ES2834483T3 - Composiciones farmacéuticas de pancreatina de alta potencia - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la preparación de HA-pancreatina derivada de mamíferos que incluye lipasas, proteasas y amilasas, que tiene una actividad lipasa específica de al menos 120 UI/mg, que comprende: a1.1) suspender la pancreatina de mamífero inicial y precipitar una primera porción insoluble en un disolvente que tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand de 38 (MPa)0,5; a1.2) separar la porción soluble de la etapa a1.1 de la primera porción insoluble; a1.3) precipitar una segunda porción insoluble al añadir a la porción soluble de la etapa a1.2 al menos un disolvente orgánico de esta para obtener una mezcla que tenga un parámetro de solubilidad de Hildebrand de 36; a2) separar la segunda porción insoluble de la etapa a1.3 de la porción soluble; a3.1) secar la primera porción insoluble de la etapa a1.2; a3.2) secar la segunda porción insoluble de la etapa a2; a4) mezclar la primera porción insoluble de la etapa a3.1 con la segunda porción insoluble de la etapa a3.2, en el que (i) dicho disolvente usado en la etapa a1.1 es una mezcla de acetona y solución tampón que tiene un pH de 7, (ii) la temperatura del procedimiento es de 4 °C, (iii) la mezcla de la etapa a1.3 es una mezcla de acetona y solución tampón que tiene un pH de 7, y (iv) la pancreatina de la etapa a1.1 está en una cantidad de 0,1 g/mL.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones farmacéuticas de pancreatina de alta potencia

Campo

La presente invención está dirigida a un procedimiento de producción de enzimas de HA-pancreatina derivadas de mamíferos. En la presente memoria son divulgadas composiciones farmacéuticas de alta potencia que incluyen enzimas de pancreatina de alta actividad (HA-pancreatina). También son divulgadas en la presente memoria composiciones o formas de dosificación y procedimientos para su uso.

Antecedentes

La insuficiencia pancreática exocrina (IPE), de la que la FDA estima que sufren más de 200.000 estadounidenses, implica un trastorno fisiológico en el que las personas son incapaces de digerir adecuadamente los alimentos debido a la falta de enzimas digestivas producidas por el páncreas. Esta pérdida de enzimas digestivas conduce a trastornos tales como mala digestión y absorción de nutrientes, que conducen a desnutrición y otras condiciones fisiológicas consecuentes e indeseables asociadas con la misma. Estos trastornos son comunes para quienes padecen fibrosis quística (FQ) y otras afecciones que comprometen la función exocrina del páncreas, tales como el cáncer de páncreas, la pancreatectomía y la pancreatitis. La desnutrición puede ser potencialmente mortal si no se trata, particularmente en el caso de bebés y pacientes con FQ. El trastorno puede provocar un crecimiento deficiente, una respuesta inmunitaria comprometida y una esperanza de vida más corta.

Pueden administrarse enzimas digestivas, tales como las enzimas pancrelipasa y otros productos de enzimas pancreáticas (PEP) para remediar, al menos parcialmente, la IPE. Las enzimas digestivas administradas permiten a los pacientes digerir sus alimentos de manera más eficaz.

Las enzimas de pancrelipasa usadas para tratar la IPE son principalmente una combinación de tres clases de enzimas: lipasa, amilasa y proteasa, junto con otras enzimas como elastasas, fosfolipasas y colesterasas, entre otras, y varios cofactores y coenzimas. Estas enzimas se producen de forma natural en el páncreas y son importantes en la digestión de grasas, proteínas y carbohidratos. Las enzimas catalizan la hidrólisis de las grasas en glicerol y ácidos grasos, del almidón en dextrina y azúcares y de las proteínas en aminoácidos y sustancias derivadas. La digestión es, sin embargo, un procedimiento complejo que involucra muchas otras enzimas y sustratos que contribuyen al correcto funcionamiento digestivo y a la producción de toda la gama de productos digestivos. Las enzimas de pancrelipasa pueden prepararse de glándulas pancreáticas porcinas. Otras fuentes de pancrelipasa incluyen las glándulas pancreáticas bovinas y/o los jugos pancreáticos. La fuente natural de mamíferos de estas enzimas da como resultado un producto con una composición enzimática similar a la secretada por el páncreas humano. También pueden usarse otras fuentes que no sean de mamíferos, por ejemplo, las descritas en US 6,051,220, US 2004/0057944, 2001/0046493 y/o WO2006044529.

Si bien los productos que contienen pancrelipasa pueden ofrecer una terapia eficaz, existen problemas con la misma. La necesidad de varias (4-9) cápsulas relativamente grandes (gran cantidad de píldoras) con cada comida disminuye la adherencia del paciente a la dosificación. También se ha observado que la posible contaminación microbiana y viral consecuente de una gran carga de píldoras es indeseable. Todos estos problemas están relacionados con que el extracto de enzima sea menos puro. El problema de la pureza es una consecuencia de los procesos de extracción de enzimas que se han implementado por muchos años, lo que implica la formación de una mezcla o suspensión acuosa gruesa, precipitación con alcohol, centrifugación y filtración. Estos procedimientos de extracción dan lugar a productos finales que pueden contener tan solo un 25 % de proteína. Por ejemplo, la lipasa, una enzima importante en términos de eficacia en estos extractos de pancrelipasa, tiene una actividad en la región de 100 UI/mg. Esto contrasta con la actividad de la lipasa porcina pura, que tiene una actividad de aproximadamente 25.000 UI/mg (tal como la lipasa porcina pura disponible en Sigma Aldrich). Mediante el uso de esta aproximación como base para el cálculo, puede estimarse que los productos contienen menos del 0,5 % de lipasa activa. Asimismo, la consecuencia adicional de la presencia de un exceso de material inactivo es que cualquier contaminación infecciosa puede formar parte inevitablemente de este volumen y, en consecuencia, también ingerirse junto con los componentes activos deseables de la mezcla. El exceso de materiales inactivos también interfiere con técnicas destinadas a reducir la carga biológica, por ejemplo, a través de la obstrucción de filtros de membrana o columnas de filtración y protegiendo al extracto de la radiación ionizante útil para disminuir su potencial carga infecciosa.

Varias enzimas simples puras y una mezcla de tres enzimas simples, en un caso, han entrado en desarrollo clínico para el tratamiento de IPE. Estas son lipasa estimulada por sales biliares recombinantes (BSSL) (EXINALDA™/KIOBRINA®); una lipasa humana recombinante contenida en la leche materna MERISPASE®; una lipasa gástrica canina recombinante MS1819; una lipasa y liprotamasa recombinantes; una mezcla que consiste en una lipasa bacteriana recombinante químicamente reticulada; y una proteasa y una amilasa extraídas de fuentes microbianas. Hasta ahora, todas estas terapias experimentales, no han logrado demostrar un nivel de eficacia de tratamiento comparable al de los extractos enzimáticos comerciales de páncreas porcino tales como ZENPEP® o ULTRESA®. Asimismo, una reunión del consejo asesor de la FDA el día 12 de enero de 2011 votó en contra de la aprobación de la liprotamasa debido a su menor eficacia en términos de aumento del coeficiente de absorción de grasas (CFA) en comparación con la obtenida previamente con los productos de extracto de pancrelipasa.

Existe una clara necesidad de un producto que esté más concentrado y purificado en comparación con los productos existentes que contienen pancrelipasa, pero que mantenga su eficacia para el tratamiento de IPE, ya que esto permitiría producir productos mejores, más convenientes y potencialmente más seguros. Hay varios informes de la literatura que describen el uso de pancrelipasa como material de partida para el aislamiento de proteasas, lipasas o amilasas. Sin embargo, no hay informes de pancrelipasa del tipo que se encuentra en los PEP o productos similares que se purifiquen con el fin de crear un producto mejorado para uso terapéutico. En cada caso, los esfuerzos anteriores han sido purificar una enzima o fracción enzimática particular sobre otras o eliminar ciertos componentes sin aumentar materialmente la actividad enzimática general. En todos los casos también ha habido instrucciones para producir un producto de HA-pancreatina para su uso como agente terapéutico.

Los procedimientos de la técnica anterior para la purificación de proteínas tienen como objetivo extraer y aislar una fracción simple rica en proteínas, como lo ejemplifica la pancrelipasa, o separar proteínas individuales o clases únicas de proteínas, por ejemplo, lipasas o proteasas.

Por ejemplo, Hwang y otros. (Ind. Eng. Chem. Res. 2007, 46, 4289) divulga una relación entre la solubilidad de las enzimas pancreáticas y la polaridad del disolvente e informa sobre la precipitación selectiva de lipasa, proteasa y amilasa de proteínas pancreáticas. Hwang y otros. muestran que la precipitación de la pancreatina aumenta cuando se usa un disolvente con polaridad reducida y que se maximiza cuando el disolvente tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand por debajo de 28 (MPa)05 La precipitación selectiva de amilasa y proteasa aumenta al disminuir la polaridad del disolvente por debajo de 34 (MPa)05, mientras que la precipitación selectiva de la lipasa es independiente de la polaridad de la solución, y no se recupera más del 65 % de la lipasa presente en la mezcla. De estos resultados, no hay ningún incentivo para purificar una mezcla de enzimas pancreáticas juntas para obtener una HA-pancreatina, y no hay ningún incentivo para que los expertos en la técnica conserven una mezcla de diferentes clases de enzimas durante la purificación. El hecho de que no se haya intentado purificar la pancrelipasa que se ha usado en productos terapéuticos durante más de 60 años es un fuerte indicador de que los beneficios de hacerlo no se han previsto ni apreciado. Todos los intentos de mejorar los productos de pancrelipasa se han centrado en enzimas individuales de fuentes no pancreáticas, enfatizando además que el uso de la pancrelipasa como fuente de enzimas más puras y/o más concentradas para la fabricación de productos mejorados no se ha apreciado anteriormente.

No hay ningún incentivo o razón para purificar la pancrelipasa, ya que se usa actualmente en aplicaciones farmacéuticas y de limpieza, con el objetivo de producir un producto con un perfil cualitativo y cuantitativo de actividad enzimática sustancialmente similar con una concentración de enzima varias veces mayor. De hecho, los productos actuales han cumplido su función de manera adecuada y, como tales, han permanecido sustancialmente sin cambios por más de 60 años, y parece que no hay descripciones en la técnica de los productos notablemente mejorados o los procedimientos de preparación asociados descritos en la presente memoria. Todos los productos que contienen enzimas puras para el tratamiento de IPE son en base a enzimas individuales o, en un caso, una mezcla de tres enzimas únicas puras y químicamente modificadas, de tecnología recombinante o fuentes microbianas. No ha habido ningún esfuerzo para purificar una mezcla que incluya proteasa, lipasa y amilasa de los extractos crudos de glándula de páncreas que se usan para el tratamiento de IPE, limpieza y digestión de tejidos. Asimismo, no ha habido incentivos o informes de que las enzimas de una fuente pancreática se purifiquen individualmente y luego se recombinen. Tal enfoque es contrario al objetivo de lograr una enzima o una clase de enzima aislada.

Resumen

La presente invención está dirigida a un procedimiento para la preparación de HA-pancreatina derivada de mamíferos que incluye lipasas, proteasas y amilasas, que tienen una actividad lipasa específica de al menos 120 UI/mg, que comprende

a1.1) suspender la pancreatina de mamífero inicial y precipitar una primera porción insoluble en un disolvente que tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand de 38 (MPa)05;

a1.2) separar la porción soluble de la etapa a1.1 de la primera porción insoluble;

a1.3) precipitar una segunda porción insoluble añadiendo a la porción soluble de la etapa a1.2 al menos un disolvente orgánico para obtener una mezcla que tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand de 36; a2) separar la segunda porción insoluble de la etapa a1.3 de la porción soluble;

a3.1) secar la primera porción insoluble de la etapa a1.2;

a3.2) secar la segunda porción insoluble de la etapa a2;

a4) mezclar la primera porción insoluble de la etapa a3.1 con la segunda porción insoluble de la etapa a3.2, en el que

i) dicho disolvente usado en la etapa a1.1 es una mezcla de acetona y solución tampón que tiene un pH de 7, ii) la temperatura del procedimiento es de 4 °C,

iii) la mezcla de la etapa a1.3 es una mezcla de acetona y solución tampón que tiene un pH de 7, y iv) la pancreatina de la etapa a1.1 está en una cantidad de 0,1 g/mL.

Las características preferidas de la invención se establecen en las reivindicaciones dependientes en la presente memoria.

La presente divulgación está dirigida a enzimas HA-pancreatina y composiciones farmacéuticas de alta potencia o formas de dosificación de estas. La presente divulgación también está dirigida a un procedimiento de alto rendimiento para producir HA-pancreatina y procedimientos para el uso de tal producto.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el espectro de absorción UV del extracto de pancreatina.

La Figura 2 muestra el Espectro de Absorción de UV del sobrenadante (A) y el precipitado que se disolvió nuevamente (B) resultante de la precipitación de la pancreatina con sulfato de amonio descrita en el Ejemplo 15. La Figura 3 muestra el espectro de absorción UV de los precipitados de sulfato de amonio sin lavar y lavados del Ejemplo 15.

La Figura 4 muestra el perfil de elución de la fracción de sulfato de amonio del Ejemplo 15. Las fracciones 4-8 muestran absorción a 280 nm, lo que indica la presencia de proteína.

La Figura 5 muestra el espectro de absorción de UV de las fracciones 6 y 10 del Ejemplo 15.

La Figura 6 muestra el perfil de elución de la fracción de sulfato de amonio del Ejemplo 17.

Descripción detallada

La presente divulgación está dirigida a una pancreatina de alta actividad (HA-pancreatina) que incluye clases de enzimas esenciales que tienen una actividad terapéutica eficaz y significativamente alta, más particularmente, que también tienen una menor carga biológica de componentes biológicos innecesarios y/o componentes potencialmente infecciosos indeseables. La presente invención está dirigida a un procedimiento para producir HA-pancreatina derivada de mamíferos, más particularmente, con un rendimiento muy alto. La HA-pancreatina permite la formulación de formas de dosificación más pequeñas y convenientes, particularmente formas de dosificación que pueden administrarse como una sola pastilla, formas de dosificación de partículas pequeñas para suspensión y formas de dosificación que pueden combinarse con otros ingredientes terapéuticos o útiles en una sola unidad de dosificación. Las composiciones de la presente divulgación pueden ser de particular valor para los pacientes que padecen IPE, tal como los pacientes con fibrosis quística. La presente divulgación también sería útil para formular formulaciones en las que la edad o el estado del paciente pueden requerir formas administrativas alternativas distintas de una cápsula, por ejemplo, suspensión y/o partículas. Una forma de dosificación, unidad o partícula más concentrada y, por tanto, más pequeña, sería de gran valor para este grupo de pacientes. La presente divulgación también permite la aplicación de tecnologías diseñadas para reducir o eliminar constituyentes biológicos innecesarios o indeseables tales como microbios y cualquier toxina asociada por las razones esbozadas anteriormente.

La presente divulgación está dirigida a enzimas HA-pancreatina (HA-pancreatina) y las composiciones farmacéuticas de alta potencia de estas. La HA-pancreatina puede ser de origen porcino. La HA-pancreatina incluye lipasa, proteasas y amilasa y tiene una actividad lipasa específica de al menos aproximadamente 120, o al menos aproximadamente 150, o al menos aproximadamente 200, o al menos aproximadamente 400, o al menos aproximadamente 500 UI/mg.

El término "enzima digestiva" usado en la presente memoria denota una enzima en el tracto alimentario que descompone los componentes de los alimentos para que puedan ser tomados o absorbidos por el organismo. Los ejemplos no limitantes de enzimas digestivas incluyen enzimas pancrelipasa (también conocidas como pancrelipasa o pancreatina), lipasa, colipasa, tripsina, quimotripsina, quimotripsina B, pancreatopeptidasa, carboxipeptidasa A, carboxipeptidasa B, glicerol esterolasa, esterol hidrolasa, elastasa, cininogenasa, ribonucleasa, desoxirribonucleasa, a-amilasa, papaína, quimopapaína, glutenasa, bromelina, ficina, p-amilasa, celulasa, p-galactosidasa, lactasa, sacarasa, isomaltasa y mezclas de estas.

El término "enzima pancreática", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquiera de los tipos de enzimas presentes en la secreción pancreática, tales como amilasa, lipasa, proteasa o mezclas de estas, o cualquier extractor de origen pancreático que tenga actividad enzimática, como la pancreatina.

Los términos "enzimas pancrelipasa" o "pancrelipasa" o "pancreatina" denotan una mezcla de varios tipos de enzimas, incluidas las enzimas amilasa, lipasa y proteasa. La enzima pancrelipasa está disponible comercialmente, por ejemplo, en Nordmark Arzneimittel GmbH o en Scientific Protein Laboratories LLC.

El término "API" se usa en la presente memoria para indicar "enzimas digestivas" o "enzimas pancrelipasa" o "pancreatina".

El término "lipasa" denota una enzima que cataliza la hidrólisis de lípidos a glicerol y a ácidos grasos simples. Los ejemplos de lipasas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, lipasa animal (por ejemplo, lipasa porcina), lipasa bacteriana (por ejemplo, lipasa de Pseudomonas y/o lipasa de Burkholderia), lipasa fúngica, lipasa vegetal, lipasa recombinante (por ejemplo, producida mediante tecnología de ADN recombinante) por una célula huésped adecuada, seleccionada de cualquiera de las bacterias, levaduras, hongos, plantas, insectos o células huésped de mamíferos en cultivo, o lipasas recombinantes que incluyen una secuencia de aminoácidos que es homóloga o sustancialmente idéntica a una secuencia natural, lipasas codificadas por un ácido nucleico que es homólogo o sustancialmente idéntico a un ácido nucleico que codifica una lipasa de origen natural, etc.), lipasa sintética, lipasa modificada químicamente y mezclas de estas. El término "lípidos" incluye en general moléculas de origen natural que incluyen grasas, ceras, esteroles, vitaminas liposolubles (tales como las vitaminas A, D, E y K), monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos, fosfolípidos, etc.

El término "amilasa" se refiere a enzimas glucósido hidrolasas que descomponen el almidón, por ejemplo, aamilasas, p-amilasas, Y-amilasas, a-glucosidasas ácidas, amilasas salivales tales como ptialina, etc. amilasas adecuadas para su uso en la presente divulgación incluye, pero no se limita a, amilasas animales, amilasas bacterianas, amilasas fúngicas (por ejemplo, amilasa de Aspergillus, por ejemplo, amilasa de Aspergillus oryzae), amilasas vegetales, amilasas recombinantes (por ejemplo, producidas mediante la tecnología de ADN recombinante por una célula huésped adecuada, seleccionadas de cualquiera de las bacterias, levaduras, hongos, plantas, insectos o células huésped de mamíferos en cultivo, o amilasas recombinantes que incluyen una secuencia de aminoácidos que es homóloga o sustancialmente idéntica a una secuencia natural, amilasas codificadas por un ácido nucleico que es homólogo o sustancialmente idéntico a un ácido nucleico que codifica una amilasa de origen natural, etc.), amilasas químicamente modificadas y mezclas de estas.

El término "proteasa" se refiere generalmente a enzimas (por ejemplo, proteinasas, peptidasas o enzimas proteolíticas) que rompen enlaces peptídicos entre aminoácidos de proteínas. Las proteasas se identifican generalmente por su tipo catalítico, por ejemplo, peptidasas de ácido aspártico, cisteína (tiol) peptidasas, metalopeptidasas, serina peptidasas, treonina peptidasas, proteasas alcalinas o semialcalinas, neutras y peptidasas de mecanismo catalítico desconocido. Los ejemplos no limitantes de proteasas adecuadas para su uso en la presente divulgación incluyen serina proteasas, treonina proteasas, cisteína proteasas, proteasas de ácido aspártico (por ejemplo, plasmepsina) metaloproteasas y proteasas de ácido glutámico. Además, las proteasas adecuadas para su uso en la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, proteasas animales, proteasas bacterianas, proteasas fúngicas (p. ej., una proteasa de Aspergillus melleus), proteasas vegetales, proteasas recombinantes (p. ej., producidas mediante la tecnología de ADN recombinante por una célula huésped adecuada, seleccionada de cualquiera de las bacterias, levaduras, hongos, plantas, insectos o células huésped de mamíferos en cultivo, o proteasas recombinantes, que incluyen una secuencia de aminoácidos que es homóloga o sustancialmente idéntica a una secuencia natural, proteasas codificadas por un ácido nucleico que es homólogo o sustancialmente idéntico a un ácido nucleico que codifica una proteasa de origen natural, etc.), proteasas modificadas químicamente y mezclas de estas.

Las enzimas pancrelipasa de la composición de la presente divulgación pueden incluir una o más lipasas (es decir, una lipasa o dos o más lipasas), una o más amilasas (es decir, una amilasa o dos o más amilasas), una o más proteasas (es decir, una proteasa, o dos o más proteasas), y mezclas de estas enzimas en diferentes combinaciones y proporciones.

Las actividades de la lipasa en las composiciones de la presente divulgación pueden oscilar entre aproximadamente 650 y aproximadamente 100.000 UI (procedimiento USP). Puede ser de aproximadamente 675 a aproximadamente 825 UI, de aproximadamente 2.500 a aproximadamente 28.000 UI, de aproximadamente 2.700 a aproximadamente 3.300 UI, de aproximadamente 4.500 a aproximadamente 5.500 UI, de aproximadamente 8.000 a aproximadamente 11.000 UI, de aproximadamente 13.500 a aproximadamente 16.500 UI y de aproximadamente 18.000 a aproximadamente 22.000 UI, de aproximadamente 22.500 a aproximadamente 27.500 UI, de aproximadamente 36.000 a aproximadamente 44.000 Ui, y todos los intervalos y subintervalos entre ellos.

Las composiciones de la presente divulgación preferentemente pueden contener al menos aproximadamente 650 UI (procedimiento USP), al menos aproximadamente 9.000, incluso con mayor preferencia contienen aproximadamente 20.000, aproximadamente 40.000, aproximadamente 60.000, aproximadamente 80.000 o aproximadamente 100.000 UI unidades de lipasa por unidad de dosificación.

La composición de HA-pancreatina de acuerdo con la presente divulgación puede estar en forma de polvo o puede estar en forma compactada, por ejemplo, una tableta, o puede incluir una pluralidad de partículas recubiertas y/o no recubiertas. Las partículas pueden incluir un núcleo revestido con al menos un revestimiento entérico, en el que dicho revestimiento contiene un polímero entérico. La composición anterior, además de las partículas recubiertas, también puede incluir partículas no recubiertas de pancrelipasa. En particular, las partículas son minicomprimidos, microcomprimidos, micropartículas, microesferas, microcápsulas y/o microsedimentos. Las partículas pueden tener diámetros de hasta aproximadamente 5 mm. Pueden tener cualquier tamaño o forma de partícula adecuada. Por ejemplo, las partículas pueden tener un tamaño de partícula en el intervalo de aproximadamente 25-5.000 pm. Por ejemplo, pueden estar en forma de "minicomprimidos" que tienen un diámetro de partícula nominal en el rango de aproximadamente 2-5 mm, o pueden ser "microcomprimidos" que tienen diámetros nominales de partículas de menos de aproximadamente 2 mm, por ejemplo, aproximadamente 1-2 mm. Las partículas pueden tener un tamaño medio de partícula de menos de aproximadamente 800 pm, preferentemente menos de aproximadamente 500 pm, con mayor preferencia menos de aproximadamente 200 pm. Las partículas pueden tener un diámetro volumétrico (d (v, 0,1)) (definido como el diámetro en el que el 10 % de la distribución volumétrica está por debajo de este valor y el 90 % está por encima de este valor) de no menos de 400 pm y un diámetro volumétrico d(v, 0,9) (definido como el diámetro en el que el 90 % de la distribución del volumen está por debajo de este valor y el 10 % está por encima de este valor) de no más de aproximadamente 800 pm.

Cuando los núcleos de pancrelipasa están rodeados por un recubrimiento entérico, el recubrimiento actúa como una barrera que protege la medicación del entorno ácido del estómago y evita sustancialmente la liberación de la medicación antes de que llegue al intestino delgado. Pueden usarse combinaciones adecuadas de composiciones de revestimiento entérico con otras composiciones de revestimiento para proporcionar el tipo deseado de control sobre la liberación del fármaco o los efectos terapéuticos. El recubrimiento entérico incluye al menos un polímero entérico y otros excipientes. La expresión "polímero entérico" significa un polímero que protege las enzimas digestivas del contenido gástrico, por ejemplo, un polímero que es estable a pH ácido, pero que puede descomponerse rápidamente a pH más alto, o un polímero cuya tasa de hidratación o erosión es lo suficiente lenta para asegurar que el contacto del contenido gástrico con las enzimas digestivas sea relativamente menor mientras está en el estómago, a diferencia del resto del tracto gastrointestinal.

Ejemplos no limitantes de polímeros entéricos incluyen ftalato de acetato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, succinato de acetato de hidroxipropilmetilcelulosa, ftalato de acetato de polivinilo, copolímeros de ácido metacrílico, ésteres de metilmetacrilato, copolímeros de metilmetacrilato, y copolímeros de ácido metacrílico/metilmetacrilato, copolímero de ácido metacrílico-acrilato de etilo (1:1), goma laca y etilcelulosa. Estos polímeros están disponibles comercialmente con diferentes marcas comerciales, tales como: Cellacefate (ftalato de acetato de celulosa), EUDRAGIT® L100, S100, L30D, FS30D, L100-55, L30D55 (copolímeros de ácido metacrílico), AQUATERIC® (ftalato de acetato de celulosa), AQOAT® (hidroxipropilmetilcelulosa acetato de succinato (hidroxipropilmetilcelulosa succinato) y HP55 ftalato). El recubrimiento entérico puede incluir además otros excipientes tales como talco. Preferentemente, el recubrimiento entérico incluye: 10-20 % en peso de al menos un polímero entérico, en el que cada uno de dichos % en peso es en base al peso total de las partículas recubiertas. El recubrimiento puede incluir además un agente lipófilo, tal como una molécula lipófila de bajo peso molecular C6-C30 seleccionada de los ácidos carboxílicos alifáticos y alcoholes, preferentemente un ácido carboxílico C14-C18 o alcohol, tal como ácido esteárico, ácido mirístico, alcohol mirístico, o alcohol estearílico. Otros ingredientes opcionales del revestimiento son plastificantes, agentes anti-pegajosidad (tales como talco, estearato de magnesio, dióxido de silicio coloidal y combinaciones de estos; además, opcionalmente, una etilcelulosa de baja viscosidad). Ejemplos no limitantes de plastificantes adecuados incluyen triacetina, citrato de tributilo, citrato de tri-etilo, citrato de acetil tri-n-butilo, ftalato de dietilo, sebacato de dibutilo, polietilenglicol, polipropilenglicol, aceite de ricino, mono y diglicéridos acetilados, cetil alcohol y mezclas de estos. El plastificante preferido es un plastificante sin ftalato o mezclas de estos.

Las partículas recubiertas o no recubiertas de pancreatina HA pueden prepararse de acuerdo con procedimientos conocidos. Por ejemplo, los núcleos de microsedimentos pueden prepararse añadiendo un aglutinante adecuado a HA-pancreatina seguido de extrusión en presencia de un disolvente adecuado y posterior esferonización. Puede aplicarse una esferonización controlada para generar partículas de pancreatina HA de tamaño pequeño. Pueden usarse tecnologías de recubrimiento por pulverización, estratificación en polvo y lecho fluido para preparar perlas mediante el recubrimiento de un núcleo inerte. Los procedimientos de coacervación también pueden ser útiles para la preparación de partículas de pancrelipasa recubiertas.

La compresión directa puede usarse para preparar comprimidos compactados sin excipientes. La tableta puede mostrar gastrorresistencia debido a la formación in situ de una capa de recubrimiento hidrófoba al entrar en contacto con los fluidos gástricos. Las composiciones que incluyen HA-pancreatina pueden estar en cualquier forma adecuada para la dosificación de un agente terapéutico que contenga enzimas digestivas, tales como, por ejemplo, pueden estar en forma de polvos, sedimentos, microesferas, cápsulas, bolsitas, comprimidos, suspensiones y soluciones líquidas.

En la presente divulgación, pueden prepararse formas de dosificación que incluyen HA-pancreatina, en particular, formas de dosificación más pequeñas y/o únicas que incluyen HA-pancreatina. La disponibilidad de HA-pancreatina permite una reducción en el tamaño de la cápsula y/o permite administrar la dosis como un número reducido de cápsulas por comida, por ejemplo, en comparación con la composición de formulación típica de una concentración de 20.000 unidades de ZENPEP® tamaño 0 cápsula, que se llena con 250-275 mg de API. Un paciente adulto puede tomar de 4 a 10 cápsulas de este tipo por comida. Para una dosificación diaria total de 200.000 UI de lipasa, un paciente ahora toma 10 cápsulas y la ingesta del medicamento es de aproximadamente 2.500-2.750 mg. Una purificación de al menos aproximadamente 2 veces constituye una mejora significativa, ya que reduciría sustancialmente la cantidad de producto farmacéutico requerida, y grados más altos de purificación proporcionarían incluso más beneficios. De hecho, la forma de dosificación farmacéutica de HA-pancreatina de la presente divulgación, que toma la forma de una cápsula administrada por vía oral, que puede tener un contenido de aproximadamente 100-110 mg de fármaco (frente a 250-275 mg) y por lo tanto para una dosificación diaria de 200.000 UI de lipasa es de aproximadamente 1.000-1.100 mg (frente a 2.500-2.750 mg). Asimismo, con la cápsula de HA-pancreatina, puede usarse un tamaño 2 (vs tamaño 0), reduciendo así drásticamente también el número total de cápsulas a administrar, o alternativamente manteniendo una cápsula de tamaño 0 y modulando adecuadamente su contenido, reduciendo así significativamente la ingesta diaria. Como el tratamiento con IPE es un tratamiento crónico que con frecuencia comienza en la infancia, la capacidad de formular la pancrelipasa de manera que pueda estar contenida en unidades de dosificación más pequeñas y/o tomarse como un número reducido de unidades de dosificación por comida constituye un beneficio significativo para los pacientes.

Las formas de dosificación divulgadas en la presente memoria también pueden incluir formas de dosificación de partículas pequeñas. Un producto de pancrelipasa con una potencia aumentada por unidad de volumen superaría problemas importantes con respecto a la reducción de la dimensión de las perlas. La mayoría de las formas de dosificación de pancrelipasa comerciales son cápsulas que están llenas de perlas de pancrelipasa, que están cubiertas con un polímero entérico. El recubrimiento se aplica porque la lipasa pancreática se inactiva de forma irreversible en medios ácidos. Las cápsulas se pueden abrir y las perlas se pueden rociar sobre ciertos alimentos, lo cual es una opción importante para los pacientes más jóvenes o aquellos que tienen dificultades para tragar o sobrellevar la gran cantidad de píldoras. Sin embargo, esta opción no responde a las necesidades de todos los pacientes, ya que las perlas tienen un diámetro apreciable, que puede ser de hasta 2 mm. Esto significa que las perlas no pueden suspenderse fácilmente en líquidos para bebés o pacientes que requieren alimentación por sonda. Los intentos de reducir las dimensiones de las perlas dan como resultado grandes aumentos en el área de superficie total y, en consecuencia, se necesita mucho más polímero entérico para cubrir eficazmente el área de superficie aumentada de las partículas. Esto aumenta enormemente el volumen de la forma de dosificación y la cantidad de polímero ingerido hasta el punto en que el volumen de la forma de dosificación aumenta aún más la carga de píldoras y los niveles de excipientes de recubrimiento pueden exceder los límites establecidos en su ingesta diaria.

La disponibilidad de una HA-pancreatina, con un volumen muy reducido, no solo permite que la dosis completa esté contenida en una sola unidad de dosificación o en un número reducido de unidades de dosificación, sino que también permite la combinación de pancrelipasa con otros compuestos. Por ejemplo, un agente tampón antiácido, tal como bicarbonato de sodio y HA-pancreatina, puede combinarse en una sola unidad de dosificación, mientras que no sería posible contemplar tal combinación de enzimas pancreáticas y un agente que aumenta el pH del estómago usando la corriente pancrelipasa, ya que esto aumentaría drásticamente la ya muy alta carga de píldoras ya que se necesitarían cápsulas/tabletas adicionales y/o las cápsulas/tabletas serían de tamaño excesivo.

La HA-pancreatina de la presente divulgación también proporciona la opción de proporcionar una forma de dosificación dispersable sin un recubrimiento entérico ya que el tampón evitaría la inactivación ácida del componente lipasa de la pancreatina. Además, la suplementación con bicarbonato también puede proporcionar un beneficio terapéutico ya que la secreción de bicarbonato generalmente se reduce en pacientes con IPE. Esta nueva forma de dosificación puede formularse para una liberación inmediata o retardada y puede dispersarse en un medio líquido. Esta última propiedad proporciona una ventaja significativa para los pacientes que requieren un alimento líquido, ya que los componentes se dispersarían fácilmente en el alimento u otro medio conveniente. Estas combinaciones pueden suministrarse en una variedad de presentaciones convencionales, tales como cápsulas, tabletas, sobres, perlas y líquidos. Como se mencionó anteriormente, la necesidad de recubrir las formas de dosificación de pancrelipasa con un polímero entérico es una consecuencia de la inestabilidad de la enzima lipasa en medios ácidos. Sin embargo, si se eleva el pH del estómago mediante el uso de inhibidores de la bomba de protones, se ha demostrado que la lipasa permanece activa, presumiblemente porque no está expuesta a niveles de pH lo suficientemente bajos como para inactivar la lipasa. Este enfoque no es conveniente, ni necesariamente deseable desde el punto de vista médico, ya que aumenta la cantidad de píldoras y usa una medicación crónica adicional para superar las desventajas de otra. El pH del estómago puede neutralizarse temporalmente con antiácidos simples tal como el bicarbonato de sodio y se ha demostrado que es eficaz para proteger los fármacos lábiles a los ácidos, como el omeprazol PPI, que es un componente del fármaco ZEGERID®. El nivel de bicarbonato de sodio en este medicamento es de 1,1 g y el nivel de omeprazol es de 20 mg o 40 mg y estos componentes están contenidos en una cápsula de cubierta dura.

Una forma de dosificación única que contiene una combinación de HA-pancreatina y al menos otro compuesto activo, tal como H2 también son divulgados en la presente divulgación antagonistas, inhibidores de la bomba de protones o sales biliares.

Se obtiene una mejora del producto con la presente divulgación. De hecho, la preparación de HA-pancreatina da como resultado una reducción de la carga biológica simplemente como resultado de la reducción de la cantidad de material que lleva esta carga biológica. Sin embargo, además, las metodologías usadas para el procedimiento de preparación también pueden reducir la carga biológica y, como resultado, se producirá un producto significativamente menos gravado. Asimismo, la eliminación de grandes cantidades de material inactivo del producto permite el uso de las técnicas de esterilización que se usan para la aplicación de biológicos inyectables, por ejemplo, filtración, exposición a luz ultravioleta (UV). Nuevamente, esto representa una mejora significativa e inesperada en las características del producto.

La HA-pancreatina presente en las composiciones o formas de dosificación oral divulgadas en la presente memoria se prepara de acuerdo con el procedimiento divulgado en la presente memoria.

El material de partida es pancreatina de mamífero. En la presente divulgación podemos referirnos a ella también mediante el uso de los términos "API", o "pancreatina de inicio", o "enzimas pancreáticas de inicio", o "pancreatina nativa", "pancrelipasa de inicio" o "pancrelipasa nativa".

Un material de partida conveniente es la pancrelipasa de origen porcino; un ejemplo de materiales de partida es material disponible comercialmente, por ejemplo, de Nordmark Arzneimittel GmbH o Scientific Protein Laboratories LLC. También pueden usarse extractos similares de fuentes bovinas o de otros mamíferos. El material de partida preferido es la pancrelipasa de origen porcino. Los procesos de extracción usados para producir el extracto crudo pueden resumirse en las siguientes etapas: glándulas de cerdo molidas en húmedo; adición de un "activador" de pancrelipasa; tratamiento de la "suspensión de enzima bruta" con isopropanol frío y caliente para precipitar proteínas y eliminar lípidos; etapas de centrifugación y filtración para eliminar las fibras y compactar y concentrar; secado al vacío de "torta húmeda"; desagrupamiento y molienda de la "torta húmeda" para determinar la densidad aparente y el tamaño de partícula. Este producto seco es la pancreatina que se usa en los productos actuales.

La HA-pancreatina de la presente divulgación se prepara tratando la pancreatina de partida (pancreatina nativa). Conserva aquellos elementos que son clave para la eficacia de los productos a base de enzimas pancreáticas y elimina aquellos elementos que no son esenciales. El material resultante del procedimiento de la presente invención es la HA-pancreatina derivada de mamífero. Esta HA-pancreatina puede tener una actividad lipasa específica de al menos aproximadamente 120, o al menos aproximadamente 150, o al menos aproximadamente 200, o al menos aproximadamente 400, o al menos aproximadamente 500 UI/mg.

La HA-pancreatina de la presente divulgación puede obtenerse mediante un procedimiento que incluye la precipitación que puede ser inducida por un disolvente o por sulfato de amonio.

La HA-pancreatina que tiene una actividad lipasa específica de al menos aproximadamente 120 UI/mg puede obtenerse mediante el uso de un procedimiento que comprende tratar la pancreatina con un disolvente, en el que dicho disolvente tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand (SP) comprendido entre 28 y 45 (MPa)0,5, y dicho disolvente es un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes orgánicos, o una mezcla de al menos un disolvente orgánico y un disolvente acuoso y el procedimiento se lleva a cabo a baja temperatura, preferentemente a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente. El procedimiento de precipitación inducida por el disolvente de la presente divulgación se caracteriza porque comprende la suspensión de pancreatina, la precipitación de una porción insoluble, el secado de la porción insoluble para obtener la HA-pancreatina.

La HA-pancreatina que tiene una actividad lipasa específica de al menos aproximadamente 120 UI/mg puede prepararse mediante el uso de un procedimiento que incluye tratar la pancreatina con un disolvente, en el que dicho disolvente tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand (SP) comprendido entre 28 y 38 (MPa)05, y dicho disolvente es un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes orgánicos o una mezcla de al menos un disolvente orgánico y un disolvente acuoso y el procedimiento se lleva a cabo a baja temperatura, preferentemente a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente.

La HA-pancreatina que tiene una actividad lipasa específica de al menos aproximadamente 120 UI/mg puede prepararse mediante el uso de un procedimiento que incluye tratar la pancreatina con un disolvente, en el que dicho disolvente tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand (SP) comprendido entre 28 y 34 (MPa)05, y dicho disolvente es un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes orgánicos o una mezcla de al menos un disolvente orgánico y un disolvente acuoso y el procedimiento se lleva a cabo a baja temperatura, preferentemente a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente.

La HA-pancreatina que tiene una actividad lipasa específica de al menos aproximadamente 120 UI/mg puede prepararse mediante el uso de un procedimiento que incluye tratar la pancreatina con un disolvente, en el que dicho disolvente tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand (SP) comprendido entre 34 y 38 (MPa)05, y dicho disolvente es un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes orgánicos o una mezcla de al menos un disolvente orgánico y un disolvente acuoso y el procedimiento se lleva a cabo a baja temperatura, preferentemente a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente.

La HA-pancreatina que tiene una actividad lipasa específica de al menos aproximadamente 120 UI/mg puede prepararse mediante el uso de un procedimiento que incluye tratar la pancreatina con un disolvente, en el que dicho disolvente tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand (SP) que incluye entre 34 y 45 (MPa)05, y dicho disolvente es un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes orgánicos o una mezcla de al menos un disolvente orgánico y un disolvente acuoso y el procedimiento se lleva a cabo a baja temperatura, preferentemente a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente. La HA-pancreatina que tiene una actividad lipasa específica de al menos aproximadamente 120 UI/mg puede prepararse mediante el uso de un procedimiento que incluye tratar la pancreatina con un disolvente, en el que dicho disolvente tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand (SP) que incluye entre 38 y 45 (MPa)05, y dicho disolvente es un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes orgánicos o una mezcla de al menos un disolvente orgánico y un disolvente acuoso y el procedimiento se lleva a cabo a baja temperatura, preferentemente a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente.

La HA-pancreatina obtenida con el procedimiento de la presente divulgación tiene una actividad lipasa específica de al menos aproximadamente 120, o al menos aproximadamente 150, o al menos aproximadamente 200, o al menos aproximadamente 400, o al menos aproximadamente 500 UI/mg. La HA-pancreatina derivada de mamífero de la presente invención tiene una actividad lipasa específica de al menos 120 UI/mg.

El parámetro de solubilidad de Hildebrand es un valor numérico que indica el comportamiento relativo de solvencia de un disolvente específico. Se deriva de la densidad de energía cohesiva del disolvente, que a su vez se deriva del calor de vaporización. Los valores de Hildebrand están disponibles de fuentes bibliográficas, tal como en el Manual de Parámetros de Solubilidad de Barton, CRC Press, 1983. El disolvente del procedimiento de la presente divulgación es un disolvente orgánico o una mezcla de más disolventes orgánicos o una mezcla de al menos un disolvente orgánico y un disolvente acuoso; la mezcla de un disolvente orgánico y disolvente acuoso puede incluir uno o más disolventes orgánicos y uno o más disolventes acuosos. El término "disolvente" usado en la presente memoria descriptiva identifica todas las posibles mezclas descritas aquí anteriormente, a menos que se especifique lo contrario. El disolvente puede tener los siguientes valores de solubilidad: 45, 42, 40, 38, 36, 35, 34 y 28, los valores de solubilidad preferidos son 38 y 36.

El disolvente orgánico puede elegirse del grupo de disolventes que incluye n-pentano, n-hexano, n-heptano, éter dietílico, ciclohexano, tetracloruro de carbono, acetato de etilo, tetrahidrofurano, cloroformo, tricloroetileno, acetona, dimetilformamida, n-propanol, isopropanol, etanol, dimetilsulfóxido butilalcohol, metanol, acetonitrilo, dioxano y cloruro de metileno. Los disolventes orgánicos preferidos son acetona, isopropanol, etanol y combinaciones de estos.

El disolvente acuoso puede elegirse del grupo que consiste en: agua o soluciones tampón. Los tampones preferidos tienen pH = 7 o pH = 4. Pueden ser respectivamente pH = 7: Tampón fosfato 10 mM y pH = 4,0: Tampón acetato 10 mM.

En la presente divulgación, el disolvente puede tener una mezcla que incluye uno o más disolventes orgánicos y un disolvente acuoso, dicha mezcla tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand que varía de 28 a 45 (MPa)05. En la presente divulgación, el disolvente puede tener una mezcla que incluye uno o más disolventes orgánicos y un disolvente acuoso, dicha mezcla tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand que varía de 28 a 38 (MPa)05. El disolvente puede tener una mezcla que incluye uno o más disolventes orgánicos y un disolvente acuoso, dicha mezcla tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand que varía de 28 a 34 (MPa)05

El disolvente puede tener una mezcla que incluye uno o más disolventes orgánicos y un disolvente acuoso, dicha mezcla tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand que varía de 34 a 38 (MPa)05

El disolvente puede tener una mezcla que incluye uno o más disolventes orgánicos y un disolvente acuoso, dicha mezcla tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand que varía de 34 a 45 (MPa)05

El disolvente puede tener una mezcla que incluye uno o más disolventes orgánicos y un disolvente acuoso, dicha mezcla tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand que varía de 38 a 45 (MPa)05

El parámetro de solubilidad (SP) de la mezcla de disolventes se calcula mediante el uso los parámetros de solubilidad de Hildebrand.

El disolvente de la presente divulgación puede tener un SP de 38 (MPa)05 y ser una mezcla de disolvente orgánico con disolvente acuoso. Algunos ejemplos de tal disolvente binario que tiene un SP = 38 divulgados en la presente memoria son:

tampón acetona: la relación volumétrica de acetona a tampón pH = 7 es 35:65; la relación volumétrica de acetona a tampón pH = 4,0 es 35:65; dónde: SP (acetona) = 20,2, SP (tampón) = 47,9;

tampón-etanol: la relación volumétrica de etanol a tampón de pH = 7 es 45:55; la relación volumétrica de etanol a tampón pH = 4,0 es 45:55; donde SP (etanol) = 26,0, Sp (tampón) = 47,9;

El disolvente usado en la etapa a1.1 de la presente invención tiene un SP de 38 (MPa)05 y es una mezcla de acetona y solución tampón que tiene un pH de 7.

Un disolvente binario con SP = 34 (MPa)05 es divulgado en la presente memoria: acetona-tampón: la relación volumétrica de acetona a pH = 7 tampón es 50:50; donde SP (acetona) = 20,2, SP (tampón) = 47,9.

Un disolvente binario con SP = 35 (MPa)05 es divulgado en la presente memoria: acetona-tampón: la relación volumétrica de acetona a tampón pH = 7 es 45: 55; donde SP (acetona) = 20,2, SP (tampón) = 47,9.

En la presente divulgación (procedimiento de una sola etapa), el tratamiento de la pancreatina con un disolvente que tiene un SP de 28-45 (MPa)05 incluye los siguientes etapas: a1) suspender la pancreatina con agitación y precipitación y la porción insoluble en un disolvente que tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand comprendido entre 28 y 45 (MPa)0,5; a2) separar la porción insoluble (sedimento) de la porción soluble (sobrenadante) de la mezcla de la etapa a1; a3) secar la porción insoluble obtenida en la etapa a2; y en el que las etapas a1-a3 se llevan a cabo a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente. La temperatura adecuada para realizar el procedimiento es de 4 °C.

En la presente divulgación (procedimiento de una sola etapa), el tratamiento de la pancreatina con un disolvente que tiene un SP de 34-45 (MPa)05 incluye los siguientes etapas: a1) suspender la pancreatina con agitación y precipitar una porción insoluble en el disolvente que tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand comprendido entre 34 y 45 (MPa)05; a2) separar la porción insoluble (sedimento) de la mezcla de la etapa a1 de la porción soluble (sobrenadante); a3) secar la porción insoluble de la etapa a2; y en el que las etapas a1-a3 se llevan a cabo a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente. La temperatura adecuada para realizar el procedimiento es de 4 °C.

En la presente divulgación (procedimiento de una sola etapa), el tratamiento de la pancreatina con un disolvente que tiene un SP de 34-38 (MPa)05 incluye los siguientes etapas: a1) suspender pancreatina en el disolvente con agitación y precipitar una porción insoluble en un disolvente que tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand comprendido entre 34 y 38 (MPa)0,5; a2) separar la porción insoluble (sedimentos) de la porción soluble (sobrenadante) de la mezcla de la etapa a1; a3) secar la porción insoluble de la etapa a2; y en el que las etapas a1-a3 se llevan a cabo a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente. La temperatura adecuada para realizar el procedimiento es de 4 °C.

La etapa 1a se lleva a cabo preferentemente por aproximadamente 60 minutos y la temperatura preferida es de 4 °C. La etapa de separación (etapa a2) puede llevarse a cabo por diferentes procedimientos tal como centrifugación, sedimentación o filtración. La etapa de secado (a3) puede llevarse a cabo, por ejemplo, en un secador de alta eficiencia, una bomba de vacío o un liofilizador. También pueden usarse otros procedimientos. La concentración de pancreatina en el disolvente en la etapa al está preferentemente en una cantidad comprendida entre 0,050 y 0,3 g/mL, preferentemente entre 0,065 y 0,1 g/mL, preferentemente 0,065 o 0,1 g/mL.

En la presente memoria es divulgado un procedimiento de una sola etapa, en el que el disolvente tiene un SP de 38 (MPa)05 y es una mezcla de acetona y tampón de pH 7 (tal como fosfato 10 mM), y la pancreatina del etapa al está a una concentración de 0,1 g/mL.

El disolvente (o mezcla de disolventes) que tiene el parámetro de solubilidad (SP) de Hildebrand comprendido entre 28 y 45 (MPa)05 se usa en la presente divulgación para suspender pancreatina y precipitar una porción insoluble. Este disolvente puede usarse como una única adición para suspender y precipitar simultáneamente o como dos adiciones posteriores: la primera adición para suspender (disolvente de suspensión) y la segunda adición para precipitar una porción insoluble (disolvente de precipitación). En este segundo caso, la primera adición es preferentemente un disolvente acuoso y la segunda adición es un disolvente orgánico (o mezcla). La mezcla de disolventes que está compuesta por el disolvente acuoso de la primera adición (disolvente de suspensión) y el disolvente orgánico de la segunda adición (disolvente de precipitación) tiene un parámetro de solubilidad comprendido entre 28 y 45.

En la presente divulgación (procedimiento de dos etapas), donde el disolvente es una mezcla de disolvente orgánico y disolvente acuoso, la pancreatina se dispersa primero en el disolvente acuoso (disolvente de suspensión) y luego se añade el disolvente orgánico (disolvente de precipitación). La etapa a1 puede incluir las siguientes etapas: a1.1 suspensión de pancreatina en el disolvente acuoso con agitación (suspensión); a1.2 precipitar una porción insoluble añadiendo a la suspensión de la etapa a1.1 el disolvente orgánico o una mezcla de este (precipitando). Por lo tanto, este procedimiento de dos etapas incluye las siguientes etapas: a1.1) suspender pancreatina en un disolvente acuoso con agitación; a1.2) precipitar una porción insoluble añadiendo a la suspensión de la etapa a1.1 al menos un disolvente orgánico o una mezcla de estos (precipitando); a2) separar la porción insoluble de la etapa a1.2 de la parte soluble; a3) secar la parte insoluble de la etapa a2.

Las etapas a1-a3 se llevan a cabo a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente. La mezcla de la etapa a1.1 se mantiene en condiciones estáticas. La duración del tiempo de la etapa a1.1 es de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 minutos, dependiendo de la escala y el equipo, y la duración del tiempo de la etapa a1.2 es de aproximadamente 30 minutos.

La pancreatina en disolvente acuoso está preferentemente en una cantidad comprendida entre 0,050 y 0,3 g/mL, preferentemente entre 0,1 y 0,3 g/mL, preferentemente 0,1 o 0,3 g/mL. El disolvente orgánico es preferentemente etanol o acetona y el disolvente acuoso es preferentemente un tampón de pH = 4,0 (tal como tampón acetato 10 mM) o un tampón de pH 7 (tal como fosfato 10 mM).

En la presente memoria es divulgado un procedimiento de dos etapas, en el que el disolvente compuesto por el disolvente de suspensión y el disolvente de precipitación (disolventes usados en las etapas a1.1 y a1.2 respectivamente) tiene un SP de 38 (MPa)05 y es una mezcla de acetona (disolvente de precipitación) y tampón de pH 7 (tal como fosfato 10 mM) (disolvente de suspensión), y la pancreatina en la etapa a1 está en una concentración de 0,1 g/mL.

En la presente memoria es divulgado otro procedimiento de dos etapas, en el que el disolvente compuesto por el disolvente de suspensión y el disolvente de precipitación (disolventes usados en las etapas a1.1 y a1.2 respectivamente) tiene un SP de 38 (MPa)05 y es una mezcla de acetona (disolvente de precipitación) y tampón de pH 4 (tal como tampón de acetato 10 mM) (disolvente de suspensión), y la pancreatina en la etapa a1 está en una concentración de 0,1 g/mL.

En la presente invención (procedimiento en múltiples etapas), cuando el disolvente es una mezcla de disolvente orgánico y disolvente acuoso, la pancrelipasa se dispersa primero en el disolvente acuoso y luego se añade el disolvente orgánico a la porción soluble de esta dispersión acuosa. El procedimiento de la presente invención comprende la etapa a1) que incluye las tres etapas: a1.1) suspensión, a1.2) separación de la porción soluble (sobrenadante) de la etapa a1.1 de la porción insoluble (sedimento), a1.3) precipitando. Este procedimiento en múltiples etapas puede incluir los siguientes etapas: a1.1) suspender pancreatina en un disolvente acuoso con agitación; a1.2) separar la porción soluble de la etapa a1.1 de la porción insoluble; a1.3) precipitar una parte insoluble añadiendo a la porción soluble de la etapa a1.2 al menos un disolvente orgánico (precipitando); a2) separar la porción insoluble de la etapa a1.3 de la porción soluble; a3) secar la parte insoluble de la etapa a2.

La etapa a1.1 se lleva a cabo preferentemente por aproximadamente 30 minutos. La mezcla de la etapa a1.3 puede mantenerse en condiciones estáticas por aproximadamente 15 minutos, y la temperatura para esta etapa es de 4 °C. La pancreatina en disolvente acuoso está preferentemente en una cantidad comprendida entre 0,05 y 0,3 g/mL, preferentemente entre 0,1 y 0,3 g/mL, preferentemente entre 0,1 y 0,3 g/mL. La pancreatina de la etapa a1.1) de la presente invención es una cantidad de 0,1 g/mL. Divulgado en la presente memoria, el SP del disolvente compuesto por el disolvente de suspensión y el disolvente de precipitación (disolventes usados en la etapa a1.1 y en la etapa a1.3 respectivamente) usado es preferentemente 38. El SP del disolvente de la etapa a1.1 de la presente invención es 38 y el SP del disolvente de la etapa a1.3 es 36. Divulgado en la presente memoria, el disolvente orgánico es preferentemente etanol o acetona (disolvente de precipitación) y el disolvente acuoso es preferentemente un tampón de pH = 4,0 (tal como tampón de acetato 10 mM) o un tampón de pH 7 (como fosfato 10 mM) (disolvente de suspensión). El disolvente de la etapa a1.1 y la mezcla de la etapa a1.3 de la presente invención es una mezcla de acetona y solución tampón que tiene un pH de 7.

En uno de los procedimientos de múltiples etapas divulgados en la presente memoria, el disolvente compuesto por el disolvente de suspensión y el disolvente de precipitación (disolventes usados en la etapa a1.1 y la etapa a1.3 respectivamente) tiene un SP de 38 (MPa)05 y es una mezcla de acetona (disolvente de precipitación) y tampón de pH 4,0 (tal como tampón de acetato 10 mM) (disolvente de suspensión), y la pancreatina en la etapa a1 está a una concentración de 0,3 g/mL.

En otro procedimiento en múltiples etapas divulgado en la presente memoria, el disolvente compuesto por el disolvente de suspensión y el disolvente de precipitación (disolventes usados en las etapas a1.1 y a1.3 respectivamente) tiene un SP de 38 (MPa)05 y es una mezcla de etanol (disolvente de precipitación) y tampón de pH 4,0 (tal como tampón de acetato 10 mM) (disolvente de suspensión), y la pancreatina de la etapa a1 está a una concentración de 0,3 g/mL.

En otro procedimiento en múltiples etapas divulgado en la presente memoria, el disolvente compuesto por el disolvente de suspensión y el disolvente de precipitación (disolventes usados en las etapas a1.1 y a1.3 respectivamente) tiene un SP de 38 (MPa)05 y es una mezcla de acetona (disolvente de precipitación) y tampón de pH 4,0 (tal como tampón de acetato 10 mM) (disolvente de suspensión), y la pancreatina en la etapa a1 está a una concentración de 0,1 g/mL.

En otro procedimiento en múltiples etapas divulgado en la presente memoria, el disolvente compuesto por el disolvente de suspensión y el disolvente de precipitación (disolventes usados en la etapa a1.1 y en la etapa a1.3 respectivamente) tiene un SP de 38 (MPa)05 y es una mezcla de acetona (disolvente de precipitación) y tampón de pH 7 (tal como fosfato 10 mM) (disolvente de suspensión), y la pancreatina en la etapa 1a está a una concentración de 0,3 g/mL.

La etapa de separación (etapa del procedimiento de una sola etapa y del procedimiento de varias etapas) puede llevarse a cabo por diferentes procedimientos tal como centrifugación o filtración. Todas las etapas del procedimiento de preparación de HA-pancreatina se llevan a cabo bajo control de temperatura, que siempre está por debajo de la temperatura ambiente, a 4 °C. También puede controlarse la humedad.

En la presente divulgación (procedimiento de doble precipitación), la etapa de tratar la pancreatina con un disolvente que tiene un parámetro de solubilidad (SP) de Hildebrand comprendido entre 28 y 45 (MPa)05 puede incluir las siguientes etapas: a1.1) suspender la pancreatina y precipitar una porción insoluble en un disolvente que tenga un parámetro de solubilidad de Hildebrand comprendido entre 28 y 45 (MPa)05 (suspender y precipitar); a1.2) separar la porción soluble de la etapa a1.1 de la porción insoluble a1.3) precipitar una porción insoluble añadiendo a la porción soluble de la etapa a1.2 al menos un disolvente orgánico o una mezcla de estos, obteniendo una mezcla con un valor más bajo de SP que el valor de SP del disolvente usado de a1.1 (precipitar); a2) separar la porción insoluble de la etapa a1.3 de la porción soluble; a3.1) secar la porción insoluble de la etapa a1.2; a3.2) secar la porción insoluble de la etapa a2; a4) mezclar la porción insoluble de la etapa a3.1 con la porción insoluble de la etapa a3.2.

El valor de SP del disolvente de la etapa a1.3 es diferente del valor de SP del disolvente usado en a1.1; siempre es al menos aproximadamente dos unidades menor que el valor de SP del disolvente en a1.1. Por ejemplo, cuando el SP del disolvente en a1.1 es 38, entonces el SP del disolvente en la etapa 1.3 es 36 o menor, puede estar preferentemente entre 27 y 36.

En la presente divulgación (procedimiento de doble precipitación), la etapa de tratar la pancreatina con un disolvente que tiene un SP de 38-45 (MPa)05 puede incluir las siguientes etapas: a1.1) suspender la pancreatina y precipitar una porción insoluble en un disolvente que tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand comprendido entre 38 y 45 (MPa)05 (suspender y precipitar); a1.2) separar la porción soluble de la etapa a1.1 de la porción insoluble; a1.3) precipitar una porción insoluble añadiendo a la porción soluble de la etapa a1.2 al menos un disolvente orgánico o una mezcla de estos, obteniendo el parámetro de solubilidad de Hildebrand comprendido entre 28 y 36 (precipitar); a2) separar la porción insoluble de la etapa a1.3 de la porción soluble; a3.1) secar la parte insoluble de la etapa a1.2; a3.2) secar la porción insoluble de la etapa a2; a4) mezclar la porción insoluble de la etapa a3.1 con la porción insoluble de la etapa a3.2.

En la presente divulgación (procedimiento de doble precipitación), la etapa de tratamiento de la pancreatina con un disolvente que tiene un SP de 38 (MPa)05 puede incluir las siguientes etapas: a1.1) suspender la pancreatina y precipitar una porción insoluble en un disolvente que tenga un parámetro de solubilidad de Hildebrand de 38 (MPa)05 (suspender y precipitar); a1.2) separar la porción soluble de la etapa a1.1 de la porción insoluble; a1.3) precipitar una porción insoluble añadiendo a la porción soluble de la etapa a1.2 el al menos un disolvente orgánico o una mezcla de estos obteniendo un parámetro de solubilidad de Hildebrand de 36 (precipitar); a2) separar la porción insoluble de la etapa a1.3 de la porción soluble; a3.1) secar la porción insoluble de la etapa a1.2; a3.2) secar la porción insoluble de la etapa a2; a4) mezclar la porción insoluble de la etapa a3.1 con la porción insoluble de la etapa a3.2.

Las etapas de secado a3.1 y a.3.2 se llevan a cabo al vacío por 48 horas a temperatura ambiente; y en el que las etapas a1.1, a1.2, a1.3, a2, se llevan a cabo a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente. La temperatura adecuada para realizar el procedimiento es de 4 °C.

La etapa de separación puede llevarse a cabo mediante diferentes procedimientos tal como centrifugación, sedimentación o filtración. La etapa de secado puede llevarse a cabo, por ejemplo, en un secador de alta eficiencia, una bomba de vacío o un liofilizador. También pueden usarse otros procedimientos. La concentración de pancreatina en el disolvente en la etapa a1 está preferentemente en una cantidad comprendida entre 0,05-02 g/mL, preferentemente 0,1 g/mL.

En el procedimiento de doble precipitación de la presente invención, el disolvente compuesto por el disolvente de suspensión y el disolvente de precipitación (disolvente usado en la etapa a1.1) tiene un SP de 38 (MPa)05 y es una mezcla de acetona (disolvente de precipitación) y tampón de pH 7 (tal como fosfato 10 mM) (disolvente de suspensión), el disolvente de la etapa a1.3 tiene un SP de 36 (MPa)05 es una mezcla de acetona (disolvente de precipitación) y tampón de pH 7 (tal como fosfato 10 mM) (disolvente de suspensión) y la pancreatina en la etapa a1 está en una concentración de 50 g/500 mL.

En el procedimiento de doble precipitación de la presente invención, el disolvente compuesto por el disolvente de suspensión y el disolvente de precipitación (disolvente usado en las etapas a1.1) tiene un SP de 38 (MPa)05 y es una mezcla de acetona (disolvente de precipitación) y tampón de pH 7 (tal como fosfato 10 mM) (disolvente de suspensión), el disolvente de la etapa a1.3 tiene un Sp de 36 (MPa)05 es una mezcla de acetona (disolvente de precipitación) y tampón de pH 7 (tal como fosfato 10 mM) (disolvente de suspensión) y la pancreatina en la etapa a1 está a una concentración de 0,1 g/mL.

El extracto de pancreatina puede purificarse mediante un procedimiento precipitación inducido por sulfato de amonio. La pancreatina puede dispersarse en agua o un tampón, tal como, pero sin limitarse a, solución salina tamponada con fosfato. Se eliminan los sólidos que puedan estar presentes, ya sea mediante centrifugación y recuperación del sobrenadante o mediante cualquier otro procedimiento adecuado. A continuación, se añade una cantidad adecuada de una solución de sulfato de amonio saturado a la solución de pancreatina así preparada de modo que precipite el contenido disuelto. El precipitado se recupera mediante cualquier procedimiento adecuado, tal como, pero sin limitarse a, centrifugación y/o filtración. A continuación, el precipitado recuperado se solubiliza nuevamente en agua o en un tampón adecuado, tal como, pero sin limitarse a, solución salina tamponada con fosfato.

La pancreatina puede dispersarse en un medio acuoso adecuado, tal como PBS, y la dispersión puede incubarse en hielo por aproximadamente cinco a aproximadamente quince minutos con agitación ocasional. Después, la dispersión se centrifuga a 16.000 xg por aproximadamente tres a aproximadamente ocho minutos y se decanta el sobrenadante. Luego se agrega una solución de sulfato de amonio saturado al sobrenadante para una concentración final de aproximadamente 50 % a aproximadamente 75 % de sulfato de amonio saturado. A continuación, la suspensión se centrifuga a 16.000 xg por aproximadamente tres a aproximadamente ocho minutos y el sobrenadante se retira y el sedimento se solubiliza nuevamente en PBS. El sedimento puede lavarse con sulfato de amonio saturado antes de que solubilice nuevamente.

El procedimiento de la presente divulgación también puede incluir esterilización e inactivación viral o reducción de la carga viral de la HA-pancreatina, que puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante filtración, calentamiento, irradiación (radiación ultravioleta, radiación X, radiación beta y radiación gamma), tratamiento a alta presión y/o alquilación de ácidos nucleicos, tal como el uso de beta-propriolactona (BPL). Calentar a una temperatura por encima de 85 °C, preferentemente entre 85 °C y 100 °C por un período de tiempo adecuado, por ejemplo, por encima de 18 horas y preferentemente entre 18 y 48 horas, incluso con mayor preferencia entre 18 y 30 horas también puede ser eficaz en la reducción de los contaminantes virales. El calentamiento a una temperatura más baja (84 °C, preferentemente 80 °C) puede llevarse a cabo sobre HA-pancreatina sólida con una humedad residual de 0,5 % en peso o menos.

En la presente memoria es divulgado un procedimiento de tratamiento de un paciente sujeto a una condición fisiológica asociada con la insuficiencia enzimática pancreática. El procedimiento de tratamiento incluye administrar al paciente una cantidad farmacéuticamente aceptable de la composición divulgada en la presente memoria. En la presente memoria es divulgado un procedimiento de preparación de HA-pancreatina que comprende precipitar pancreatina de una solución de pancreatina nativa con sulfato de amonio saturado. El procedimiento de preparación de HA-pancreatina incluye las siguientes etapas: a) suspender la pancreatina nativa en un tampón acuoso; b) centrifugar la suspensión de pancreatina nativa; c) decantar el sobrenadante de la etapa b; d) añadir una solución de sulfato de amonio al sobrenadante para formar un precipitado; e) centrifugar la suspensión de la etapa d para producir un sedimento que comprende HA-pancreatina, en el que la solución de sulfato de amonio es una solución saturada de sulfato de amonio y se agrega sulfato de amonio saturado al sobrenadante para una concentración final de aproximadamente 50-75 % de sulfato de amonio saturado, preferentemente a una concentración final de sulfato de amonio saturado del 60 %. El procedimiento incluye además lavar el sedimento con sulfato de amonio, solubilizar el sedimento en un tampón acuoso para formar una solución de HA-pancreatina., en el que la solución de HA-pancreatina se desala mediante filtración en gel y la filtración en gel se realiza en una columna que comprende un gel de dextrano entrecruzado. La HA-pancreatina tiene al menos aproximadamente el 50 %, 60 % o 70 % de la actividad lipasa de la pancreatina nativa, una concentración de proteína de 2-5 veces la concentración de proteína de la pancreatina nativa y tiene al menos aproximadamente el 60 % de la actividad lipasa, al menos aproximadamente el 75 % de la actividad amilasa y al menos aproximadamente el 50 % de la actividad proteasa de la pancreatina nativa. La HA-pancreatina tiene al menos aproximadamente el 60 % de la actividad de la lipasa, al menos aproximadamente el 75 % de la actividad de la amilasa y al menos aproximadamente el 50 % de la actividad de la proteasa de la pancreatina nativa y una concentración de proteína de 2-5 veces la concentración de proteína de la pancreatina nativa.

De lo anterior se desprende claramente que existen muchas ventajas del enfoque de suspensión-precipitación divulgado en la presente divulgación. Permite la preparación de pancreatina con alta actividad enzimática. Conserva las enzimas digestivas presentes en los jugos digestivos y mantiene el comportamiento digestivo del material de partida. Elimina aquellos materiales que no son necesarios para la digestión que quedan como resultado del procedimiento de extracción del crudo, disminuyendo así el volumen del API. Permite la reducción o eliminación de contaminantes bacterianos o virales. Permite un control de las proporciones de las clases de enzimas mixtas entre sí. Por otra parte, permite formular el API en varias formas de dosificación con alta potencia.

Para la preparación de la pancreatina de alta actividad de la invención, se prefiere el procedimiento de suspensiónprecipitación (procesos de una sola etapa, dos etapas, múltiples etapas, doble precipitación) sobre el proceso que usa la precipitación con sulfato de amonio; el proceso de doble precipitación es el proceso más preferido de la invención.

Ejemplos

Materiales

La pancrelipasa (API, pancrelipasa inicial o pancreatina, pancrelipasa nativa o pancreatina) es proporcionada por Nordmark y se extrae del páncreas porcino. Normalmente contiene aproximadamente un 30 % de proteínas (cuantificadas con el procedimiento de Bradford) y tiene una actividad lipasa de 94,4 UI/mg, actividad proteasa de 253,2 UI/mg, actividad amilasa de 420,3 UI/mg; la relación P/L es 2,7, la relación A/L es 4,5 y el contenido de agua es 0,3 %.

Este material se analiza mediante electroforesis mono y bidimensional, seguida de la caracterización de Maldi Tof para identificar los componentes de la pancrelipasa (Instituto Mario Negri, Milán, Italia). La electroforesis bidimensional en este extracto muestra que hay al menos 50 manchas de proteína/péptido en una fracción que aparentemente es fácilmente soluble en agua y 30 manchas de proteína/péptido en una fracción que aparentemente es menos soluble en agua. Las determinaciones de solubilidad se confunden por el hecho de que las enzimas activas pueden adsorberse o ser atrapadas por componentes insolubles en agua de la pancrelipasa. La solubilidad también será función del pH. Las manchas, correspondientes a las proteínas individuales de la mezcla, y las imágenes de los geles preparados con las fracciones más solubles y menos solubles se analizan después de cortar y digerir las manchas principales con tripsina bovina y analizarlas mediante el uso de espectrometría de masas por desorción/ionización mediante láser asistida por Matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF) y zimografía. Las huellas de masa de péptidos se comparan con las de las referencias de la biblioteca y se identifican amilasa, lipasa, colipasa, carboxipeptidasa A1 y B, elastasa 2A y 1, quimotripsina, tripsina y fosfolipasa A2. El extracto es claramente relativamente crudo y contiene muchas proteínas extrañas además de varias especies de enzimas activas.

Fórmula entérica: PEPTAMEN® Junior 1,0 Cal (Nestlé, envase de 250 mL): contenido de grasa: 3,8 g/100 mL, contenido proteico: 3 g/100 mL, contenido de carbohidratos: MLML 13,8 g/100 mL.

Métodos

Actividad lipolítica: La medición se lleva a cabo con un procedimiento en base al proceso compendiado de ensayo de lipasa descrito en la monografía de enzimas pancrelipasa de la USP, en base a la titulación, mediante el procedimiento pH-stat, de los ácidos grasos libres formados de la hidrólisis de grasas esterificadas en el sustrato usado (aceite de oliva). Es en base al siguiente principio: la lipasa cataliza la hidrólisis de los triglicéridos lo que conduce a la formación de ácidos grasos libres (FFA). La titulación del FFA formado de acuerdo con el tiempo permite la determinación de la actividad enzimática de la lipasa, que puede expresarse en unidades: 1U = 1 pmol de FFA formado por minuto. La reacción se produce manteniendo un valor de pH estable a través de un sistema experimental que proporciona la adición de NaOH (titulante) cuando el valor de pH cambia en comparación con un valor fijo (procedimiento pHstat). La cantidad de titulante añadido de acuerdo con el tiempo corresponde a la cantidad de FFA formado por la acción de la lipasa sobre los triglicéridos. La pendiente de la curva {titulante añadido = f (volumen (mL)/tiempo (minutos))} da la actividad enzimática de la lipasa.

La actividad de la lipasa (LA) informada a continuación siempre se expresa como UI. La actividad específica de la lipasa (LSA) informada a continuación siempre se expresa como UI/mg.

Actividad proteolítica y amilolítica: Las mediciones se llevan a cabo de acuerdo con el proceso compendiado descrito en la monografía USP de enzimas pancrelipasa. La actividad enzimática específica (SA) informada a continuación siempre se expresa como UI/mg.

El contenido de agua se mide por TGA a 80 °C por 4 horas (muestras 18, 19 y 20) o con el procedimiento de Karl Fisher (muestras 26, 27 y 28).

Los triglicéridos se extraen con hexano: isopropanol (3:2) mediante el uso de palmitato de colesterilo como patrón interno y se analizan por HPLC. Los picos se identifican comparando todos los tiempos de retención con una solución estándar de trioleína.

Análisis de proteínas: El contenido total de proteínas se cuantifica con un ensayo de Bradford.

Análisis de carbohidratos: 1) Los azúcares de cadena corta se analizan por HPLC usando xilitol como estándar interno; los picos se identifican comparando todos los tiempos de retención con estándares de azúcar, es decir, maltosa. 2) Las maltodextrinas se extraen en presencia de Carrez I y Carrez II y se analizan por HPLC. Los picos se identifican comparando todos los tiempos de retención con estándares de maltodextrinas, es decir, maltosa monohidrato, maltotriosa, maltotetraosa, maltopentaosa, maltohexaosa y maltoheptaosa.

Sulfato de amonio saturado: Se prepara una solución saturada de sulfato de amonio de la siguiente manera: se calcula la saturación para 4 °C y la solución se prepara a temperatura ambiente, luego se enfría en hielo. Por ejemplo, se añaden 1,43 g de sulfato de amonio a 2 mL de PBS a temperatura ambiente (fosfato de sodio 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) y se mezcla para disolver hasta un volumen final de 2,76 mL. Una vez que se ha disuelto el sulfato de amonio, la solución se coloca en hielo.

Extracción de pancreatina: Se prepara un extracto de 40 mg/mL de pancreatina de la siguiente manera: se agrega pancreatina en polvo (aproximadamente 40-50 mg) a un tubo de microcentrífuga, seguido de tampón PBS frío. El tubo se agita para volver a suspender el polvo y se incuba en hielo por unos 15 minutos con mezcla ocasional. Alternativamente, pueden agregarse aproximadamente 200 mg de pancreatina en polvo a un pequeño vaso de precipitados enfriado, seguido de 5 mL de PBS frío. La mezcla se agita con un agitador magnético por aproximadamente 15-30 minutos en hielo y se transfiere a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Los tubos de microcentrífuga se centrifugan a 16.000 g por 5 minutos, ya sea a temperatura ambiente o a 4 °C. El tubo se enfría si se centrifuga a temperatura ambiente, el sobrenadante se decanta y el extracto se almacena en hielo.

Precipitación con sulfato de amonio: La precipitación con sulfato de amonio ocurre de la siguiente manera: en un tubo de microcentrífuga, se añaden lentamente 750 pl de sulfato de amonio saturado enfriado a 500 pl de extracto de pancreatina enfriado preparado como se discutió anteriormente. La mezcla se mezcla bien y se incuba en hielo por 20 minutos con mezcla ocasional. La mezcla se centrifuga por 5 minutos a 16.000 g y el sobrenadante se decanta y se almacena en hielo.

Lavado de sedimentos: El sedimento puede lavarse como sigue: el sedimento de la precipitación con sulfato de amonio se resuspende en 500 pL de sulfato de amonio saturado al 60 % enfriado (en tampón PBS). La suspensión se incuba en hielo por 5 minutos, luego se centrifuga por 5 minutos a 16.000 g y se vuelve a colocar en hielo. El sobrenadante puede decantarse para dejar el sedimento lavado. El sedimento de sulfato de amonio puede volverse a disolver de la siguiente manera: Se agrega 1 mL de PBS enfriado al sedimento y luego el tubo se agita suavemente para disolverlo. La mezcla resultante se incuba en hielo por 15 minutos, luego se centrifuga por 5 minutos a 16.000 g para eliminar cualquier material insoluble. El sedimento también puede volverse a disolver en 0,5 mL de PBS para hacer una solución más concentrada.

Desalación: Se equilibra una columna Sefadex G-25 de 4 mL en agua desionizada y se seca por centrifugación a 2000 g por 2 minutos. Se añade la muestra (0,75 mL) a desalar y la columna se centrifuga a 2.000 g por 2 minutos.

Ensayo oleato de 4-metilumbeliferilo: Se prepara una solución madre 20 mM de oleato de 4-metilumbeliferilo en etanol y se almacena a -20 °C. Se prepara una dilución de trabajo el día del ensayo diluyendo el stock de etanol con PBS a una concentración de 0,1 mM. Se mezcla lo siguiente: 50 pl de la solución madre de oleato de 4-metilumbeliferilo 0,1 mM; 25 pl de PBS; 25 pL de ~ 0,4 pg de pancreatina en Tris HCl 50 mM, NaCl 100 mM pH 7,6. La emisión a 450 nm con una excitación de 355 nm se mide en un lector de placas. El ensayo puede realizarse como un ensayo de punto final agregando 1 mL de Triton X-100 5 mM después de aproximadamente 10 minutos para detener la reacción.

Protocolo de ensayo de amilasa: Materiales para el ensayo de amilasa: El ensayo de amilasa requiere: Ácido 2,2'-azino-bis (3-etilbenztiozolin-6-sulfónico) (ABTS), glucosa oxidasa, a-glucosidasa, almidón y peroxidasa de soja (Rz = 1,63). El ABTS se almacena en tampón fosfato-citrato 50 mM pH 7 a 4 °C. La peroxidasa de soja se almacena en PBS pH 7,4 a 4°C. La glucosa oxdiasa se almacena en acetato de sodio 50 mM/NaCl 100 mM pH 5. La aglucosidasa y el almidón se almacenan en agua desionizada a 4 °C. Todos los reactivos, una vez traídos como soluciones, se mantienen a 4 °C. Una mezcla de reacción de 100 pL de 0,1 mg/mL ABTS, 39 ug/mL de peroxidasa de soja (SBP), 10 U/mL u 80,6 pg/mL de glucosa oxidasa, 7 U/mL o 63 pg/mL de glucosidasa y 1 mg/mL de almidón se preparan a 4 °C o en hielo. El almidón, a diferencia de los otros componentes, está a temperatura ambiente antes de agregarlo a la mezcla de reacción y también se agrega a la mezcla de reacción inmediatamente antes de usarlo en la placa. Los componentes de la mezcla de reacción deben agregarse en este orden: ABTS, SBP, glucosa oxidasa, glucosidasa y almidón. La reacción se inicia mediante la adición de 5 pl de pancreatina, que se diluye en PBS 1 mM/CaCl 30 mM2, a 95 pL de mezcla de reacción. La concentración final de pancreatina en el ensayo es 4 pg/mL. La absorbancia a 405 nm se registra hasta aproximadamente 15 minutos. Los puntos de datos se grafican en función del tiempo. Hay una fase de retraso y la parte lineal de la curva se encuentra generalmente entre aproximadamente 8-12 minutos después de ejecutar el ensayo. Las pendientes de la porción lineal de la curva se calculan y se usan como datos finales.

Ejemplo de referencia 1: Procedimiento en múltiples etapas

Preparación de HA-pancreatina; 0,1 g/mL; en múltiples etapas: suspensión, separación, precipitación; (SP = 38: acetona: disolvente acuoso = 35:65; etanol: disolvente acuoso = 45:55)

Etapa a1.1- Suspensión: La pancrelipasa de partida se dispersa en disolvente acuoso a una concentración de 0,1 g/mL a 4 °C y se mantiene en agitación por 30 minutos. Los experimentos se llevan a cabo a escala de laboratorio mediante el uso de 650 mg (cuando el disolvente orgánico es acetona) o 550 mg (cuando el disolvente orgánico es etanol) de pancrelipasa de partida. Se prueban cuatro disolventes acuosos diferentes para la suspensión de pancrelipasa: 1) tampón pH = 4,0 (tampón acetato 10 mM); 2) tampón pH = 7,0 (fosfato 10 mM); 3) agua desionizada (DW); 4) tampón pH = 4,0 (acetato 10 mM) con NaCl (0,5 M).

Etapa a1.2- Separación: La suspensión de la etapa a1.1 se centrifuga (10 minutos, 4 °C, aproximadamente 11.000 g) y el sobrenadante (SN) se separa del sedimento (P).

Etapa a1.3- Precipitación: El disolvente orgánico se añade al sobrenadante de la etapa a1.2 y la mezcla se mantiene a 4 °C por 15 minutos en condición estática. El disolvente orgánico es acetona o etanol. Se añade acetona en una cantidad de 35 partes (volumen) por cada 65 partes (volumen) de disolvente acuoso. Se añade etanol en una cantidad de 45 partes (volumen) por cada 55 partes (volúmenes) de disolvente acuoso.

Etapa a2- Separación: La mezcla se centrifuga (10 minutos, 4 °C, aproximadamente a 11.000 g) para separar el sobrenadante del sedimento, que contiene las enzimas pancrelipasa. El sedimento se resuspende en el disolvente acuoso usado en la etapa a1.1 (LA en sedimentos después de la resuspensión, precipitación).

Se analizan los materiales de las diferentes etapas. Se mide la cantidad de pancrelipasa, expresada como actividad lipasa (LA):

- en suspensión de la etapa a1.1 (LA en suspensión; LA-Sa1.1);

- en el sobrenadante obtenido en la etapa a2 (LA en SN, precipitación, LA-SN);

- en los sedimentos obtenidos en la etapa a2 y luego resuspendidos en el medio de partida (LA en los sedimentos, precipitación, LA-P).

Los resultados son informados en las Tablas 1, 2, 3, 4.

Tabla 1

La Tabla 1 muestra que la precipitación de pancrelipasa (etapa a1.3) permite una buena recuperación de la actividad de la lipasa en la porción de precipitado (sedimento), que varía de aproximadamente 67 a aproximadamente 77 %. El rendimiento es el % de la actividad lipasa total de la etapa a2 (sedimento y sobrenadante) con respecto a la actividad lipasa de la pancrelipasa suspendida inicial, expresada como actividad lipasa en la suspensión de la etapa a1.1 (Sa1.1): (LA-SN LA-P)/ (LA-Sa1.1).

Tabla 2

El rendimiento del procedimiento varía de aproximadamente 37 a aproximadamente 56 %. El % de rendimiento es la actividad lipasa total en el sedimento y en el sobrenadante de la etapa a2 con respecto a la actividad lipasa teórica de la pancrelipasa usada en la etapa a1.1, que se calcula factorizando la actividad específica de la materia prima no tratada (es decir, 94,4 UI/mg como determinado de acuerdo con el procedimiento de USP compendiado) y su peso inicial.

Tabla 3

El factor de enriquecimiento (independiente del pH) se determina calculando la relación entre la actividad de la lipasa en el sedimento de la etapa a2 y la actividad de la lipasa de la pancreatina de partida (que es 94,4 UI/mg). Con este procedimiento se obtiene un factor de enriquecimiento de hasta 2,5; el enriquecimiento se confirma también mediante análisis de perfil de HPLC.

Con respecto a las otras enzimas digestivas, el contenido de amilasa en el sedimento final (precipitado de la etapa a2) es menor que el contenido de amilasa en la pancrelipasa inicial.

Ejemplo de referencia 2: Procedimiento en múltiples etapas

Preparación de HA-pancreatina; 0,3 g/mL; en varias etapas: suspensión, separación, precipitación (SP = 38: acetona: disolvente acuoso = 35:65; etanol: disolvente acuoso = 45:55)

Etapa a1.1- Suspensión: La pancrelipasa (API) se dispersa en un disolvente acuoso a una concentración de 0,3 g/mL a 4 °C y se agita por 30 minutos. El experimento se lleva a cabo a escala de laboratorio mediante el uso de 0,650 mL (cuando el disolvente orgánico es acetona) o 0,550 mL (cuando el disolvente orgánico es etanol) de pancrelipasa de partida. Se realizan dos experimentos cada uno en un disolvente acuoso diferente: 1) tampón pH = 4,0 (tampón acetato 10 mM); 2) tampón pH = 7,0 (fosfato 10 mM).

Etapa a1.2- Separación: La suspensión de la etapa a1 se centrifuga (10 minutos, 4 °C, aproximadamente 11.000 g) y el sobrenadante (SN) se separa del sedimento (P).

Etapa a1.3- Precipitación: El disolvente orgánico se añade al sobrenadante de la etapa a1.2 y la mezcla se mantiene a 4 °C por 15 minutos en condición estática. El disolvente orgánico es acetona o etanol. Se añade acetona en una cantidad de 35 partes (volumen) por cada 65 partes (volumen) de disolvente acuoso. Se añade etanol en una cantidad de 45 partes (volumen) por cada 55 partes (volúmenes) de disolvente acuoso.

Etapa a2- Separación: La mezcla se centrifuga (10 minutos, 4 °C, aproximadamente a 11.000 g) para separar el sobrenadante del sedimento, que contiene las enzimas pancrelipasa. El sedimento se resuspende en el disolvente acuoso de partida (LA en los sedimentos después de la resuspensión, precipitación).

Etapa a3- Secado: Se seca el sedimento de la etapa a2.

Se analizan los materiales de las diferentes etapas. La cantidad de pancrelipasa se expresa como actividad lipasa (LA) y se mide:

- en suspensión de la etapa a1.1 (LA en suspensión; LA-Sa1.1);

- en el sobrenadante obtenido en la etapa a2 (LA en SN, precipitación, LA-SN);

- en los sedimentos obtenidos en la etapa a2 y luego resuspendidos en el medio acuoso de partida (LA en sedimentos, precipitación, LA-P). Los resultados son informados en las Tablas 4, 5, 6.

Tabla 4

La Tabla 4 muestra que la recuperación después de la precipitación es muy buena (73-92 %).

Tabla 5

El rendimiento del sedimento del procedimiento en múltiples etapas llevado a cabo con una concentración de pancrelipasa de 0,3 g/mL varía de aproximadamente 56 a aproximadamente 64.

Tabla 6

El factor de enriquecimiento se determina calculando la relación entre la actividad de la lipasa en el sedimento de la etapa a2 y la actividad de la lipasa de la pancrelipasa de partida de la etapa a1.1 (que es 94,4 U/mg). El factor de enriquecimiento varía de 1,9 a 3,0.

Ejemplo de referencia 3: Procedimiento en dos etapas

Preparación de HA-pancreatina; 0,1 g/mL; en dos etapas: suspensión, precipitación (SP = 38: acetona: disolvente acuoso = 35:65; etanol: disolvente acuoso = 45:55, donde SP (acetona) = 20,2, SP (etanol) = 26,0, SP (tampón) = 47,9)

Etapa a1.1- Suspensión: La pancrelipasa se dispersa en un disolvente acuoso a una concentración de 0,1 g/mL a 4 °C y se mantiene en agitación por 30 minutos. El experimento se lleva a cabo a escala de laboratorio mediante el uso de 650 mg (cuando el disolvente orgánico es acetona) o 550 mg (cuando el disolvente orgánico es etanol) de pancrelipasa de partida. Se realizan dos experimentos, cada uno en un disolvente acuoso diferente: 1) pH = 4,0, tampón acetato 10 mM; 2) pH = 7,0, tampón fosfato 10 mM.

Etapa a1.2- Precipitación: Se añade el disolvente orgánico a la suspensión de la etapa a1.1 y se mantiene esta mezcla a 4 °C por 15 minutos. El disolvente orgánico es acetona o etanol. Se añade acetona en una cantidad de 35 partes (volumen) por cada 65 partes (volumen) de disolvente acuoso. Se añade etanol en una cantidad de 45 partes (volumen) por cada 55 partes (volúmenes) de disolvente acuoso.

Etapa a2- Separación: La mezcla se centrifuga (10 min, 4 °C, aproximadamente a 11.000 g) para separar el sobrenadante del sedimento, que contiene las enzimas pancreáticas. El sedimento se resuspende en el disolvente acuoso de partida (LA en los sedimentos después de resuspensión, separación).

Se analizan los materiales de las diferentes etapas. La cantidad de pancrelipasa, expresada como actividad lipasa, se mide a lo largo de todo el procedimiento:

- en suspensión de la etapa a1.1 (LSA en suspensión; LA-Sa1.1);

- en el sobrenadante obtenido en la etapa a2 (LA en SN, separación, LA-SN);

- en los sedimentos obtenidos en la etapa a2 y luego resuspendidos en el medio de partida (LA en los sedimentos, precipitación, LA-P).

Los resultados son informados en las Tablas 7, 8, 9.

Tabla 7

La recuperación después de la precipitación es alta, la recuperación casi completa se logra con el procedimiento de dos etapas.

Tabla 8

El rendimiento del procedimiento para el sedimento varía de 73,1 a 80,4, que es más alto que el obtenido con el procedimiento en múltiples etapas. El porcentaje de rendimiento es la actividad lipasa total en el sedimento y en el sobrenadante de la etapa a2 con respecto a la actividad lipasa teórica de la pancreatina usada en la etapa a1.1, que se calcula factorizando la actividad específica del material de partida (es decir, 94,4 UI/mg como se determina de acuerdo con el procedimiento USP compendiado) y su peso inicial.

Tabla 9

Los resultados muestran que el uso del tampón acuoso a pH = 7 y acetona en un procedimiento de dos etapas proporciona un rendimiento interesante (rendimiento del procedimiento para el sedimento de aproximadamente 76 %) y el factor de enriquecimiento varía de 2,1 a 2,9.

Ejemplo de referencia 4: Procedimiento en dos etapas

Preparación de HA-pancreatina; 0,1 g/mL; en dos etapas: suspensión, precipitación; piloto (SP = 38: acetona: disolvente acuoso = 35:65)

Etapa a1.1- Suspensión: Se dispersan 6,5 g de pancrelipasa de partida (61.400 U de lipasa) en 45 mL de solución tampón pH = 7,0 (tampón fosfato 10 mM) a 4 °C y se agita (Ultraturrax, 3 ciclos) por 1 minuto para cada ciclo, el agitador se lava dos veces con 10 mL de tampón frío para recuperar la pancrelipasa residual.

Etapa a1.2- Precipitación: Se añaden 35 mL de acetona a la suspensión de la etapa a1.1 y la mezcla se mantiene a 4 °C por 30 minutos en condiciones estáticas.

Etapa a2- Separación: La mezcla se centrifuga (10 minutos, 4 °C, aproximadamente 2.700 g) para separar el sobrenadante del sedimento, que contiene las enzimas pancreáticas.

Etapa a3- Secado: El sedimento se seca de acuerdo con dos protocolos diferentes: el sedimento seco ponderado medio es 1,55 g, la actividad lipasa (LA) es 365.000 UI de lipasa, la actividad específica (LSA) es 235 UI/mg. La Tabla 10 informa las actividades específicas de lipasa (L), proteasa (P) y amilasa (A) medidas para cada material obtenido con los dos protocolos. La actividad de la lipasa en los sedimentos (medida después de su suspensión en 1 mL de tampón) se mide también antes del tratamiento de secado; asciende a 233,7 UI/mg.

Tabla 10

El análisis muestra que el procedimiento de secado en sí no afecta al LSA y que diferentes protocolos conducen a materiales con las mismas actividades enzimáticas. El factor de enriquecimiento calculado como en los ejemplos previos también está siempre por encima de 2 y es constante entre los diferentes protocolos. Está: 2,5 (muestra 18), 2,7 (muestra 19), 2,3 (muestra 20), el valor medio es 2,5. La actividad de la lipasa en los sedimentos, medida antes del tratamiento de secado, asciende a 233,7 UI/mg (muestra 18).

Los perfiles de HPLC de las muestras obtenidas con los diferentes protocolos son superponibles; no se observó ninguna diferencia cualitativa relevante con el perfil de HPLC del material de partida.

Ejemplo de referencia 5: Procedimiento en dos etapas

Preparación de HA-pancreatina; 0,1 g/mL; en dos etapas: suspensión, precipitación; aumento de escala (SP = 38: etanol: disolvente acuoso (pH = 7) = 45:55, muestra 21); (SP = 34: acetona: disolvente acuoso (pH = 7) = 50:50 muestra 22); (SP = 35: acetona: disolvente acuoso (pH = 7) = 45:55, muestra 23). El procedimiento de preparación del Ejemplo 4 se aplica a diferentes cantidades de pancrelipasa de partida, diferentes volúmenes de solución tampón y diferentes volúmenes de acetona (SP = 34 o 35) o volúmenes de etanol (SP = 38). El protocolo de secado es de 24 horas, 6-8 °C, 0,2 mbar, todos los demás parámetros y condiciones son los mismos que en el Ejemplo 4.

Tabla 12

Los resultados son informados en las Tablas 13, 14.

Tabla 13

El factor de enriquecimiento calculado como en los ejemplos previos es: 1,6 (muestra 21), 1,3 (muestra 22), 1,7 (muestra 23).

La Tabla 14 muestra las actividades enzimáticas del material purificado final obtenido con el procedimiento de escalado aquí aplicado y el rendimiento enzimático.

No se observó ninguna diferencia cualitativa relevante con el perfil de HPLC del material de partida.

Las muestras 22 y 23 obtenidas con un protocolo diferente muestran una LA específica más baja y una PA y AA más altas que la muestra 20 producida con el protocolo (SP = 38).

Ejemplo de referencia 6: Procedimiento de una sola etapa

Preparación de HA-pancreatina; 0,065 y 0,1 g/mL; una sola etapa; escala de laboratorio (SP = 38-acetona: disolvente acuoso = 35:65)

Etapa a1- Suspensión- precipitación: 650 mg (muestra 24) o 1000 mg (muestra 25) de pancrelipasa nativa se dispersan en 10 mL de una mezcla 65:35 de tampón (pH = 7 fosfato 10 mM) y acetona (65 volúmenes de tampón y 35 volúmenes de acetona) con agitación por 60 minutos a 4 °C.

Etapa a2- Separación: La mezcla de la etapa a1 se centrifuga (10 min a 10.000 g a 4 °C) para separar el sobrenadante del sedimento, que contiene las enzimas pancreáticas.

Etapa a3 -Secado: El sedimento se seca con una bomba de alta eficiencia a 0,2 mbar.

Se analiza el material. La cantidad de pancrelipasa, expresada como actividad lipasa, se mide a lo largo de todo el procedimiento:

- en el sobrenadante obtenido en la etapa a2 (LA en SN, separación, LA-SN);

- en los sedimentos obtenidos en la etapa a2 y luego resuspendidos en el medio de partida (LA en sedimentos, precipitación, LA-P);

- el LA de la suspensión - etapa de precipitación a1 (LA en suspensión; LA-SN) Los resultados se muestran en las Tablas 15 y 16.

Tabla 15

Tabla 16

El procedimiento en una sola etapa proporcionó un buen rendimiento y un factor de mejora. Esto es útil para la industrialización ya que la ejecución es fácil y sencilla.

La Tabla 16a informa la actividad específica de la lipasa (LSA), para el material purificado obtenido con diferentes tiempos de suspensión - precipitación.

Tabla 16a. Actividad de la li asa en diferentes tiem os

Tabla 16b. Actividad específica de la lipasa, comparación de diferentes procedimientos.

Los datos mostraron que el procedimiento usado por sí mismo no afecta la partición de la lipasa entre las fases. Ejemplo de referencia 7: Procedimiento de una sola etapa

Preparación de HA-pancreatina; 0,1 g/mL; una sola etapa; escala piloto (SP = 38-acetona: disolvente acuoso = 35:65).

Etapa a1- Suspensión- precipitación: Se dispersan 10 g de pancrelipasa nativa en 100 mL de una mezcla de disolventes de tampón (pH = 7, fosfato 10 mM) y acetona (65 volúmenes de tampón y 35 volúmenes de acetona) con agitación por 60 minutos a 4 °C.

Etapa a2- Separación: La mezcla de la etapa a1 se centrifuga (10 min a 2.700 g a 4 °C) para separar el sobrenadante del sedimento, que contiene las enzimas pancreáticas.

Etapa a3- Secado: Los sedimentos de la muestra 26 se vierten en placas de Petri, mientras que los sedimentos de las muestras 27 y 28 se mantienen en los tubos de centrifugación y se secan directamente usando una bomba de alta eficiencia a 0,2 mbar.

Se analiza el material. La cantidad de pancrelipasa, expresada como actividad lipasa, se mide en:

- en sedimentos obtenidos en la etapa a2 y secados según la etapa a3.

Los resultados se informan en las Tablas 17 y 18.

Tabla 17

Se obtuvo una buena reproducibilidad en términos de actividad lipasa, proteasa y amilasa.

Tabla 18

Se obtuvo un rendimiento de lipasa muy alto y el factor de enriquecimiento fue alto (por encima de 2). Por ejemplo, el factor de enriquecimiento fue 2,2 (Muestra 26), 2,4 (Muestra 27), 2,3 (Muestra 28).

El procedimiento de una sola etapa proporcionó buenos rendimientos. Se obtienen 4,2 g de HA-pancreatina (42 % de la pancrelipasa inicial), las unidades totales de lipasa son 940.000 UI (99-100 % de la LA inicial). La HA-pancreatina obtenida tiene una actividad específica de 221 UI/mg considerando la media entre 27 y 28.

Los perfiles de HPLC, SDS-Page y los espectros UV de las muestras 26-28 obtenidos con los diferentes protocolos fueron superponibles. No se observó ninguna diferencia cualitativa relevante con el perfil de HPLC del material de partida.

Tabla 18a

Los datos de la tabla 18a muestran en que la escala no afecta a la partición de la lipasa entre las fases y los resultados del procedimiento escalables en consecuencia.

La reproducibilidad del procedimiento de una sola etapa se evaluó mediante el uso de diferentes materias primas de pancrelipasa enumeradas en la Tabla 18b.

Tabla 18b. Materia prima de pancreatina

Tabla 18c. Reproducibilidad del procedimiento de una sola etapa

Los datos de la Tabla 18c muestran que la materia prima nativa con diferentes LSA de partida no afecta el resultado del procedimiento de purificación en términos de factor de mejora y se obtuvieron buenos rendimientos.

Ejemplo de referencia 8: Ejemplo comparativo

Preparación de HA-pancreatina; 0,1 g/mL; suspensión, precipitación, separación; ejemplo comparativo (SP = 38-acetona: agua = 35:65).

Etapa 1- Suspensión: La pancrelipasa se dispersa en un disolvente acuoso (agua destilada a una concentración de 0,045 g/mL a 4 °C (muestra 29), por aproximadamente 30 minutos con agitación.

Etapa 2- Precipitar: Se añaden 80 mL de la mezcla de disolventes (acetona: agua = 35:45) a 20 mL de suspensión de la etapa a1.1 (para obtener SP = 38 (MPa)05 en la mezcla final de disolventes). La mezcla se mantiene a 25 °C por 60 minutos en condiciones estáticas.

Etapa 3- Separación: La mezcla se centrifuga (10 min a 3.000 g a 25 °C) para separar el sobrenadante del sedimento, que contiene las enzimas pancreáticas.

Se analizan los materiales de las diferentes etapas. La cantidad de pancrelipasa, expresada como actividad lipasa, se mide a lo largo de todo el procedimiento:

- en suspensión de la etapa 1 (LA en suspensión; LA-Sa1);

- en el sobrenadante obtenido en la etapa 2 (LA en SN, precipitación, LA-SN);

- en los sedimentos obtenidos en la etapa 3 y luego resuspendidos en el agua destilada de partida (LA en sedimentos, precipitación, LA-P).

Los resultados se informan en las Tablas 19-20. Los resultados obtenidos con los procedimientos de dos etapas y de una etapa en los ejemplos previos también se informan aquí para fines de comparación directa.

Tabla 19

Tabla 20

Este procedimiento comparativo proporcionó bajo rendimiento, la inactivación enzimática es pronunciada y no se obtuvo enriquecimiento de lipasa.

Ejemplo de referencia 9 Caracterización de HA-pancreatina purificada (Muestra 20)

El material HA se prueba para determinar su capacidad de digestión y se compara con la pancrelipasa inicial. Se suspenden 20 mg de HA-pancreatina y 50 mg de pancrelipasa de partida (correspondientes a 2.300 UI de lipasa) en 1 mL de agua desionizada y se añaden a 50 mL de fórmula enteral PEPTAMEN® Junior 1,0 a 37 °C y se agita a 100 rpm por 60, 120 y 240 minutos. Las pruebas de digestión se llevaron a cabo después de 1, 2 y 4 horas. La prueba se repite 6 veces para cada muestra de pancrelipasa.

Los nutrientes lipídicos se controlan midiendo la digestión de la trioleína (disminución del pico de trioleína); la digestión de la proteína total se controla mediante el procedimiento de Bradford. El procedimiento amilolítico se controla midiendo la formación de azúcares de cadena corta. La diferencia del grado de digestión se obtiene comparando el rendimiento de digestión de los materiales nativos y de HA después de 4 horas de digestión.

Tabla 21

La diferencia de actividad se calcula con la fórmula:

{actividad de pancreatina nativa - actividad de HA-pancreatina) / actividad de pancrelipasa nativa La diferencia de digestión se calcula mediante la siguiente fórmula:

Esta prueba in vitro permite el análisis de la digestión de lípidos, proteínas y carbohidratos de HA-pancreatina. La digestión con lipasa es extremadamente sensible a la diferencia en las actividades enzimáticas presentes en los recipientes de reacción, por lo tanto, un 10 % de diferencia en la actividad corresponde al 10 % de diferencia en la cantidad de digestión. La cinética de la digestión muestra tendencias similares. Estos resultados sugieren que la pancreatina nativa y la HA tienen un patrón de digestión lipídica similar.

Los perfiles de digestión de proteínas son casi superponibles, lo que sugiere que la actividad proteasa de HA-pancreatina mantiene la digestión al mismo nivel que la pancrelipasa nativa. Una diferencia de aproximadamente el 60 % de la actividad de la proteasa no produce ningún efecto sobre el grado de digestión de las proteínas.

Los perfiles de digestión de carbohidratos son diferentes ya que la producción de maltosa es menor en la HA-pancreatina. La comparación de la diferencia en la actividad de la amilasa y la cantidad de productos digeridos muestra que en la HA-pancreatina también se produce la amilólisis.

Ejemplo de referencia 10: Procedimiento en una sola etapa

Preparación de HA-pancreatina; 0,1 g/mL; una sola etapa; escalar (SP = 38 -acetona: disolvente acuoso = 35:65). Para este ejemplo se usó una pancrelipasa nativa (código 005A) con las siguientes características: actividad específica de lipasa 81,1 UI/mg, actividad proteasa 284,2 UI/mg y actividad amilasa 517,9 UI/mg; la relación P/L es 3,5 y la relación A/L es 6,4.

Etapa a1) Suspensión-Precipitación: Se dispersan 100 g de pancrelipasa nativa en 1 L de una mezcla de disolventes de tampón (pH = 7, fosfato 10 mM) y acetona (65 volúmenes de tampón y 35 volúmenes de acetona) con agitación por 60 minutos a 4 °C.

Etapa a2) Separación: La mezcla de la etapa a1 se centrifuga (15 min a 2.700 g a 4 °C) para separar el sobrenadante del sedimento, que contiene las enzimas pancreáticas.

Etapa a3) Secado: Los sedimentos se secan con una bomba de alta eficiencia a 0,2 mbar.

Se analiza el material. La Tabla 22 informa la actividad específica medida de la lipasa (L), para la muestra obtenida mediante el uso de una escala diferente.

Tabla 22

La Tabla 22 muestra la actividad de la lipasa del material purificado final obtenido con el procedimiento ampliado aquí aplicado. Los resultados de esta escala son coherentes con la escala piloto.

Tabla 23

Se obtiene una buena reproducibilidad en términos de actividad lipasa, proteasa, amilasa.

Ejemplo 1: Procedimiento de doble precipitación

Preparación de HA-pancreatina; 0,1 g/mL; doble precipitación; escala piloto (SP (a1.1) = 38 - acetona: disolvente acuoso = 35:65; SP (a1.3) = 36).

Se usó una pancrelipasa nativa (código 005A) con las siguientes características: actividad específica de lipasa 81,1 UI/mg, actividad proteasa 284,2 UI/mg y actividad amilasa 517,9 UI/mg; la relación P/L es 3,5 y la relación A/L es 6,4.

Etapa a1.1- Suspensión- precipitación: Se dispersan 10 g de pancrelipasa nativa en 100 mL de una mezcla de disolventes de tampón (pH = 7, fosfato 10 mM) y acetona (65 volúmenes de tampón y 35 volúmenes de acetona) con agitación por 60 minutos a 4 °C.

Etapa a1.2- Separación: La mezcla de la etapa al se centrifuga (10 min a 2.700 g a 4 °C) para separar el sobrenadante del sedimento, que contiene las enzimas pancreáticas.

Etapa a3.1- Secado: Los sedimentos se secan con una bomba de alta eficiencia a 0,2 mbar.

Etapa a1.3- Precipitación: Se añade acetona al sobrenadante de la etapa a1.2 (para alcanzar un SP de 36) con agitación por 60 minutos a 4 °C.

Etapa a2- Separación: La mezcla de la etapa a4 se centrifuga (10 min a 2.700 g a 4 °C) para separar el sobrenadante del sedimento, que contiene las enzimas pancreáticas.

Etapa a3.2- Secado: Los sedimentos se secan con una bomba de alta eficiencia a 0,2 mbar.

Etapa a4- Mezcla: Los sedimentos secos de la etapa a3.1 y a3.2 se mezclan.

Se analiza el material. La Tabla 24 informa las actividades específicas de la lipasa (L), proteasa (P) y amilasa (A) medidas para cada muestra.

Tabla 24.

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Ejemplo 2: Procedimiento de doble precipitación

Preparación de HA-pancreatina; 0,1 g/mL; doble precipitación; escalar (SP (a1.1) = 38 - acetona: disolvente acuoso = 35:65; SP (a1.3) = 36).

Se usó una pancrelipasa nativa con las siguientes características: actividad lipasa 128,7 Ul/mg, actividad proteasa 324,6 Ul/mg y actividad amilasa 408,0 Ul/mg; la relación P/L es 2,5 y la relación A/L es 3,2.

Etapa a1.1- Suspender- precipitar: Se dispersan 100 g de pancrelipasa nativa en 1 L de una mezcla de disolventes de tampón (pH = 7, fosfato 10 mM) y acetona (65 volúmenes de tampón y 35 volúmenes de acetona) con agitación por 60 minutos a 4 °C.

Etapa a1.2- Separación: La mezcla de la etapa a1 se centrifuga (15 min a 2.700 g a 4 °C) para separar el sobrenadante del sedimento, que contiene las enzimas pancreáticas.

Etapa a3.1- Secado: Los sedimentos se secan con una bomba de alta eficiencia a 0,2 mbar.

Etapa a1.3- Segunda precipitación: se agrega acetona al sobrenadante de la etapa a1.2 (SP de 36) por 120 o 180 minutos a 4 °C en condición estática.

Etapa a2- Separación: La mezcla de la etapa a1.3 se centrifuga (15 min a 2.700 g a 4 °C) para separar el sobrenadante del sedimento, que contiene las enzimas pancreáticas.

Etapa a3.2- Secado: Los sedimentos se secan con una bomba de alta eficiencia a 0,2 mbar.

Etapa a4- Mezcla: Los sedimentos secos de la etapa a3.1 y a3.2 se mezclan juntos

Se analiza el material. La Tabla 25 informa las actividades específicas de la lipasa (L), proteasa (P) y amilasa (A) medidas para cada muestra.

Tabla 25

Ejemplo de referencia 11: Procedimiento de una sola etapa

Preparación de HA-pancreatina; 0,1 g/mL; una sola etapa; escala piloto (SP = 36- acetona: disolvente acuoso = 43: 57)

Para este ejemplo se ha usado una pancrelipasa nativa con las siguientes características: actividad lipasa 85,5 UI/mg, actividad proteasa 337,8 UI/mg y actividad amilasa 434,0 UI/mg; la relación P/L es 2,5 y la relación A/L es 3,2.

Etapa a1- Suspender- precipitar: Se dispersan 10 g de pancrelipasa nativa en 100 mL de una mezcla de disolventes de tampón (pH = 7, fosfato 10 mM) y acetona (57 volúmenes de tampón y 43 volúmenes de acetona) con agitación por 60 minutos a 4 °C.

Etapa a2- Separación: La mezcla de la etapa a1 se centrifuga (10 min a 2.700 g a 4 °C) para separar el sobrenadante del sedimento, que contiene las enzimas pancreáticas.

Etapa a3) -Secado: Los sedimentos de la etapa a2 se secan con una bomba de alta eficiencia a 0,2 mbar.

Se analiza el material. La cantidad de pancrelipasa, expresada como actividad lipasa, se mide en el sedimento de la etapa a3.

Tabla 26

Los resultados informados en la Tabla 26 mostraron que SP = 38 produjo buenos resultados.

Ejemplo de referencia 12: Procedimiento en una sola etapa

Preparación de HA-pancreatina; 0,1 g/mL; una solo etapa; escala piloto (SP = 38-alcohol isopropílico: disolvente acuoso = 40: 60).

Etapa a1- Suspensión- precipitación: Se dispersaron 10 g de pancrelipasa nativa en 100 mL de una mezcla de disolventes de tampón (pH = 7, fosfato 10 mM) y alcohol isopropílico (60 volúmenes de tampón y 40 volúmenes de alcohol isopropílico) con agitación por 60 minutos a 4 °C.

Etapa a2- Separación: La mezcla de la etapa a1 se centrifuga (10 min a 2.700 g a 4 °C) para separar el sobrenadante del sedimento, que contiene las enzimas pancreáticas.

Etapa a3- Secado: Los sedimentos de la etapa a2 se secan con una bomba de alta eficiencia a 0,2 mbar.

Tabla 27

Los resultados presentados en la Tabla 27 mostraron que la precipitación con acetona produjo mejores resultados en términos de actividad de lipasa y potenciación en comparación con el alcohol isopropílico.

Ejemplo 3: Precipitación con sulfato de amonio

Se preparó un extracto de pancreatina soluble en agua mediante dispersión en solución salina fría tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 40 mg/mL. La dispersión se incubó en hielo con agitación ocasional y luego se centrifugó a 16.000 xg por 5 minutos. Se decantó el sobrenadante que contenía pancreatina disuelta. El sobrenadante absorbe fuertemente en UV con una absorbancia con un pico a 259 nm, indicativo de la presencia de ácidos nucleicos disueltos. (Figura 1).

A continuación, el sobrenadante se mezcló con sulfato de amonio saturado hasta una concentración final de aproximadamente 60 % de sulfato de amonio saturado. El precipitado resultante se recuperó por centrifugación y se disolvió en solución salina tamponada con fosfato (PBS). El espectro UV de una dilución adecuada del precipitado que se volvió a disolver se muestra en la Figura 2B. El pico a 280 nm es típico de una solución de proteína. El sobrenadante tenía un pico de absorbancia a 260 nm, típico del ácido nucleico disuelto. La comparación de los valores de concentración y absorbancia (Figura 1 y Figura 2) indica que se elimina aproximadamente el 60-90 % del material que se absorbe en la región de 260 nm. La posición y la forma de los espectros concuerdan con el enriquecimiento de componentes proteicos y/o peptídicos. El sobrenadante que contiene el material no precipitado por sulfato de amonio (Figura 2A) tiene una relación de absorbancia de 260 nm/280 nm de 1,7 en comparación con la relación de absorbancia de 260 nm/280 nm de 1,4 del extracto de pancreatina soluble en agua (Figura 1). Este aumento en la proporción de 260 nm/280 nm es consistente con un enriquecimiento de ADN y/o ARN en el material que no es precipitado por sulfato de amonio.

Sin estar ligado a una teoría particular, estos resultados sugieren que la precipitación con sulfato de amonio elimina una cantidad sustancial de material de ADN/ARN del componente proteico de la pancreatina, es decir, la fracción que contiene amilasa, lipasa y proteasa.

El sedimento recogido de la precipitación con sulfato de amonio se lavó con una solución saturada de sulfato de amonio al 60 %. Los espectros mostraron un cambio de pico de 272 nm a 275 nm después del lavado del precipitado (Figura 3), lo que indica una mayor eliminación del material con un pico de absorbancia a 260 nm.

La concentración de proteína de una solución puede estimarse en base a su absorbancia a 280 nm. Un ensayo de proteínas (mediante el uso de albúmina de suero bovino como estándar) determinó que una solución de absorbancia 1,0 a 280 nm (longitud de paso 1 cm) corresponde a 0,19 mg/mL de proteína.

El extracto original de pancreatina contenía 40 mg/mL, de los cuales 0,5 mL se mezclaron con 0,75 mL de sulfato de amonio saturado para formar el precipitado como se describe en la sección experimental. A continuación, este precipitado se volvió a solubilizar en 1 mL de PBS. Se midió la absorbancia de 5 pl de la solución del precipitado que se volvió a solubilizar, diluido en 1,2 mL de PBS. La Figura 3 muestra los espectros de precipitados de sulfato de amonio sin lavar y lavados, los valores de absorbancia registrados a 280 nm son aproximadamente 0,085 y 0,075 (longitud de trayectoria de 1 cm) respectivamente después de la dilución (1/240).

Como 1,0 absorbancia corresponde a 0,19 mg/mL de proteína, el sedimento sin lavar tiene una concentración de proteína de 3,9 mg/mL (240 x 0,085 x 0,19) y el sedimento lavado tiene una concentración de proteína de 3,4 mg/mL. Dado que se tomaron 20 mg de material (0,5 mL de una solución que contenía 40 mg/mL) a través del procedimiento de purificación, esto representa una purificación de aproximadamente 20/3,9 = 5 veces. Se determinaron las actividades de la lipasa y la amilasa en el precipitado enriquecido en proteínas. Como se ve en la Tabla 28 y 29, se recupera un promedio del 81 % de la actividad de la lipasa y el 83 % de la actividad de la amilasa en el sedimento sin lavar. El lavado del sedimento con sulfato de amonio al 60 % reduce la recuperación de la lipasa al 68 %. Estos porcentajes se normalizan a los niveles de actividad en la fracción original soluble en agua de pancrelipasa.

Tabla 28

Tabla 29

Antes de determinar la actividad del sedimento por miligramo, se desaló el precipitado con una columna adecuada. Se realizó una cromatografía de filtración en gel para desalinizar el producto de precipitación con sulfato de amonio. El sedimento de sulfato de amonio sin lavar se resuspendió en dos volúmenes de tampón PBS y se aplicaron 0,5 mL de la suspensión resultante a una columna G-25 Sefadex y se eluyó por gravedad. El perfil de elución de la fracción de sulfato de amonio se presenta en la Figura 4. Las fracciones 4-8 muestran absorción a 280 nm, lo que indica la presencia de proteína. El ensayo de metilumbeliferona para medir la actividad de la lipasa también mostró actividad en las fracciones 4-8.

El material de elución posterior (fracción 10, Figura 5, escaneado a una dilución 1/20 en agua en una cubeta de 1 cm) tiene un máximo de absorbancia de 260 nm, consistente con el perfil de absorbancia del ADN. Esto sugiere que, además de desalar, la columna G-25 podría usarse para eliminar cantidades residuales del material UV de 260 nm (por ejemplo, ADN).

Ejemplo 4: Precipitación con sulfato de amonio

La desalación también puede realizarse mediante el uso columnas de centrifugación Sefadex G-25. La recuperación del peso seco puede realizarse sin concentrar el material desalado.

Se preparó una fracción de sulfato de amonio saturado al 60 % como se describió anteriormente en los Ejemplos, el sedimento de sulfato de amonio se resuspendió en un volumen de tampón PBS (en comparación con el extracto). Una porción de la fracción de sulfato de amonio se desaló sobre dos columnas de centrifugación Sefadex G-25 equilibradas en agua como se describió previamente. Se precipitó un mL del material desalado (equivalente a 37 mg de pancreatina) con 2 volúmenes de isopropanol para ayudar al secado posterior y se centrifugó por 5 minutos a 16K. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento se secó al aire a temperatura ambiente durante la noche y se recuperaron 7,9 mg de sólido.

Se observó una pérdida de aproximadamente el 17 % del material absorbente de UV durante la precipitación con isopropanol. Si el material absorbente de UV representa una masa de proteína equivalente a la del sedimento, corregir esto significaría que el material desalado contiene 9,5 mg de sólido. Esto representa una concentración de 37/9,5 = 3,9 veces del material de partida de pancreatina. Suponiendo actividades de lipasa y amilasa del 78 % y 83 % (Tablas 28 y 29), con respecto al extracto, esto representa un aumento en la actividad específica de aproximadamente 3 con respecto a la lipasa y la amilasa. Se ha observado que el 90 % de la actividad de la lipasa se recupera durante el proceso de extracción, por lo que el aumento de la actividad específica sería de 2,7 veces. Sin embargo, el secado del material recuperado no fue completo y se prevé un aumento adicional de la actividad específica con el secado adicional.

Se realizó una repetición de la determinación del peso seco con secado adicional con calor más alto. Se preparó una fracción de sulfato de amonio saturada al 60 % como se describe anteriormente, el sedimento de sulfato de amonio se resuspendió en un volumen de tampón PBS (en comparación con el extracto). Una porción de la fracción de sulfato de amonio se desaló sobre dos columnas de centrifugación Sefadex G-25 equilibradas en agua como se describe en la sección experimental. Se precipitó un mL del material desalado (equivalente a 37,5 mg de pancreatina) con 2 volúmenes de isopropanol para ayudar al secado posterior y se centrifugó por 5 minutos a 16K. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento se secó al aire a 80 °C durante la noche; se recuperaron 4,6 mg de sólido.

Se observó una pérdida de aproximadamente el 17 % del material absorbente de UV durante la precipitación con isopropanol. Si este material absorbente de UV representa una masa de proteína equivalente a la del sedimento, corregir esto significaría que el material desalado contendría 5,4 mg de sólido. Esto representa una concentración de 37,5/5,4 = 7 veces del material de partida de pancreatina. Las actividades de la lipasa y amilasa fueron 74 % y 78 %, con respecto al extracto. Esto representa un aumento en la actividad específica de aproximadamente 5 con respecto a la lipasa y la amilasa. Se ha observado que el 90 % de la actividad de la lipasa se recupera durante el proceso de extracción, por lo que el aumento de la actividad específica sería de 4,5 veces.

Las recuperaciones de lipasa fueron 87-103 % en columnas equilibradas con PBS, mientras que las recuperaciones de lipasa fueron 52-72 % en columnas equilibradas con agua, lo que sugiere que se conserva una mayor actividad enzimática cuando las columnas se equilibran con PBS en comparación con el agua.

Los tiempos de ejecución de la columna más largos también mostraron evidencia de auto hidrólisis de proteínas, presumiblemente por las proteasas presentes. Esto puede atenuarse mediante la adición de inhibidores de proteasa o mediante el ajuste de condiciones tales como el pH y la temperatura.

Es preferible agregar componentes para estabilizar las proteínas durante el procesamiento, incluido la etapa de secado final. Estos estabilizadores podrían incluir sales, carbohidratos, antioxidantes, polímeros e inhibidores de proteasas tales como EDTA e inhibidor de tripsina de soja. Una solución salina de fosfato 5 mM tamponado a pH 7,4 funcionaría para mantener el pH y posiblemente unir calcio, lo que inhibiría la proteólisis. Se encontró que la etapa de secado final después de la precipitación con isopropanol da como resultado reducciones significativas en la actividad de la lipasa. Puede ser preferible liofilizar el material final.

Ejemplo 5: Precipitación con sulfato de amonio

La extracción y precipitación con sulfato de amonio se realizaron como se describió anteriormente en una centrífuga de mesa a 4 °C. El sólido resultante se desaló en una columna de centrifugación Sefadex G-25 como se describió previamente en los Ejemplos. La columna G-25 de 4,5 mL se cargó con 0,5 mL de precipitado resuspendido. Suponiendo que toda la pancreatina precipitó con sulfato de amonio, se estimaría que el precipitado resuspendido contenía 16 mg de pancreatina. La Figura 6 muestra la actividad de la lipasa, la amilasa y la tripsina en cada fracción, así como el peso, en mg, del material recuperado. Después de la extracción, precipitación con sulfato de amonio y desalación sobre la columna G-25 se recuperaron aproximadamente 5 mg de sólido en las fracciones 4 y 5. Esto produce un aumento del cálculo de la actividad específica de la lipasa de aproximadamente 3 veces, un aumento de la actividad de la amilasa de aproximadamente 1,7 veces y un aumento de la actividad de la tripsina de aproximadamente 2 veces en las fracciones 4 y 5 en comparación con la suspensión/solución acuosa de pancreatina original.

Cuando la desalación se realizó en dos columnas de desalación, con 13,4 mg de material de 33,3 mg de material de partida, la actividad específica de la lipasa aumentó aproximadamente 1,2 veces y la actividad específica de la amilasa aumentó aproximadamente 1,5 veces. Sin estar ligado a una teoría particular, esta disminución en la actividad puede deberse a la eliminación de importantes sales estabilizantes por el procedimiento de desalación prolongado del procesamiento prolongado en el tiempo.

La descripción detallada anterior se ha proporcionado únicamente para claridad de comprensión y no deben entenderse limitaciones innecesarias de ella, ya que las modificaciones serán obvias para los expertos en la técnica. Mientras que la invención se ha descrito en relación con realizaciones específicas de esta, se entenderá que es susceptible de modificaciones adicionales y la presente solicitud está destinada a cubrir cualquier variación, uso o adaptación de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo las desviaciones de la presente divulgación que se encuentran dentro de la práctica conocida o habitual dentro de la técnica a la que pertenece la invención y que pueden aplicarse a las características esenciales expuestas anteriormente y como sigue en el ámbito de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la preparación de HA-pancreatina derivada de mamíferos que incluye lipasas, proteasas y amilasas, que tiene una actividad lipasa específica de al menos 120 UI/mg, que comprende:

a1.1) suspender la pancreatina de mamífero inicial y precipitar una primera porción insoluble en un disolvente que tiene un parámetro de solubilidad de Hildebrand de 38 (MPa)05;

a1.2) separar la porción soluble de la etapa a1.1 de la primera porción insoluble;

a1.3) precipitar una segunda porción insoluble al añadir a la porción soluble de la etapa a1.2 al menos un disolvente orgánico de esta para obtener una mezcla que tenga un parámetro de solubilidad de Hildebrand de 36;

a2) separar la segunda porción insoluble de la etapa a1.3 de la porción soluble;

a3.1) secar la primera porción insoluble de la etapa a1.2;

a3.2) secar la segunda porción insoluble de la etapa a2;

a4) mezclar la primera porción insoluble de la etapa a3.1 con la segunda porción insoluble de la etapa a3.2, en el que

(i) dicho disolvente usado en la etapa a1.1 es una mezcla de acetona y solución tampón que tiene un pH de 7,

(ii) la temperatura del procedimiento es de 4 °C,

(iii) la mezcla de la etapa a1.3 es una mezcla de acetona y solución tampón que tiene un pH de 7, y (iv) la pancreatina de la etapa a1.1 está en una cantidad de 0,1 g/mL.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 para la preparación de pancreatina que tiene una actividad lipasa específica de al menos 150 UI/mg,

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para la preparación de pancreatina que tiene una actividad lipasa específica de al menos 200 UI/mg.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, para la preparación de pancreatina que tiene una actividad lipasa específica de al menos 400 UI/mg.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende la etapa de reducción de la carga microbiana y/o viral.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la reducción de la carga bacteriana y/o viral se lleva a cabo mediante filtración, calentamiento, radiación ionizante, alta presión o mediante alquilación.