CN111139206A - 一种促生复合内生菌剂及其应用 - Google Patents

一种促生复合内生菌剂及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111139206A
CN111139206A CN202010159343.8A CN202010159343A CN111139206A CN 111139206 A CN111139206 A CN 111139206A CN 202010159343 A CN202010159343 A CN 202010159343A CN 111139206 A CN111139206 A CN 111139206A
Authority
CN
China
Prior art keywords
growth
bacillus amyloliquefaciens
promoting compound
promoting
endophyte
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010159343.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111139206B (zh
Inventor
袁宗胜
刘芳
张国防
黄秋良
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fuzhou Ruigu Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Minjiang University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Minjiang University filed Critical Minjiang University
Priority to CN202010159343.8A priority Critical patent/CN111139206B/zh
Publication of CN111139206A publication Critical patent/CN111139206A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111139206B publication Critical patent/CN111139206B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)

Abstract

本发明提供一种促生复合内生菌剂，属于微生物技术领域。所述促生复合内生菌剂，包括产气肠杆菌CT‑B09‑2，乙酸钙不动杆菌WYS‑A01‑1、解淀粉芽孢杆菌JL‑B05和解淀粉芽孢杆菌JL‑B06；产气肠杆菌CT‑B09‑2、乙酸钙不动杆菌WYS‑A01‑1、解淀粉芽孢杆菌JL‑B05和解淀粉芽孢杆菌JL‑B06的质量比为（3~5）:（3~6）:（3~6）:（3~8）；促生复合内生菌剂中的总活菌浓度为（5~8）×108cfu/ml或（2~3）×109cfu/g。该促生复合内生菌剂菌种具有强解磷解钾固氮作用，能够在植物体内定殖，进而提高毛竹光合特性、生物酶活性，对调节毛竹生长和发育具有重要作用。

Description

一种促生复合内生菌剂及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种促生复合内生菌剂及其应用。
背景技术
植物内生细菌是指其生活史的一定阶段或全部阶段均生活在健康植物的各种组织和器官内部, 并且与植物建立了和谐联合关系的细菌。内生细菌因能在植物体内长期定殖、传导，且不易受环境条件的影响，对植物生长发育、抵抗疾病以及不良环境具有广泛的生物学作用，是非常难得的天然生物资源。研究表明，含有内生菌的植物宿主一般都具有生长快、抗逆境、抗病害等优势，在农业生产中具有良好的研究和开发潜力。因此，加强植物内生细菌资源的研究，建立各种功能内生细菌的资源库具有重要的意义。
毛竹（Phyllostachys edulis）属禾本科刚竹属，毛竹生长快，适应性强，用途多，经济价值大，是我国南方地区重要的森林资源。根据第6次森林资源清查统计，我国的毛竹林面积约为337.2万hm2，约占世界毛竹林总面积的47%。毛竹笋是一种全天然营养食品，竹笋中纤维素含量最高，其在保健上起着重要作用。竹材广泛应用于各行工程领域和人们日常生活的各个方面，毛竹发达的根系和坚固的竹株还起着水土保持的作用。但目前针对毛竹等林木具有较强促生功能的复合内生菌剂尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促生复合内生菌剂及其应用。所述促生复合内生菌剂的组成菌种具有强解磷解钾固氮作用，能够在植物体内定殖。所述复合内生菌剂能够提高毛竹光合特性，提高毛竹生物酶活性，对调节毛竹生长和发育具有重要促进作用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种促生复合内生菌剂，包括产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06，均为毛竹内生细菌。
所述促生复合内生菌剂中产气肠杆菌CT-B09-2、乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的固体菌粉或发酵液的质量比为（3~5）:（3~6）:（3~6）:（3~8）。
上述解淀粉芽孢杆菌JL-B05，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），已于2019年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京，保藏编号为：CGMCC No.18998。
上述解淀粉芽孢杆菌JL-B06，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），已于2019年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京，保藏编号为：CGMCC No.18999。
所述促生复合内生菌剂中的总活菌浓度为（5~8）×108cfu/ml或（2~3）×109cfu/g。
所述促生复合内生菌剂为液体制剂或固体制剂。
所述促生复合内生菌剂固体制剂的制备方法为：产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的固体菌粉按质量比混合，制成固体混合菌粉；载体与固体混合菌粉以100:2~5的质量比混合后获得促生复合内生菌剂固体制剂，所述载体为麸皮。
所述促生复合内生菌剂液体制剂的制备方法为：产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的发酵液按照质量比为（3~5）:（3~6）:（3~6）:（3~8）的比例混合获得。
本发明提供了所述的促生复合内生菌剂在促进毛竹生长中的应用。
本发明的有益效果：
本发明的促生复合内生菌剂的组成菌种具有强解磷解钾固氮作用，能够在植物体内定殖。所述促生复合内生菌剂能够提高毛竹光合特性，提高毛竹生物酶活性，对调节毛竹生长和发育具有重要促进作用。将促生复合内生菌剂通过灌根接种毛竹幼苗，能够明显提高叶片净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)，降低叶片胞间CO2浓度(Ci)，与对照相比，差异达显著水平。通过竹腔注射接种到II度毛竹，能够提高毛竹叶片叶绿素含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量，与对照相比，差异达显著水平；能够提高毛竹地上部分生物量。因此，本发明提供了一种对毛竹具有强促生功能的复合内生菌剂。
附图说明
图1 促生复合内生菌剂处理后毛竹叶片 SPAD值的变化。
图2 促生复合内生菌剂处理后毛竹叶片MDA含量的变化。
图3 促生复合内生菌剂处理后毛竹叶片POD活性的变化。
图4促生复合内生菌剂处理后毛竹叶片SOD 活性的变化。
图5促生复合内生菌剂处理后毛竹叶片可溶性蛋白含量的变化。
图6促生复合内生菌剂处理后毛竹叶片可溶性糖含量的变化。
具体实施方式
下面结合实例对本发明进一步说明。
菌种材料：
（1）产气肠杆菌CT-B09-2，其分类命名为产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）CT-B09-2，已于2017年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.14377，保藏地址：中国北京，已公开。产气肠杆菌CT-B09-2是从毛竹中分离纯化后得到的具有解磷解钾固氮作用的内生细菌。
（2）乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1，其分类命名为乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）WYS-A01-1，已于2017年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.14378。保藏地址：中国北京，已公开。乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1是从毛竹中分离纯化后得到的具有解磷解钾固氮作用的内生细菌。
（3）解淀粉芽孢杆菌JL-B05，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），已于2019年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京，保藏编号为：CGMCC No.18998。在本发明中，所述解淀粉芽孢杆菌JL-B05是从毛竹中分离纯化后得到的内生细菌，所述解淀粉芽孢杆菌JL-B05的菌落特征及菌体形态为：在NA平板培养基上培养24h后形成菌落颜色为白色，无光泽，菌落呈圆形、边缘不整齐，菌落4-5mm；菌体杆状，革兰氏染色阳性，有芽孢，无荚膜。所述解淀粉芽孢杆菌JL-B05的生理生化特征：接触酶反应呈阳性，V．P测定呈阳性，甲基红测定呈阴性，葡萄糖产酸试验阴性，葡萄糖产气试验阴性，柠檬酸盐试验阴性，硝酸盐还原反应呈阳性，淀粉水解呈阴性，需氧性测定呈阳性，吲哚试验呈阴性，丙二酸呈阴性，产H2S试验呈阳性。所述解淀粉芽孢杆菌JL-B05的16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明：JL-B05与Bacillus amyloliquefaciens 同处于一个分支上，其16S rDNA序列与Bacillus amyloliquefaciens（KM117160）的相似度达100%。结合菌落形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
（4）解淀粉芽孢杆菌JL-B06，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），已于2019年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京，保藏编号为：CGMCC No.18999。在本发明中，所述解淀粉芽孢杆菌JL-B06是从毛竹中分离纯化后得到的具有解磷解钾固氮作用的内生细菌，所述解淀粉芽孢杆菌JL-B06的菌落特征及菌体形态为：在NA平板上培养24h后形成菌落颜色为白色，无光泽，呈圆形、边缘不整齐，无流动性，革兰氏染色阳性，有芽孢；菌落4-5mm。所述解淀粉芽孢杆菌JL-B06的生理生化特征：接触酶反应呈阳性，氧化酶反应呈阳性，V．P测定呈阳性，甲基红测定呈阴性，葡萄糖产酸试验阳性，葡萄糖产气试验阴性，利用木糖产酸阳性，利用甘露醇产酸阳性，柠檬酸盐试验阳性，硝酸盐还原反应呈阳性，淀粉水解呈阳性，需氧性测定呈阳性。所述解淀粉芽孢杆菌JL-B06的16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明：JL-B06与Bacillus amyloliquefaciens 同处于一个分支上，其16S rDNA序列与Bacillus amyloliquefaciens（KM117160）的相似度达100%。结合菌落形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
本发明提供了一种促生复合内生菌剂，包括产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06；所述促生复合内生菌剂中产气肠杆菌CT-B09-2、乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的质量比为（3~5）:（3~6）:（3~6）:（3~8）；所述促生复合内生菌剂中的总活菌浓度为（5~8）×108cfu/ml或（2~3）×109cfu/g。
在本发明中，所述促生复合内生菌剂优选为液体制剂或固体制剂。当所述促生复合内生菌剂为固体制剂时，所述促生复合内生菌剂中包括载体。在本发明中，所述载体为麸皮。所述麸皮与产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06总的质量比优选为100:（2~5）。在本发明中，当所述促生复合内生菌剂为固体制剂时，通过分别将所述产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06发酵液通过冷冻干燥或喷雾干燥制备成固体菌粉后，按比例混合。在本发明中，当所述促生复合内生菌剂为液体制剂时，通过将发酵后的产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的发酵液按照质量比为（3~5）:（3~6）:（3~6）:（3~8）的比例混合获得。
在本发明中，所述固体菌粉的制备方法优选为包括以下步骤：将所述菌种活化后进行连续两级种子液培养，接入发酵培养基发酵、浓缩获得浓缩菌液，将所述产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1的浓缩菌液与保护剂（脱脂奶粉）混合后经冷冻干燥获得所述固体菌粉；将所述解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的发酵液与轻质碳酸钙混合后经喷雾干燥获得所述固体菌粉。
在本发明中，将菌种接于NB培养基中培养15~25h获得一级种子液；所述培养温度优选为25~35℃，所述培养的转速优选为150~ 350 r·min-1。
本发明在获得一级种子液后，将所述一级种子液转接于NB液体培养基中培养10 ~20h获得二级种子液。本发明中，所述一级种子液转接的接种量优选为0.5% ~ 1.0%（V/V），所述培养优选在发酵罐中进行，所述培养的过程中通入无菌空气，所述发酵罐通气手动调转速和空气流量来调节DO（DO40%），所述的培养温度为25℃~ 35℃，所述培养的转速为200~ 350r·min-1，所述培养的时间优选为10~20h。在本发明中，所述二级种子液的OD600优选为0.6~1.0。
本发明在获得所述二级种子液后，将所述二级种子液接入发酵培养基中进行发酵培养获得发酵液。在本发明中，所述二级种子液的接种量0.5% ~ 1.0%（V/V），所述发酵培养过程中的罐压维持在0.05MPa；所述培养的过程中通入无菌空气，所述发酵罐通气手动调转速和空气流量来调节DO（DO40%），所述的培养温度为25℃~ 35℃，所述培养的转速为200 ~350r·min-1，所述培养的时间优选为15~35 h。在本发明中，所述二级种子液的OD600优选为0.8~1.5。
本发明在获得发酵菌液后，将所述发酵菌液浓缩获得浓缩菌液。在本发明中，所述浓缩菌液的浓缩倍数为5~20倍；所述浓缩的方法，产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1的发酵菌液通过高速离心的方法获得浓缩菌液；所述解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的发酵菌液通过陶瓷膜过滤的方法获得浓缩菌液。本发明对所述浓缩设备的具体参数设置没有特殊限定，采用常规的参数设置实现上述倍数的浓缩即可。
本发明在获得所述发酵菌液后，将所述产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1的发酵菌液通过高速离心机离心获得浓缩菌液，所述浓缩菌液加入保护剂（脱脂奶粉）后通过真空冷冻干燥获得固体菌粉，所述浓缩液与保护剂（脱脂奶粉）的质量比为10:1，所述真空冷冻干燥过程控制条件为3~5 h冷至-40℃维持3~5 h后抽真空，通热水控温-20℃，升华，去除水份。将所述解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的发酵菌液通过陶瓷膜过滤获得浓缩菌液，所述浓缩菌液加入轻质碳酸钙后通过喷雾干燥获得固体菌粉，所述浓缩液与轻质碳酸钙的质量比为100:2~5，所述喷雾干燥过程控制指标为物料进口温度150~200℃，出口80~85℃，物料在塔内干燥时间15~30S。
实施例1
（1）产气肠杆菌CT-B09-2菌液、固体菌粉的制备：
产气肠杆菌CT-B09-2一级种子液制备
活化产气肠杆菌CT-B09-2菌株，挑取单菌落，接种于150ml NB培养基中（121℃下，灭菌30min），28 ℃，180 r·min-1 条件下振荡培养 20 h，得到一级种子液。
产气肠杆菌CT-B09-2二级种子液制备
将一级种子液接入无菌的种子罐中，接种量为0.5% ~ 1.0%（V/V）；培养条件为：通气手动调转速和空气流量来调节DO（DO40%），培养温度为25℃~ 35℃，转速为200 ~ 350r·min-1，罐压0.05MPa；培养的时间10~15 h。二级种子液的OD600值在0.6~0.8，此时菌种活力最强。
产气肠杆菌CT-B09-2发酵液制备
将产气肠杆菌CT-B09-2的二级种子液，按照接种量为0.5% ~ 1.0%（V/V）接入无菌发酵罐中，发酵培养基的组成如下（每升）：酵母抽提浸膏25-50克，麦芽糖浆12-20克。培养条件为：通气手动调转速和空气流量来调节DO（DO40%），培养温度为25℃~ 35℃，转速为200 ~350r·min-1，罐压0.05MPa；培养的时间15~20 h，pH回升至7.5~8.0，OD600值0.8~1.0，终止发酵，得到发酵成熟菌液。
产气肠杆菌CT-B09-2菌粉制备
将上述所得的发酵成熟菌液经过高速离心机离心后，加入保护剂（脱脂奶粉）混合均匀，浓缩菌液与保护剂（脱脂奶粉）的质量比为10:1，得到固液混合物，真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的条件为：3~5h冷至-40℃维持3~5 h后抽真空，通热水控温-20℃，升华，去除水份。得到产气肠杆菌CT-B09-2固体菌粉，菌粉含水量小于5%（W/W），活菌数为2~5×1011cfu/g。
所述乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1菌液、固体菌粉的制备同上。
（2）解淀粉芽孢杆菌JL-B05菌液、固体菌粉的制备：
活化解淀粉芽孢杆菌JL-B05菌株，挑取单菌落，接种于150ml NB培养基中（121℃,下，灭菌30min），28 ℃，180 r·min-1 条件下振荡培养 20 h，得到一级种子液。
解淀粉芽孢杆菌JL-B05二级种子液制备
将一级种子液接入无菌的种子罐中，接种量为0.5% ~ 1.0%（V/V）；培养条件为：通气手动调转速和空气流量来调节DO（DO40%），培养温度为30℃~ 35℃，转速为200 ~ 350r·min-1，罐压0.05MPa；培养的时间15~20 h。二级种子液的OD600值在0.6~0.8，此时菌种活力最强。
解淀粉芽孢杆菌JL-B05发酵液制备
将解淀粉芽孢杆菌JL-B05的二级种子液，按照接种量为0.5% ~ 1.0%（V/V）接入无菌发酵罐中，发酵培养基的组成如下（每升）：酵母抽提浸膏：10-20克，麦芽糖浆：25-35克，氯化镁：0.2-0.5克，氯化钙：0.1-0.4克，氯化锰：0.1-0.4克，磷酸氢二钾：1.0-2.5克。培养条件为：通气手动调转速和空气流量来调节DO（DO40%），培养温度为30℃~ 35℃，转速为200 ~350r·min-1，罐压0.05MPa；培养的时间30~35h，pH回升至7.5~8.0，OD600值1.2~1.5，下罐时间以取样镜检芽孢在90%以上成熟时，终止发酵，得到发酵成熟菌液。
解淀粉芽孢杆菌JL-B05菌粉制备
将上述所得的发酵成熟菌液经过陶瓷膜过滤后，加入轻质碳酸钙混合均匀，所述浓缩菌液与轻质碳酸钙的质量比为100:2~5，得到固液混合物，喷雾干燥，喷雾干燥的条件为：物料进口温度150~200℃，出口80~85℃，物料在塔内干燥时间15~30S。得到解淀粉芽孢杆菌JL-B05固体菌粉，菌粉含水量小于5%（W/W），活菌数为2~5×1011cfu/g。
所述解淀粉芽孢杆菌JL-B06菌液、固体菌粉的制备同上。
将上述产气肠杆菌CT-B09-2、乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的固体菌粉按照质量比为3:3:3:3混合均匀为固体混合菌粉，再将所述麸皮与上述固体混合菌粉以100:2的质量比混合后获得促生复合内生菌剂的固体制剂1，总活菌浓度为2×109cfu/g。
将上述产气肠杆菌CT-B09-2、乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的固体菌粉按照质量比为5:6:6:8混合均匀为固体混合菌粉，再将所述麸皮与上述固体混合菌粉以100:5的质量比混合后获得促生复合内生菌剂的固体制剂2，总活菌浓度为5×109cfu/g。
将上述产气肠杆菌CT-B09-2、乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的固体菌粉按照质量比为4:5:5:6混合均匀为固体混合菌粉，再将所述麸皮与上述固体混合菌粉以100:3的质量比混合后获得促生复合内生菌剂的固体制剂3，总活菌浓度为3×109cfu/g。
将上述产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的发酵成熟菌液按照质量比为3:3:3:3的比例混合获得促生复合内生菌剂液体制剂1，总活菌浓度为5×108cfu/ml。
将上述产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的发酵成熟菌液按照质量比为5:6:6:8的比例混合获得促生复合内生菌剂液体制剂2，总活菌浓度为8×108cfu/ml。
将上述产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的发酵成熟菌液按照质量比为4:5:5:6的比例混合获得促生复合内生菌剂液体制剂3，总活菌浓度为6×108cfu/ml。
实施例2
将实施例1制备的促生复合内生菌剂液体制剂1及产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的单菌种发酵成熟菌液，分别用无菌水配置成活菌含量为1×108 cfu/mL的菌悬液，通过灌根接种毛竹幼苗（接种量为30mL/株）后于15d、30d采用美国LI-COR公司生产的LI-6400型便携式光合作用测定仪进行毛竹幼苗叶片进行净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和细胞间隙CO2浓度等光合作用指标的测定。
毛竹盆栽幼苗经灌根接种促生复合内生菌剂液体制剂1后15d和30d分别测定毛竹叶片净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）和胞间CO2浓度（Ci）。结果表明，经促生复合内生菌剂处理后的毛竹幼苗叶片净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）显著高于对照，胞间CO2浓度（Ci）则低于对照。
盆栽毛竹幼苗接种15d时，施用促生复合内生菌剂的毛竹幼苗叶片净光合速率显著高于清水对照及施用产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的单菌种发酵成熟菌液处理，其中施用促生复合内生菌剂的毛竹幼苗叶片净光合速率显著比清水对照高出86.18%。施用促生复合内生菌剂30d时毛竹幼苗叶片净光合速率均高于清水对照处理及施用产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的单菌种发酵成熟菌液处理，见表1。
表1 促生复合内生菌剂对毛竹叶片净光合速率（Pn）的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE001
盆栽毛竹幼苗接种15d时，施用促生复合内生菌剂的毛竹幼苗叶片蒸腾速率显著高于清水对照及施用产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的单菌种发酵成熟菌液处理，其中施用促生复合内生菌剂的毛竹幼苗叶片蒸腾速率显著比清水对照高出71.29%。施用促生复合内生菌剂30d时毛竹幼苗叶片蒸腾速率均高于清水对照处理及施用产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的单菌种发酵成熟菌液处理，见表2。
表2促生复合内生菌剂对毛竹叶片蒸腾速率（Tr）的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE002
盆栽毛竹幼苗接种15d时，施用促生复合内生菌剂的毛竹幼苗叶片气孔导度显著高于清水对照及施用产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的单菌种发酵成熟菌液处理，其中施用促生复合内生菌剂的毛竹幼苗叶片气孔导度显著比清水对照高出163.64%。施用促生复合内生菌剂30d时毛竹幼苗叶片气孔导度均高于清水对照处理及施用产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的单菌种发酵成熟菌液处理，见表3。
表3 促生复合内生菌剂对毛竹叶片气孔导度（Gs）的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE003
从表4 可以看出，盆栽毛竹幼苗接种15d时，施用促生复合内生菌剂的毛竹幼苗叶片胞间CO2浓度显著低于清水对照及施用产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的单菌种发酵成熟菌液处理，其中施用促生复合内生菌剂的毛竹幼苗叶片胞间CO2浓度显著比清水对照低25.67%。施用促生复合内生菌剂30d时毛竹幼苗叶片胞间CO2浓度均低于清水对照处理及施用产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的单菌种发酵成熟菌液处理。
表4 促生复合内生菌剂对毛竹叶片胞间CO2浓度（Ci）的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE005
实施例3
将实施例1制备的促生复合内生菌剂固体制剂1及产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的单菌种固体菌粉，分别活化后，用无菌水稀释至1×108cfu/mL液体制剂备用。选取福建省将乐县龙栖山自然保护区毛竹林基地，选取II度毛竹，先用电钻在距土表30cm左右的竹杆部位钻孔，然后取上述促生复合内生菌剂液体制剂30 mL分别用无菌注射器注射至毛竹竹腔内部，第二天重复接种30mL，并用泥土封住竹腔空洞。每处理 10 株，3 次重复，以清水为对照。分别于处理后15d和30d通过高枝剪采集毛竹东、南、西、北四个方向的毛竹叶片各10片，并充分混合作为一个混合样，用于叶绿素含量、丙二醛（MDA）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶(SOD)、可溶性蛋白含量、可溶性糖等生理生化指标的测定。
采用SPAD-502叶绿素快速测定仪（Minolta，Japan），选取10片毛竹叶片，分别在叶基、叶中、叶尖处测得SPAD值，求出每片叶的平均值，进行3个重复。用SPAD值表示叶片叶绿素相对值。
参照硫代巴比妥酸法测定毛竹叶片丙二醛（MDA）含量，参照愈创木酚法测定毛竹叶片过氧化物酶（POD）活性活性，参照氮蓝四唑(NBT)光还原法测定毛竹叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用考马斯亮蓝比色法测定毛竹叶片可溶性蛋白含量，采用恩同比色法测定毛竹叶片可溶性糖含量。
促生复合内生菌剂对毛竹叶片叶绿素含量的影响
促生复合内生菌剂注射接种处理15 d和30 d时，毛竹叶片SPAD值均高于清水对照处理及及施用产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的单菌种固体菌粉处理，施用促生复合内生菌剂的毛竹叶片SPAD值与清水对照相比差异显著。内生细菌处理后的毛竹叶片叶绿素含量增加，因叶绿素在光能吸收、传递和转换中起着重要的作用，叶绿素含量的增加能够提高毛竹的光合作用速率，从而促进其生长，见图1。
促生复合内生菌剂对毛竹叶片丙二醛（MDA）活性的影响
促生复合内生菌剂注射接种处理15 d和30 d时，毛竹叶片丙二醛（MDA）活性均低于清水对照处理及及施用产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的单菌种固体菌粉处理，施用促生复合内生菌剂的毛竹叶片丙二醛（MDA）活性与清水对照相比差异显著。因MDA含量与寄主细胞的损伤程度相关，MDA含量增加则是植物细胞损伤的直接因素，因此，毛竹经内生细菌处理后可以有效地降低MDA的含量，从而起到保护毛竹细胞膜的作用，见图2。
促生复合内生菌剂对毛竹叶片过氧化物酶(POD)活性的影响
促生复合内生菌剂注射接种处理15 d和30 d时，毛竹叶片过氧化物酶(POD)活性均高于清水对照处理及及施用产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的单菌种固体菌粉处理，施用促生复合内生菌剂的毛竹叶片过氧化物酶(POD)活性与清水对照相比差异显著。表明促生复合内生菌剂可以提高毛竹叶片过氧化物酶（POD）活性，从而促进毛竹生长，见图3。
促生复合内生菌剂对毛竹叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响
促生复合内生菌剂注射接种处理15 d和30 d时，毛竹叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性均高于清水对照处理及及施用产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的单菌种固体菌粉处理，施用促生复合内生菌剂的毛竹叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性与清水对照相比差异显著。表明施用促生复合内生菌剂可以提高毛竹叶片的超氧化物歧化酶（SOD）活性，从而促进毛竹生长，见图4。
促生复合内生菌剂对毛竹叶片可溶性蛋白含量的影响
促生复合内生菌剂注射接种处理15d和30 d时，毛竹叶片可溶性蛋白含量均高于清水对照处理及及施用产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的单菌种固体菌粉处理，施用促生复合内生菌剂的毛竹叶片可溶性蛋白含量与清水对照相比差异显著。因此，接种促生复合内生菌剂可诱导毛竹叶片内可溶性蛋白含量的显著增加，见图5。
促生复合内生菌剂对毛竹叶片可溶性糖含量的影响
促生复合内生菌剂注射接种处理15 d和30 d时，毛竹叶片可溶性糖含量均高于清水对照处理及及施用产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的单菌种固体菌粉处理，施用促生复合内生菌剂的毛竹叶片可溶性糖含量与清水对照相比差异显著，见图6。
实施例4 促生复合内生菌剂对毛竹地上生物量的影响
将实施例1制备的促生复合内生菌剂固体制剂2活化后，用无菌水稀释至1×108cfu/mL液体制剂备用。选取福建省将乐县龙栖山自然保护区毛竹林基地，选取II度毛竹，先用电钻在距土表30cm左右的竹杆部位钻孔，然后取上述促生复合内生菌剂液体制剂30 mL分别用无菌注射器注射至毛竹竹腔内部，第二天重复接种30 mL，并用泥土封住竹腔空洞。每处理10 株，3 次重复，以清水为对照。试验年份上半年和下半年各施用1次，连续施用2年。施用促生复合内生菌剂第三年，以第一株春笋破土为起始时间，定期记录，至无笋出土为终止时间。统计接种促生复合内生菌剂毛竹林地和对照林地出笋数、出笋率、成竹数、成竹率、新竹（I度竹）眉径、平均每亩立株数等指标。
从表5可以看出，施用促生复合内生菌剂的毛竹林地能提高出笋数量，比对照增长47.89%；出笋率比对照提高8.73%，并使发笋期提早和延长，证明施用促生复合内生菌剂对毛竹促生效果明显。数据表明，施用促生复合内生菌剂的毛竹林成竹数高于对照54.55%，成竹率提高6.42%。同时施用促生复合内生菌剂对笋高增长速度有一定控制作用，生长速度较均匀。
表5 促生复合内生菌剂对毛竹地上生物量的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE006
毛竹眉径是构成毛竹产量和质量等级的重要指标之一，施用促生复合内生菌剂能够提高新竹眉径，使竹子增粗，对新竹生长有促进作用。从表5数据可以看出，施用促生复合内生菌剂的新竹平均眉径为10.9cm，比对照新竹眉径（10.2cm）提高6.86%；毛竹林总立株数为216/667m2比对照总立竹数（192/667m2）提高12.5%。充分表明施用促生复合内生菌剂能够显著提高毛竹竹材质量，对增加毛竹竹林收入非常有利。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种促生复合内生菌剂，其特征在于：所述促生复合内生菌剂包括产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06。
2.根据权利要求1所述的一种促生复合内生菌剂，其特征在于：产气肠杆菌CT-B09-2、乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的固体菌粉或发酵液的质量比为（3~5）:（3~6）:（3~6）:（3~8）。
3.根据权利要求1所述的一种促生复合内生菌剂，其特征在于：所述促生复合内生菌剂中的总活菌浓度为（5~8）×108cfu/ml或（2~3）×109cfu/g。
4.根据权利要求1所述的一种促生复合内生菌剂，其特征在于：所述促生复合内生菌剂为液体制剂或固体制剂。
5.根据权利要求4所述的一种促生复合内生菌剂，其特征在于：所述促生复合内生菌剂固体制剂的制备方法为：产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的固体菌粉按质量比混合，制成固体混合菌粉；载体与固体混合菌粉以100:2~5的质量比混合后获得促生复合内生菌剂固体制剂；所述载体为为麸皮。
6.根据权利要求4所述的一种促生复合内生菌剂，其特征在于：所述促生复合内生菌剂液体制剂的制备方法为：产气肠杆菌CT-B09-2，乙酸钙不动杆菌WYS-A01-1、解淀粉芽孢杆菌JL-B05和解淀粉芽孢杆菌JL-B06的发酵液按照质量比为（3~5）:（3~6）:（3~6）:（3~8）的比例混合获得。
7.如权利要求1所述的促生复合内生菌剂在促进毛竹生长中的应用。
CN202010159343.8A 2020-03-09 2020-03-09 一种促生复合内生菌剂及其应用 Active CN111139206B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010159343.8A CN111139206B (zh) 2020-03-09 2020-03-09 一种促生复合内生菌剂及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010159343.8A CN111139206B (zh) 2020-03-09 2020-03-09 一种促生复合内生菌剂及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111139206A true CN111139206A (zh) 2020-05-12
CN111139206B CN111139206B (zh) 2021-12-03

Family

ID=70528398

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010159343.8A Active CN111139206B (zh) 2020-03-09 2020-03-09 一种促生复合内生菌剂及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111139206B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112725249A (zh) * 2021-03-10 2021-04-30 闽江学院 一种促生复合微生物菌剂及其应用
CN112877253A (zh) * 2021-03-10 2021-06-01 闽江学院 一种饲用微生态制剂及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101948771A (zh) * 2010-08-27 2011-01-19 黑龙江省科学院微生物研究所 防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN104232528A (zh) * 2014-08-29 2014-12-24 湖北省生物农药工程研究中心 一种解淀粉芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺
CN108504608A (zh) * 2018-04-27 2018-09-07 福建农林大学 一株内生解磷解钾固氮乙酸钙不动杆菌及其应用
CN108587959A (zh) * 2018-04-27 2018-09-28 福建农林大学 一株毛竹内生解磷解钾固氮产气肠杆菌及其应用
CN110564647A (zh) * 2019-09-23 2019-12-13 福建农林大学 一株促进再生稻腋芽萌发生长的解淀粉芽胞杆菌及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101948771A (zh) * 2010-08-27 2011-01-19 黑龙江省科学院微生物研究所 防病促生植物内生解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN104232528A (zh) * 2014-08-29 2014-12-24 湖北省生物农药工程研究中心 一种解淀粉芽孢杆菌活菌制剂的制备工艺
CN108504608A (zh) * 2018-04-27 2018-09-07 福建农林大学 一株内生解磷解钾固氮乙酸钙不动杆菌及其应用
CN108587959A (zh) * 2018-04-27 2018-09-28 福建农林大学 一株毛竹内生解磷解钾固氮产气肠杆菌及其应用
CN110564647A (zh) * 2019-09-23 2019-12-13 福建农林大学 一株促进再生稻腋芽萌发生长的解淀粉芽胞杆菌及其应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112725249A (zh) * 2021-03-10 2021-04-30 闽江学院 一种促生复合微生物菌剂及其应用
CN112877253A (zh) * 2021-03-10 2021-06-01 闽江学院 一种饲用微生态制剂及其应用
CN112725249B (zh) * 2021-03-10 2022-05-13 闽江学院 一种促生复合微生物菌剂及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111139206B (zh) 2021-12-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111139206B (zh) 一种促生复合内生菌剂及其应用
CN112877261B (zh) 一种生防链霉菌的发酵方法
CN108913625B (zh) 耐盐链霉菌、其菌剂及其菌剂在促进植物生长中的应用
CN108504608B (zh) 一株内生解磷解钾固氮乙酸钙不动杆菌及其应用
CN111019872B (zh) 一株内生解淀粉芽孢杆菌jl-b06及其应用
CN110846262B (zh) 一株粘质沙雷氏菌sz201及其应用
CN101451112B (zh) 一种防治果树根癌病的土壤杆菌及其菌剂和制备方法
CN108587959B (zh) 一株毛竹内生解磷解钾固氮产气肠杆菌及其应用
CN116463220B (zh) 一株促进蓝莓生长的深色有隔dse真菌及其应用
CN113234601B (zh) 一株海洋真菌新种及其在植物抗干旱胁迫中的应用
CN113736671B (zh) 一种促进油茶钾素吸收的内生真菌am8.2
CN110066755B (zh) 一株牛蒡内生链霉菌、含有该内生菌的微生物菌剂及应用
CN110607249B (zh) 链霉菌生防菌株及其应用
CN112662598A (zh) 一株芬氏纤维微细菌、包括芬氏纤维微细菌的菌剂及制备方法和应用
CN112725249B (zh) 一种促生复合微生物菌剂及其应用
CN115747122B (zh) 一种短小芽孢杆菌lx4400及其应用
CN112795521B (zh) 一株促生高地芽孢杆菌及其应用
CN114717166B (zh) 一株阿洛杰链霉菌bc1及其应用
CN117363489B (zh) 一株具备黄瓜促生和抗病功能的长尾柄孢壳菌及其应用
CN114854599B (zh) 一株哈茨木霉及其应用
CN117431194B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌、组合物及其在切花芍药中的应用
CN117106670A (zh) 一种同温层芽孢杆菌pt6-20及其应用
CN116536189A (zh) 一种能提高枸杞产量和品质的乳酸菌制剂及其应用
CN118104688A (zh) 一株海洋细菌hz在作物种植或改良重金属污染土壤中的应用
CN118064325A (zh) 一种具有促进坛紫菜丝状体孢子囊枝形成功效的嗜温粘杆菌

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230808

Address after: R-02, 4th Floor, No. 28 Wenquan Road, Wenquan Street, Gulou District, Fuzhou City, Fujian Province, 350003

Patentee after: Fuzhou Ruigu Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 200 xiyuangong Road, Shangjie Town, Minhou County, Fuzhou City, Fujian Province

Patentee before: MINJIANG University