CN101945996A - 来自里氏木霉的具有微生物裂解活性的酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供来自里氏木霉的具有抗微生物活性的真菌多肽、编码该多肽的多核苷酸、包含该多肽和多核苷酸的组合物及其使用方法。

Description

来自里氏木霉的具有微生物裂解活性的酶
优先权
本申请要求在2008年2月11日提交的美国临时专利申请序列号61/027,571的优先权，特此以其整体引入作为参考。
技术领域
本发明涉及具有抗微生物活性的真菌多肽，及其使用方法。
背景技术
溶菌酶(1，4-β-N-乙酰胞壁质酶(N-acetylmuraminidase))分布在活组织中，并认为其在防御细菌感染中起作用。(Fleming(1922)Proc Royal Soc London B39：306-317)，溶菌酶通过β-葡糖苷酶活性水解细菌细胞壁中的多糖来行使功能。由此裂解细胞壁，导致细胞死亡。这些酶起杀菌剂的作用，该性质解释了它们在哺乳动物的大部分生物液体中的广泛存在。例如，在哺乳动物的血液、眼泪、唾液、乳等中发现了多种浓度水平的溶菌酶。还在植物，例如木瓜中发现了溶菌酶。溶菌酶在鸡蛋清中以高浓度存在，从其中可相对容易并高纯度地分离该溶菌酶。(Imoto等(1972)在The Enzymes(Boyer，P.D.，编辑)第3版，7：665-668，Academic Press，Orlando，FL)。
向乳酪、香肠和海产品中加入溶菌酶用于防腐目的，并且在例如止血、抗炎症或组织再生应用中其也用作药剂。其还可用于保藏奶成份用于儿科使用。(日本专利号16780/70,1970)在生物技术应用中，可在回收表达蛋白质的过程中向细菌培养物中加入溶菌酶，促进蛋白质从细胞中释放。(Zukaite等(2000)Lett Appl Microbiol 30：203-206)
来自鸡蛋清的溶菌酶可在敏感个体中诱导***反应，因此在某些应用如食品保藏中限制了其使用。需要具有微生物裂解活性的新酶作为鸡蛋清溶菌酶的可选项。
发明简述
本发明组合物和方法涉及来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的多肽(此处称作“NSP38”，其具有抗微生物活性)、编码NSP38多肽的多核苷酸，及其使用方法。
一方面，本发明提供来自里氏木霉的多肽(此处称为“NSP38”)，其具有抗微生物活性。在一些实施方案中，抗微生物活性是细菌细胞壁裂解活性，例如1，4-β-N-乙酰胞壁质酶活性。在一些实施方案中，抗微生物活性是对微生物细胞，例如细菌或真菌细胞生长的抑制(即，部分或完全抑制)，包括延长的滞后期效应。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，或从SEQ ID NO：4切割信号序列后产生的成熟蛋白质；由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，或从SEQ ID NO：4切割信号序列后产生的成熟蛋白质组成；或基本上由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，或从SEQ ID NO：4切割信号序列后产生的成熟蛋白质组成。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO：4的变体，或从SEQ ID NO：4切割信号序列后产生的成熟蛋白质的变体，其具有如本文所述的抗微生物活性；由SEQ ID NO：4的变体，或从SEQ ID NO：4切割信号序列后产生的成熟蛋白质的变体，其具有如本文所述的抗微生物活性组成；或基本上由SEQ ID NO：4的变体，或从SEQ ID NO：4切割信号序列后产生的成熟蛋白质的变体，其具有如本文所述的抗微生物活性组成。NSP38多肽在酸性pH，例如低于约6.5的pH，例如约pH6处具有催化活性。
另一方面，本发明提供编码如上述NSP38多肽或其变体的多核苷酸。多核苷酸可处于表达载体的形式中，所述表达载体包含编码NSP38或其变体的多核苷酸。表达载体可转化到宿主细胞中，以用于表达NSP多肽或其变体。
另一方面，本发明提供用于表达NSP38多肽或其变体的方法，其包括在适合表达的条件下培养已经转化了编码多肽的多核苷酸的宿主细胞。在一些实施方案中，该方法还包括从宿主细胞和/或培养基中回收多肽。
另一方面，本方面提供用于抑制细菌生长的方法，其包括使微生物细胞(例如细菌或真菌细胞)与如本文所述的NSP38多肽或其变体接触，其中细胞的生长受到了抑制。在一些实施方案中，该方法包括使微生物培养物与该多肽接触。在一些实施方案中，该方法在酸性pH，例如低于约6.5的pH，例如约pH 6处进行。
另一方面，本发明提供回收微生物产生的蛋白质的方法，其包括使表达蛋白质的微生物培养物与如本文所述的NSP38多肽或其变体接触，由此从微生物细胞中释放蛋白质。
另一方面，本发明提供在清洗过程中减少织物上微生物负荷的组合物，在清洁组合物中包含NSP38多肽或其变体。在一些实施方案中，该组合物还包含一种或更多溶素、蛋白酶、过水解酶(perhydrolase)、脂肪酶、磷脂酶、氧化酶、内切糖苷酶、糖酶(carohydrase)，和其他微生物细胞壁降解酶。在一些实施方案中，与不包含NSP38多肽或其变体的相同组合物相比，该组合物产生更少的恶臭。
另一方面，本发明提供用于食品保藏的组合物。
下文阐明了组合物和方法的特定方面和实施方案：
一方面，提供来自里氏木霉的重组多肽(NSP38)，所述多肽具有抗微生物活性。在一些实施方案中，抗微生物活性是细菌细胞壁裂解活性。在一些实施方案中，抗微生物活性是1，4-β-N-乙酰胞壁质酶活性。在一些实施方案中，抗微生物活性的特征在于部分或完全抑制微生物细胞的生长。在一些实施方案中，抗微生物活性的特征在于微生物生长中的延长滞后期效应。在特定实施方案中，具有抗微生物活性的多肽对抗的微生物细胞是细菌或真菌细胞。在一些实施方案中，多肽在酸性pH，例如低于pH6.5，例如低于pH 6处具有抗微生物活性。
在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO：4所示的多肽，或从所述多肽切割信号序列后产生的成熟蛋白质具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽基本上由与SEQ ID NO：4所示的多肽，或从所述多肽切割信号序列后产生的成熟蛋白质具有至少85％的序列同一性的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，多肽和SEQ ID NO：4之间的同一性是至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或甚至至少99％。在特定实施方案中，多肽具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
另一方面，提供编码上述多肽的分离的多核苷酸。在相关方面，提供包含这种多核苷酸的载体。在相关方面，提供包含这种载体的宿主细胞。
另一方面，提供用于在清洗过程中减少在织物上的微生物负荷的组合物，其包含如上述多肽。组合物还包含一种或更多溶素、蛋白酶、过水解酶、脂肪酶、磷脂酶、氧化酶、内切糖苷酶、糖酶，和另一种微生物细胞壁降解酶。该组合物比不包含该多肽或其变体的相同组合物产生更少的恶臭。另一方面，提供用于食品保藏的组合物，其包含如上述多肽。相关方面包括NSP38多肽或其变体在制备如上述组合物中的用途。
另一方面，提供表达NSP38多肽或其变体的方法，其包括在适合表达的条件下在培养基中培养已经转化了编码NSP38多肽的多核苷酸的宿主细胞。该方法还包括从宿主细胞或培养基中回收多肽。在一些实施方案中，多肽(或其变体)包含与SEQ ID NO：4所示的多肽，或从所述多肽切割信号序列后产生的成熟蛋白质具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
另一方面，提供抑制微生物生长的方法，其包括使微生物细胞与NSP38多肽或其变体接触，由此抑制细胞的生长。在一些实施方案中，该方法在酸性pH下进行。在一些实施方案中，多肽(或其变体)包含与SEQ ID NO：4所示的多肽，或从所述多肽切割信号序列后产生的成熟蛋白质具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
另一方面，提供回收微生物产生的蛋白质的方法，其包括使表达该蛋白质的微生物细胞与NSP38多肽或其变体接触，由此引起细胞裂解并回收微生物细胞表达的蛋白质。在一些实施方案中，多肽(或其变体)包含与SEQ ID NO：4所示的多肽，或从所述多肽切割信号序列后产生的成熟蛋白质具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
组合物和方法的这些特征和其他特征将从说明书和附图中显而易见。
附图简述
图1是pTrex3g-DEST里氏木霉(T.reesei)目的载体的示意图。
图2是用于NSP38的Trlys1表达载体的示意图。
图3是在里氏木霉中表达的NSP38的SDS-PAGE凝胶。
图4描述了来自里氏木霉的NSP38基因的核苷酸序列(SEQ IDNO：3)。
图5描述了NSP蛋白质的推导氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
发明详述
除非另有说明，本发明的实践将使用本领域技术人员已知的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术。在文献，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，编辑，1984；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等，编辑，1994)；PCR：The Polymerase Chain Reaction(Mullis等，编辑，1994)；和Gene  Transfer and Expression：A Laboratory Manual(Kriegler，1990)中详细解释了此类技术。
除非本文另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明隶属领域的技术人员通常理解的相同意思。Singleton，等，Dictionary of  Microbiology and Molecular Biology，第二版，John Wiley and Sons，New York(1994)，和Hale & Markham，The Harper Collins Dictionary of  Biology，Harper Perennial，NY (1991)提供了本发明使用的许多术语的常用词典。与本发明描述的那些类似或等同的方法和材料可用于实践或检测本发明。
本文提供的数值范围包括定义范围的数值。
除非另有说明，分别以5′到3′方向从左到右书写核酸；以氨基到羧基方向从左到右书写氨基酸序列。
定义
如本文所用，术语“多核苷酸”指任何长度和任何三维结构和单链或多链(例如单链、双链、三股螺旋等)的核苷酸的聚合形式，其含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸，和/或脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的类似物或修饰形式，包括修饰的核苷酸或碱基或其类似物。因为遗传密码是减并的，多于一个密码子可用于编码特定的氨基酸，并且本发明包括编码特定氨基酸序列的多核苷酸。可使用任何类型的修饰核苷酸或核苷酸类似物，只要所述多核苷酸在使用条件下保留想要的功能，包括增加核酸酶抗性的修饰(例如脱氧、2′-O-Me、硫代磷酸等)。也可掺入标记，用于检测或捕获目的，例如放射性或非放射性标记或锚，例如生物素。术语多核苷酸也包括肽核酸(PNA)。多核苷酸可以是天然发生的或非天然发生的。术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”在本文中互换使用。多核苷酸可含有RNA、DNA，或两者，和/或其修饰形式和/或类似物。非核苷酸组分可中断连续核苷酸。可选的连接基团可取代一个或多个磷酸二酯键。这些可选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸取代为P(O)S(“thioate”)、P(S)S(“dithioate”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR’、CO或CH2(“formacetal”)，其中各R或R’独立地是H，或取代或非取代的烷基(1-20C)，其任选地含有醚(-O-)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或araldyl。多核苷酸中并非所有的键需要均相同。多核苷酸可以是线性的或环形的或包含线性和环形部分的组合。
如本文所用，“多肽”指包含氨基酸并为本领域技术人员认为是蛋白质的组合物。本文使用氨基酸残基的常规单字母或三字母密码。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中互换用于指任何长度氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性的或分支的，其可包含修饰的氨基酸，并且非氨基酸可中断所述聚合物。该术语还包括已经经过天然修饰或干涉(例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化，或任何其他操作或修饰，如与标记成分的缀合)的氨基酸聚合物。该定义中还包括，例如含有一个或多个氨基酸的类似物(包括例如，非天然氨基酸等)，以及本领域已知的其他修饰的多肽。
如本文所用，“载体”指设计用于将核酸引入一个或多个细胞类型中的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、表达盒等。
如本文所用，术语“表达”指在基因的核酸序列基础上产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。
如本文所用，“表达载体”指含有DNA编码序列(例如基因序列)的DNA构建体，所述DNA编码序列有效连接能够在宿主中引起编码序列表达的一个或多个合适的控制序列。此类控制序列包括引起转录的启动子、控制该转录的任选的操作子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、和控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒，或简单的可能的基因组***片段。一旦转化到合适的宿主中，载体可独立于宿主基因组，或在一些情况下整合到基因组中进行复制并行使功能。质粒是最常用的表达载体形式。然而，本发明旨在包括这类其他形式的表达载体，其行使等同功能，并且为本领域已知或变得为本领域所知。
“启动子”指参与结合RNA聚合酶以起始基因转录的调节序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。可用于本发明的诱导型启动子的非限制性实例来自里氏木霉cbh1基因，其为诱导型启动子。“诱导型启动子”是在环境或发育调节条件下有活性的启动子。
术语“有效连接”指特定元件的并列或排列，其允许它们一致进行产生影响。例如，如果启动子控制编码序列的转录，那么其有效连接编码序列。
“在转录控制下”是本领域理解透彻的术语，其表示多核苷酸序列的转录取决于其有效连接的促进转录起始或促进转录的元件。
“在翻译控制下”是本领域理解透彻的术语，其表示在已经形成mRNA后发生的调节过程。
“基因”指参与产生多肽的DNA区段，并包括编码区之前和之后的区域，以及各编码区段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。
如本文所用，术语“宿主细胞”指细胞或细胞系，向其中转染产生多肽的重组表达载体用于表达多肽。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然、意外或刻意的突变，所述后代与初始亲本细胞不必完全相同(在形态或总的基因组DNA互补物上)。宿主细胞包括体内用表达载体转染或转化的细胞。
术语“重组的”指如通过突变编码序列产生改变的多肽、将编码序列与另一基因的编码序列融合、将基因置于不同启动子控制下、在异源生物中表达基因、以减少或升高水平表达基因、以不同于其天然表达谱的方式有条件地或组成型地表达基因等修饰，以改变其序列或表达特征的遗传物质(即，核酸、它们编码的多肽，和包含此类多核苷酸的载体和细胞)。一般地，人为操作重组核酸、多肽和基于其上的细胞，使得它们不同于在自然界中发现的相关核酸、多肽和细胞。
“信号序列”指结合蛋白质N末端部分的氨基酸序列，其促进成熟形式的蛋白质从细胞的分泌。成熟形式的细胞外蛋白质缺少在分泌过程中切掉的信号序列。
术语“选择标记”或“选择性标记”指能够在宿主细胞中表达的基因，其允许方便选择那些含有引入核酸或载体的宿主。选择性标记的实例包括但不限于抗微生物物质(例如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢优势，如营养优势的基因。
术语“来自”包括术语“起源于”、“获得”、“从中获得”、“分离自”和“产生自”，一般表示一种特定材料在另一特定材料中发现其起源，或具有另一特定材料描述的特征。
术语“丝状真菌”指细分真菌亚门(Eumycotina)的所有丝状体形式(参阅，Alexopoulos，C.J.(1962)，Introductory Mycology，Wiley，New York)。这些真菌的特征在于营养菌丝体具有由壳多糖、纤维素和其他复合糖组成的细胞壁，并且在形态上、生理上和遗传学上不同于酵母。丝状真菌的营养生长是通过菌丝伸长，并且碳代谢是完全需氧的。丝状真菌亲本细胞可以是木霉属(Trichoderma)物种(例如里氏木霉(之前分类为T.Iongibrachiatum，现在也称为Hypocrea jecorina)、绿色木霉(Trichoderma viride)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)等)的细胞。
如本文所用，术语“木霉(属)”或“木霉属物种(Trichoderma sp.)”指先前或目前分类为木霉属的任何真菌属。
术语“培养”指在适合生长的条件下，在液体或固体培养基中培养微生物细胞群。
术语“异源的”指多核苷酸或蛋白质时指特定宿主细胞中非天然发生的多核苷酸或蛋白质。期望该术语包括天然发生的基因、突变基因和/或合成基因编码的蛋白质。相反，术语“同源的”指多核苷酸或蛋白质时指宿主细胞中天然发生的多核苷酸或蛋白质。
在向细胞中***核酸序列的上下文中，术语“引入”包括“转染”、“转化”或“转导”，并且指向真核或原核细胞中掺入核酸序列，其在所述真核或原核细胞中核酸序列可掺入细胞的基因组内(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转化成自主复制子或瞬时表达。
“转染”或“转化”指外源多核苷酸***宿主细胞中。外源多核苷酸可维持为非整合载体，例如质粒，或可整合到宿主细胞的基因组中。术语“转染”旨在包括向宿主细胞中引入核酸的所有常规技术。转染技术的实例包括但不限于，磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂质转染、电穿孔和显微注射。
如本文所用，术语“转化”、“稳定转化”和“转基因”指具有非天然(例如异源)核酸序列整合到其基因组内或作为通过多代维持的游离型质粒的细胞。
如本文所用，术语“回收”、“分离”、“纯化”和“分离”指从其天然结合的至少一种组分中回收的材料(例如蛋白质、核酸或细胞)。例如，这些术语可指这样的材料，其大体上或基本上没有其天然状态中，例如完整的生物***中发现的通常伴随的组分。
如本文所用，“溶菌酶”指催化肽聚糖中N-乙酰胞壁酸与N-乙酰-D-葡糖胺残基和壳糊精中N-乙酰-D-葡糖胺残基之间的1，4-β键水解的酶(即，具有催化活性的多肽)。溶菌酶通过水解连接N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡萄糖胺第四个碳原子的糖苷键攻击肽聚糖(在细菌，特别是革兰氏阳性菌的细胞壁中发现)。
“信号序列”(也称为“前序列”、“信号肽”、“前导序列”或“前导肽”)指在将多肽靶向分泌途径的新生多肽氨基末端的氨基酸序列，并且一旦转运到内质网膜上就从新生多肽上切割掉。
相关(和衍生)蛋白质包括“变体”蛋白质。变体蛋白质通过小数量的氨基酸残基不同于亲本蛋白质和/或其他蛋白质。在一些实施方案中，不同氨基酸残基的数量是大约1、2、3、4、5、10、20、25、30、35、40、45或50中的任何一个。在一些实施方案中，变体通过大约1到大约10个氨基酸而不同。或者或另外，如使用序列比对工具，如BLAST、ALIGN和CLUSTAL(见下文)测定，变体与参照蛋白质或核酸可具有一定程度的序列同一性。例如，变体蛋白质或核酸与参照序列可具有至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或甚至99.5％的氨基酸序列同一性。术语“同源性”和“同一性”不区分使用。
如本文所用，术语“类似序列”指提供与参照蛋白质功能、三级结构和/或保守残基类似的蛋白质中的多肽序列。例如，在含有α螺旋或β折叠结构的表位区域中，类似序列内取代氨基酸维持相同的结构元件。在一些实施方案中，提供类似序列，其产生变体酶，所述变体酶显示与变体来源的亲本蛋白质类似或改善的功能。
如本文所用，“同源蛋白质”指与参照蛋白质(例如来自不同来源的溶菌酶)具有相似功能(例如酶活性)和/或结构的蛋白质(例如过水解酶的酶)。同源物可来自进化相关的或不相关的物种。在一些实施方案中，同源物具有与参照蛋白质类似的四级、三级和/或一级结构，由此潜在允许用来自同源物的类似区段或片段取代参照蛋白质的区段或片段，与用来自非同源蛋白质的序列取代区段或片段相比减少对参照蛋白质的结构和/或功能的破坏。
如本文所用，“野生型”、“天然的”和“天然发生的”蛋白质是在自然界中发现的那些蛋白质。术语“野生型序列”指在自然界中发现的或天然发生的氨基酸或核酸序列。在一些实施方案中，野生型序列是蛋白质改造工程，例如产生变体蛋白质的出发点。
在至少两个核酸或多肽的上下文中，短语“基本类似”和“基本相同”通常表示多核苷酸或多肽包含这样的序列，其与参照序列(例如野生型)多核苷酸或多肽相比具有至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至99.5％的序列同一性。可使用已知算法如BLAST、ALIGN和CLUSTAL，使用标准参数测定序列同一性。(参阅例如Altshul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Henikoff等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.89：10915；Karin等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：5873；和Higgins等(1988)Gene 73：237)。从National Center for Biotechnology Information中可公开获得用于进行BLAST分析的软件。同样，可使用FASTA搜索数据库(Person等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448.)。在一些实施方案中，基本相同的多肽仅通过一个或多个保守氨基酸取代而不同。在一些实施方案中，基本相同的多肽是免疫上交叉反应的。在一些实施方案中，基本相同的核酸分子在严格条件(例如在中等到高度严格范围内)下彼此杂交。
术语“抗微生物活性”指对微生物(例如细菌或真菌细胞)生长的部分或完全抑制，和/或对微生物细胞的裂解。
缩写“MIC”指最小抑制浓度。
“ATCC”指位于Manassas，Va.20108(www.atcc.org)的美国典型培养物保藏中心。
“NRRL”指Agricultural Research Service Culture Collection，National Center for Agricultural Utilization Research(之前称为)USDA Northern Regional Research Laboratory)，Peoria，Ill。
“一个”“该”和“所述”包括复数参考，除非上下文清楚地另有说明。
NSP38多肽和多核苷酸
本发明的一方面提供来自里氏木霉的本文称为“NSP38”的多肽，其具有抗微生物活性。在图4中显示了编码该蛋白质的里氏木霉多核苷酸序列(SEQ ID NO：3)，并且在图5中显示了推导的氨基酸序列(SEQ IDNO：4)。使用将该序列与其他已知信号序列相关联的软件模型预测了信号序列(图5中粗体所示)。推导的氨基酸序列包括228个氨基酸残基，包括预测的20个氨基酸信号序列。剩余的序列是成熟多肽的序列。
图4中所示的多核苷酸序列在下文实施例1中所述表达载体背景中转化到里氏木霉中，并如图3中所示进行表达。推导的成熟多肽的分子量是22,246道尔顿，并且基于氨基酸组成预测的等电点是5.60。如上述实例中所详细描述的，显示该多肽显示细菌裂解活性，并在酸性pH处而非中性pH处具有最高活性。
本发明的另一方面提供SEQ ID NO：4的变体或从SEQ IDNO：4切割信号序列后产生的成熟蛋白质的变体，其中所述变体与野生型NSP38多肽具有相同的抗微生物活性，或比其高的抗微生物活性。变体相对于SEQ ID NO：4的多肽可包括取代、缺失、***或化学修饰。变体中包括的示例性取代是保守氨基酸取代，如在下表中列出的那些取代。
Figure BPA00001197313200131
Figure BPA00001197313200141
本发明的另一方面提供编码NSP38多肽或其变体的多核苷酸。该多核苷酸可包含在载体，如表达载体中，用于在微生物宿主细胞中产生多肽。在一个实施方案中，提供包含编码多肽SEQ ID NO：4的多核苷酸的表达载体。
宿主细胞
本发明的其他方面提供可表达如本文所述NSP多肽或其变体的宿主细胞，即包含编码NSP多肽或其变体的多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞选自细菌、真菌、植物和酵母细胞。术语“宿主细胞”包括细胞、细胞的后代、和从用于产生NSP多肽或其变体的细胞产生的原生质体。
在一些实施方案中，宿主细胞是真菌细胞，例如丝状真菌宿主细胞。术语“丝状真菌”指细分真菌亚门的所有丝状体形式(参阅Alexopoulos，C.J.(1962)，INTRODUCTORY MYCOLOGY，Wiley，New York)。这些真菌的特征在于营养菌丝体，其具有由壳多糖、纤维素和其他复合糖组成的细胞壁。丝状真菌在形态上、生理上和遗传学上不同于酵母。丝状真菌的营养生长是通过菌丝延长并且碳代谢是完全需氧的。丝状真菌宿主细胞可以是这些种类但不限于这些种类的细胞：木霉属(例如里氏木霉，其为Hypocrea jecorina的无性形态，先前分类为T.longibrachiatum、绿色木霉、康氏木霉、哈茨木霉)(Sheir-Neirs等，(1984)Appl.Microbiol.Biotechnol 20：46-53；ATCC No.56765和ATCC No.26921)；青霉属物种(Penicillium sp.)；腐质霉属物种(Humicola sp.)(例如H.insolens、H.lanuginosa和灰腐质霉(H.grisea)；Chrysosporium sp.(例如C.lucknowense)；粘帚霉属物种(Gliocladium sp.)；曲霉属物种(Aspergillus sp.)(例如米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)、酱油曲霉(A sojae)、日本曲霉(A.japonicus)、构巢曲霉(A.nidulans)和泡盛曲霉(A.awamori))(Ward等，(1993)Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-743和Goedegebuur等，(2002)Genet 41：89-98)；镰孢霉属物种(F美国rium sp.)，(例如粉红镰孢(F.roseum)、禾赤镰孢(F.graminum)、F.cerealis、尖镰孢(F.oxysporuim)和F.venenatum)；脉孢菌属物种(Neurospora sp.)，(粗糙脉孢菌(N.crassa))；肉座菌属物种(Hypocrea sp.)；毛霉属物种(Mucor sp.)，(米黑毛霉(M.miehei))；根霉属物种(Rhizopus sp.)和Emericella sp.(也参阅Innis等，(1985)Science 228：21-26)。术语″木霉″或″木霉属物种”指之前或目前分类为木霉属的任何真菌属。
在一些实施方案中，宿主细胞是里氏木霉菌株。里氏木霉的菌株是已知的，其非限制性实例包括ATCC No.13631、ATCC No.26921、ATCC No.56764、ATCC No.56765、ATCC No.56767和NRRL No.15709。在一些实施方案中，宿主细胞来自RL-P37里氏木霉菌株(描述于Sheir-Neiss等(1984)Appl.Microbiol.Biotechnology 20：46-53)。在一些实施方案中，宿主细胞是Morph 1.1(pyr+)里氏木霉菌株，其为四分之一缺失的RL-P37里氏木霉菌株的自生pyr4回复体(描述于PCT申请号WO05/001036)。
在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阳性菌细胞。非限制性实例包括链霉菌属(Streptomyces)的菌株(例如变铅青链霉菌(S.lividans)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)和灰色链霉菌(S.griseus))和芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株。如本文所用，“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属内的所有物种，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、B.clausii、B.halodurans、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、B.lautus和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。认为芽孢杆菌属继续进行分类学上的再分类。因此，期望属包括已经再分类的物种，包括但不限于这样的生物，如嗜热脂肪芽孢杆菌，现在其称为“嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”。
在一些实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性菌菌株，如大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)。在一些实施方案中，宿主细胞可以是酵母细胞，如酵母属物种(Saccharomyces sp.)、裂殖酵母属物种(Schizosaccharomyces sp.)、毕赤酵母属物种(Pichia sp.)或假丝酵母属物种(Candida sp)。
之前已经通过遗传改造处理过宿主菌株。在一些实施方案中，真菌宿主细胞的多个天然基因已经失活。可通过完全或部分缺失、***失活或通过使得基因为预期目的失去功能的任何其他手段完成基因失活(以便防止基因表达成有功能的蛋白质)。期望获得具有一个或多个失活基因的真菌宿主细胞时，可使用已知的方法(例如在美国专利号5,246,853和5,475,101和WO 92/06209中公开的方法)。基因包括，例如编码纤维素分解酶，如内切葡聚糖酶(EG)和外切纤维二糖水解酶(CBH)(例如cbh1、cbh2、egl1和egl3)的基因。美国专利号5,650,322公开了在cbh1基因和cbh2基因中具有缺失的RL-P37的衍生菌株。在一些实施方案中，当宿主细胞是木霉细胞，并尤其是里氏木霉宿主细胞时，cbh1、cbh2、egl1和egl2基因例如通过缺失而失活。在美国专利号5,847,276和WO 05/001036所示并描述了具有四分之一缺失蛋白质的里氏木霉宿主细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是蛋白酶缺失或蛋白酶负型的菌株。
可使用标准技术将编码本发明的多肽的表达载体转染或转化到宿主细胞中。转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory press和其他实验室教科书中。也可通过适合在体内通过逆转录病毒载体(参阅例如，Ferry等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，88：8377-8381；和Kay等(1992)Human Gene Therapy 3：641-647)、腺病毒载体(参阅例如，Rosenfeld(1992)Cell 68：143-155；以及Herz和Gerard(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，90：2812-2816)、受体介导的DNA摄取(参阅例如，Wu，和Wu(1988)J.Biol.Chem.263：14621；Wilson等(1992)J.Biol.Chem.267：963-967；和美国专利号5,166,320)、DNA直接注射(参阅例如，Acsadi等(1991)Nature 332：815-818；和Wolff等(1990)Science247：1465-1468)或粒子轰击(生物射弹)(参阅例如，Cheng等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.，美国，90：4455-4459；和Zelenin等(1993)FEBS Letts.315：29-32)向细胞引入核酸的递送机制将核酸转移到细胞中。
某些载体以低频率整合到宿主细胞中。为了鉴定这些整合体，在一些实施方案中含有选择性标记(例如药物抗性)的基因与目的核酸一起引入宿主细胞中。选择性标记的实例包括赋予对某些药物抗性的那些标记，如G418和潮霉素。可从目的核酸中在分开的载体或同一载体上引入选择性标记。然后可使用选择性标记选择细胞来鉴定转染的宿主细胞。例如，如果选择性标记编码赋予潮霉素抗性的基因，那么可通过其在G418存在下的生长鉴定吸收核酸的宿主细胞。整合了选择性标记基因的细胞将存活，而其他细胞则死亡。
一旦表达了，可通过本领域的标准方法，包括但不限于亲和纯化、硫酸铵沉淀、离子交换层析或凝胶电泳纯化多肽(一般参阅R.Scopes(1982)Protein Purification，Springer-Verlag，N，Y.；Deutscher(1990)Methods in Enzymology 182卷：Guide to Protein Purification，Academic Press，Inc.N.Y.)。
载体
根据本发明，将包含编码NSP38或其变体的多核苷酸序列的载体引入木霉宿主细胞中。通常，包含NSP38或其变体的多肽从包含编码多肽的多核苷酸和包含有效连接编码序列的调节序列的表达载体表达。
载体可以是可引入宿主细胞例如木霉细胞并在其中进行复制的任何载体。合适载体的实例可见于例如Sambrook等(1989)，上文，Ausubel(1994)，上文，van den Hondel等(1991)Bennet和Lasure(编辑)，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，San Diego，第396-428页，和美国专利号5,874,276中。重要的载体的实例包括但不限于pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D。
通常，编码NSP38或其变体的多核苷酸有效连接至木霉宿主细胞中显示转录活性的合适启动子。启动子可来自编码对宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。启动子的合适的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1和egl2。在一些实施方案中，启动子对宿主细胞是天然的。例如，当里氏木霉是宿主细胞时，启动子可以是天然的里氏木霉启动子。在一个实施方案中，启动子是里氏木霉cbh1，其为诱导型启动子并以登录号D86235保藏在GenBank中。在另一实施方案中，启动子对宿主细胞是异源的。
在一些实施方案中，编码序列有效连接编码信号序列的多核苷酸序列。在一些实施方案中，信号序列是在自然界中与待表达基因结合的序列。在一些实施方案中，信号序列是里氏木霉cbh1信号序列。在一些实施方案中，待引入木霉宿主细胞的载体包含来自同一来源的信号序列和启动子序列。在一些实施方案中，信号序列和启动子序列来自不同来源。
在一些实施方案中，载体还包括终止序列。在一些实施方案中，待引入木霉宿主细胞的载体包含来自同一来源的终止序列和启动子序列。在一些实施方案中，终止序列和启动子序列来自不同来源。合适的终止子序列的非限制性实例是来自木霉菌株，如里氏木霉菌株的cbh1终止子序列。
在一些实施方案中，载体包括选择性标记。合适的选择性标记的实例包括，但不限于赋予抗微生物化合物抗性的基因，该抗微生物化合物例如为潮霉素、腐草霉素(phleomycin)。也可使用营养选择性标记，例如amdS、argB、pyr4。用于转化木霉的载体***的标记为本领域所知。(参阅例如，Finkelstein(1992)Biotechnology of Filamentous Fungi，第6章，Finkelstein等，编辑，Butterworth-Heinemann，Boston，Mass.；Kinghorn等(1992)Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi，BlackieAcademic and Professional，Chapman and Hall，伦敦)。在一个实施方案中，选择性标记是amdS基因，其编码乙酰胺酶，允许转化的细胞以乙酰胺作为氮源生长。在Kelley等(1985)EMBO J.4：475-497和Penttila等(1987)Gene 61：155-164中描述了构巢曲霉amdS基因作为选择性标记的用途。
包含编码NSP38或其变体的多核苷酸的表达载体可以是能够在木霉宿主细胞中自主复制或整合到宿主细胞DNA中的任何载体。在一些实施方案中，表达载体是质粒。
制备包含编码多肽的多核苷酸或其他序列(如启动子和终止子)的DNA构建体，并将它们***合适载体的方法为本领域所熟知。一般通过在便利限制性位点处进行连接来完成多核苷酸序列的连接。如果该位点不存在，可根据常规实践使用合成的寡核苷酸接头。(参阅例如Sambrook(1989)，上文；Bennett和Lasure(1991)，上文，第70-76页)
向宿主细胞中引入载体
可使用任何本领域熟知的技术，例如转化、电穿孔、核显微注射、转导、转染(例如脂质转染或DEAE-糊精介导的转染)、与磷酸钙DNA沉淀温育、具有DNA包被微粒的高速轰击或原生质体融合进行包含编码多肽的多核苷酸序列的载体向宿主细胞中的引入。
在一些实施方案中，产生稳定转化体，由此编码多肽的多核苷酸稳定整合到宿主细胞染色体中。然后通过已知技术纯化转化体。
在一个实施方案中，包括amdS标记的稳定转化体通过其在含有乙酰胺的固体培养基上更快的生长速率和具有光滑而非凹凸不平的环形菌落形成与非稳定转化体区分开。另外，在一些情况下，通过在固体非选择培养基(即缺少乙酰胺的培养基)上培养转化体、从该培养基中收获孢子、并测定随后在含乙酰胺的选择性培养基上萌发并生长的这些孢子的百分比来进行稳定性的进一步检测。或者，可使用本领域其他已知方法选择转化体。
在一个实施方案中，制备用于转化的木霉宿主细胞涉及从真菌菌丝体中制备原生质体。(参阅例如，Campbell等(1989)Curr.Genet.16：53-56.)在一些实施方案中，从萌发的营养孢子中获得菌丝体。用消化细胞壁的酶处理菌丝体，产生原生质体。通过悬浮培养基中渗透稳定剂的存在保护原生质体。此类稳定剂包括，例如山梨醇、甘露醇、氯化钾和硫酸镁。通常，稳定剂浓度在约0.8M到约1.2M的范围内。在一个实施方案中，山梨醇在悬浮培养基中以约1.2M的浓度存在。
通常，吸收DNA到宿主木霉细胞中依赖于吸收溶液中的钙离子浓度。一般地，在吸收溶液中包括约10mM到约50mM CaCl2。此外，吸收溶液通常还包括缓冲***(例如TE缓冲液(10mM Tris，pH 7.4；1mMEDTA)或10mM吗啉代丙磺酸(MOPS)，pH 6.0)和聚乙二醇(PEG)。尽管不希望受理论约束，PEG可作用于融合细胞膜，因而允许培养基的内含物递送到木霉细胞的细胞质中，并允许质粒DNA转移到细胞核中。该融合通常导致多个拷贝的质粒DNA整合到宿主染色体中。
通常，含有已经进行通透性处理的密度为每ml约105到约107，通常每ml约2x106的木霉原生质体或细胞的悬浮液用于转化。适当溶液(例如含有1.2M山梨醇50mM CaCl2的溶液)中100μl体积的这些原生质体或细胞与DNA混合。一般地，向吸收(uptake)溶液中加入高浓度的PEG。例如，可向原生质体悬浮液中加入约0.1到约1体积的25％PEG 4000。在一个实施方案中，加入约0.25体积的25％PEG 4000。可向吸收溶液中加入包括但不限于二甲基亚砜、肝素、亚精胺和氯化钾的添加剂并帮助转化。
通常，吸收混合物然后在0℃温育约10到约30分钟。然后向混合物中加入额外的PEG，以进一步增强期望基因或多核苷酸序列的吸收。例如，可加入约5到约15体积的25％PEG 4000。然而，更多或更少的体积也是合适的。加入的25％PEG 4000的量经常是转化混合物体积的约10倍。加入PEG后，转化混合物然后在室温或冰上温育，随后加入山梨醇和氯化钙溶液。然后向生长培养基(例如熔化的生长培养基，其仅允许转化体生长)的等分试样中加入原生质体悬浮液。
NSP38多肽的产生
例如在美国专利号6,022,725和6,268,328，Harkki等(1991)Enzyme Microb.Technol.13：227-233，Harrki等(1989)Bio Technol.7：596-603，EP 244,234，EP 215,594，和Nevalainen等(1992)“The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes，”在Molecular IndustrialMycology中，Leong和Berka，编辑，Marcel Dekker Inc.，NY，第129-148页中描述了蛋白质在木霉中的表达。
一般地，在包含生理盐和营分的标准培养基中培养木霉宿主细胞。可使用常见的商品化制备培养基(例如酵母麦芽提取物(YM)培养液；Luria Bertani(LB)培养液；Sabouraud Dextrose(SD)培养液)。通常，细胞振荡培养或发酵罐中大约28℃下进行培养，直至达到期望的表达水平。在使用里氏木霉cbh1启动子的一些实施方案中，包括乳糖或葡萄糖-槐糖混合物作为培养基中的碳源。
方法
一方面，本发明提供表达如本文所述的NSP38多肽或其变体的方法。在一个实施方案中，该方法包括用包含编码NSP38多肽或其变体的多核苷酸的表达载体转化宿主细胞，例如木霉宿主细胞，并在适合于表达多肽的条件下培养宿主细胞。在一个实施方案中，该方法包括在适合表达多肽的条件下培养宿主细胞，例如木霉宿主细胞，其已经转化有包含编码NSP38多肽或其变体的多核苷酸的表达载体。在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO：3所示的序列；由SEQ ID NO：3所示的序列组成基本上由SEQ ID NO：3所示的序列组成。在一些实施方案中，方法还包括从培养基中回收NSP38多肽。
另一方面，本发明提供抑制细菌生长的方法，其包括使微生物细胞与如本文所述的NSP38多肽或其变体接触，其中细胞的生长受到抑制。在一个实施方案中，微生物细胞是细菌细胞。在一个实施方案中，微生物细胞是真菌细胞。在一些实施方案中，该方法在酸性pH，例如任何约6.5、6、5.5或5的pH处进行。
另一方面，本发明提供回收微生物产生的蛋白质的方法，其包括使表达目的蛋白质的微生物培养物与本文所述的NSP38多肽或其变体接触，由此降解微生物细胞壁并从微生物细胞中释放目的蛋白质。
另一方面，提供在清洗应用中，如家庭洗衣应用中减少织物上微生物负荷的方法，其包括用包含本文所述的NSP38多肽或其变体的去污剂组合物清洗织物，其中微生物负荷比使用不包含NSP38多肽或其变体的相同去污剂组合物时少。在一些实施方案中，恶臭相比于不包含NSP38多肽或其变体的去污剂组合物减少。
另一方面，本发明提供用于食品保藏的方法，其包括使食品产品与NSP38多肽或其变体接触以减少或消除微生物在食品产品中的生长。其中可使用该方法用于食品保藏的食品产品的非限制性实例包括乳制品、肉制品和鱼制品或海产品。
组合物
其他方面，本发明提供包含如本文所述的NSP38多肽或其变体的组合物。
清洁组合物
提供在清洗过程中减少织物上微生物负荷的组合物。该组合物包含清洁组合物，例如去污剂组合物中的NSP38多肽或其变体。在一些实施方案中，该组合物还包括一种或更多在清洗组合中有益的酶，该酶包括但不限于赖氨酸、蛋白酶、过水解酶、脂肪酶、磷脂酶、氧化酶、内切糖苷酶、糖酶和/或其他微生物细胞壁降解酶。在一些实施方案中，组合物比不包含NSP38多肽或其变体的相同组合物产生更少的恶臭。
在清洁组合物中还可包括佐剂材料，例如来帮助或增强清洗性能，用于处理待清洁的底物，或改善清洁组合物的美感，如香味、着色、染色等。应理解此类佐剂在如本文所述的含酶颗粒之外。这些额外组分的精确性质及其掺入的水平将取决于组合物的物理形式和待用于清洁操作的性质。合适的佐剂材料包括，但不限于表面活性剂、助洗剂(builder)、螯合剂、染料转移抑制剂、沉积助剂、分散剂、酶稳定剂、催化材料、漂白活性剂、漂白加强剂、预制过氧乙酸(preformed peracids)、聚合的分散剂、粘质土去除/抗再沉积剂、增亮剂、抑泡剂、染料、香料、塑形剂、织物软化剂、载体、助水溶物、操作助剂和/或色素。除了下文的公开内容，在美国专利号5,576,282、6,306,812和6,326,348中描述了此类其他佐剂的合适实例和使用浓度。
表面活性剂-如本文所述的清洁组合物可包括表面活性剂或表面活性剂***，其中表面活性剂可选自非离子型表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂、半极性非离子型表面活性剂及其混合物。表面活性剂通常以目标清洁组合物的重量计约0.1％到约60％，约1％到约50％或约5％到约40％的水平存在。
助洗剂(builder)-如本文所述的清洁组合物可包含一种或更多去污剂助洗剂或助洗剂***。当使用助洗剂时，目标清洁组合物通常包含以目标清洁组合物重量计至少约1％、约3％到约60％，或约5％到约40％的助洗剂。
助剂包括，但不限于碱土金属、多聚磷酸铵和多聚磷酸链烷醇铵(alkanolammonium)盐类、碱金属硅酸盐类、碱土金属碳酸盐类和碱金属碳酸盐类、铝矽酸盐助洗剂、聚羧酸化合物、羟基聚羧酸醚类(ether hydroxypolycarboxylates)、马来酸酐与乙烯或乙烯甲醚的共聚物、1，3，5-三羟基苯酚-2，4，6-三磺酸、和羧基甲氧基琥珀酸、多种碱土金属、聚乙酸的铵盐和取代铵盐，如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸、以及聚羧酸如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧二琥珀酸、聚马来酸、1，3，5-苯三甲酸(benzene1，3，5-tricarboxylic acid)、羧基甲氧基琥珀酸及其可溶性盐。
螯合剂-如本文所述的清洁组合物可包含一种或更多螯合剂。合适的螯合剂包括，但不限于铜、铁和/或锰螯合剂及其混合物。当使用螯合剂时，清洁组合物可包含以目标清洁组合物重量计约0.1％到约15％，或约3.0％到约10％的螯合剂。
沉积助剂-如本文所述的清洁组合物可包含一种或更多沉积助剂。合适的沉积助剂包括，但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚羧酸、污垢释放聚合物如polytelephthalic acid，和粘土，如高岭土、蒙脱石、atapulgite、伊利石、膨润土、多水高岭土及其混合物。
染料转移抑制剂-如本文所述的清洁组合物可包括一种或更多染料转移抑制剂。合适的聚合染料转移抑制剂包括，但不限于聚乙烯吡咯酮聚合物、多胺N-氧化物、N-乙烯基砒咯烷酮和N-乙烯基咪唑的聚合物、polyvinyloxazolidones、和聚乙烯咪唑，及其混合物。当在目标清洁组合物中存在时，染料转移抑制剂可以以清洁组合物重量计约0.0001％到约10％，约0.01％到约5％，或约0.1％到约3％的浓度存在。
分散剂-如本文所述的清洁组合物可包括一种或更多分散剂。合适的水溶性有机分散剂包括，但不限于高聚酸或共聚酸或其盐，其中多聚羧酸包含通过多于两个碳原子彼此分离的至少两个羧基。
酶稳定剂-可通过多种技术稳定用于去污剂的酶。例如可通过完工组合物中水溶性来源钙和/或镁离子的存在稳定本文使用的酶，所述组合物为酶提供这类离子。
催化金属复合物-如本文所述的清洁组合物可包括一种或更多催化金属复合物。一种类型的含金属漂白催化剂是下述催化***，其包含定义漂白催化活性的过渡金属阳离子，如铜、铁、钛、钌、钨、钼、或锰阳离子，具有很少或没有漂白催化活性的辅助金属阳离子，如锌或铝阳离子，以及对催化和辅助金属阳离子具有确定稳定常数的螯合物(sequestrate)，尤其是乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸盐(methylenephosphonic acid)及其水溶性盐。在美国专利号4,430,243中公开了此类催化剂。已知并例如在美国专利号5,576,282中描述了本文重要的含锰催化剂。已知并例如在美国专利号5,597,936和5,595,967中描述了本文重要的钴漂白催化剂。可通过已知方法，例如在美国专利号5,597,936和U.S.5,595,967中教导的方法容易地制备此类钴催化剂。
本文的组合物还可包括macropolycyclic刚性体-缩写为“MRL”的过渡金属复合体。作为实践事件，并不在限制，可调整本文的组合物和清洁方法以在水洗涤介质中提供在每亿活性MRL种类数量级上的至少一部份，并经常在洗涤溶液中提供约0.005ppm到约25ppm、约0.05ppm到约10ppm或约0.1ppm到约5ppm的MRL。过渡金属漂白催化剂中的合适过渡金属包括锰、铁和铬。在一个实施方案中，MRL是交联的超刚性配体，如5，12-二乙基-1，5，8，12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷(5，12-diethyl-1，5，8，12-tetraazabicyclo[6.6.2]hexadecane)。可通过已知的方法，如在PCT申请号WO 00/332601和美国专利号6,225,464中教导的方法容易地制备合适的过渡金属MRL。
本文公开的清洁组合物可用于清洁表面或织物上的位点。通常，至少一部份位点与上文所述净重形式或在洗涤溶液中稀释的清洁组合物接触，然后任选地洗涤和/或冲洗位点。洗涤包括，但不限于擦洗和机械搅拌。织物可包含能够在正常消费者使用条件下洗涤的大多数任何织物。公开的清洁组合物通常以在溶液中从约500ppm到约15,000ppm的浓度使用。当洗涤溶剂是水时，水温度通常在从约5℃到约90℃的范围内，当位点包含织物时，水与织物量的比例通常是从约1∶1到约30∶1。
食品保藏组合物
提供用于食品保藏的组合物。该组合物包含NSP38多肽或其变体，并用于减少或消除在食品产品中细菌的生长。包括NSP38多肽或其变体的食品保藏组合物的非限制性实例包括乳糖抗微生物组合物(例如，乳铁蛋白(lactoferrin)、乳球蛋白类、lactolipids)、卵抗微生物组合物(例如，卵转铁蛋白、抗生物素蛋白)、植物抗微生物组合物(例如植物酚、皂苷、儿茶素)、bacto-抗微生物组合物(例如，杆菌素、reuterin)、酸抗微生物组合物(例如，乳酸、山梨酸、柠檬酸)、环境抗微生物组合物(例如多聚磷酸盐)、包含具有抗微生物功能的酶的组合物，和包含中链脂肪酸和酯的组合物。
以下实施例旨在说明，不在限制本发明。实施例实施例1.里氏木霉中NSP38的克隆和表达A.包含编码里氏木霉溶菌酶A的多核苷酸的表达载体的构建。
从里氏木霉菌株QM6a中提取基因组DNA。基于在里氏木霉基因组(JGI里氏木霉基因组v2.0)Trire2/scaffold 2：146675-147417中发现的推测蛋白酶序列设计PCR引物。正向引物含有用于定向克隆到PDONRTM 201(Invitrogen，Carlsbad，Ca.美国)的基序。
NSP381正向引物的序列是ATGAAGTTTCTGACTCCCCTTGCC(SEQ ID NO：1)，NSP382反向引物的序列是CTAACTTCCGCGGGCAATCTTCTG(SEQ ID NO：2)。
通过凝胶提取(Gel Purification试剂盒，Qiagen)纯化0.8kb的PCR产物，并根据Invitrogen Gateway***方案将其克隆到PDONRTM 201中。
将包含DNA序列(SEQ ID NO：3)的表达盒克隆到
Figure BPA00001197313200261
Entry载体PDONRTM 201(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。通过LR重组反应将Trlys1表达盒克隆到Gateway相容性目的载体pTrex3g-DEST中(图1)，其也描述于PCT申请号WO 06/060062中。pTrex3g-Trlys1表达载体(图2)使得能够在里氏木霉宿主中表达TrLYS蛋白(SEQ ID NO：4)。
B.转化。
使用颗粒轰击通过PDS-1000/Helium System(BioRad Cat.No.165-02257)将pTrex3g-Trlys1表达载体转化到来自RL-P37(IA52)并具有多个基因缺失(Δcbh1、Δcbh2、Δegl1、Δegl2)的里氏木霉宿主菌株中。该方案概括于下文中，还参考PCT申请号WO 05/001036的实施例6到11。
制备来自里氏木霉菌株的孢子悬浮液(大约5x108孢子/ml)。将100μl-200μl孢子悬浮液涂布在基本培养基(MM)乙酰胺培养基的平板中央。(MM乙酰胺培养基具有以下组成：0.6g/L乙酰胺、1.68g/L CsCl、20g/L葡萄糖、20g/L KH2PO4、0.6g/L CaCl2·2H2O、1ml/L 1000X微量元素溶液、20g/L Noble琼脂；pH 5.5。)1000X微量元素溶液含有5.0g/LFeSO4.7H2O、1.6g/L MnSO4、1.4g/L ZnSO4.7H2O和1.0g/L CoCl2.6H2O。允许孢子悬浮液在MM乙酰胺培养基表面上干燥。
根据生产商的说明书进行转化。简言之，将60mg的M10钨颗粒置于微量离心管中。加入1mL乙醇并允许静止15分钟。颗粒在15,000转/分钟下离心15分钟。去除乙醇并用无菌dH2O洗涤颗粒三次，然后加入1mL 50％(v/v)无菌甘油。将25μl钨颗粒悬浮液置于微量离心管中。连续混合的同时加入以下：0.5-5μl(100-200ng/μl)质粒DNA、25μl的2.5M CaCl2和10μl的0.1M亚精胺。将颗粒离心3秒钟。去除上清液并用200μl 70％(v/v)乙醇洗涤颗粒，离心3秒钟。去除上清液，加入24μl100％乙醇，通过抽吸(pipetting)混合，并将离心管置于超声浴中。去除8μl颗粒的等分试样，并置于在干燥器中保持的大载体片(macrocarrier disk)的中央。一旦钨/DNA溶液干燥了，将大载体片与具有孢子的MM乙酰胺平板一起置于轰击室中，并根据生产商的说明书进行轰击过程。轰击平板孢子与钨/DNA颗粒后，将平板在28℃温育。4天后挑取转化的菌落到新鲜MM乙酰胺平板中(
Figure BPA00001197313200271
等(1987)Gene 61：155-164)。
C.证实转化细胞中所表达的Trlys1的产生。
在MM乙酰胺平板上生长5天后，将显示稳定形态的转化体接种到含有30ml Proflo培养基的250ml摇瓶中。(Proflo培养基含有：30g/L α-乳酸、6.5g/L(NH4)2SO4、2g/L KH2PO4、0.3g/L MgSO4.7H2O、0.2g/L CaCl2、1ml/L 1000X微量元素盐溶液、2ml/L 10％Tween 80、22.5g/L ProFlo棉籽淀粉(Traders protein，Memphis，TN)、0.72g/L CaCO3)在28℃和140转/分钟下生长2天后，将10％Proflo培养物转移到含有30ml Lactose Defined Media的250ml摇瓶中。Lactose defined Media的组成如下：5g/L(NH4)2SO4、33g/L PIPPS缓冲液、9g/L酪蛋白氨基酸、4.5g/L KH2PO4、1.0g/L MgSO4·7H2O、5ml/L Mazu DF60-P消泡剂(Mazur Chemicals，IL)、1000X微量元素溶液；pH 5.5。灭菌后将40ml/L 40％(w/v)乳糖溶液加入培养基中。Lactose Defined培养基摇瓶在28℃，140转/分钟振荡4-5天。
通过离心回收菌丝体，并分析上清液的总蛋白质(BCA ProteinAssay Kit，Pierce目录号23225)。培养上清液的样品与适当体积的具有还原剂的2X样品上样缓冲液混合。通过在具有MES SDS电泳缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)的
Figure BPA00001197313200281
Novex 10％Bis-Tris Gel上的SDS-PAGE电泳测定蛋白质谱(图3)。
实施例2.NSP38的细菌裂解活性
在LB培养基(Luria-Bertani培养基：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l NaCl，用NaOH调整到pH 7.0)生长的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的1.25ml过夜培养物在37℃离心16小时，并将细胞在400μl TEN缓冲液(20mM Tris/1mM EDTA/50mM NaCl)，pH7.5或来自Qiagen plasmid prep试剂盒的P1缓冲液中重悬浮。加入1μlNSP38超滤浓缩物(UFC)，并在37℃温育。NSP38UFC是如实施例1中所述里氏木霉发酵物的浓缩培养上清液，并含有127mg/ml总蛋白质(估计有大约100mg/ml NSP38蛋白)。
阳性对照含有2μl READY-LYSETM溶菌酶溶液(Epicentre)，阴性对照含有仅在TEN或P1缓冲液中重悬浮的细胞。
通过肉眼以粘度的降低来评估裂解。READY-LYSETM大约5分钟后开始裂解细胞，大约15分钟后完全澄清。TEN缓冲液中的NSP38大约45分钟后裂解细胞，但不完全澄清，而P1缓冲液中的NSP38不裂解细胞。
实施例3.发酵培养液相对于TEN缓冲液中NSP38的细菌裂解
向500μl发酵培养液中的地衣芽孢杆菌(在LB培养基中37℃下发酵大约100小时)或在TEN缓冲液中离心并重悬浮的细菌细胞中加入实施例2中所述的10μl NSP38UFC，并在37℃下温育。裂解与具有READY-LYSETM发酵培养液和TEN缓冲液的阳性对照和单独的具有发酵培养液的阴性对照进行比较。
通过肉眼以粘度的减少评估裂解。在具有NSP38的发酵培养液中的细胞比在TEN缓冲液中重悬浮的细胞显示更高程度的裂解。READY-LYSETM比在两种缓冲液条件下NSP38裂解的程度更高。
实施例4.NSP38和鸡蛋清溶菌酶的活性比较
向1ml发酵培养液中的地衣芽孢杆菌(在LB培养基中37℃下发酵大约100小时)中加入实施例2中所述2、5或10μl NSP38UFC，并在37℃或45℃温育1小时或2小时。用NSP38的裂解与通过鸡蛋清溶菌酶(HEWL)以200μg/ml终浓度在45℃下温育的裂解进行比较。
通过肉眼以粘度的减少评估裂解。与HEWL(2μl NSP38/ml相比于200μgHEWL/ml)相比等同剂量的NSP38裂解细胞，但其在这些条件下进行了大约两倍时间(NSP382小时相比对HEWL 1小时)。
实施例5.pH对NSP38活性的影响
向1ml发酵培养液中的地衣芽孢杆菌(在LB培养基中37℃下发酵大约100小时)中加入50μl、150μl或250μl的3M醋酸钠pH 5.5，所述发酵培养液含有如实施例2中所述的2μl NSP38UFC，并在37℃下温育多达2小时。最终混合物中的pH从7.5降到6。
通过肉眼以粘度的减少评估裂解。在具有150μl醋酸钠的混合物中总裂解需要的时间是15分钟，其比在发酵培养液中的快8倍。15分钟后，在具有50μl醋酸钠的样品中没有观察到裂解，在具有150μl醋酸钠的样品中观察到了一些裂解，并在具有250μl醋酸钠的样品中观察到了完全裂解。
实施例6.NSP38剂量反应
向500μl发酵培养液中的地衣芽孢杆菌(在LB培养基中37℃下发酵大约100小时)中加入75μl的3M醋酸钠，pH 5.5。加入10、2或1μl，或5μl如实施例2中所述NSP38UFC的1∶10稀释物，并将混合物在37℃下温育30分钟。然后测定每一样品的细菌裂解。通过肉眼以粘度的减少评估裂解。
30分钟后与10、2或1μl温育的样品完全裂解。具有5μl NSP38的1∶10稀释物的样品也裂解了，但裂解水平比其他样品低。
实施例7.用NSP38抑制微生物生长
制备如实施例2中所述的NSP38UFC的60∶40(v/v)贮存液和微生物生长培养基，然后用于在96孔微量滴定板中制备2/3连续稀释系列。基于NSP38UFC中约100mg/ml NSP38的起始浓度，检测的NSP38的浓度大约是20,000、13,333、8,889、5,926、3,951、2,634、1,756、1,171、780和520ppm。
用5μl微生物菌株的过夜培养物接种每一孔，并在37℃(细菌)或30℃(酵母和霉菌)下温育24小时。一式两份检测每一菌株。
通过在加入菌株后立即(OD0h)和24小时后(OD24h)测定620nm处的光密度来表征不同NSP38稀释对微生物生长的抑制。如果ΔOD＝OD24h-OD0h低于不加NSP38的同一菌株的ΔOD的20％，则记录为完全抑制。不加菌株的样品的连续稀释用于从结果中扣除背景OD。
结果总结于下表中：
Figure BPA00001197313200311
尽管为清楚理解目的已经通过阐明和实施例在一定程度上详细描述了上述本发明，对本领域技术人员显而易见的是可进行某些修改和修饰，而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书不应解释为限制本发明的范围。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请为了所有目的以其整体引入作为参考，并如同每一出版物、专利或专利申请明确并单独引入作为参考一样。

Claims (25)

1.来自里氏木霉并具有抗微生物活性的重组多肽(NSP38)。
2.权利要求1的多肽，其中所述抗微生物活性是细菌细胞壁裂解活性。
3.权利要求1的多肽，其中所述抗微生物活性是1，4-β-N-乙酰胞壁质酶活性。
4.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述抗微生物活性的特征在于部分或完全抑制微生物细胞的生长。
5.前述权利要求中任一项的多肽，其中所述抗微生物活性的特征为在微生物生长中的延长滞后期效应。
6.前述权利要求中任一项的多肽，其中具有抗微生物活性的多肽对抗的微生物细胞是细菌或真菌细胞。
7.权利要求1-6中任一项的多肽，其包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示的多肽，或从所述多肽切割信号序列后产生的成熟蛋白质具有至少85％序列同一性。
8.权利要求1-6中任一项的多肽，其基本上由与SEQ ID NO：4所示的多肽，或从所述多肽切割信号序列后产生的成熟蛋白质具有至少85％序列同一性的氨基酸序列组成。
9.权利要求1-6中任一项的多肽，其具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
10.前述权利要求中任一项的多肽，其在酸性pH处具有抗微生物活性。
11.分离的多核苷酸，其编码前述权利要求中任一项的多肽。
12.载体，其包含权利要求11的多核苷酸。
13.宿主细胞，其包含权利要求12的载体。
14.用于在清洗过程中减少织物上微生物负荷的组合物，其包含权利要求1-10中任一项的多肽。
15.权利要求14的组合物，其还包含一种或更多溶素、蛋白酶、过水解酶、脂肪酶、磷脂酶、氧化酶、内切糖苷酶、糖酶，和其他微生物细胞壁降解酶。
16.权利要求14或15的组合物，其中与不包含所述多肽或其变体的相同组合物相比，所述组合物产生更少的恶臭。
17.用于食品保藏的组合物，其包含权利要求1-10中任一项的多肽。
18.用于表达NSP38多肽或其变体的方法，其包括在适合表达的条件下，在培养基中培养已经转化了编码所述NSP38多肽的多核苷酸的宿主细胞。
19.权利要求18的方法，其还包括从所述宿主细胞或培养基中回收所述多肽。
20.权利要求18的方法，其中所述多肽包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示的多肽，或从所述多肽切割信号序列后产生的成熟蛋白质具有至少85％序列同一性。
21.用于抑制微生物生长的方法，其包括使微生物细胞与NSP38多肽或其变体接触，由此抑制所述细胞的生长。
22.权利要求21的方法，其中所述方法在酸性pH处进行。
23.权利要求21或22的方法，其中所述多肽包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示的多肽，或从所述多肽切割信号序列后产生的成熟蛋白质具有至少85％序列同一性。
24.回收微生物产生的蛋白质的方法，其包括使表达蛋白质的微生物细胞与NSP38多肽或其变体接触，由此引起细胞裂解，并回收所述微生物细胞表达的蛋白质。
25.权利要求24的方法，其中所述多肽包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示的多肽，或从所述多肽切割信号序列后产生的成熟蛋白质具有至少85％序列同一性。
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