组生产的纯化的微生物脂肪酶包衣(得到颗粒)的丸粒需要量,根据如下公式计算:
填充重量=50mg×1000/颗粒的脂肪酶蛋白质含量(mg/g)
将计算量的丸粒包入硬明胶胶囊,尺寸2。包装并测试所述产品。也可以用根据实施例12或13包衣的颗粒填充胶囊。
4.通过不根据本发明的挤出工艺生产包衣重组生产的纯化的微生
物脂肪酶的丸粒
在混合器中干燥-预混合750g来自实施例1的重组生产的纯化的微生物脂肪酶(=纯化固体脂肪酶浓缩物)和750g微晶纤维素。在加入1171g异丙醇后,用常规的挤出机通过具有0.8mm直径的孔的模具混合并挤出70%的量,以便形成圆柱丸粒。在压制过程中所述小球的温度不超过50℃。生产的挤出物通过加入必需量的异丙醇(70%)用常规搓圆机(spheronizer)整圆成球形丸粒。在真空干燥器中提供的大约40℃温度下干燥所述丸粒(产品温度不超过45℃)。利用具有0.7和1.4mm网格的机械筛选机进行所述干燥丸粒的分离。收集≥0.7mm和≤1.4mm的筛分级分用于进一步加工。淘汰超尺寸和尺寸不足的丸粒并保存用于其它用途。
5.比较根据本发明的颗粒和不根据本发明的丸粒
进行比较试验,以测定如此获得的脂肪酶的活性和蛋白质纯度,即,当制备i)包含重组生产的纯化的微生物脂肪酶的丸粒,通过挤出工艺(不根据本发明)和ii)包含重组生产的纯化的微生物脂肪酶的颗粒,通过包衣核芯颗粒(根据本发明)时。
包含重组生产的纯化的微生物脂肪酶的丸粒是使用挤出工艺(如实施例4中所述)制备的。包含重组生产的纯化的微生物脂肪酶的颗粒是通过包衣核芯颗粒(如实施例2所述)制备的。在各丸粒和颗粒中,重组生产的纯化的微生物脂肪酶的活性如描述于实施例7地测定。重组生产的纯化的微生物脂肪酶的蛋白质纯度如描述于实施例10地测定。
表1:比较在不根据本发明的丸粒和根据本发明的颗粒中的脂肪酶活性和蛋白质纯度
纯化的脂肪酶(起始材料) | 通过挤出制备的丸粒 | 通过包衣核芯颗粒制备的颗粒 | |
脂肪酶活性(%回收率,对工艺产率修正) | - | 94.1 | 96.4 |
蛋白质纯度(%)(HPLC) | 99.9 | 97.1 | 99.6 |
由表1可以看出,与通过不根据本发明的挤出工艺制备的重组生产的纯化的微生物脂肪酶丸粒相比,所述通过根据本发明的工艺制备的重组生产的纯化的微生物脂肪酶的颗粒显示更高的活性和更高的纯度。
6.使用RP-HPLC测定重组生产的纯化的微生物脂肪酶的蛋白质含
量
通过用乙腈/水/TFA的梯度RP-HPLC在214nm波长下测定自实施例1的重组生产的纯化的微生物脂肪酶的蛋白质含量。在YMC Protein RP,S-5μm柱,125×3mmI.D.(YMC Europe GmbH,Schermbeck,德国)上通过在50分钟内低流速1.0ml/min下运行梯度从0至90%乙腈/TFA0.05%进行分离。待测样本溶于2%(w/w)的氯化钠水溶液。所述柱在40℃操作。脂肪酶蛋白质含量的分析通过外标法进行。使用经良好表征的脂肪酶参考标准作为参考,其中通过氨基酸分析(通过HPLC分析水解后衍生化的氨基酸的含量)独立地测定了绝对蛋白质含量。根据面积%方法进行所有峰的量化并脂肪酶峰的面积%表达为总面积的百分比。
7.测定脂肪酶活性
通过基于脂肪酶水解橄榄油和滴定释放的脂肪酸的酶分析测定分解脂肪的活性,如下:
将作为酶分析底物的橄榄油(175g)与630ml***胶溶液(474.6g***胶,64g氯化钙,于4000mL水中)在混合器中混合15分钟,以获得乳液。冷却至常温后,使用4M NaOH调节pH到6.8至7.0。为了测定,在反应容器中混合19mL乳液和10mL胆盐溶液(492mg胆盐溶于水,加水至500mL)并加热到36.5℃至37.5℃。通过加入1.0mL酶溶液起始反应。通过总计5分钟加入0.1M氢氧化钠,在pH7.0时自动滴定释放的酸。从第一和第五分钟之间的滴定曲线的斜度计算活性。为了校准,将标准在三个不同的活性水平进行测量。该参考标准具有定义的绝对活性,其中1单位定义为在pH7.0温度37℃一分钟内水解1μ当量酸的酶活性。
8.测定重组生产的纯化的微生物脂肪酶的比活性
比活性是通过滴定测定的分解脂肪的活性(见实施例7)与通过HPLC测定的蛋白质含量(见实施例6)的比率以脂肪酶单位/g(U/g)计算的。
9.测定基于组合物总重量的酶活性
酶活性是通过滴定测定的分解脂肪的活性(见实施例7)与以常规方法测定的包含于发明的药物组合物颗粒(如描述于实施例2地制备)的总重量,或除以挤出丸粒(如描述于实施例4地制备)的总重量的比率来计算的。
10.测定蛋白质纯度
通过色谱法测定脂肪酶制剂或重组生产的纯化的微生物脂肪酶的蛋白质纯度。为了该目的,通过使用如用于分析蛋白质含量(见实施例6)的同样的HPLC方法,分析肽杂质的百分比。从主要化合物脂肪酶中分离所述肽杂质,并计算为峰面积%。
11.鉴定重组生产的纯化的微生物脂肪酶
通过该主要蛋白质条带(见实施例1)的N末端测序鉴定以下SEQ IDNO:1的微小差异N末端形式,以下根据丰度列出。各种形式的量是通过N末端测序测定的,测序通过比较在埃德曼降解第一次循环中各种形式的最初收益。样本中五种N末端形式的收率也列出:
#1SPIRREVSQDLF...(SEQ ID NO:1的氨基酸-5-269)45-65%
#2EVSQDLF...(SEQ ID NO:1的氨基酸1-269)35-47%
#3VSQDLF...(SEQ ID NO:1的氨基酸2-269)<1%至16%
#4PIRREVSQDLF...(SEQ ID NO:1的氨基酸-4-269)<1%
#5IRREVSQDLF...(SEQ ID NO:1的氨基酸-3-269).<1%
两种主要形式#1和#2发现于所有批次中,形式#3发现于一些批次中但不是所有批次中,并且形式#4和#5以非常少量发现于一些批次(接近于或低于检测限)。
认为,这些变体是作为内源性曲霉属宿主蛋白酶的裂解的结果形成的。例如,#2可能是由于#1通过KexB蛋白酶裂解,#3通过KexB并且然后通过氨肽酶裂解,和#4和#5通过氨肽酶裂解形成的。
基于N末端测序的量化通过电喷雾电离质谱(“ESI-MS“)被证实,其显示匹配质量的强度。
#1,#2,和#3之间的差别分别地导致了不同的理论pI值5.45,5.11,和5.23。相应地,这三种形式通过IEF(等电聚焦)分离,即在pH 3-7IEF凝胶上。通过N末端测序印记的IEF凝胶确认条带。相应地IEF是用于检测和量化SEQ ID NO:1的形式#1,#2,和#3的简单和快捷的方法。
发现SEQ ID NO:1的形式#1和#2具有相同的以LU/g酶蛋白的比活性。特异脂肪酶活性如描述于实施例7和实施例8地测定。
氨基酸分析(“AAA”)/(mg/ml):使脂肪酶样本的肽键受酸水解,随后通过在从Bie & Berntsen A/S,Sandbaekvej 5-7,DK-2610Roedovre,Denmark商购可得的Biochrom 20Plus Amino Acid Analyser上根据制造商的说明分离和纯化释放的氨基酸。各单个氨基酸的量通过与茚三酮反应测定。
各种脂肪酶批次的ESI-MS数据也清晰地显示了,复合糖基化模式符合高甘露糖糖基化,同时许多质量峰被相应于一个己糖的分子量分开。
SEQ ID NO:1包含一个假定的N糖基化位点(NIT),N是SEQ ID NO:1的残基数值33。在真菌表达宿主中,作为翻译后修饰的结果N-乙酰葡萄糖胺残基将被链接到在NIT序列的N-残基,并且许多甘露糖单体(从5至21)将依次地附在N-乙酰葡萄糖胺残基上。这导致了单个糖基化的分子在分子量上的巨大变化。通过ESI-MS分子量范围为大约30-34kDa。典型的全长糖基化蛋白的异构形式(2N-乙酰基己糖+8己糖)的分子量通过ESI-MS测定为31,721Da。未糖基化的#1和#2的理论分子量分别地是30.2kDa和29.6kDa。这表示,当在未糖基化的宿主中表达时在SDS-PAGE凝胶上的主要条带较窄,并且相应的分子量在大约30kDa。全长脱糖基化蛋白的分子量通过ESI-MS测定为30,015Da。
SEQ ID NO:1的变体N33Q(保守置换)即使在真菌宿主中表达,将不被糖基化。SEQ ID NO:1的未糖基化的N33Q变体在生物体内脂肪酶筛选测试中显示与SEQ ID NO:1相似的功效。
12.包含重组生产的纯化的微生物脂肪酶的颗粒的肠溶包衣
通过在室温搅拌下将1623.2g羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸盐(HP55)、90.2g柠檬酸三乙酯、34.3g鲸蜡醇和38.9g二甲硅油1000加入14030g丙酮中,制备包衣溶液。
向商购可得的流化床包衣机中投入5025g颗粒(通过类似描述于实施例2的工艺制备),并以50-100g/min的喷雾速率和在1.5-2.5巴气压下用以上制备的包衣溶液喷雾包衣,直到达到所期望的包衣薄膜厚度。
13.非功能性包衣包含重组生产的纯化的微生物脂肪酶的颗粒
通过在室温搅拌下将29.4g羟丙基甲基纤维素(HPMC E3PremiumLV)加入363.2g纯化的水中,制备包衣溶液。
向商购可得的流化床包衣机中投入500g颗粒(通过类似描述于实施例2的工艺制备),并以3-6g/min喷雾速率和在0.8-1.2巴气压下用以上制备的包衣溶液喷雾包衣,直到达到所期望的包衣薄膜厚度。
脂肪酶丸粒的产品温度用适宜的温度传感器监控,并在包衣期间维持在40℃和50℃之间的范围。
14.脂肪酶参考标准(LRS)
(i).制备脂肪酶参考标准(LRS)
使用如描述于实施例1获得的固体脂肪酶浓缩物(20g)作为起始材料。所述起始材料悬浮于180mL去离子水中(用20%乙酸调节pH至pH 6.0)。加入200mL 10mM丁二酸/NaOH溶液和2.0M NaCl溶液,并调节pH至pH 6.0,以得到几乎澄清溶液。然后通过0.22μm的过滤单元过滤所述混合物。20mL滤液施加到,在10mM丁二酸/NaOH,2.0MNaCl溶液,pH6.0的溶液中平衡的20mL乙酰化癸基胺琼脂糖(癸基-琼脂糖)柱(通过疏水作用层析HIC分离)。用平衡缓冲液彻底清洗柱后,用pH 9.0含有30%异丙醇的50mM H3BO3/NaOH溶液分步洗脱柱。所述癸基-琼脂糖步骤重复19次(共20次)。合并所有洗脱液(250ml),并用去离子水稀释至15L。将经洗脱的脂肪酶施加到,在pH 9.0的50mMH3BO3/NaOH溶液中平衡的400mL Q-琼脂糖FF柱中(通过离子交换色谱法分离)。彻底清洗柱,并用超过3倍柱体积的线性NaCl梯度(0→0.5M)洗脱柱。经洗脱的脂肪酶峰(200mL)通过在1.4L葡聚糖凝胶G25柱(通过分子筛析色谱法SEC分离)上缓冲液交换,转移到pH 7.0的20mMHEPES/NaOH,100mM NaCl溶液,1mM CaCl2溶液。在0.22μm的过滤单元中过滤经缓冲液交换的脂肪酶(300mL)(=终产物,290mL)并以等分试样(5×50ml,1×30ml,1×10ml)冷冻。
通过该工艺获得的脂肪酶溶液作为脂肪酶参考标准(LRS)使用。
(ii).表征
a)一致性
脂肪酶参考标准的鉴定是通过如下证实的,即通过完整的和去糖基化的蛋白质的ESI-MS和用赖氨酰基内肽酶(LysC)进行切割的PMF(包括ESI-MS/MS),该切割涉及关于N末端加工和糖基化的脂肪酶的典型变体。此外,二硫键连接性是通过如下证实的,即通过无还原和还原性烷基化的蛋白质消化同时通过LC/MS鉴定片段。
b)蛋白质纯度
如描述于实施例6地测定所述脂肪酶参考标准的蛋白质纯度。所述脂肪酶参考标准仅显示了小于0.1%量的杂质。
c)含量
通过在使用6N HCl溶液于110℃在适当的真空水解达16小时后的氨基酸分析,测定所述脂肪酶参考标准的含量。通过具有柱后衍生化(茚三酮)的离子交换色谱法进行分离。
d)比活性
如描述于实施例8地测定所述脂肪酶参考标准的比活性。
15.与脂肪酶参考标准的比活性相比较的所述重组生产的纯化的微
生物脂肪酶的比活性
如描述于实施例1获得的固体脂肪酶浓缩物(20g)作为起始材料使用。
a)制备和表征所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶
如描述于实施例1地制备重组生产的纯化的微生物脂肪酶。测定所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶的脂肪酶活性和比活性,如描述于实施例7和8地进行。
b)制备和表征所述脂肪酶参考标准
如描述于实施例14地制备和表征所述脂肪酶参考标准。
c)对比
对于纯化的脂肪酶批次的结果显示于表2中。所述脂肪酶参考标准(LRS)的比活性为1.821.000单位/g。
表2:对于不同重组生产的纯化的微生物脂肪酶批次的结果
纯化的脂肪酶批次# | A | B | C | D | E | F | G |
脂肪酶活性[U/g材料] | 1326409 | 1197396 | 1268180 | 1300219 | 1361471 | 1268226 | 1303934 |
蛋白质含量(脂肪酶)[%] | 79.7 | 80.6 | 79.1 | 80.6 | 83.1 | 80.7 | 83.9 |
比活性[U/g] | 1664252 | 1485603 | 1603262 | 1613175 | 1638353 | 1571532 | 1554153 |
%LRS(1)[%] | 91.39 | 81.58 | 88.04 | 88.59 | 89.97 | 86.30 | 85.35 |
(1):%LRS=100×重组生产的纯化的微生物脂肪酶的比活性/LRS的比活性
重组生产的纯化的微生物脂肪酶批次的比活性是脂肪酶参考标准比活性的至少80%。
序列表
<110>Solvay Pharmaceuticals GmbH
<120>包含含有纯化的脂肪酶颗粒的药物组合物
及其用于预防或治疗消化紊乱的方法
<130>SPH0801WO
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>274
<212>PRT
<213>Humicola lanuginosa
<220>
<221>变体
<222>(1)..(274)
<220>
<221>成熟_肽
<222>(6)..(274)
<400>1
Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Ash
-5 -1 1 5 10
Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp
15 20 25
Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu
30 35 40
Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly
45 50 55
Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu
60 65 70 75
Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly
80 85 90
Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys
95 100 105
Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr
110 115 120
Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg
125 130 135
Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala
140 145 150 155 160
Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr
160 165 170
Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val
175 180 185
Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Ash Asp Ile Val
190 195 200
Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu
205 210 215
Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Arg Arg Arg Asp Ile
220 225 230 235
Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn
240 245 250
Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr
255 260 265
Cys Leu
<210>2
<211>269
<212>PRT
<213>Humicola Ianuginosa
<220>
<221>成熟_肽
<222>(1)..(269)
<400>2
Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr
20 25 30
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp
35 40 45
Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr
50 55 60
Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe
65 70 75 80
Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp
85 90 95
Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly
100 105 110
Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val
115 120 125
Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly
130 135 140
His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg
145 150 155 160
Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val
165 170 175
Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr
180 185 190
Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro
195 200 205
Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser
210 215 220
Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly
225 230 235 240
Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro
245 250 255
Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu
260 265
Claims (17)
1.包含颗粒的药物组合物,所述颗粒含有
a)制药学可接受的核芯颗粒和
b)至少一种包衣在所述核芯颗粒上的包衣层,所述包衣层包含至少一种重组生产的纯化的微生物脂肪酶,
其中所述重组生产的纯化的微生物脂肪酶具有至少90面积%(w/w)的蛋白质纯度和至少60%(w/w)的蛋白质含量。
2.根据权利要求1的药物组合物,其中所述纯化的微生物脂肪酶的比活性是其最大比活性的至少80%。
3.根据权利要求1的药物组合物,其中所述包衣层b)另外包含一种或多种酶稳定剂。
4.根据权利要求3的药物组合物,其中所述酶稳定剂为非还原性碳水化合物。
5.根据权利要求4的药物组合物,其中所述非还原性碳水化合物选自由蔗糖、海藻糖和麦芽糖醇组成的组。
6.根据权利要求1至5任何一项的药物组合物,其中所述包衣层b)另外包含一种或多种粘合剂。
7.根据权利要求6的药物组合物,其中所述粘合剂选自由羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、糊精和聚乙烯醇组成的组。
8.根据权利要求1的药物组合物,其中至少一种纯化的微生物脂肪酶是源自Humicula lanuginosa的脂肪酶。
9.根据权利要求1的药物组合物,另外含有常规药物助剂和/或赋形剂。
10.根据权利要求9的药物组合物,其是以适合口服施用的剂型的。
11.根据权利要求10的药物组合物,其是以胶囊、颗粒、微片剂、丸剂、粉末、袋剂和/或片剂形式的。
12.根据权利要求1的药物组合物,用于预防和治疗消化紊乱、胰腺分泌不足、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病。
13.根据权利要求1的药物组合物的用途,其用于制备预防和治疗消化紊乱、胰腺分泌不足、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的药物。
14.预防和治疗消化紊乱、胰腺分泌不足、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的方法,其是通过施用具有至少90面积%的蛋白质纯度和至少60%(w/w)的蛋白质含量的治疗有效量的重组生产的纯化的微生物脂肪酶于需要其的哺乳动物。
15.预防和治疗消化紊乱、胰腺分泌不足、胰腺炎、囊性纤维化、I型糖尿病和/或II型糖尿病的方法,其是通过施用治疗有效量的根据权利要求1的药物组合物于需要其的哺乳动物。
16.用于制备药物组合物的方法,其包括以下步骤:
a)提供制药学可接受的核芯颗粒,
b)提供包衣溶液,其包含至少一种具有至少90面积%的纯度和至少60%(w/w)的蛋白质含量的重组生产的纯化的微生物脂肪酶,
c)用步骤b)的包衣溶液包衣步骤a)的核芯颗粒一次或多次,以得到含有至少一种重组生产的纯化的微生物脂肪酶的颗粒,和
d)任选地向适宜的药物组合物中混合入步骤c)的颗粒。
17.可通过根据权利要求16的方法获得的药物组合物。
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