CN102625810A

CN102625810A - 真菌蛋白酶及其用途

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Publication number: CN102625810A
Application number: CN2010800399914A
Authority: CN
Inventors: L.瓦尔塔卡里; K.容图南; S.马基南; P.奥贾帕洛; M.帕罗海莫
Original assignee: AB Enzymes Oy
Current assignee: AB Enzymes Oy
Priority date: 2009-07-08
Filing date: 2010-07-08
Publication date: 2012-08-01
Anticipated expiration: 2030-07-08
Also published as: EP2451829A1; US8362222B2; FI121851B; CN102625810B; DK2451829T3; FI20095779A; JP2014503171A; US20110008870A1; FI20095779A0; JP6054741B2; WO2011003968A1; EP2451829B1

Abstract

本发明涉及用于修饰、降解或去除蛋白质性质的材料的真菌丝氨酸蛋白酶，所述酶包含具有SEQIDNO:10的氨基酸序列的成熟TrPrb1酶或其具有相似活性的变体的氨基酸序列。丝氨酸蛋白酶可得自木霉属。还公开的是编码所述蛋白酶的核酸序列，例如质粒pALK2650，其包含在保藏于登记号DSM22635下大肠杆菌RF8052中的全长酶的核苷酸序列SEQIDNO:10。所述蛋白酶用作在去垢剂组合物中可应用的酶制剂，且用于处理纤维、用于处理羊毛、用于处理毛发、用于处理皮革、用于处理食物或饲料、或用于涉及在低温或中等温度范围蛋白质性质的材料的修饰、降解或去除的任何应用。

Description

真菌蛋白酶及其用途

发明领域

本发明涉及在多种工业应用中，特别是在洗衣和餐具洗涤去垢剂中有用的真菌丝氨酸蛋白酶，其中所述酶在低温或中等温度范围时的性能是有利的。本发明涉及编码所述酶的分离的核酸分子、重组载体、用于产生所述酶的宿主细胞、包含所述酶的酶组合物以及用于制备此类组合物的方法。本发明还涉及所述酶或包含所述酶的组合物的多种用途。

背景技术

微生物细胞外蛋白酶占大部分，超过三分之一的全世界工业酶总销售（Cherry和Fidantsef，2003）。约90％的商业蛋白酶是去垢剂酶（Gupta等人，2002）。其他应用包括例如食物、饲料、皮革、药物、诊断学、废物管理和银回收。

目前使用的商业去垢剂制剂包含源于芽孢杆菌属（Bacillus）物种的碱性丝氨酸蛋白酶（Maurer，2004）。通过定点和/或随机诱变已开发了具有改善催化效率和/或针对温度、氧化试剂和多种洗涤条件的更佳稳定性的芽孢杆菌属酶变体。商业蛋白酶的例子是例如枯草杆菌蛋白酶Carlsberg（Alcalase?，Novozymes，DK）、枯草杆菌蛋白酶309（Savinase?，Novozymes，DK）、枯草杆菌蛋白酶147（Esperase?，Novozymes，DK）、Kannase?（Novozymes，DK）、Purafect?（Genencor Inc.，USA）、Purafect? Ox（Genencor Inc.，USA）、Properase?（Genencor Inc.，USA）以及BLAP S和X系列（Henkel，DE）。

来自真核生物包括酵母和丝状真菌的碱性丝氨酸蛋白酶基因和酶（EC 3.4.21）也已得到表征。真菌丝氨酸蛋白酶的使用由几个专利申请已知。例如，美国专利号3,652,399和EP 519229（Takeda Chemical Industries，Ltd.，JP）公开了在去垢剂和其他清洁剂组合物的配制中有用的，来自镰刀菌属（Fusarium）（有性型）或赤霉菌属（Gibberella）（无性型），特别是来自镰刀菌属物种S-19-5（ATCC 20192，IFO 8884）、F. oxysporum f. sp. lini（IFO 5880）或小麦赤霉（G. saubinetti）（ATCC 20193，IFO6608）的碱性蛋白酶。WO1994025583（NovoNordisk A/S，DK）公开了可衍生自镰刀菌属物种，特别是尖孢镰刀菌（F. oxysporum）的菌株（DSM 2672）的活性胰蛋白酶样蛋白酶，和编码其的DNA序列。衍生自镰刀菌属物种BLB（FERM BP-10493）的新蛋白酶的氨基酸序列公开于WO 2006101140（SODX Co. Ltd，Nakamura）中。此类去垢剂组合物可以进一步包含如WO 1992003529和WO 1992005239（NovoNordisk A/S，DK）中公开的，用于稳定一种或多种酶的可逆蛋白酶抑制剂，或如WO 1997028243（NovoNordisk A/S，DK）中公开的，蛋白酶的催化活性的氨基酸序列可以与包含纤维素酶结合结构域的序列连接。

丝氨酸蛋白酶可以单独或与其他其他水解酶组合用于应用中。例如，WO 88/03946和WO 89/04361（Novo Industri A/S，DK）公开了包含蛋白酶和脂肪酶的酶促去垢剂添加剂和去垢剂组合物，其中真菌蛋白酶衍生自镰刀菌属特别是尖孢镰刀菌或茄病镰刀菌（F. solani）。WO 1997002753（NovoNordisk A/S，DK）公开了使用蛋白酶和脂肪酶的此类组合用于轻柔清洁染污过程设备的方法。作为去垢剂添加剂或组合物的纤维素酶和蛋白酶特别是来自镰刀菌属物种DSM 2672的胰蛋白酶样蛋白酶的组合公开于WO 1992018599（NovoNordisk A/S，DK）中。

木霉属（Trichoderma）物种已描述为分泌广泛多样的蛋白酶（在Kredics等人，2005中综述）。然而，其中仅少数已得到表征。来自生物控制菌株哈茨木霉（T. harzianum）的丝氨酸蛋白酶编码基因prb1的分离（分离物以后重新分类为深绿木霉（T. atroviride））已公开于Geremia等人（1993）中。深绿木霉prb1基因序列用于克隆来自钩状木霉（T. hamatum）和哈茨木霉的prb1基因（Steyaert等人，2004）以及来自绿木霉（T. virens）的tvsp1基因（Pozo等人，2004）。成熟深绿木霉PRB1和绿木霉TVSP1蛋白质预期具有分别在8.98 - 9.2的pI，和29 kDa的分子量。它们显示了与几种枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的同源性，并且指定至丝氨酸蛋白酶的家族S8。TrichoEST方法（Suarez等人2007）揭示了来自生物控制真菌哈茨木霉CECT 2413的4种新丝氨酸蛋白酶P5431（AM294975）、P7129（AM296482）、P8048（AM294978）和P10261（AM294980），属于蛋白酶的S8A亚家族。里氏木霉（T. reesei）基因组计划证实编码不同类型蛋白酶的几种基因的存在（Martinez等人，2008；http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html）。关于prb1基因的同源物编码具有ID 121495的蛋白质。

上述木霉属丝氨酸蛋白酶的表征已暗示为候选生物控制基因和改善的商业生物控制试剂的鉴定铺平了道路。它们在其他生物技术过程中的应用仍未进行研究。康氏木霉（T. koningii）的碱性丝氨酸蛋白酶已暗示可应用于去垢剂工业中，因为与戊二醛的交联导致对于通过去垢剂的抑制有抵抗力的经过广泛范围的温度和pH稳定的酶制剂（Manonmani和Joseph，1993）。然而，由于其85 kDa的高分子量，该酶不同于Prb1型蛋白酶。木霉属物种例如里氏木霉QM9414已知还分泌家族S1的胰蛋白酶样蛋白酶，具有25 kDa的分子量和7.3的pI，以及在pH 8和50℃的最大限度活性（Dienes等人，2007）。EP 1347045 A1公开了来自哈茨木霉的家族S1丝氨酸蛋白酶。来自里氏木霉QM6a的酸性蛋白酶NSP24和NSP25的核酸和氨基酸序列已公开于WO2006073839中。重组产生的NSP24具有例如在食物和饲料的制备中和在去垢剂中的效用。

此外，来自真菌物种例如麦轴梗霉属（Tritirachium）和耳霉属（Conidiobolus）的碱性蛋白酶已得到报道（在Anwar和Saleemuddin，1998中综述）。

社会经济攻击和政府管理机构已迫使去垢剂工业考虑许多环境方面，不仅包括更温和的化学制品的使用，还包括节能的需要，所述更温和的化学制品可以以较少量使用且因此留下更少的环境废物痕迹。去垢剂酶特别是蛋白酶是去垢剂组合物中的重要成分。通过减少洗涤温度节约能量的需要和不能耐受高温的合成纤维的增加使用以及目前生活方式已改变了消费者习惯，且产生了关于在低温有效的新酶的需求。

尽管许多专利申请、综述和论文已得到公开的事实，其中公开了来自多种微生物的丝氨酸蛋白酶，例如来自放线菌达松维尔拟诺卡氏菌（Nocardiopsis dassonvillei）（EP 0290567，Novo Nordisk A/S，DK）和真菌马昆德拟青霉（Paecilomyces marquandii）（EP 0290569，Novo Nordisk A/S，DK）的低温碱性蛋白酶以及冷耐受的木霉属分离物的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶样活性（Antal等人，2000），但仍非常需要可替代的丝氨酸蛋白酶，其特别在低温或中等温度范围中适合和有效修饰、降解且去除蛋白质性质的材料，并且在具有高度不同性质的去垢剂的存在下是稳定的。

去垢剂工业在使其新产品适应消费者的习惯和需要、新纺织产品和新洗衣机的性质方面做出极大进步。为了满足去垢剂工业和政府管理机构的所有不同需求，用于去垢剂组合物的新丝氨酸蛋白酶成分应能够完成其在宽pH和温度范围中的任务，且在包括与多种不同去垢剂组合的机械和化学干预的多种条件下保持稳定。还希望丝氨酸蛋白酶可以以高量产生，这可以通过容易从发酵肉汤和菌丝体分离进行成本有效地下游加工。

发明概述

本发明的目的是提供真菌起源的丝氨酸蛋白酶，其显示广泛底物特异性，在广泛pH范围是活性的并且具有广泛最适温度，即在低和中等温度起作用。用于洗衣和餐具去垢剂的丝氨酸蛋白酶在去垢剂的存在下也必须是稳定的或必须与去垢剂相容的。特别地，本发明的目的是提供丝氨酸蛋白酶，这能够在比现有商业酶制剂更低的温度有效去除蛋白质性质的材料，包括在洗涤衣服和餐具中的污物，从而节约能量。真菌丝氨酸蛋白酶可以在高得率真菌宿主及其下游加工例如易于执行发酵肉汤和菌丝体的分离中产生。

本发明涉及在低温或中等温度范围在蛋白质性质的材料的修饰、降解或去除中可应用的真菌丝氨酸蛋白酶。该酶具有丝氨酸蛋白酶活性，并且包含如SEQ ID NO:10中定义的成熟Tr Prb1酶或其具有相似性质的变体的氨基酸序列。优选地，该酶可作为去垢剂添加剂应用。

本发明的酶可得自丝状真菌木霉属，更优选得自里氏木霉，最优选得自里氏木霉QM6a菌株（ATCC 13631、CBS 383.78、IMI 192654、IMI 45548和T.V. B117）。优选地，该酶具有丝氨酸蛋白酶活性，且包含如SEQ ID NO:10中定义的成熟Tr Prb1酶的氨基酸序列。

本发明的酶具有25 - 35 kDa的分子量。该酶在pH 9具有在30℃ - 70℃范围的最适温度。所述酶在50℃具有在至少pH 6 – pH 11的pH范围的最适pH。使用15分钟反应时间和酪蛋白作为底物测定最适温度和pH。本发明的丝氨酸蛋白酶能够在10℃ - 60℃在去垢剂的存在下修饰、降解或去除蛋白质性质的污物。

所述酶由分离的多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列编码包含如SEQ ID NO:10中定义的成熟Tr Prb1酶的氨基酸序列的多肽。优选地，所述成熟酶由包含核苷酸序列SEQ ID NO:9的分离的核酸分子编码。

本发明的真菌丝氨酸蛋白酶由在质粒pALK2650中包括的分离的多核苷酸序列编码，所述质粒pALK2650包含在保藏于登记号DSM 22635下大肠杆菌（E. coli）RF8052中的核苷酸序列SEQ ID NO:5。质粒pALK2650包含编码全长真菌丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列。

真菌丝氨酸蛋白酶由包含核酸分子的重组表达载体产生，所述核酸分子编码与调节序列可操作地连接的本发明的真菌丝氨酸蛋白酶，所述调节序列能够指导丝氨酸蛋白酶编码基因在合适宿主中的表达。合适的宿主包括异源宿主，优选木霉属、曲霉属（Aspergillus）、镰刀菌属、腐质霉属（Humicola）、金孢属（Chrysosporium）、链孢霉属（Neurospora）、根霉属（Rhizopus）、青霉属（Penicillium）和被孢霉属（MortiriellaMortierella）的微生物宿主。

优选地所述酶在木霉属或曲霉属中，最优选在里氏木霉中产生。

本发明还涉及选自下述的编码真菌丝氨酸蛋白酶的分离的核酸分子，所述酶在低温或中等温度范围在蛋白质性质的材料的修饰、降解或去除中可应用：

（a）编码具有丝氨酸蛋白酶活性且包含如SEQ ID NO:10中所述的氨基酸序列的多肽或其具有相似性质的变体的核酸分子；

（b）包含如SEQ ID NO:9中所述的多核苷酸序列的核酸分子；

（c）包含在DSM 22635中含有的多核苷酸序列SEQ ID NO:5的编码序列的核酸分子；

（d）由于遗传密码的简并性，其多核苷酸序列不同于（b）或（c）的核酸分子的多核苷酸序列的核酸分子。

本发明进一步涉及包含与调节序列可操作地连接的本发明的核苷酸序列的重组表达载体，所述调节序列能够指导所述丝氨酸蛋白酶编码基因在合适宿主中的表达。

本发明还涉及包含如上所述的重组表达载体的宿主细胞。优选地，宿主细胞是微生物宿主，例如丝状真菌。优选宿主是木霉属、曲霉属、镰刀菌属、腐质霉属、金孢属、链孢霉属、根霉属、青霉属和被孢霉属。宿主对于本发明的核苷酸序列可以是同源或异源的。

本发明涉及产生具有丝氨酸蛋白酶活性的本发明多肽的方法，所述方法包括培养本发明的宿主细胞且回收多肽的步骤。还在本发明内的是由本发明的核酸序列编码的具有丝氨酸蛋白酶活性且可通过上述方法获得的多肽。

本发明涉及用于获得酶制剂的方法，其包括培养本发明的宿主细胞和从细胞中回收本发明的多肽或使细胞与培养基分离且获得上清液的步骤。还在本发明内的是可通过上述方法获得的酶制剂。

本发明涉及包含本发明的丝氨酸蛋白酶的酶制剂。

本发明的酶制剂可以进一步包含具有或不具有媒介剂（mediator）的选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、果胶酶或氧化酶的其他酶，以及选自下述的合适添加剂：稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、漂白剂、媒介剂、防蚀剂、助洗剂、抗再沉积剂、荧光增白剂、染料、色素、腐蚀剂、研磨剂和防腐剂等。

生产宿主的耗尽培养基可以像这样使用，或可以去除宿主细胞，和/或可以将它浓缩、过滤或分馏。它还可以进行干燥。本发明的酶制剂可以以液体、粉末或颗粒的形式。

还在本发明内的是本发明的丝氨酸蛋白酶或酶制剂用于去垢剂、用于处理纤维、用于处理羊毛、用于处理毛发、用于处理皮革、用于处理食物或饲料、或用于涉及蛋白质性质的材料的修饰、降解或去除的任何应用的用途。特别地，酶或酶制剂用作去垢剂液体和去垢剂粉末中的去垢剂添加剂。

附图说明

图1显示了里氏木霉QM6a prb1（Tr prb1）基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。假定的信号肽以小写字母示且是有下划线的。假定的前导序列和前导序列的推导的氨基酸以小写字母示。成熟的核苷酸序列以大写字母示。内含子序列以小写、斜体字母示且通过核苷酸序列下的虚线标记。终止密码子由序列下的星号显示。

图1A显示了从ATG起始密码子到TCC密码子（核苷酸1 – 1200）的Tr prb1基因的核苷酸序列，编码Tr Prb1蛋白质的Met1到Ser353的氨基酸序列的序列区域。

图1B显示了从ATG起始密码子到TAA密码子（核苷酸1201 - 1371）的Tr prb1基因的核苷酸序列，编码Tr Prb1蛋白质的Met354到Ala409的氨基酸序列的序列区域。

图2显示了禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）ALKO1726 Fg prtS8A基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。通过SignalP V3.0程序分析的假定的信号肽以小写字母示且是有下划线的。假定的前导序列和前导序列的推导的氨基酸以小写字母示。成熟的核苷酸序列以大写字母示。假定的内含子序列的位置以小写、斜体字母示且通过核苷酸序列下的虚线标记。终止密码子由序列下的星号显示。

图2A显示了从核苷酸1到1140的Fg prt8A基因的核苷酸序列，编码Fg_ALKO1726蛋白质的Met1到Val361的氨基酸序列的序列区域。

图2B显示了从核苷酸1141 到1292的Fg prt8A基因的核苷酸序列，编码Fg_ALKO1726蛋白质的Ala 362到Thr411的氨基酸序列的序列区域。

图3示意性显示了用于在里氏木霉中过表达Tr prb1基因的表达盒（来自pALK2701的8762 bp NotI片段）。显示了在表达盒中用于将prb1基因的3'末端与cbh1终止子融合的接头和限制位点的选择的位置。

图4示意性显示了用于在里氏木霉中表达Fg prtS8A基因的表达盒（来自pALK2708的8683 bp NotI片段）。显示了在表达盒中用于将prb1基因的3'末端与cbh1终止子融合的接头和限制位点的选择的位置。

图5描述了使用15分钟反应时间和酪蛋白作为底物在pH 9测定的里氏木霉Prb1（Tr Prb1）和禾谷镰刀菌（F. graminearum）Fg_ALKO1726重组蛋白质的温度曲线图。数据点是3次分开测量的平均值。

图5A显示了来自Tr Prb1测定的结果。

图5B显示了来自Fg_ALKO1726测定的结果。

图6描述了pH对重组Tr Prb1和Fg_ALKO1726蛋白质的活性的作用。使用的缓冲液是40 mM Britton-Robinson缓冲液，酪蛋白用作底物，反应时间是15分钟，并且反应温度是50℃。数据点是3次分开测量的平均值。

图6A显示了来自Tr Prb1测定的结果。

图6B显示了来自Fg_ALKO1726测定的结果。

图7描述了在不同温度（pH 9，60分钟），重组蛋白质Tr Prb1和Fg_ALKO1729对于血/乳/墨污物（Art 117，EMPA）的性能。商业制剂Savinase Ultra? 16L（Novozymes A/S，DK）、Purafect? 4000L（Genencor Inc.，USA）和Properase? 4000E（Genencor Inc.，USA）用于比较。ΔL*（deltaL*）= 酶处理的织物的亮度值L* - 仅用缓冲液（酶空白对照）处理的织物的亮度值L*。

图7A显示了在10℃重组蛋白质Tr Prb1和商业蛋白酶制剂的性能。

图7B显示了在20℃重组蛋白质Tr Prb1和Fg_ALKO1729以及商业蛋白酶制剂的性能。

图7C显示了在30℃重组蛋白质Tr Prb1和Fg_ALKO1729以及商业蛋白酶制剂的性能。

图7D显示了在40℃重组蛋白质Tr Prb1和Fg_ALKO1729以及商业蛋白酶制剂的性能。

图7E显示了在50℃重组蛋白质Tr Prb1和商业蛋白酶制剂的性能。

图7F显示了在60℃重组蛋白质Tr Prb1和商业蛋白酶制剂的性能。

图8显示了在30℃重组蛋白质Tr Prb1和Fg_ALKO1729连同不同液体去垢剂对于血/乳/墨污物（Art 117，EMPA）的性能。商业制剂以及Properase? 4000E（Genencor Inc.，USA）、Purafect? 4000L和Savinase? Ultra 16L用于比较。ΔL*（deltaL*）= 酶处理的织物的亮度值L* - 不用酶处理的织物的亮度值L*。

图8A显示了连同以3.3 g/l的浓度和pH约7.9的Ariel sensitive（Procter & Gamble，UK）的性能。

图8B显示了连同以3.3 g/l的浓度和pH约8.2的Erisan（Farmos，Finland）的性能。

图9显示了在30℃连同以不同去垢剂浓度的用于彩色织物的液体基础去垢剂（Liquid Base detergent）（表2）以及在10℃和20℃连同去垢剂浓度3,3 g/l，重组蛋白质Tr Prb1和Fg_ALKO1729对于血/乳/墨污物（Art 117，EMPA）的性能。商业制剂Properase? 4000E、Purafect? 4000L和Savinase? Ultra 16L用于比较。ΔL*（deltaL*）= 酶处理的织物的亮度值L* - 不用酶处理的织物的亮度值L*。

图9A显示了在30℃连同以5 g/l的浓度和pH约7.5的液体基础去垢剂的性能。

图9B显示了在30℃连同以3.3 g/l的浓度和pH约7.4的液体基础去垢剂的性能。

图9C显示了在30℃连同以1 g/l的浓度和pH约7.3的液体基础去垢剂的性能。

图9D显示了在20℃连同以3.3 g/l的浓度的液体基础去垢剂的性能。

图9E显示了在10℃连同以3.3 g/l的浓度的液体基础去垢剂的性能。

图10描述了在40 - 50℃和pH约10在去垢剂粉末（Art. 601，EMPA）的存在下，重组蛋白质Tr Prb1和Fg_ALKO1729对于血/乳/墨污物（Art 117，EMPA）的性能。商业制剂Purafect? 4000L和Properase? 4000E用于比较。ΔL*（deltaL*）= 酶处理的织物的亮度值L* - 不用酶处理的织物的亮度值L*。

图10A显示了在40℃的性能。

图10B显示了在50℃的性能。

图11描述了在30℃具有15分钟洗涤时间的满刻度试验（full-scale trials）中，重组蛋白质Tr Prb1和用于彩色织物的液体基础去垢剂对于不同污物（来自EMPA和CFT）的性能。商业制剂Purafect? 4000L用于比较。ΔL*（deltaL*）= 酶处理的织物的亮度值L* - 不用酶处理的织物的亮度值L*。

图11A显示了对血/乳/墨/PE+CO（Art. 117，EMPA）的性能。

图11B显示了对血/乳/墨/PE+CO（Art. 116，EMPA）的性能。

图11C显示了对血/乳/墨/PE+CO（CFT/ PC-05-014）的性能。

图11D显示了对血/乳/墨/ CO（CFT/ C-05-059b）的性能。

图11E显示了对可可（Art. 112，EMPA）的性能。

图11F显示了对巧克力/乳/色素（CFT/C-03-030）的性能。

图11G显示了对落花生油/乳（CFT/C-10-186b）的性能。

图11H显示了对草（CFT/CS-08-069）的性能。

图11I显示了对蛋黄/色素（CFT/CS-38-010）的性能。

图12描述了当酶剂量作为蛋白质的量计算时，在30℃具有15分钟洗涤时间的满刻度试验中，重组蛋白质Tr Prb1和用于彩色织物的液体基础去垢剂对于不同污物的性能。商业制剂Purafect? 4000L用于比较。ΔL*（deltaL*）= 酶处理的织物的亮度值L* - 不用酶处理的织物的亮度值L*。

图12A显示了对血/乳/墨/PE+CO（Art. 117，EMPA）的性能。

图12B显示了对草（CFT/CS-08-069）的性能。

序列表

SEQ ID NO:1用于克隆编码Prb1蛋白酶（根据Joint Genome Institute里氏木霉基因组，v. 2.0的蛋白质ID 121495）的里氏木霉QM6a prb1基因和用于将其与cbh1启动子融合（确切融合）的5′-PCR引物PRO213的序列。

SEQ ID NO:2 用于克隆编码Prb1蛋白酶（根据Joint Genome Institute里氏木霉基因组，v. 2.0的蛋白质ID 121495）的里氏木霉QM6a prb1基因和用于将其与cbh1终止子融合（经由接头）的3′-PCR引物PRO214的序列。

SEQ ID NO:3 用于克隆禾谷镰刀菌ALKO1726蛋白酶和用于将其与cbh1启动子融合（确切融合）的5′-PCR引物PRO245的序列。

SEQ ID NO:4 用于克隆禾谷镰刀菌ALKO1726蛋白酶和用于将其与cbh1终止子融合（经由接头）的3′-PCR引物PRO246的序列。

SEQ ID NO:5 编码Prb1蛋白酶（ID 121495）的全长里氏木霉QM6a蛋白酶基因prb1（Tr prb1）的核苷酸序列。

SEQ ID NO:6 全长里氏木霉QM6a蛋白酶Prb1（Tr Prb1）的推导的氨基酸序列，包括从Met1到Ala409的氨基酸。

SEQ ID NO:7 编码前酶形式的里氏木霉Prb1蛋白酶的氨基酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO:8 前酶形式的里氏木霉Prb1蛋白酶的氨基酸序列，包括全长蛋白酶的氨基酸Ala21到Ala 409。

SEQ ID NO:9 编码成熟形式的里氏木霉Prb1蛋白酶的氨基酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO:10 成熟形式的里氏木霉Prb1蛋白酶的氨基酸序列，包括全长酶的氨基酸Ala121到Ala409。

SEQ ID NO:11 全长禾谷镰刀菌ALKO1726蛋白酶基因Fg prtS8A的核苷酸序列。

SEQ ID NO:12 全长禾谷镰刀菌ALKO1726蛋白酶（Fg_ALKO1726）的推导的氨基酸序列，包括从Met1到Thr411的氨基酸。

SEQ ID NO:13 编码前酶形式的禾谷镰刀菌ALKO1726蛋白酶的氨基酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO:14 前酶形式的禾谷镰刀菌ALKO1726蛋白酶的氨基酸序列，包括全长蛋白酶的氨基酸Ala21到Thr411。

SEQ ID NO:15 编码成熟形式的禾谷镰刀菌ALKO1726蛋白酶的氨基酸序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO:16 成熟形式的禾谷镰刀菌ALKO1726蛋白酶的氨基酸序列，包括全长酶的氨基酸Ala123到Thr411。

保藏

禾谷镰刀菌ALKO1726于2009年6月3日保藏于在Uppsalalaan 8，3508 AD，Utrecht，荷兰的Centraalbureau Voor Schimmelcultures，并且指定登记号CBS 124697。

包括质粒pALK2650的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）菌株RF8052于2009年6月3日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSMZ），Inhoffenstrasse 7 B，D-38124 Braunschweig，德国，并且指定登记号DSM 22635。

包括质粒pALK2707的大肠埃希氏菌菌株RF8098于2009年6月3日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSMZ），Inhoffenstrasse 7 B，D-38124 Braunschweig，德国，并且指定登记号DSM 22636。

发明详述

本发明提供了真菌起源的丝氨酸蛋白酶，所述蛋白酶显示广泛底物特异性，在广泛pH范围是活性的并且具有广泛最适温度，即在低和中等温度的良好性能。该酶对于去垢剂应用是理想的，经得住一般的去垢剂组合物并且在去垢剂溶液中以低酶水平是有效的。特别地，丝氨酸蛋白酶在低温即使在或低于10℃是有活性的，优选范围是10℃ - 60℃。因此，本发明提供了用于在希望在低温或中等温度范围具有性能的去垢剂和其他工业应用中使用的可替代丝氨酸蛋白酶。真菌丝氨酸蛋白酶可以在高得率真菌宿主及其下游加工例如易于执行发酵肉汤和菌丝体的分离中产生。

“丝氨酸蛋白酶”或“丝氨酸内肽酶”或“丝氨酸内蛋白酶”与本发明结合意指由国际生物化学和分子生物学联盟命名法（Nomenclature of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology）分类为EC 3.4.21的酶。丝氨酸蛋白酶在单细胞和复杂生物中发现。基于其结构相似性，丝氨酸蛋白酶已分组成至少6个异种集团（clans）（SA、SB、SC、SE、SF和SG；S表示丝氨酸蛋白酶），这已进一步再分组成具有相似氨基酸序列和三维结构的家族和亚家族（参见例如在http://www.biochem.wustl.edu/~protease/，Department of Biochemistry and Molecular Biophysics，Washington University of Medicine，St. Louis，MO，USA的丝氨酸蛋白酶主页）。这些蛋白质水解或降解酶的特征在于在其活性位点中亲核丝氨酸基团的存在，并且主要异种集团SA和SB的蛋白酶也通过具有必需天冬氨酸盐和组氨酸残基区分，所述必需天冬氨酸盐和组氨酸残基连同丝氨酸一起形成催化三分子。该酶靶向多肽链的不同区域，基于切割位点周围的氨基酸残基。

本发明的丝氨酸蛋白酶属于由“枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶”或“枯草杆菌酶”组成的异种集团SB，家族8。由多个芽孢杆菌属物种如解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquifaciens）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）和枯草芽孢杆菌（B. subtilis）代表的这类丝氨酸蛋白酶对于芳香族或疏水残基例如酪氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸是特异性的。

如本发明中使用的，术语“丝氨酸蛋白酶活性”意指对于含蛋白质底物的水解活性，所述底物例如酪蛋白、血红蛋白、角蛋白和牛血清清蛋白（BSA）。用于分析蛋白水解活性的方法是文献中众所周知的，并且例如在Gupta等人（2002）中提及。

蛋白酶可以使用组特异性抑制剂进行分类。“丝氨酸蛋白酶抑制剂”的不同组包括合成化学抑制剂和天然蛋白质性质的抑制剂。一组天然抑制剂是舍平类（serpins）（由丝氨酸蛋白酶抑制剂缩写），例如抗凝血酶和α1-抗胰蛋白酶。人工合成抑制剂包括3,4-二氯异香豆素（3,4-DCI）、二异丙基氟磷酸（DFP）、苯甲磺酰基氟化物（PMSF）和甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮（TLCK）。由于接近活性位点的半胱氨酸残基的存在，某些丝氨酸蛋白酶受硫醇试剂例如对氯汞苯甲酸（PCMB）抑制。因此，丝氨酸蛋白酶活性可以在合适条件下在基于特异性底物的切割的测定中或在使用任何含蛋白质底物连同或不连同丝氨酸蛋白酶的特异性抑制剂的测定中进行测定。

丝氨酸蛋白酶以前原酶的形式作为失活的“酶原前体”或“酶原”合成，所述前原酶通过信号序列（分泌信号肽或前肽）和前导序列（原肽）的去除得到活化，以获得活性成熟形式的酶（Chen和Inouye，2008）。这种活化过程涉及蛋白酶的作用，并且可以起因于丝氨酸蛋白酶的有限自消化或自动催化的加工。前导序列可以例如在生产的翻译后阶段过程中或在耗尽培养基中或在培养基或酶制剂的贮存过程中进行切割。前酶的活化还可以通过将蛋白水解酶（其能够将失活的前酶转换成活性成熟酶）加入在其中培养宿主生物的培养基内，或在培养过程后将蛋白水解酶加入培养上清液中来达到。酶的缩短还可以例如通过在将其转化至生产宿主前截短编码多肽的基因来达到。

术语“成熟的”意指在信号序列和原肽去除后包含酶促或催化活性必需的氨基酸的酶形式。在丝状真菌中，它是分泌到培养基内的天然形式。

能够产生蛋白酶活性的微生物菌株可以在不同底物上进行筛选。所选菌株可以在合适培养基上培养，以产生足够量的目的丝氨酸蛋白酶用于分离或纯化及其性质的进一步表征。可替代地，可以分离多种生物中编码丝氨酸蛋白酶的基因，并且由所述基因编码的氨基酸序列可以与本文实施例中分离且表征的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列比较。

本发明的丝氨酸蛋白酶可以衍生自真菌，包括丝状真菌和酵母，例如衍生自木霉属。由于容易下游加工以产生无微生物的酶或酶组合物，真菌碱性蛋白酶比细菌蛋白酶有利。在酶纯化前菌丝体可以通过过滤技术容易地去除。

天然或重组丝氨酸蛋白酶可以使用酶化学的常规方法进行纯化，例如盐制备、超滤、离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤和疏水作用层析。纯化可以通过蛋白质测定、酶活性测定和通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行监控。可以测定纯化的酶在多个温度和pH值的酶活性和稳定性以及分子量和等电点。

2种重组丝氨酸蛋白酶的纯化已在实施例3中得到证实。将里氏木霉QM6a和禾谷镰刀菌ALKO1726的过滤和脱盐的培养上清液应用于Q Sepharose FF柱。将流出的级分（flow-through fractions）应用于Superdex 75 10/300 GL柱。纯化随后为对酪蛋白的活性测定，如实施例2c和8中所述。天然地，可能通过使用其他已知纯化法代替或加上本文描述的方法分离本发明的酶。如实施例3中所述，重组丝氨酸蛋白酶用于表征pH和温度曲线图。

最适pH的测定可以通过跟踪对蛋白质底物的活性在合适缓冲液中在不同pH值执行。丝氨酸蛋白酶一般在中性或碱性pH是活性的，最适值在pH 7 - 11之间，并且具有广泛的底物特异性。“碱性丝氨酸蛋白酶”意指在pH 9 - pH 11或甚至在pH 10 - 12.5是活性和稳定（Shimogaki等人，1991），且具有约pH 9的等电点的酶。

丝氨酸蛋白酶的最适温度可以如实施例2c、3或8中所述通过使用酪蛋白作为底物在合适缓冲液中在不同温度或通过使用文献（Gupta等人，2002）中所述的其他底物和缓冲***进行测定。天然丝氨酸蛋白酶的最适温度是约60℃（Rao等人，1998）。

通过在由聚丙烯酰胺、淀粉或琼脂糖组成的固定的pH梯度凝胶上的等电点聚焦，或例如通过使用在ExPASy服务器上的pI/MW工具（http://expasy.org/tools/pi_tool.html；Gasteiger等人，2003）通过由氨基酸序列估计pI，可以测定pI。

纯化的丝氨酸蛋白酶的分子量可以根据Laemmli（1970）通过质谱法或在SDS-PAGE上进行测定。分子量还可以由酶的氨基酸序列进行预测。成熟的丝氨酸蛋白酶或成熟的丝氨酸蛋白酶一般具有20 - 35 kDa的分子量，一般为约25 - 30 kDa（Rao等人，1998）。纯化的蛋白酶以及内部肽的N末端可以根据埃德曼（Edman）降解化学（Edman和Begg，1967）或通过文献中描述的其他方法进行测序。

蛋白酶活性一般基于可溶性底物的降解。在去垢剂应用中，蛋白酶必须对至少部分不溶性的物质发生作用。因此，关于去垢剂蛋白酶的重要参数是吸附至且水解这些不溶性片段的能力。

关于去垢剂蛋白酶选择的另一个重要参数是等电点或pI值。当它在其中工作的去垢剂溶液的pH值与关于酶的pI值大约相同时，去垢剂蛋白酶性能最佳。

在本发明中，“在去垢剂的存在下的良好性能”意指酶或包含所述酶在这种情况下本发明的真菌丝氨酸蛋白酶的制剂，在比目前用于销售的许多商业枯草杆菌蛋白酶低的温度范围起作用。换言之，“良好性能”意指该酶能够在低至中等温度范围修饰、降解或去除蛋白质性质的污物或材料，但在比现有商业产品更低的温度范围（10-30℃）具有特别良好的性能，所述现有商业产品例如商业酶产品Purafect? 4000L（Genencor Inc.，USA）或Savinase?（Novozymes A/S，DK）。例如，通过修饰pH，选择具有合适性质的去垢剂，包括酶保护试剂和通过控制洗涤条件，本发明的丝氨酸蛋白酶的活性可以在低至10℃的温度得到维持。

表达“去垢剂”用于意指预期帮助清洁或具有清洁性质的物质或材料。术语“去垢力”指示清洁性质的存在或程度。清洁性质的程度可以在与固体、水不溶性载体例如纺织品纤维或玻璃结合的不同蛋白质性质或含蛋白质的底物材料或污物或污物混合物上进行测试。一般的“蛋白质性质的材料”包括血、乳、墨、蛋、草和沙司。对于测试目的，蛋白质性质的污物的混合物是商购可得的。去垢剂酶的功能是降解且去除含蛋白质污物。测试结果取决于在洗涤测试中使用的污物的类型，去垢剂的组成以及纺织品的性质和状态（Maurer，2004）。

在本申请的上下文中的术语“低温”意指10℃ - 30℃的温度范围，这根据实验对于许多目前可获得的酶制剂特别是去垢剂酶制剂的性能不是最佳的。术语“中等温度”意指30℃ - 60℃的温度范围。

术语“在低温或中等温度范围可应用的”包括其中希望该酶在低温或中等温度范围（10℃ - 60℃）有效起作用的工业应用。此类应用包括其在食物、饲料和皮革工业、药物、诊断学、废物管理和银回收中的用途。如本文意指的，这些应用排除本发明的丝氨酸蛋白酶作为植物致病性真菌和线虫的生物防治中的生物控制试剂的用途。

根据本发明的一个优选实施方案，真菌丝氨酸蛋白酶是在其中希望酶在低温或中等温度的性能的应用中，在蛋白质性质的材料的修饰、降解或去除中可应用或有用的多肽。所述真菌丝氨酸蛋白酶具有丝氨酸蛋白酶活性，并且包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:10的Tr Prb1的成熟酶，并且能够在低温或中等温度修饰、降解或去除含蛋白质材料。成熟的酶缺乏信号序列或前肽和前导序列或原肽。本发明的成熟丝氨酸蛋白酶包括特征在于SEQ ID NO:6的全长蛋白酶的氨基酸Ala121到Ala409。因此，在本发明的范围内的还是具有SEQ ID NO:6的全长Tr Prb1酶，包括信号序列（前肽）和原肽和成熟酶以及缺乏信号序列（前肽）但包括原肽和成熟酶的前酶，从而具有SEQ ID NO:8。

氨基酸序列SEQ ID NO:10的天然变体也包括在本发明的上下文中。这些变体包括在氨基酸序列中的较小变化，例如由于在异源宿主生物中生产蛋白质，这可以引起由于缺少、置换、***、添加或其组合在氨基酸序列中的一个或多个位置中的变化。然而，这些变异不改变分子的生物学功能。因此，变体在性质中即在特征和活性中类似于具有氨基酸序列SEQ ID NO:10的丝氨酸蛋白酶。

术语“同一性”在此处意指在具有大约相同量的氨基酸的相应序列区域内2个氨基酸序列彼此比较的同一性。例如，可以比较2个氨基酸序列的全长或成熟序列的同一性。序列的同一性可以通过使用ClustalW比对（例如在www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw中）进行测量，使用矩阵：BLOSUM，缺口开放:10，缺口延伸：0.5。2个序列的同一性很高，优选至少94％、优选至少95％、更优选96％、更优选97％、更加优选98％且最优选99％。

优选地，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶可作为去垢剂添加剂应用。

本发明的丝氨酸蛋白酶命名为Tr Prb1，源于木霉属，更优选源于里氏木霉，最优选源于里氏木霉QM6a菌株（ATCC 13631、CBS 383.78、IMI 192654、IMI 45548和T.V. B117）的分离的丝氨酸蛋白酶，并且是丝氨酸内蛋白酶的异种集团SB，家族8的成员。

本发明的一个优选实施方案是真菌丝氨酸蛋白酶，其具有丝氨酸蛋白酶活性，并且包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:10的Tr Prb1的成熟酶。

本发明涉及真菌丝氨酸蛋白酶，其成熟形式具有20 - 35 kDa的分子量（molecular mass）或分子量（molecular weight），优选25 - 33 kDa、更优选28 - 30 kDa。最优选的MW是通过使用在ExPASy服务器上的Compute pI/MW工具获得的关于成熟多肽为29 kDa的Tr Prb1的预测分子量（Gasteiger等人，2003）。

本发明的酶在广泛温度范围降解蛋白质性质的材料方面是有效的。如实施例3中所述，当使用15分钟反应时间和酪蛋白作为底物在pH 9测量时，该酶的最适温度是30℃ - 70℃（约20％的最大限度活性），优选40℃ - 60℃（至少约40％的最大限度活性），且更优选50℃ - 60℃（至少70％的最大限度活性），最优选在50℃（Tr Prb1的最大限度活性）。

根据本发明的一个优选实施方案，真菌丝氨酸蛋白酶具有在至少pH 6 – pH 11的pH范围的最适pH，如实施例2c和实施例3或8中所述使用15分钟反应时间和酪蛋白作为底物，显示在pH 6 - pH 10的pH范围时超过20％的最大限度活性。特别地，最适pH是pH 6 - pH 10（至少约90％的最大限度活性）。

本发明的真菌丝氨酸蛋白酶在去垢剂的存在下具有良好性能，即在去垢剂的存在下在低（10℃ - 30℃）至中等温度（30℃ - 60℃）范围能够修饰、降解或去除蛋白质性质的污物或材料，特别是在比现有商业产品更低的温度范围，所述现有商业产品例如商业酶产品Purafect? 4000L和Properase? 4000E（Genencor Inc.，USA）以及Savinase?（Novozyme A/S，DK）。取决于洗涤条件和在去垢剂中的辅助成分和添加剂，本发明的酶在10℃ - 60℃之间，优选在或低于50℃起作用。Tr Prb1酶也在或低于45℃、在或低于40℃、在或低于35℃、在或低于30℃、在或低于25℃、在或低于20℃、在或低于15℃、或在或低于10℃的温度中起作用。

在去垢剂的存在下，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶如上定义的在10℃ - 60℃起作用，并且特别地，所述真菌丝氨酸蛋白酶Tr Prb1在≤30℃在去垢剂中具有良好性能。在实施例5 – 7中，描述了比较实验，并且根据图7 – 12，显而易见的是在多种条件和暴露于多种处理中，真菌丝氨酸蛋白酶Tr Prb1对于测量为deltaL*的在不同纺织品材料上的大量不同污物的性能，比商业产品Savinase? Ultra 16L（Novozymes A/S，DK）、Properase? 4000E和Purafect? 4000L（Genencor Inc，USA）的性能好得多。根据制造商，Properase?是适合于低温洗涤条件的碱性蛋白酶。

根据所述实验结果，可以得出结论本发明的真菌丝氨酸蛋白酶能够满足去垢剂消费者以及去垢剂工业和提供洗涤机器的工业的非常不同的需求，并且非常适合于未来管理机构和消费者习惯的要求。

本发明的丝氨酸蛋白酶具有pI，其如由推导的氨基酸序列预测的在pI 8.7 - pI 9.4之间，优选在pI 8.8 - pI 9.3之间。本发明的Tr Prb1酶的预测pI是pI 8.9。

根据一个优选实施方案，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶由分离的核酸分子编码，所述分离的核酸分子编码包含特征在于SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽或其具有相似性质的变体。

编码本发明的丝氨酸蛋白酶的cDNA或基因组基因的分离可以使用PCR和引物执行，所述引物基于同源丝氨酸蛋白酶的已知核苷酸或氨基酸序列设计。此外，在纯化酶的N末端或胰蛋白酶肽的氨基酸序列上合成的寡核苷酸或通过使用上述寡核苷酸获得的PCR产物可以用作分离编码本发明的丝氨酸蛋白酶的cDNA或基因组基因中的探针。丝氨酸蛋白酶克隆还可以基于在含有关于酶的特异性底物的板上的活性或通过使用对于丝氨酸蛋白酶特异性的抗体进行筛选。

在本发明中，如实施例1b中所述，使用PCR和根据prb1基因（基因ID 121495）序列设计的引物分离Tr prb1基因，所述prb1基因序列由DOE Joint Genome Institute（里氏木霉QM6a基因组序列v2.0，http://genome.jgi-psf.org/cgi-bin/dispGeneModel?db=Trire2&id121495）公开。标准分子生物学方法，例如分子生物学手册中所述的方法，例如Sambrook和Russell，2001，可以用于分离宿主生物的cDNA或基因组DNA。

在使用通过PCR制备的DNA探针分离多核苷酸序列的情况下，通常在“高严格”条件下执行用由超过100-200个核苷酸组成的DNA探针的杂交，即在低于完全杂交物的计算解链温度（Tm）20-25℃的温度杂交，所述Tm根据Bolton和McCarthy（1962）计算。通常地预杂交和杂交至少在65℃在6xSSC（或6xSSPE），5xDenhardt’s试剂，0.5％（w/v）SDS，100 μg/ml变性的、成碎片的鲑精DNA中执行。50％甲酰胺的添加使预杂交和杂交温度降至42℃。洗涤在低盐浓度中例如在2xSSC-0.5％SDS（w/v）中在室温（RT）执行15分钟，随后在2xSSC-0.1％SDS（w/v）中在RT，且最后在0.1xSSC-0.1％SDS（w/v）中至少在65℃。

因此，在本发明的范围内的是多肽序列，其由编码本发明的全长丝氨酸蛋白酶（包括前肽（信号序列）和原肽加上成熟形式的酶）的氨基酸序列的核酸分子编码，，并且所述氨基酸序列的特征在于SEQ ID NO:6。

此外，在本发明的范围内的是多肽序列，其由编码本发明的丝氨酸蛋白酶的原肽（包括原肽加上成熟形式的酶）的核酸分子编码，并且所述氨基酸序列的特征在于SEQ ID NO:8。

本发明的一个优选实施方案是由分离的核酸分子编码的真菌丝氨酸蛋白酶，其包括编码具有SEQ ID NO:9的成熟形式的Tr Prb1丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列。

因此，本发明的Tr Prb1多肽由包含关于酶的“编码序列”的具有核苷酸序列SEQ ID NO:5的核酸分子编码。表达“编码序列”意指这样的核苷酸序列，其从翻译起始密码子（ATG）开始且在翻译终止密码子（TAA、TAG或TGA）停止，并且可以含有内含子序列。翻译的全长多肽通常以甲硫氨酸起始。本发明的真菌丝氨酸蛋白酶还可以由包含核苷酸序列SEQ ID NO:7的核酸分子编码，其编码Tr Prb1前酶形式。

根据本发明的一个优选实施方案，真菌丝氨酸蛋白酶由在质粒pALK2650中包括的分离的多核苷酸序列编码，所述质粒pALK2650包含在大肠杆菌RF8052中的核苷酸序列SEQ ID NO:5，所述大肠杆菌RF8052在登记号DSM 22635下贮存于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（DSMZ）。

本发明的一个实施方案是由包含核酸分子的重组表达载体产生的丝氨酸蛋白酶，所述核酸分子编码与调节序列可操作地连接的如上表征的真菌丝氨酸蛋白酶，所述调节序列能够指导所述丝氨酸蛋白酶编码基因在合适宿主中的表达。所述重组表达载体的构建和所述载体的用途在实施例2中更详细地描述。

用于产生真菌丝氨酸蛋白酶的合适宿主是同源或异源宿主，例如微生物宿主例如细菌、酵母和真菌。由于下游加工和酶产物回收的容易，丝状真菌例如木霉属、曲霉属、镰刀菌属、腐质霉属、金孢属、链孢霉属、根霉属、青霉属和被孢霉属，是优选生产宿主。合适的宿主包括物种例如里氏木霉、黑曲霉（A. niger）、米曲霉（A oryzae）、酱油曲霉（A. sojae）、泡盛曲霉（A. awamori）或日本曲霉（A. japonicus）型菌株，F. venenatum或尖孢镰刀菌，特异腐质霉（H. insolens）或柔毛腐质霉（H. lanuginosa），粗糙链孢霉（N. crassa）和（C. lucknowense），其中某些作为酶生产宿主生物在例如商业酶的AMFEP 2007列表（http://www.amfep.org/list.html）中列出。更优选地，该酶在木霉属或曲霉属的丝状真菌宿主中产生，例如里氏木霉或黑曲霉、米曲霉或泡盛曲霉。根据本发明的最优选实施方案，真菌丝氨酸蛋白酶在里氏木霉中产生。

（b）包含如SEQ ID NO:9中所述的多核苷酸序列的核酸分子；

（d）由于遗传密码的简并性，其多核苷酸序列不同于（b）-（c）的核酸分子的多核苷酸序列的核酸分子。

本发明的核酸分子可以是RNA或DNA，其中所述DNA可以由基因组DNA或cDNA构成。

标准分子生物学方法可以用于编码本发明的真菌丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列的分离和酶处理中，包括基因组和质粒DNA的分离、DNA的消化以产生DNA片段、测序、大肠杆菌转化等。基本方法在分子生物学手册例如Sambrook和Russell，2001中描述。

编码Tr Prb1多肽的全长Tr prb1基因的分离在实施例1中描述。简言之，使用PCR和根据prb1基因（基因ID 121495）序列设计的引物分离基因，所述prb1基因序列由DOE Joint Genome Instritute（里氏木霉QM6a基因组序列v2.0，http://genome.jgi-psf.org/cgi-bin/dispGeneModel?db=Trire2&id121495）公开。全长Tr prb1基因包括在质粒pALK2650中，所述质粒pALK2650保藏于DSMZ培养物保藏中心的登记号DSM 22635的大肠杆菌中。由DNA序列分析丝氨酸蛋白酶的推导的氨基酸序列。

全长里氏木霉丝氨酸蛋白酶Tr prb1的核苷酸序列（SEQ ID NO：5）和推导的序列（SEQ ID NO:6）呈现于图1A-B中。该基因的长度是1371 bp（包括终止密码子）。发现分别具有68和73 bp长度的2个假定内含子。推导的蛋白质序列由409个氨基酸组成，包括20个氨基酸的预测信号序列（SignalP V3.0；Nielsen等人，1997以及Nielsen和Krogh，1998）和从Ala21到Ala121的原肽。预测的分子量对于成熟多肽是29 kDa，并且预测的pI是8.94。使用在ExPASy服务器上的Compute pI/MW工具做出这些预测（Gasteiger等人，2003）。推导的氨基酸序列含有2个可能的N-糖基化位点（Asn252和Asn396），但根据CBS Server NetNGlyc V1.0，仅一个位点Asn252是可能的。使用在NCBI（美国国家生物技术信息中心）的BLASTP程序，版本2.2.21（Altschul等人，1990）搜索与公开的蛋白酶序列的同源性。通过使用ClustalW比对（矩阵：BLOSUM，缺口开放:10，缺口延伸：0.5（例如在www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw中）获得成熟Tr Prb1序列与同源序列的相应区域的同一性值。

本发明的丝氨酸蛋白酶Tr Prb1显示与来自钩状木霉的碱性蛋白酶（AAP15044；Steyaert等人，2004）、来自白腐真菌（Hypocrea lixii）（有性型哈茨木霉；CAL25580；Suarez等人2007）的丝氨酸内肽酶、来自深绿木霉的碱性蛋白酶（ALP_TRIAT；Geremia等人，1993）和来自Hypocrea virens的细胞外丝氨酸蛋白酶Tvsp1（AAO63588；Pozo等人，2004）的最高同源性（92-93％同一性）。Tr Prb1成熟氨基酸序列与ALP蛋白酶（EMBL登记号M87516；Geremia等人1993；在US 60/818,910中公开为SEQ ID No:313（Catalyst Bioscience Inc.））的相应区域的同一性是92％。

因此，在本发明的范围内的是分离的多核苷酸序列或分离的核酸分子，其编码包含特征在于SEQ ID NO：10的成熟形式Tr Prb1酶的氨基酸序列的真菌丝氨酸蛋白酶或多肽，即SEQ ID NO:6的全长丝氨酸蛋白酶的氨基酸Ala121到Ala409。

此外，包括了编码氨基酸序列SEQ ID NO:10的天然变体的分离的多核苷酸序列。这些变体包括在氨基酸序列中的较小变化，例如由于缺少、置换、***、添加或其组合在氨基酸序列中的一个或多个位置中的变化。然而，这些变异不改变分子的生物学功能。因此，变体具有含有氨基酸序列SEQ ID NO:10的丝氨酸蛋白酶的性质，即特征和活性。在2个氨基酸序列之间的同一性可以在具有大约相同量的氨基酸的相应序列区域内彼此比较。例如，可以比较2个氨基酸序列的全长或成熟序列的同一性。序列的同一性可以通过使用ClustalW比对（例如在www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw中）进行测量，使用矩阵：BLOSUM，缺口开放:10，缺口延伸：0.5。2个序列的同一性很高，优选至少94％、优选至少95％、更优选96％、更优选97％、更加优选98％且最优选99％。

分离的多核苷酸序列或分离的核酸分子优选包含如SEQ ID NO:9中定义的多核苷酸序列，即编码SEQ ID NO:10的成熟Tr Prb1的氨基酸序列的多核苷酸序列。

本发明的分离的核酸分子可以是包含DSM 22635中含有的多核苷酸序列SEQ ID NO:5的编码序列的分子，所述DSM 22635携带全长Tr prb1基因的核苷酸序列。

本发明的核酸分子还可以是在上文中表征的核苷酸序列的类似物。“简并性”意指核苷酸序列的类似物，其在一个或多个核苷酸或密码子中不同，但编码本发明的重组蛋白酶。

因此，在本发明的范围内的是分离的核酸分子，其包含如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9中所述的核苷酸序列及其类似物。

根据本发明的一个优选实施方案，分离的核酸分子编码用于作为去垢剂添加剂使用的真菌丝氨酸蛋白酶。

本发明还涉及重组表达载体或重组表达构建体，其可以用于在合适原核或真核宿主中繁殖或表达编码所选丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列。重组表达载体包含可操作地连接编码所述丝氨酸蛋白酶的多核苷酸序列的DNA或核酸序列，其促进或指导丝氨酸蛋白酶编码序列在合适宿主中的表达和分泌，例如启动子、增强子、终止子（包括转录和翻译终止信号）和信号序列。表达载体可以进一步包含用于选择转化菌株的标记基因，或可以通过共转化将在另一个载体构建体中的选择标记引入宿主。所述调节序列对于生产生物可以是同源或异源的，或它们可以源于由其分离编码丝氨酸蛋白酶的基因的生物。

用于在丝状真菌宿主中表达本发明的丝氨酸蛋白酶的启动子的例子是米曲霉TAKA淀粉酶的启动子、碱性蛋白酶ALP和磷酸丙糖异构酶、Rhizopus miehei脂肪酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶（glaA）、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶、Chrysosporium lucknowense纤维二糖水解酶1启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I（Cel7A）等。

在酵母中，例如酿酒酵母（S. cerevisiae）烯醇酶（ENO-1）、半乳糖激酶（GAL1）、醇脱氢酶（ADH2）和3-磷酸甘油酯激酶的启动子可以用于提供表达。

用于指导本发明的丝氨酸蛋白酶在细菌宿主中的转录的启动子序列的例子是大肠埃希氏菌的lac操纵子的启动子、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）琼脂糖酶dagA启动子、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因（amyL）的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌（B. stearothermophilus）生麦芽糖淀粉酶基因（amyM）的启动子、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子等。

合适的终止子包括上述基因的那些或在宿主菌株中起作用的任何其他表征的终止子序列。

合适的转化或选择标记包括补足宿主中的缺陷的那些，例如来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因或曲霉属amdS和niaD。选择可以基于赋予抗生素抗性的标记，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、腐草霉素或潮霉素抗性。

本发明的丝氨酸蛋白酶的细胞外分泌是优选的。因此，重组载体包含促进在所选宿主中的分泌的序列。本发明的丝氨酸蛋白酶的信号序列或前导序列或前肽可以包括在重组表达载体中，或天然信号序列可以由能够促进在所选宿主中的分泌的另一种信号序列替换。因此，所选信号序列对于表达宿主可以是同源或异源的。

合适的信号序列的例子是真菌或酵母生物的那些，例如来自良好表达基因的信号序列。此类信号序列由于文献是众所周知的。

重组载体可以进一步包含促进载体整合到宿主染色体DNA内以获得稳定表达的序列。

如实施例1中所述，本发明的Tr Prb1蛋白酶用来自里氏木霉cbh1（cel7A）启动子的信号序列进行表达。用于转化里氏木霉宿主的表达构建体还包括cbh1终止子和amdS标记用于从未转化的细胞中选择转化株。

本发明还涉及包含如上所述的重组表达载体的宿主细胞。用于产生真菌丝氨酸蛋白酶的合适宿主是同源或异源宿主，例如微生物宿主包括细菌、酵母和真菌。在植物或哺乳动物细胞中的生产***也是可能的。

由于下游加工和酶产物回收的容易，丝状真菌例如木霉属、曲霉属、镰刀菌属、腐质霉属、金孢属、链孢霉属、根霉属、青霉属和被孢霉属，是优选的生产宿主。合适的表达和生产宿主***是例如开发用于丝状真菌宿主里氏木霉的生产***（EP 244234），或曲霉属生产***，例如米曲霉或黑曲霉（WO 9708325、US 5,843,745、US 5,770,418）、泡盛曲霉、酱油曲霉和日本曲霉型菌株，或开发用于镰刀菌属例如尖孢镰刀菌（Malardier等人，1989）或F. venenatum，和用于粗糙链孢霉、Rhizopus miehei、Mortiriella alpinis（疑为Mortierella alpina，高山被孢霉）、柔毛腐质霉或特异腐质霉或用于Chrysosporium lucknowense（US 6,573,086）的生产***。开发用于酵母的合适生产***是开发用于酵母属（Saccharomyces）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）或巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）的***。开发用于细菌的合适生产***是开发用于芽孢杆菌属例如用于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌，用于大肠杆菌，或用于放线菌链霉菌属（Streptomyces）的生产***。优选地，本发明的丝氨酸蛋白酶在木霉属或曲霉属的丝状真菌宿主中产生，例如里氏木霉或黑曲霉、米曲霉、酱油曲霉、泡盛曲霉或日本曲霉型菌株。根据本发明的最优选实施方案，真菌丝氨酸蛋白酶在里氏木霉中产生。

由于通过失活或去除一种或多种宿主蛋白酶的蛋白酶去除，例如通过编码此类同质或同源蛋白酶的一种或多种基因的缺失，宿主可以不含同质蛋白酶。

本发明还涉及用于产生多肽的方法，所述多肽用于在其中希望该酶在低温或中等温度具有性能的工业应用中修饰、降解或去除蛋白质性质的材料，优选用作去垢剂添加剂，所述多肽具有丝氨酸蛋白酶活性，并且所述方法包含在合适条件下培养携带用于本发明的丝氨酸蛋白酶的重组表达载体的天然或重组宿主细胞和任选地分离所述酶的步骤。生产培养基可以是适合于生长宿主生物且含有用于有效表达的诱导剂的培养基。合适培养基由于文献是众所周知的。

本发明涉及Tr Prb1多肽，其用于在低温或中等温度在应用中修饰、降解或去除蛋白质性质的材料，优选用作去垢剂添加剂，所述多肽具有丝氨酸蛋白酶活性，并且由本发明的核酸分子编码且可通过上述方法获得。优选地，多肽是通过培养携带用于本发明的丝氨酸蛋白酶的重组表达载体的宿主细胞获得的重组蛋白酶。

本发明的重组酶具有25 - 35 kDa的分子量。该酶在pH 9具有在30℃ - 70℃范围的最适温度。所述酶在50℃具有在至少pH 6 – pH 11的pH范围的最适pH。使用15分钟反应时间和酪蛋白作为底物测定最适温度和pH。本发明的丝氨酸蛋白酶能够在10℃ - 60℃在去垢剂的存在下修饰、降解或去除蛋白质性质的污物。

本发明进一步涉及用于获得包含多肽的酶制剂的方法，所述酶制剂用于在低温或中等温度的应用中修饰、降解或去除蛋白质性质的材料，优选用作去垢剂添加剂，所述多肽具有丝氨酸蛋白酶活性，并且所述方法包含培养携带本发明的表达载体的宿主细胞和从细胞中回收多肽或使细胞与培养基分离且获得具有丝氨酸蛋白酶活性的上清液的步骤。

本发明还涉及用于在低温或中等温度的应用中修饰、降解或去除蛋白质性质的材料，优选用作去垢剂添加剂的酶制剂，所述酶制剂包含上文表征的丝氨酸蛋白酶。酶制剂或组合物具有丝氨酸蛋白酶活性，并且可通过根据本发明的方法获得。优选地，酶组合物包含通过培养宿主细胞获得的重组丝氨酸蛋白酶，所述宿主细胞携带本发明的重组表达载体。

所述酶制剂可以进一步包含不同类型的酶加上本发明的丝氨酸蛋白酶，例如另一种蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶和/或氧化酶例如漆酶或过氧化物酶，其具有或不具有媒介剂。通过去除待处理材料中存在的碳水化合物和油或脂肪，这些酶预期增强本发明的丝氨酸蛋白酶的性能。所述酶可以是通过宿主菌株产生的天然或重组酶，或可以在生产过程后加入培养上清液中。

所述酶制剂可以进一步含有选自下述的合适添加剂：表面活性剂或表面活性试剂、缓冲剂、防蚀剂、稳定剂、漂白剂、媒介剂、助洗剂、腐蚀剂、研磨剂和防腐剂、荧光增白剂、抗再沉积剂、染料、色素等。

表面活性剂用于乳化油脂和湿润表面。表面活性剂可以是非离子型的，包括半极性和/或阴离子和/或阳离子和/或两性离子型的。

缓冲剂可以加入酶制剂中，以修饰pH或影响其他成分的性能或稳定性。

合适的稳定剂包括多元醇例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物、肽等。

漂白剂用于氧化且降解有机化合物。合适的化学漂白***的例子是H₂O₂来源，例如过硼酸盐或过碳酸盐连同或不连同形成过酸的漂白激活物，例如四乙酰乙二胺，或可替代地过酸例如酰胺、酰亚胺或砜类型。化学氧化剂可以通过使用氧化酶例如漆酶或过氧化物酶部分或全部替换。许多漆酶在不存在媒介剂的情况下无法有效起作用。

助洗剂或络合剂包括物质，例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等。酶制剂可以进一步包含一种或多种聚合物例如羧甲基纤维素、聚（乙二醇）、聚（乙烯醇）、聚（乙烯吡咯烷酮）等。此外，可以加入软化剂、腐蚀剂、用于防止其他成分的腐败的防腐剂、研磨剂以及修饰发沫和粘度性质的物质。

根据本发明的一个优选实施方案，所述酶制剂以液体、粉末或颗粒的形式。

本发明的真菌丝氨酸蛋白酶可以如同其他蛋白酶，特别是在去垢剂、蛋白质、酿造、肉、摄影、皮革、乳制品和制药工业中使用的碱性蛋白酶（Kalisz，1988；Rao等人，1998）。例如，它可以作为化学制品的替代物使用，以将纤维蛋白质废物（例如角、羽毛、指甲和毛发）转换为有用生物量、蛋白质浓缩物或氨基酸（Anwar和Saleemuddin，1998）。本发明的真菌丝氨酸蛋白酶的使用可以如同在改善皮革质量中以及在减少环境污染和节能中证明成功的其他酶，并且它可以用于合成肽和分辨D,L-氨基酸的混合物。在烧伤和伤口处理中与广谱抗生素组合的枯草杆菌蛋白酶是在医药工业中使用的丝氨酸蛋白酶的例子，因此本发明的真菌丝氨酸蛋白酶也可以发现此类用途，并且还可以如同碱性蛋白酶应用于去除外科设备上的血液和清洁隐形眼镜或假牙。如同来自冠状虫霉（Conidiobolus coronatus）的碱性蛋白酶，本发明的丝氨酸蛋白酶可以用于替换动物细胞培养中的胰蛋白酶。本发明的蛋白酶还可以用于清洁膜和破坏生物被膜。在酿造中，蛋白酶可以用于例如破坏谷蛋白网络且在其他食物应用中用于水解食物蛋白质例如乳中的蛋白质。它们还可以用于例如处理酵母，提炼（从动物骨中提取更多蛋白质），产生新调味，减少苦味，改变乳化性质，生成生物活性肽且减少蛋白质的变应原性。底物包括动物、植物和微生物蛋白质。

去垢剂工业特别是洗衣去垢剂工业已作为在高pH范围具有活性的蛋白酶的单个主要消费行业出现（Anwar和Saleemuddin，1998）。理想的去垢剂蛋白酶应具有广泛底物特异性，以促进由于食物、草、血液和其他身体分泌的大量各种各样污物的去除。它在去垢剂溶液的pH和离子强度、洗涤温度和pH中必须是有活性的，并且耐受机械处理以及加入去垢剂中的螯合和氧化试剂。蛋白酶的pI必须接近去垢剂溶液的pH。由于目前的能源危机和关于能力节省的意识，目前希望在较低温度使用蛋白酶。

本发明还涉及丝氨酸蛋白酶或酶制剂用于去垢剂、处理纺织品纤维、用于处理羊毛、用于处理毛发、用于处理皮革、用于处理食物或饲料、或用于涉及蛋白质性质的材料的修饰、降解或去除的任何应用的用途。

本发明的一个优选实施方案因此是如上表征的丝氨酸蛋白酶作为用于洗衣去垢剂和餐具洗涤组合物包括自动餐具洗涤组合物的去垢剂添加剂的用途。

去垢剂是预期帮助清洁或具有清洁性质的物质或材料。术语“去垢力”指示清洁性质的存在或程度。清洁性质的程度可以在与固体、水不溶性载体例如纺织品纤维或玻璃结合的不同蛋白质性质或含蛋白质的底物材料或污物或污物混合物上进行测试。一般的“蛋白质性质的材料”包括血、乳、墨、蛋、草和沙司。对于测试目的，蛋白质性质的污物的混合物是商购可得的。去垢剂酶的功能是降解且去除含蛋白质污物。测试结果取决于在洗涤测试中使用的污物的类型，去垢剂的组成以及纺织品的性质和状态（Maurer，2004）。

一般地，蛋白酶或洗涤性能作为“污物去除效率”或“污物去除效应”或“清洁性质的程度”进行测量，意指染污材料例如人工弄脏的样片或测试衣服的亮度的可见和可测量增加或颜色中的改变。如实施例4 – 7中所述，使用L*a*b*颜色空间坐标通过用分光光度计测量作为反射比值的颜色，可以测量亮度或颜色值中的变化。指示蛋白酶性能（污物去除效率）的蛋白质性质的污物的褪色或去除例如计算为ΔL*，这意指酶处理的织物的亮度值L*减去用不含酶的洗涤液（缓冲液或去垢剂溶液）（酶空白对照或对照）处理的织物的亮度值L*。去垢剂的存在可以改善酶在去除污物中的性能。

本发明的丝氨酸蛋白酶在中性和碱性pH的条件下和在具有不同组成的去垢剂的不存在或存在下降解多个种类的蛋白质性质的污物（如实施例4 – 7中所示）。蛋白酶在广泛温度范围也能够降解蛋白质性质的材料，特别是在低温范围，例如10℃ - 30℃（实施例4，图7）。

如实施例5中用不同液体去垢剂显示的，本发明的Tr Prb1丝氨酸蛋白酶在低洗涤温度去除血/乳/墨污物相当大地优于商业蛋白酶制剂Savinase? Ultra 16L、Purafect? 4000L和Properase? 4000E。图8显示了用Ariel Sensitive和Erisan去垢剂的结果。图9A-C显示了在30℃连同不同剂量的基础去垢剂的结果，并且9D-E显示了在10℃和20℃连同去垢剂浓度3.3 g/l的结果。酶制剂按照活性单位施用。

如实施例6中所述，Tr Prb1蛋白酶的性能还在去垢剂粉末中在40℃和50℃在pH约10下进行测试。测定了酶在去除聚酯-棉花材料上的血/乳/墨标准污物中的能力。每种酶制剂按照活性单位（μmol酪氨酸/分钟/体积）施用。如图10中所示，本发明的Tr Prb1蛋白酶还适合于在非常碱性条件的粉末去垢剂。

在里氏木霉中产生的重组Tr Prb1酶制剂的性能在液体基础去垢剂的存在下以满刻度在洗涤机器中在30℃进行测试（实施例7）。用于测试副作用的9种不同蛋白酶敏感示踪剂呈现于表5中，并且过程条件呈现于表6中。在测试试验中使用的酶剂量计算为酶活性和酶蛋白质的量。图11A-I中呈现的结果显示当酶根据活性施用时，与商业蛋白酶制剂Purafect ? 4000L比较，Tr Prb1在低温和短周期洗涤（15分钟）时的性能对于所有测试的污物显著更高。此外，如果剂量计算为加入的蛋白质的量（图12），那么污物去除效率类似于或略微优于Purafect? 4000L。

根据本发明的一个优选实施方案，如实施例5 – 7中所示，本发明的真菌丝氨酸蛋白酶在去垢剂液体和去垢剂粉末中有用。本发明的酶制剂的酶可以配制用于在手动或机器洗衣中使用，或可以配制用于在家具硬表面清洁中或优选在手动或机器餐具洗涤操作中使用。

本申请还公开了来自禾谷镰刀菌ALKO1726的真菌丝氨酸蛋白酶，可从在登记号CBS 124697下保藏于Centraalbureau voor Schimmelcultures的菌株获得。

如实施例2c、3和8中所述，当使用15分钟反应时间和酪蛋白作为底物在pH 9测量时，Fg_ALKO1726酶的最适温度是30℃ - 60℃（至少30％的在50℃的最大限度活性），40℃ - 60℃（至少约40％的最大限度活性），或在50℃（Fg_ALKO1726的最大限度活性）。

Fg_ALKO1726丝氨酸蛋白酶具有在至少pH 6 – pH 11的pH范围的最适pH，如实施例2c以及实施例3和8中所述使用15分钟反应时间和酪蛋白作为底物，显示在pH 9在50℃至少50％的最大限度活性。至少约60％的最大限度活性在pH 7 - pH 10之间显示出。本发明的Fg_ALKO1726酶的预测pI是pI 9.3。

在去垢剂的存在下，Fg_ALKO1726酶在10℃ - 60℃之间，优选在或低于50℃起作用。该酶也在或低于45℃、在或低于40℃、在或低于35℃、或在或低于30℃的温度中起作用。

禾谷镰刀菌丝氨酸蛋白酶包含如SEQ ID NO:16中定义的成熟Fg_ALKO1726酶的氨基酸序列。成熟的丝氨酸蛋白酶包括特征在于SEQ ID NO:12的全长蛋白酶的氨基酸Ala123到Ala411。前酶形式的Fg_ALKO1726蛋白酶的氨基酸序列在SEQ ID NO:14中定义。

Fg_ALKO1726丝氨酸蛋白酶由包含核苷酸序列SEQ ID NO:11（其编码Fg_ALKO1726全长酶（SEQ ID NO:12））、或核苷酸序列SEQ ID NO:13（其编码Fg_ALKO1726前酶形式（SEQ ID NO:14））的核酸分子编码，或它可以由包含核苷酸序列SEQ ID NO:15（其编码成熟Fg_ALKO1726多肽（SEQ ID NO:16））的核酸分子编码。

如实施例1中所述，通过PCR且使用对于序列XM_383491特异性的引物分离编码Fg_ALKO1726丝氨酸蛋白酶的Fg prtS8A基因。全长Fg prtS8A基因包括在质粒pALK2707中，所述质粒pALK2707在登记号DSM 22636下在大肠杆菌RF8098中保藏于DSMZ培养物保藏中心。由DNA序列分析丝氨酸蛋白酶的推导的氨基酸序列。

全长Fg prtS8A的核苷酸序列（SEQ ID NO：11）和推导的序列（SEQ ID NO:12）呈现于图2A-B中。该基因的长度是1292 bp（包括终止密码子）。发现具有56 bp长度的1个假定内含子。推导的蛋白质序列由411个氨基酸组成，包括20个氨基酸的预测信号序列（SignalP V3.0；Nielsen等人，1997以及Nielsen和Krogh，1998）和从Ala21到Ala123的原肽。预测的分子量对于成熟多肽是29 kDa，并且预测的pI是9.30。使用在ExPASy服务器上的Compute pI/MW工具做出这些预测（Gasteiger等人，2003）。推导的氨基酸序列含有3个可能的N-糖基化位点（Asn77、Asn254和Asn 398），但根据CBS Server NetNGlyc V1.0，仅一个位点Asn77（定位于前导序列中）是可能的。使用在NCBI（美国国家生物技术信息中心）（Altschul等人，1990）的BLASTP程序，版本2.2.21搜索与公开的蛋白酶序列的同源性。通过使用ClustalW比对（矩阵：BLOSUM，缺口开放:10，缺口延伸：0.5（例如在www.ebi.ac.uk/Tools/Clustalw中）获得成熟Fg_ALKO1726序列与同源序列的相应区域的同一性值。

Fg_ALKO1726序列与玉米赤霉（Gibberella zeae）假定蛋白质XP_383491的同一性是99％。发现了在成熟多肽的氨基酸序列中的2个差异，氨基酸188在Fg_ALKO1726中是Ser而在XP_383491中是Ala，并且氨基酸289在Fg_ALKO1726中是Phe而在XP_383491中是Leu。Fg_ALKO1726成熟多肽显示与来自钩状木霉的碱性蛋白酶（AAP15044；Steyaert等人，2004）、来自白腐真菌（Hypocrea lixii）（有性型哈茨木霉；CAL25580；Suarez等人2007）的丝氨酸内肽酶、来自深绿木霉的碱性蛋白酶（ALP_TRIAT；Geremia等人，1993）和来自Hypocrea virens的细胞外丝氨酸蛋白酶Tvsp1（AAO63588；Pozo等人，2004）的72 - 78％同一性。Fg_ALKO1726成熟氨基酸序列与ALP蛋白酶（EMBL登记号M87516；Geremia等人1993；在US 60/818,910中公开为SEQ ID No:313（Catalyst Bioscience Inc.））的相应区域的同一性是76％。Tr Prb1和Fg_ALKO1726成熟序列之间的同一性是76％。

如实施例2中所述，含Fg_ALKO1726蛋白酶的酶制剂在里氏木霉中在里氏木霉cbh1（cel7A）启动子的控制下产生。来自实验室规模的生物反应器培养的耗尽培养基用于测试Fg_ALKO1726在含或不含去垢剂的洗衣洗涤中的性能。如实施例4-6中所示，在不同测试条件中Fg_ALKO1726丝氨酸蛋白酶制剂的性能至少与商业蛋白酶制剂Savinase? Ultra 16L、Purafect? 4000L或Properase? 4000E一样好或略微优于其。然而，污物去除效应低于用含有本发明的Tr Prb1丝氨酸蛋白酶的酶制剂获得的效应。

实施例1. 里氏木霉QM6a prb1（Tr prb1）和禾谷镰刀菌ALKO1726 Fg prtS8A蛋白酶基因的克隆

（a）DNA的分离和使用的分子生物学方法

标准分子生物学方法用于DNA的分离和酶处理（例如质粒DNA的分离、DNA的消化以产生DNA片段）、在大肠杆菌中转化、测序等。使用的基本方法如由酶、试剂或试剂表达盒制造商所述，或如标准分子生物学手册例如Sambrook和Russell（2001）中所述。如由Raeder和Broda（1985）描述的完成基因组DNA从里氏木霉QM6a和禾谷镰刀菌ALKO1726中的分离。使用PhaseLock管（Eppendorf，德国）执行苯酚提取阶段。

（b）用于基因克隆的寡核苷酸引物

使用里氏木霉QM6a和禾谷镰刀菌ALKO1726基因组DNA制剂作为模板，通过PCR克隆Tr prb1和Fg prtS8A基因。根据prb1（ID 121495）的序列设计用于克隆Tr prb1基因的PCR引物，所述prb1的序列由DOE Joint Genome Institute（里氏木霉QM6a基因组序列v2.0，http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html）公开。根据序列XM_383491设计用于克隆Fg prtS8A基因的PCR引物，所述序列XM_383491先前公开于EMBL数据库中且得自玉米赤霉PH-1（无性型：禾谷镰刀菌）。XM_383491在数据库中描述为编码假定蛋白质EAA71059的部分mRNA。在克隆Tr prb1和Fg prtS8A基因中使用的引物序列显示于表1中。5′-PCR引物PRO213和PRO245分别包括（从5′-到3′-方向）与Tr prb1和Fg prtS8A基因序列的开始（分别包括ATG的26和27个核苷酸）融合的cbh1启动子序列（从SacII位点起）的末端。此外，引物在其5'-末端含有3个（PRO213）或2个（PRO245）另外的核苷酸，以确保PCR产物从SacII位点的切割且使得基因确切融合志全长cbh1启动子的SacII位点。3′-PCR引物PRO214和PRO246分别包括（从5′-到3′-方向）BamHI位点以及Tr prb1和Fg prtS8A基因的末端（分别包括STOP密码子的26或25个核苷酸）。此外，PRO214在5'-末端含有3个并且PRO246 含有2个另外的核苷酸，以确保从BamHI位点的切割，所述BamHI位点用于使基因经由接头与cbh1终止子融合。

表1. 在Tr prb1和Fg prtS8A基因的克隆中用作PCR引物的寡核苷酸（SEQ ID NO：1-4）。显示了引物、其相应SEQ ID NO和序列（5′-> 3′）。衍生自Tr prb1和Fg prtS8A基因的序列以粗体字母。

（c）PCR反应

里氏木霉QM6a和禾谷镰刀菌ALKO1726（CBS 124697）基因组DNA用作PCR反应中的模板。PCR反应混合物含有1XPhusion HF缓冲液（Finnzymes，Finland）、0.2 mM dNTP、0.5 μM每种引物和0.5单位Phusion DNA聚合酶（Finnzymes，Finland）和约0.5 – 1 μg基因组DNA/50 μl反应体积。关于PCR反应的条件如下：在98℃30秒起始变性，随后为在98℃10秒，在49.4、54.7和60.2℃（Tr prb1）或54.4、59.5和64.8℃（Fg prtS8A）30秒退火，在72℃1分钟延伸的25个循环和在72℃7分钟的最后延伸。分别具有预期大小（根据基于公开序列的计算）~1.4和~1.3 kb的DNA产物得自使用引物组合PRO213（SEQ ID NO:1）与PRO214（SEQ ID NO:2）和PRO245（SEQ ID NO:3）与PRO246（SEQ ID NO:4）的所有反应。从PCR反应混合物中分离且纯化DNA产物。使用SacII和BamHI将它们切割，且与用SacII和BamHI切割的pALK1910载体连接。pALK1910包括~2.2 kb cbh1启动子（至SacII位点）和接头（包括例如BamHI位点），致使基因与cbh1启动子和终止子（~0.6 kb，从STOP到AvaII位点）的连接。测序来自2次分开的里氏木霉PCR反应的产物，且发现彼此等同且与由DOE Joint Genome Institute公开的序列是等同的。此外，测序来自2次分开的禾谷镰刀菌PCR反应的产物，且发现彼此是等同的。将包括与cbh1启动子和终止子融合的Tr prb1和Fg prtS8A基因的质粒分别命名为pALK2650和pALK2707。将包括质粒pALK2650和pALK2707的大肠杆菌菌株RF8052和RF8098在登记号DSM 22635和DSM 22636下分别保藏于DSM保藏中心。如实施例2中所述，由这些质粒进一步构建表达盒pALK2701（Tr prb1）和pALK2708（Fg prtS8A）。

（d）编码Tr Prb1和Fg_ALKO1726蛋白酶的基因的表征和推导的氨基酸序列

Tr prb1序列（SEQ ID NO：5）和推导的氨基酸序列（SEQ ID NO:6）显示于图1A-B中。该基因的长度是1371 bp（包括终止密码子）。该基因包含68和73 bp的2个内含子。推导的氨基酸序列由409个氨基酸组成，包括20个氨基酸的预测信号序列（http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html和SignalP V3.0；Nielsen等人，1997以及Nielsen和Krogh，1998）。预测的分子量对于成熟多肽是29062.21 Da，并且预测的pI是8.94。使用在ExPASy服务器上的Compute pI/MW工具做出这些预测（Gasteiger等人，2003）。推导的氨基酸序列含有在氨基酸位置Asn252和Asn396上的2个可能的N-糖基化位点（图1），但根据CBS Server NetNGlyc V1.0，仅预测在位置Asn252上的位点为潜在的N-糖基化位点。

Fg prtS8A序列（SEQ ID NO：11）和推导的氨基酸序列（SEQ ID NO:12）显示于图2A-B中。该基因的长度是1292 bp（包括终止密码子）。该基因含有56 bp的1个假定内含子（根据真菌内含子的5'和3'边界序列，根据Gurr等人，1987）。推导的氨基酸序列由411个氨基酸组成，包括20个氨基酸的预测信号序列（SignalP V3.0；Nielsen等人，1997以及Nielsen和Krogh，1998）。预测的分子量对于成熟多肽是28935.98 Da，并且预测的pI是9.30。使用在ExPASy服务器上的Compute pI/MW工具做出这些预测（Gasteiger等人，2003）。推导的氨基酸序列含有在氨基酸位置Asn77、Asn254和Asn 398上的3个可能的N-糖基化位点（图2），但根据CBS Server NetNGlyc V1.0，仅预测在位置Asn77（定位于前导序列中）上的位点为潜在的N-糖基化位点。

（e）同源性、同一性和比对研究

使用具有缺省设置的NCBI（美国国家生物技术信息中心）的蛋白质BLASTP程序版本2.2.21（Altschul等人，1990），搜索编码成熟Tr Prb1和Fg_ALKO1726蛋白质序列与公开的蛋白酶序列（非冗余的GenBank CDS翻译+PDB+SwissProt+PIR+PRF排除来自WGS计划的环境样品）的同源性。关于Tr Prb1的最高同一性（92 - 93 ％）如下：来自钩状木霉的碱性蛋白酶（AAP15044；Steyaert等人，2004）、来自白腐真菌（Hypocrea lixii）（有性型哈茨木霉；CAL25580；Suarez等人2007）的丝氨酸内肽酶、来自深绿木霉的碱性蛋白酶（ALP_TRIAT；Geremia等人，1993）和来自Hypocrea virens的细胞外丝氨酸蛋白酶Tvsp1（AAO63588；Pozo等人，2004）。关于Fg_ALKO1726序列与来自玉米赤霉（Gibbrella zeae）（禾谷镰刀菌）的假定蛋白质XP_383491序列的同一性是99％。检测到在上述2个成熟氨基酸序列的氨基酸序列中的仅2个差异（氨基酸188在Fg_ALKO1726中是Ser并且在XP_383491中是Ala，并且氨基酸289在Fg_ALKO1726中是Phe并且在XP_383491中是Leu）。发现关于Fg_ALKO1726的接下来最紧密的同源物是Tr Prb1同源物（参见上文）。Fg_ALKO1726成熟序列针对这些序列的同一性是74 - 78 ％。还发现了与作为SEQ ID NO:313包括在专利申请US 60/818,910（Catalyst Bioscience Inc.）中的序列的同源性。通过使用成熟序列区域和ClustalW比对（www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw；矩阵：BLOSUM，缺口开放:10，缺口延伸：0.5）获得的这个序列与Tr Prb和Fg_ALKO1726的同一性值是92 ％（Tr Prb1）和76 ％（Fg_ALKO1726）。使用上述ClustalW比对，Tr Prb1和Fg_ALKO1726之间的同一性是76％。

实施例2. 在里氏木霉中生产Tr Prb1和Fg_ALKO1726重组蛋白酶

（a）表达盒的制备及其转化到里氏木霉内

通过分别将amdS（乙酰胺酶）标记基因连接到质粒pALK2650和pALK2707（实施例1c）内构建用于在里氏木霉中生产重组Tr Prb1和Fg_ALKO1726蛋白质的表达质粒pALK2701（Tr prb1）和pALK2708（Fg prtS8A）。amdS标记在cbh1终止子后连接到表达构建体内。类似构建已在例如Paloheimo等人（2003）中描述。在表达盒pALK2701和pALK2708（图3和4）中，通过PCR将具有其自身信号序列的Tr prb1和Fg prtS8A基因与里氏木霉cbh1（cel7A）启动子确切融合。使用在PCR中在终止密码子后产生的BamHI位点，将基因的3-'末端与cbh1终止子融合。这在构建中在cbh1终止子序列前不留下原始终止序列。使用NotI消化从载体主链中分离~8.7 kb线性表达盒（呈现于图3和4中），并且用于转化里氏木霉原生质体。使用的宿主菌株不产生4种主要里氏木霉纤维素酶（CBHI、CBHII、EGI和EGII）中的任何。如Penttil?等人（1987）中所述并具有Karhunen等人（1993）中所述的修改执行转化，。在使它们在PD上形成孢子前通过单个分生孢子在选择板上纯化转化子。

（b）在摇瓶和实验室规模生物反应器中的蛋白酶生产

将选择的转化子从PD斜面培养接种到含有50 ml基于乳糖的复合纤维素酶诱导培养基（Joutsjoki等人，1993）的摇瓶，所述培养基用pH 6.0的5％KH₂PO₄缓冲。在使它们在30℃、250 rpm生长7天后，由培养上清液分析转化株的蛋白酶生产。在SDS-PAGE凝胶中，由耗尽的（spent）培养上清液检测到对应于Tr Prb1和重组Fg_ALKO1726蛋白酶的预期分子量的约29 kDa的主要蛋白质条带。如实施例2c或8中所述，使用酪蛋白作为底物由培养上清液测定蛋白酶活性。检测到与宿主比较明确增加的蛋白酶活性。通过使用DNA印迹分析从选择的转化株中证实一个或多个表达盒整合到真菌基因组内，在所述DNA印迹分析中包括几种基因组消化物并且分别的表达盒用作探针。

选择在摇瓶培养中产生最佳蛋白酶活性的里氏木霉转化株，以在实验室规模的生物反应器中培养。在培养中使用纤维素酶诱导复合培养基。得自培养的耗尽培养基用于应用测试（实施例4-7）中，且用作原材料用于Tr Prb1和重组Fg_ALKO1726蛋白酶的纯化和进一步表征。

（c）蛋白酶活性测定

通过酪蛋白Folin–Ciocalteau法测定蛋白酶活性。通过分光光度计监控随时间而变化的酸可溶性片段释放来测量通过蛋白酶的酪蛋白降解速率。在测定中使用的酪蛋白底物如下制备：将6 g Casein Hammerstein Grade MP Biomedicals，LLC（101289）溶解于500 ml 100 mM Tris、20 μM CaCl₂、7 μM MgCl₂、25 μM NaHCO₃中。用HCl将底物溶液的pH调整至9.0。使用TCA溶液停止酶反应，所述TCA溶液含有：在1000 ml蒸馏水中的0.11 M TCA、0.22 M乙酸钠、0.33 M乙酸、0.5 M Na₂CO₃。通过经由蒸馏水将25 ml 2 N Folin-Ciocalteu的苯酚试剂（SIGMA，F 9252）稀释至100 ml，制备在测定中使用的Folin试剂。通过首先将2.5 ml底物溶液在给定温度孵育5分钟之后加入0.5 ml酶溶液起始反应，并且将反应进行15分钟（用于测定温度或pH曲线图）或30分钟。在15或30分钟反应后，加入2.5 ml反应停止液，将内容物混合并且允许在室温静置30分钟。将管4000 rpm离心10分钟（Hettich Rotanta 460）。吸取1 ml澄清上清液，并且与2.5 ml 0.5 M Na₂CO₃和0,5 ml稀释的Folin试剂混合。在等待5分钟（显色）后，在660 nm针对酶空白对照测量混合物的吸光度（颜色）。酶空白对照如下制备：将0.5 ml酶溶液与2.5 ml停止液和2.5 ml底物混合，并且将混合物在给定温度孵育15或30分钟。1单位酶活性定义为释放对应于1 μg酪氨酸的酸可溶性蛋白质水解产物/ml（或g）反应混合物/分钟的酶数量。

实施例3. 重组Tr Prb1和Fg_ALKO1726蛋白酶的纯化和表征

通过在4℃离心30分钟，50000 g（Sorvall RC6 plus），从得自发酵（实施例2）的耗尽培养基中去除细胞和固体。15 ml上清液用于蛋白酶的纯化。所有纯化步骤在冷室执行。在离心后，在应用于在20 mM Tris pH 8.8中平衡的HiPrep 26/10 Desalting柱（来自GE Healthcare）前，将样品通过0.44 μm滤器（MILLEX HV Millipore）过滤。将凝胶过滤的样品应用于在20 mM Tris pH 8.8中平衡的20 mL Q Sepharose FF柱（来自GE Healthcare）。使用Amicon Ultra离心过滤装置10000 MWCO（Millipore）浓缩具有蛋白水解活性的流出物级分。将浓缩的样品应用到Superdex 75 10/300 GL柱（GE Healthcare）内，并且用20 mM Hepes、150 mM NaCl pH 6,8洗脱。合并含蛋白酶级分，并且用于表征pH和温度曲线图。

温度曲线图

通过使用实施例2c或8中所述的测定，使用15分钟反应时间和0.11 M TCA停止液，在pH9分析关于Tr Prb1和Fg_ALKO1726蛋白酶的温度曲线图。结果显示于图5A（Tr Prb1）和5B（Fg_ALKO1726）中。2种蛋白酶具有其在约50℃的其最适温度。

pH曲线图

如实施例2c或8中所述，使用酪蛋白作为底物和15分钟反应时间测定蛋白酶的pH曲线图。使用40 mM Britton-Robinson缓冲液将反应的pH调整至pH 6-12。0.11 M TCA停止液含有0.22 M乙酸钠和0.33 M乙酸。结果显示于图6A（Tr Prb1）和6B（Fg_ALKO1726）中。2种蛋白酶在广泛pH区域上是有活性的。Tr Prb1显示出从pH 6到pH 10超过85％的相对活性。Tr Prb1的最适pH是广泛的，它在测量中使用的条件下在pH 6 - pH 9之间具有至少95％的最大限度活性。

实施例4. 在不同温度在pH 9缓冲液中重组蛋白质Tr Prb1和Fg_ALKO1726的性能

测试在木霉属中产生的重组蛋白质Tr Prb1和Fg_ALKO1726（如实施例2中所述）分别在温度10 – 60℃或20 – 40℃去除血/乳/墨标准污物（Art 117，聚酯+棉花，EMPA Testmaterialen AG，Swizerland）的能力。商业蛋白酶制剂Savinase? Ultra 16 L（Novozymes）、Purafect? 4000 L（Genencor International）和Properase? 4000 E（Genencor International）和不含酶的处理（对照）用于比较。首先将污物织物切割成1.5 cm x 1.5 cm样片，并且通过切割边角将小片变得更圆。将小片置于微量滴定板（Nunc 150200）的孔中。向具有2 cm直径的每个孔内，将在Glysine-NaOH缓冲液pH 9中的1.5 ml酶稀释物加到织物之上。每种酶施用0、0.2、0.4、0.8、1.6、4和8活性单位（μmol酪氨酸/分钟）/ 1.5 ml缓冲液。如实施例2（c）或8中所述，使用30分钟反应时间测量活性。测量在pH 8.5执行，并且停止液含有0.11 M TCA。使用在稀释的Folin试剂添加后的10分钟孵育时间用于显色。将具有样品的微量滴定板在水平振荡器中在10 – 60℃/20 – 40℃伴随125 rpm孵育60分钟。在那之后，将样片在活水（running water）下（约在洗涤温度）小心地清洗，并且在室内空气中在格栅（grid）上干燥过夜，保护不受日光照射。

通过使用L*a*b*颜色空间坐标（照明D65/2°）用Minolta CM 2500分光光度计测量作为反射比值的颜色，评估污物去除效应。在处理后测量来自样片两侧的颜色。每个值是由织物两侧测量的至少2个平行织物样品的平均值。指示蛋白酶性能（污物去除效率）的血/乳/墨污物的褪色计算为ΔL*，这意指酶处理的织物的亮度值L*减去用不含酶的洗涤液（缓冲液）（酶空白对照，对照）处理的织物的亮度值L*。

结果显示于图7A-F中。Tr Prb1蛋白酶制剂显示与商业蛋白酶制剂Savinase? Ultra 16L、Purafect? 4000L和Properase? 4000E比较，在pH 9 缓冲液中在从10到60℃的整个温度范围，特别是在最低洗涤温度如10 – 30℃更高的污物去除能力。在20 – 40℃，Fg_ALKO1726蛋白酶制剂略微优于蛋白酶制剂Savinase? Ultra 16L和 Purafect? 4000L。

实施例5. 重组蛋白质Tr Prb1和Fg_ALKO1726连同不同液体去垢剂在低温的性能

测试在木霉属中产生的重组蛋白质Tr Prb1和Fg_ALKO1726（如实施例2中所述）在30℃连同不同液体去垢剂去除血/乳/墨标准污物（Art 117，聚酯+棉花，EMPA）的能力。含有25％洗涤活性物质、多元醇和聚合物（表2）的用于彩色织物的液体基础去垢剂（pH >8.0）以1 - 5 g/l的浓度使用，并且不含酶的商业去垢剂Ariel Sensitive（pH >8.0，Procter & Gamble，UK，表3）和Erisan（pH >9.0，Farmos，Finland，表4）以3.3 g/l的浓度使用。商业蛋白酶制剂Savinase? Ultra 16L、Purafect? 4000L、Properase? 4000E和不含酶的处理（对照）用于比较。Tr Prb1还使用基础去垢剂（3.3 g/l）在10和20℃进行测试。每种酶施用0、0.2、0.4、0.8、1.6、4和8活性单位（μmol酪氨酸/分钟）/ ml洗涤液。如实施例4中所述测量活性。在每次实验中，商业酶的至少2个剂量/洗涤液等价于约0.2 – 0.5 ％酶制剂/去垢剂重量的剂量，这处于去垢剂酶的一般商用水平。

表2. 用于彩色织物的液体基础去垢剂的组成。

成分	％
		NaLES（十二烷基醚硫酸钠）	4,9
非离子C12-15 7EO（环氧乙烷）	15
		Na-肥皂（棕榈仁FA）	4,4
椰油基葡糖苷（Coco Glucoside）	1
		<总表面活性剂>	<25,30>
多元醇（丙三醇）	5
		膦酸盐（32％）（ThermPhos）	2
PVP-Sokalan HP 53（BASF）	1
		Sokalan PA 15（BASF）	1,56
Sorez -100（ISP）	0,4
		水直到100 ％

表3. Ariel Sensitive的组成。

成分	％
		肥皂	<5
荧光增白剂	<5
		磷酸盐	<5
香料	<5
		阴离子型表面活性剂	<5 - 15 ％
非离子型表面活性剂	<5 - 15 ％

表4. 用于精细和彩色织物的Erisan去垢剂的组成。

成分	％
		肥皂	<5
柠檬酸盐	<5
		磷酸盐	<5
聚羧酸盐	<5
		阴离子型表面活性剂	<5 - 15 ％
非离子型表面活性剂	<5 - 15 ％

将1、3.3或5 g液体去垢剂的量溶解于1升自来水（dH ≤ 4）中，用磁力搅拌器充分混合，并且调节至30℃。取决于去垢剂浓度，在洗涤液中的pH对于基础去垢剂是约7.3-7.5，或对于Ariel是约7.9，并且对于Erisan是约8.2。如同实施例4中所述，将污物织物切割成小片。将样片置于微量滴定板（Nunc 150200）的孔中，并且将含有在水中的去垢剂和酶稀释物（低于60 μl）的1.5 ml洗涤液加到织物之上。将具有样品的板在水平振荡器中在30℃伴随125 rpm孵育60分钟。在那之后，将样片在活水下（约在洗涤温度）小心地/彻底清洗，并且在室内空气中、在格栅上干燥过夜，保护不受日光照射。用基础去垢剂的测试以相同方式也在10℃和20℃执行，使用去垢剂浓度3.3 g/l。

如实施例4中所述，使用L*a*b*颜色空间坐标用Minolta CM 2500分光光度计测量在处理后样片的颜色，并且污物去除效应计算为ΔL*。对于不含酶的处理（酶空白对照），相应去垢剂溶液用作洗涤液。

在30℃连同Ariel Sensitive和Erisan获得的结果显示于图8A和B中。在30℃使用不同去垢剂浓度连同用于彩色织物的基础去垢剂获得的结果显示于图9 A-C中，并且在10℃和20℃用去垢剂浓度3.3 g/l获得的结果显示于图9 D和E中。当施用相同量的活性时，对于所有去垢剂和在所有去垢剂浓度，与商业制剂Savinase? Ultra 16L、Purafect? 4000L和Properase? 4000E比较，Tr Prb1对于血/乳/墨污物的效率显著更高。与Purafect? 4000L和Properase? 4000E比较，特别是在最低温度（10℃和20℃）Tr Prb1的性能明显更高。这些测试的结果指出Tr Prb1蛋白酶连同液体去垢剂在低洗涤温度具有极佳性能。此外，在30℃，Fg_ALKO1726制剂至少与上文提及的商业蛋白酶制剂一样好。

实施例6. 重组蛋白质Tr Prb1和Fg_ALKO1726连同去垢剂粉末在40 – 50℃和pH 10的性能

测试在木霉属中产生的重组蛋白质Tr Prb1和Fg_ALKO1726制剂（如实施例2中所述）在40℃和50℃（pH约10）在含磷酸盐的参考去垢剂的存在下去除血/乳/墨标准污物的能力。标准污物Art 117（血/乳/墨，聚酯+棉花，EMPA）用作标准材料。商业蛋白酶Purafect? 4000L、Properase? 4000E和不含酶的处理（对照）用于比较。每种酶施用0、0.2、0.4、0.8、1.6、4和8活性单位（μmol酪氨酸/分钟）/ ml缓冲液。如实施例4中所述测量活性。

将3.3 g不含荧光增白剂的含磷酸盐的ECE参考去垢剂77（Art. 601，EMPA）的量溶解于1升自来水（dH ≤ 4）中，用磁力搅拌器充分混合，并且调节至40℃/50℃。如同实施例4中所述，将污物织物切割成小片。将样片置于微量滴定板（Nunc 150200）的孔中，并且将含有在水中的去垢剂和酶稀释物（低于60 μl）的1.5 ml洗涤液加到织物之上。将具有样品的板在水平振荡器中在40℃/50℃伴随125 rpm孵育60分钟。在那之后，将样片在活水下（约45℃）小心地清洗，并且在室内空气中、在格栅上干燥过夜，保护不受日光照射。

如实施例4中所述，使用L*a*b*颜色空间坐标用Minolta CM 2500分光光度计测量在处理后样片的颜色，污物去除效应计算为ΔL*。对于不含酶的处理（酶空白对照），去垢剂溶液用作洗涤液。

结果（图10 A和B）显示蛋白酶Tr Prb1和Fg_ALKO1726在非常碱性的条件下连同粉末去垢剂也是合适的。

实施例7. 重组蛋白质Tr Prb1在液体洗衣去垢剂30℃中在满刻度试验中的性能评估

使用短洗涤时间（15分钟），在液体去垢剂中以满刻度在洗涤机器中在30℃测试在木霉属中产生的重组蛋白质Tr Prb1制剂（如实施例2中所述），并且与商业蛋白酶制剂Purafect? 4000L和用不含酶的去垢剂的处理比较。如实施例8中所述，使用用于彩色织物的液体基础去垢剂和9种不同蛋白酶敏感示踪剂（表5）。示踪剂来自EMPA Testmaterialen AG，Swizerland CFT（Center For Testmaterials BV，荷兰）。将约10 cm x 10 cm的污物样片缝至枕套。过程参数和条件在表6中描述。在试验中使用的酶剂量计算为酶活性（约0 – 14活性单位/ml洗涤液）和蛋白质的量（约0 – 4 mg/升洗涤液）。Purafect? 4000L施用0.5、0.75和1 ％的去垢剂重量。如实施例4中所述测量蛋白酶活性。使用牛丙种球蛋白（Bio-Rad）作为标准，通过Bio-Rad蛋白质测定（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）测定来自酶制剂的蛋白质的量。

使用在欧洲标准EN ISO 6330:2000上描述的除编号5A外的相似洗涤程序（similar wash procedure than No. 5A），除温度设为30℃而不是40℃外。蛋白酶敏感样片在室内空气中、在格栅上干燥过夜，保护不受日光照射，并且将填充材料转笼干燥。

表5. 在测试中使用的蛋白酶敏感示踪剂。

表6. 过程参数和条件。

通过使用L*a*b*颜色空间坐标（照明D65/2°）用Minolta CM 2500分光光度计测量作为反射比值的颜色，评估污物去除效应。在处理后测量来自样片两侧的颜色。每个值是约12次测量（来自每侧6次）的平均值。对于EMPA的污物，值是2个样片的测量平均值。指示蛋白酶性能（污物去除效率）的污物的褪色计算为ΔL*，这意指酶处理的织物的亮度值L*减去仅用去垢剂处理的织物的亮度值L*。污物样片的颜色也在处理前进行测量，但该值不包括在计算中，因为样片是同质的（对于所有污物，L*值的标准差<0.2单位）。

结果显示于图11A-I中。当蛋白酶以活性的量施用时，与商业蛋白酶制剂Purafect ? 4000L比较，Tr Prb1在低温和短周期洗涤（15分钟）的性能对于所有测试的污物显著更高。此外，如果剂量计算为加入的蛋白质的量（图12 A和B），那么Tr Prb1的污物去除效率类似于或略微优于Purafect? 4000L，即使总蛋白质的测量不利于源于非最佳化发酵的Tr Prb1制剂。

当酶剂量是1.9 mg蛋白质/升洗涤液时，对应于对于Tr Prb1约2单位和对于Purafect? 4000L约14单位的活性单位/ml，使用更长的洗涤时间（60分钟），用Tr Prb1也获得了与Purafect? 4000L比较相似或略微更佳的污物去除效率。

实施例8. 蛋白质活性测定II

使用酪蛋白作为底物，通过酪蛋白Folin–Ciocalteau法测定蛋白酶活性。通过分光光度计监控随时间而变化的酸可溶性片段释放来测量通过蛋白酶的酪蛋白降解速率。在测定中使用的酪蛋白底物如下制备：将6 g Casein Hammerstein Grade MP Biomedicals，LLC（101289）溶解于500 ml 的30 mM Tris、2.0 mM CaCl₂、0.7 mM MgCl₂、2.5 mM NaHCO₃中。将底物溶液的pH调整至8.5。使用0.11 M TCA溶液停止酶反应。通过蒸馏水将25 ml 2 N Folin-Ciocalteu的苯酚试剂（SIGMA，F 9252）稀释至100 ml，制备在测定中使用的Folin试剂。通过首先将2.5 ml底物溶液在50℃孵育5分钟之后加入0.5 ml酶溶液起始反应，并且将反应进行15分钟（用于测定温度和pH曲线图）或30分钟。在15分钟或30分钟反应后，加入2.5 ml反应停止液，将内容物混合并且允许在室温静置30分钟。将管4000 rpm离心10分钟（Hettich Rotanta 460）。将1 ml澄清上清液与2.5 ml 0.5 M Na₂CO₃和0.5 ml稀释的Folin试剂混合。在等待至少5分钟（显色）后，在660 nm针对酶空白对照测量混合物的吸光度（颜色）。酶空白对照如下制备：将0.5 ml酶溶液与2.5 ml停止液和2.5 ml底物混合，并且将混合物在50℃孵育15分钟或30分钟。1单位酶活性定义为释放对应于1 μg酪氨酸的酸可溶性蛋白质水解产物/ml（或g）反应混合物/分钟的酶数量。

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<150> FI 20095779

<151> 2009-07-08

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于克隆里氏木霉QM6a prb1基因的5′-PCR引物PRO213的序列

<400> 1

tccccgcgga ctgcgcatca tggccagcct tcgtcgcctt gccct 45

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于克隆里氏木霉QM6a prb1基因的3′-PCR引物PRO214的序列

<400> 2

cgcggatcct taagcactgt tcccgttgaa gatga 35

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于克隆禾谷镰刀菌ALKO1726蛋白酶的5′-PCR引物PRO245的序列

<400> 3

acccgcggac tgcgcatcat gaccagcttc cgccgtcttg ctctc 45

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于克隆禾谷镰刀菌ALKO1726蛋白酶的3′-PCR引物PRO246的序列

<400> 4

cgggatcctt aagtagaggc accgttgaag gcg 33

<210> 5

<211> 1371

<212> DNA

<213> 里氏木霉

<220>

<221> misc_feature

<223> 编码Prb1蛋白酶 (ID 121495)的全长里氏木霉QM6a蛋白酶基因prb1 (Tr prb1)的核苷酸序列

<400> 5

atggccagcc ttcgtcgcct tgccctctat ctcggagccc tgctcccggc tgttctggcc 60

gctcctgctg tcaattacaa gctgcctgaa gctgttccca acaagttcat tgtcactctc 120

aaagatggtg cctctgttga tacagactct caccttacat gggtgaaaga ccttcacagg 180

cgctcactcg gcaagcgcag cactgctggt gttgagaaga cgtacaacat cgacagctgg 240

aatgcctatg ctggcgagtt cgatgaagaa accgttaagc agatcaaggc gaatcccgac 300

gtaagtattt gccctactgt tggacgagat gccaatgttc cattgcgaaa ttctaatgag 360

cataccaggt tgcttccgta gagccagact acatcatgtg gttgtctgac attgtggaag 420

acaagcgtgc tttgaccact cagactggcg ccccctgggg actcggcact gtctcccacc 480

gcacacccgg ctcaactagc tacatctatg acacttcggc tggtagcgga acattcgcct 540

atgttgttga ctctggaatc aacattgctc accagcaatt cggcggacgt gccagcctcg 600

gctacaacgc cgctggtgga gatcatgtcg acactctcgg ccacggcacg cacgtttccg 660

gaactatcgg tggctctacc tatggtgttg ctaagcaggt aagctgcttc attatacttc 720

ttcctttgca gtgcgggcct tgagcacgcc gggctgactc tgtaacgaaa ggccagctta 780

atctccgtca aggtcttcca gggcaacagc gccagcacct cggtcatcct tgacggctat 840

aattgggccg tgaacgacat tgtctcccgc aaccgcgcca gcaagtctgc catcaacatg 900

tctctcggtg gcccggcctc ttccacctgg gctacggcga tcaatgcagc ctttaacaag 960

ggcgtcctga cgatcgtggc cgccggcaat ggtgacgctc ttggaaaccc tcagcctgtc 1020

tccagtactt ctccagccaa tgtgcccaac gccatcaccg tcgcagccct tgacattaac 1080

tggcgcaccg cttccttcac caattatggt gctggcgttg acgtcttcgc tcctggtgtc 1140

aacatcctgt cttcgtggat cggctctaac actgccacaa acacgattag cggcacctcc 1200

atggccactc ctcacgttgt cggcctcgct ctttacctgc aggctcttga gggccttagc 1260

accccgactg ctgtaaccaa ccgcatcaag gccttggcta ctactggacg cgtcaccggc 1320

agtctgaatg gcagccccaa cactctcatc ttcaacggga acagtgctta a 1371

<210> 6

<211> 409

<212> PRT

<213> 里氏木霉

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 全长里氏木霉QM6a蛋白酶Prb1 (Tr_Prb1)的推导的氨基酸序列，包括从Met1到Ala409的氨基酸

<400> 6

Met Ala Ser Leu Arg Arg Leu Ala Leu Tyr Leu Gly Ala Leu Leu Pro

1 5 10 15

Ala Val Leu Ala Ala Pro Ala Val Asn Tyr Lys Leu Pro Glu Ala Val

20 25 30

Pro Asn Lys Phe Ile Val Thr Leu Lys Asp Gly Ala Ser Val Asp Thr

35 40 45

Asp Ser His Leu Thr Trp Val Lys Asp Leu His Arg Arg Ser Leu Gly

50 55 60

Lys Arg Ser Thr Ala Gly Val Glu Lys Thr Tyr Asn Ile Asp Ser Trp

65 70 75 80

Asn Ala Tyr Ala Gly Glu Phe Asp Glu Glu Thr Val Lys Gln Ile Lys

85 90 95

Ala Asn Pro Asp Val Ala Ser Val Glu Pro Asp Tyr Ile Met Trp Leu

100 105 110

Ser Asp Ile Val Glu Asp Lys Arg Ala Leu Thr Thr Gln Thr Gly Ala

115 120 125

Pro Trp Gly Leu Gly Thr Val Ser His Arg Thr Pro Gly Ser Thr Ser

130 135 140

Tyr Ile Tyr Asp Thr Ser Ala Gly Ser Gly Thr Phe Ala Tyr Val Val

145 150 155 160

Asp Ser Gly Ile Asn Ile Ala His Gln Gln Phe Gly Gly Arg Ala Ser

165 170 175

Leu Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Gly Asp His Val Asp Thr Leu Gly His

180 185 190

Gly Thr His Val Ser Gly Thr Ile Gly Gly Ser Thr Tyr Gly Val Ala

195 200 205

Lys Gln Ala Ser Leu Ile Ser Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Ser Ala

210 215 220

Ser Thr Ser Val Ile Leu Asp Gly Tyr Asn Trp Ala Val Asn Asp Ile

225 230 235 240

Val Ser Arg Asn Arg Ala Ser Lys Ser Ala Ile Asn Met Ser Leu Gly

245 250 255

Gly Pro Ala Ser Ser Thr Trp Ala Thr Ala Ile Asn Ala Ala Phe Asn

260 265 270

Lys Gly Val Leu Thr Ile Val Ala Ala Gly Asn Gly Asp Ala Leu Gly

275 280 285

Asn Pro Gln Pro Val Ser Ser Thr Ser Pro Ala Asn Val Pro Asn Ala

290 295 300

Ile Thr Val Ala Ala Leu Asp Ile Asn Trp Arg Thr Ala Ser Phe Thr

305 310 315 320

Asn Tyr Gly Ala Gly Val Asp Val Phe Ala Pro Gly Val Asn Ile Leu

325 330 335

Ser Ser Trp Ile Gly Ser Asn Thr Ala Thr Asn Thr Ile Ser Gly Thr

340 345 350

Ser Met Ala Thr Pro His Val Val Gly Leu Ala Leu Tyr Leu Gln Ala

355 360 365

Leu Glu Gly Leu Ser Thr Pro Thr Ala Val Thr Asn Arg Ile Lys Ala

370 375 380

Leu Ala Thr Thr Gly Arg Val Thr Gly Ser Leu Asn Gly Ser Pro Asn

385 390 395 400

Thr Leu Ile Phe Asn Gly Asn Ser Ala

405

<210> 7

<211> 1311

<212> DNA

<213> 里氏木霉

<220>

<221> misc_feature

<223> 编码前酶形式的里氏木霉Prb1蛋白酶的氨基酸序列的核苷酸序列

<400> 7

gctcctgctg tcaattacaa gctgcctgaa gctgttccca acaagttcat tgtcactctc 60

aaagatggtg cctctgttga tacagactct caccttacat gggtgaaaga ccttcacagg 120

cgctcactcg gcaagcgcag cactgctggt gttgagaaga cgtacaacat cgacagctgg 180

aatgcctatg ctggcgagtt cgatgaagaa accgttaagc agatcaaggc gaatcccgac 240

gtaagtattt gccctactgt tggacgagat gccaatgttc cattgcgaaa ttctaatgag 300

cataccaggt tgcttccgta gagccagact acatcatgtg gttgtctgac attgtggaag 360

acaagcgtgc tttgaccact cagactggcg ccccctgggg actcggcact gtctcccacc 420

gcacacccgg ctcaactagc tacatctatg acacttcggc tggtagcgga acattcgcct 480

atgttgttga ctctggaatc aacattgctc accagcaatt cggcggacgt gccagcctcg 540

gctacaacgc cgctggtgga gatcatgtcg acactctcgg ccacggcacg cacgtttccg 600

gaactatcgg tggctctacc tatggtgttg ctaagcaggt aagctgcttc attatacttc 660

ttcctttgca gtgcgggcct tgagcacgcc gggctgactc tgtaacgaaa ggccagctta 720

atctccgtca aggtcttcca gggcaacagc gccagcacct cggtcatcct tgacggctat 780

aattgggccg tgaacgacat tgtctcccgc aaccgcgcca gcaagtctgc catcaacatg 840

tctctcggtg gcccggcctc ttccacctgg gctacggcga tcaatgcagc ctttaacaag 900

ggcgtcctga cgatcgtggc cgccggcaat ggtgacgctc ttggaaaccc tcagcctgtc 960

tccagtactt ctccagccaa tgtgcccaac gccatcaccg tcgcagccct tgacattaac 1020

tggcgcaccg cttccttcac caattatggt gctggcgttg acgtcttcgc tcctggtgtc 1080

aacatcctgt cttcgtggat cggctctaac actgccacaa acacgattag cggcacctcc 1140

atggccactc ctcacgttgt cggcctcgct ctttacctgc aggctcttga gggccttagc 1200

accccgactg ctgtaaccaa ccgcatcaag gccttggcta ctactggacg cgtcaccggc 1260

agtctgaatg gcagccccaa cactctcatc ttcaacggga acagtgctta a 1311

<210> 8

<211> 389

<212> PRT

<213> 里氏木霉

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 前酶形式的里氏木霉Prb1蛋白酶的氨基酸序列，包括全长蛋白酶的氨基酸Ala21到Ala 409

<400> 8

Ala Pro Ala Val Asn Tyr Lys Leu Pro Glu Ala Val Pro Asn Lys Phe

1 5 10 15

Ile Val Thr Leu Lys Asp Gly Ala Ser Val Asp Thr Asp Ser His Leu

20 25 30

Thr Trp Val Lys Asp Leu His Arg Arg Ser Leu Gly Lys Arg Ser Thr

35 40 45

Ala Gly Val Glu Lys Thr Tyr Asn Ile Asp Ser Trp Asn Ala Tyr Ala

50 55 60

Gly Glu Phe Asp Glu Glu Thr Val Lys Gln Ile Lys Ala Asn Pro Asp

65 70 75 80

Val Ala Ser Val Glu Pro Asp Tyr Ile Met Trp Leu Ser Asp Ile Val

85 90 95

Glu Asp Lys Arg Ala Leu Thr Thr Gln Thr Gly Ala Pro Trp Gly Leu

100 105 110

Gly Thr Val Ser His Arg Thr Pro Gly Ser Thr Ser Tyr Ile Tyr Asp

115 120 125

Thr Ser Ala Gly Ser Gly Thr Phe Ala Tyr Val Val Asp Ser Gly Ile

130 135 140

Asn Ile Ala His Gln Gln Phe Gly Gly Arg Ala Ser Leu Gly Tyr Asn

145 150 155 160

Ala Ala Gly Gly Asp His Val Asp Thr Leu Gly His Gly Thr His Val

165 170 175

Ser Gly Thr Ile Gly Gly Ser Thr Tyr Gly Val Ala Lys Gln Ala Ser

180 185 190

Leu Ile Ser Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Ser Ala Ser Thr Ser Val

195 200 205

Ile Leu Asp Gly Tyr Asn Trp Ala Val Asn Asp Ile Val Ser Arg Asn

210 215 220

Arg Ala Ser Lys Ser Ala Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ala Ser

225 230 235 240

Ser Thr Trp Ala Thr Ala Ile Asn Ala Ala Phe Asn Lys Gly Val Leu

245 250 255

Thr Ile Val Ala Ala Gly Asn Gly Asp Ala Leu Gly Asn Pro Gln Pro

260 265 270

Val Ser Ser Thr Ser Pro Ala Asn Val Pro Asn Ala Ile Thr Val Ala

275 280 285

Ala Leu Asp Ile Asn Trp Arg Thr Ala Ser Phe Thr Asn Tyr Gly Ala

290 295 300

Gly Val Asp Val Phe Ala Pro Gly Val Asn Ile Leu Ser Ser Trp Ile

305 310 315 320

Gly Ser Asn Thr Ala Thr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr

325 330 335

Pro His Val Val Gly Leu Ala Leu Tyr Leu Gln Ala Leu Glu Gly Leu

340 345 350

Ser Thr Pro Thr Ala Val Thr Asn Arg Ile Lys Ala Leu Ala Thr Thr

355 360 365

Gly Arg Val Thr Gly Ser Leu Asn Gly Ser Pro Asn Thr Leu Ile Phe

370 375 380

Asn Gly Asn Ser Ala

385

<210> 9

<211> 943

<212> DNA

<213> 里氏木霉

<220>

<221> misc_feature

<223> 编码成熟形式的里氏木霉Prb1蛋白酶的氨基酸序列的核苷酸序列

<400> 9

gctttgacca ctcagactgg cgccccctgg ggactcggca ctgtctccca ccgcacaccc 60

ggctcaacta gctacatcta tgacacttcg gctggtagcg gaacattcgc ctatgttgtt 120

gactctggaa tcaacattgc tcaccagcaa ttcggcggac gtgccagcct cggctacaac 180

gccgctggtg gagatcatgt cgacactctc ggccacggca cgcacgtttc cggaactatc 240

ggtggctcta cctatggtgt tgctaagcag gtaagctgct tcattatact tcttcctttg 300

cagtgcgggc cttgagcacg ccgggctgac tctgtaacga aaggccagct taatctccgt 360

caaggtcttc cagggcaaca gcgccagcac ctcggtcatc cttgacggct ataattgggc 420

cgtgaacgac attgtctccc gcaaccgcgc cagcaagtct gccatcaaca tgtctctcgg 480

tggcccggcc tcttccacct gggctacggc gatcaatgca gcctttaaca agggcgtcct 540

gacgatcgtg gccgccggca atggtgacgc tcttggaaac cctcagcctg tctccagtac 600

ttctccagcc aatgtgccca acgccatcac cgtcgcagcc cttgacatta actggcgcac 660

cgcttccttc accaattatg gtgctggcgt tgacgtcttc gctcctggtg tcaacatcct 720

gtcttcgtgg atcggctcta acactgccac aaacacgatt agcggcacct ccatggccac 780

tcctcacgtt gtcggcctcg ctctttacct gcaggctctt gagggcctta gcaccccgac 840

tgctgtaacc aaccgcatca aggccttggc tactactgga cgcgtcaccg gcagtctgaa 900

tggcagcccc aacactctca tcttcaacgg gaacagtgct taa 943

<210> 10

<211> 289

<212> PRT

<213> 里氏木霉

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 成熟形式的里氏木霉Prb1蛋白酶的氨基酸序列，包括全长酶的氨基酸Ala121到Ala409

<400> 10

Ala Leu Thr Thr Gln Thr Gly Ala Pro Trp Gly Leu Gly Thr Val Ser

1 5 10 15

His Arg Thr Pro Gly Ser Thr Ser Tyr Ile Tyr Asp Thr Ser Ala Gly

20 25 30

Ser Gly Thr Phe Ala Tyr Val Val Asp Ser Gly Ile Asn Ile Ala His

35 40 45

Gln Gln Phe Gly Gly Arg Ala Ser Leu Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Gly

50 55 60

Asp His Val Asp Thr Leu Gly His Gly Thr His Val Ser Gly Thr Ile

65 70 75 80

Gly Gly Ser Thr Tyr Gly Val Ala Lys Gln Ala Ser Leu Ile Ser Val

85 90 95

Lys Val Phe Gln Gly Asn Ser Ala Ser Thr Ser Val Ile Leu Asp Gly

100 105 110

Tyr Asn Trp Ala Val Asn Asp Ile Val Ser Arg Asn Arg Ala Ser Lys

115 120 125

Ser Ala Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ala Ser Ser Thr Trp Ala

130 135 140

Thr Ala Ile Asn Ala Ala Phe Asn Lys Gly Val Leu Thr Ile Val Ala

145 150 155 160

Ala Gly Asn Gly Asp Ala Leu Gly Asn Pro Gln Pro Val Ser Ser Thr

165 170 175

Ser Pro Ala Asn Val Pro Asn Ala Ile Thr Val Ala Ala Leu Asp Ile

180 185 190

Asn Trp Arg Thr Ala Ser Phe Thr Asn Tyr Gly Ala Gly Val Asp Val

195 200 205

Phe Ala Pro Gly Val Asn Ile Leu Ser Ser Trp Ile Gly Ser Asn Thr

210 215 220

Ala Thr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Val

225 230 235 240

Gly Leu Ala Leu Tyr Leu Gln Ala Leu Glu Gly Leu Ser Thr Pro Thr

245 250 255

Ala Val Thr Asn Arg Ile Lys Ala Leu Ala Thr Thr Gly Arg Val Thr

260 265 270

Gly Ser Leu Asn Gly Ser Pro Asn Thr Leu Ile Phe Asn Gly Asn Ser

275 280 285

Ala

<210> 11

<211> 1292

<212> DNA

<213> 禾谷镰刀菌

<220>

<221> misc_feature

<223> 全长禾谷镰刀菌ALKO1726蛋白酶基因Fg prtS8A的核苷酸序列

<400> 11

atgaccagct tccgccgtct tgctctcgct cttggagctc tgctccctgc agtcctcgcc 60

gctcctactg agaagcgaca ggaactcact gccgcgcctg acaagtacat catcactctc 120

aagcccgagg ctactgagaa caagatcgag gctcacttga actgggtcag cgatgtccac 180

cgccgcagcc tgaacaagcg tgacacttct ggtgttgaga agaagttcaa catcagcagc 240

tggaacgcct actctggcga gttcgacaag gctaccattg atgagatcaa gaagagcccc 300

gaggttgctt tcgtcgagcc tgactacact gtctacctcg acttcgagac cgaactcact 360

gaccgtgctc tgaccaccca gagcggcgct ccttggggtc tcgcctccat ctcccgccga 420

acctccggtg gcagcaccta cacctacgac accactgccg gctccggttc ttacggatac 480

gtcgttgaca gcggcatcaa cgtcaaccac cgagacttcg gtggccgtgc ttctctcggt 540

tacaacgctg ccggtggttc ccacgtcgac accctgggcc acggtaccca cgttgctgga 600

accattgctt cttccaccta cggtgttgcc aaggctgtaa gtaaacccca cattatatgg 660

tagcatctga actttatact tactatcttt aggccaacgt catctctgtc aaggtcttca 720

ctggcaacag tgcctctacc tccactatcc tcgctggttt caactgggct gtcaacgaca 780

tcacttccaa gggccgtgct ggtcgctctg tcatcaacat gtctctcggc ggtccctctg 840

ctcagacctg gaccactgct atcaacgctg cctacaactc tggtgtcctc tccgttgttg 900

ctgccggtaa cggtgacgat ttcggccgcc ctcttcccgt ctctggccag tctcctgcca 960

acgtccccaa cgctctgacc gttgctgcca ttgactccag ctggcgcact gcctctttca 1020

ccaactacgg tgccggtgtt gatgtcttcg cccctggtgt cggcatcctc tccacctggt 1080

acacctccaa cactgctacc aactccatca gcggtacctc catggcctgc cctcacgttg 1140

ctggtcttgc tctctacctc caggttctcg agggtctttc cacccctgct gccgtcacca 1200

accgcatcaa ggctcttgct accactggcc gtgtcactgg caccctcaac ggcagcccca 1260

acctgatcgc cttcaacggt gcctctactt aa 1292

<210> 12

<211> 411

<212> PRT

<213> 禾谷镰刀菌

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 全长禾谷镰刀菌ALKO1726蛋白酶(Fg_ALKO1726)的推导的氨基酸序列，包括从Met1到Thr411的氨基酸

<400> 12

Met Thr Ser Phe Arg Arg Leu Ala Leu Ala Leu Gly Ala Leu Leu Pro

1 5 10 15

Ala Val Leu Ala Ala Pro Thr Glu Lys Arg Gln Glu Leu Thr Ala Ala

20 25 30

Pro Asp Lys Tyr Ile Ile Thr Leu Lys Pro Glu Ala Thr Glu Asn Lys

35 40 45

Ile Glu Ala His Leu Asn Trp Val Ser Asp Val His Arg Arg Ser Leu

50 55 60

Asn Lys Arg Asp Thr Ser Gly Val Glu Lys Lys Phe Asn Ile Ser Ser

65 70 75 80

Trp Asn Ala Tyr Ser Gly Glu Phe Asp Lys Ala Thr Ile Asp Glu Ile

85 90 95

Lys Lys Ser Pro Glu Val Ala Phe Val Glu Pro Asp Tyr Thr Val Tyr

100 105 110

Leu Asp Phe Glu Thr Glu Leu Thr Asp Arg Ala Leu Thr Thr Gln Ser

115 120 125

Gly Ala Pro Trp Gly Leu Ala Ser Ile Ser Arg Arg Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Ser Thr Tyr Thr Tyr Asp Thr Thr Ala Gly Ser Gly Ser Tyr Gly Tyr

145 150 155 160

Val Val Asp Ser Gly Ile Asn Val Asn His Arg Asp Phe Gly Gly Arg

165 170 175

Ala Ser Leu Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Gly Ser His Val Asp Thr Leu

180 185 190

Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ser Ser Thr Tyr Gly

195 200 205

Val Ala Lys Ala Ala Asn Val Ile Ser Val Lys Val Phe Thr Gly Asn

210 215 220

Ser Ala Ser Thr Ser Thr Ile Leu Ala Gly Phe Asn Trp Ala Val Asn

225 230 235 240

Asp Ile Thr Ser Lys Gly Arg Ala Gly Arg Ser Val Ile Asn Met Ser

245 250 255

Leu Gly Gly Pro Ser Ala Gln Thr Trp Thr Thr Ala Ile Asn Ala Ala

260 265 270

Tyr Asn Ser Gly Val Leu Ser Val Val Ala Ala Gly Asn Gly Asp Asp

275 280 285

Phe Gly Arg Pro Leu Pro Val Ser Gly Gln Ser Pro Ala Asn Val Pro

290 295 300

Asn Ala Leu Thr Val Ala Ala Ile Asp Ser Ser Trp Arg Thr Ala Ser

305 310 315 320

Phe Thr Asn Tyr Gly Ala Gly Val Asp Val Phe Ala Pro Gly Val Gly

325 330 335

Ile Leu Ser Thr Trp Tyr Thr Ser Asn Thr Ala Thr Asn Ser Ile Ser

340 345 350

Gly Thr Ser Met Ala Cys Pro His Val Ala Gly Leu Ala Leu Tyr Leu

355 360 365

Gln Val Leu Glu Gly Leu Ser Thr Pro Ala Ala Val Thr Asn Arg Ile

370 375 380

Lys Ala Leu Ala Thr Thr Gly Arg Val Thr Gly Thr Leu Asn Gly Ser

385 390 395 400

Pro Asn Leu Ile Ala Phe Asn Gly Ala Ser Thr

405 410

<210> 13

<211> 1232

<212> DNA

<213> 禾谷镰刀菌

<220>

<221> misc_feature

<223> 编码前酶形式的禾谷镰刀菌ALKO1726蛋白酶的氨基酸序列的核苷酸序列

<400> 13

gctcctactg agaagcgaca ggaactcact gccgcgcctg acaagtacat catcactctc 60

aagcccgagg ctactgagaa caagatcgag gctcacttga actgggtcag cgatgtccac 120

cgccgcagcc tgaacaagcg tgacacttct ggtgttgaga agaagttcaa catcagcagc 180

tggaacgcct actctggcga gttcgacaag gctaccattg atgagatcaa gaagagcccc 240

gaggttgctt tcgtcgagcc tgactacact gtctacctcg acttcgagac cgaactcact 300

gaccgtgctc tgaccaccca gagcggcgct ccttggggtc tcgcctccat ctcccgccga 360

acctccggtg gcagcaccta cacctacgac accactgccg gctccggttc ttacggatac 420

gtcgttgaca gcggcatcaa cgtcaaccac cgagacttcg gtggccgtgc ttctctcggt 480

tacaacgctg ccggtggttc ccacgtcgac accctgggcc acggtaccca cgttgctgga 540

accattgctt cttccaccta cggtgttgcc aaggctgtaa gtaaacccca cattatatgg 600

tagcatctga actttatact tactatcttt aggccaacgt catctctgtc aaggtcttca 660

ctggcaacag tgcctctacc tccactatcc tcgctggttt caactgggct gtcaacgaca 720

tcacttccaa gggccgtgct ggtcgctctg tcatcaacat gtctctcggc ggtccctctg 780

ctcagacctg gaccactgct atcaacgctg cctacaactc tggtgtcctc tccgttgttg 840

ctgccggtaa cggtgacgat ttcggccgcc ctcttcccgt ctctggccag tctcctgcca 900

acgtccccaa cgctctgacc gttgctgcca ttgactccag ctggcgcact gcctctttca 960

ccaactacgg tgccggtgtt gatgtcttcg cccctggtgt cggcatcctc tccacctggt 1020

acacctccaa cactgctacc aactccatca gcggtacctc catggcctgc cctcacgttg 1080

ctggtcttgc tctctacctc caggttctcg agggtctttc cacccctgct gccgtcacca 1140

accgcatcaa ggctcttgct accactggcc gtgtcactgg caccctcaac ggcagcccca 1200

acctgatcgc cttcaacggt gcctctactt aa 1232

<210> 14

<211> 391

<212> PRT

<213> 禾谷镰刀菌

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 前酶形式的禾谷镰刀菌ALKO1726蛋白酶的氨基酸序列，包括全长蛋白酶的氨基酸Ala21到Thr411

<400> 14

Ala Pro Thr Glu Lys Arg Gln Glu Leu Thr Ala Ala Pro Asp Lys Tyr

1 5 10 15

Ile Ile Thr Leu Lys Pro Glu Ala Thr Glu Asn Lys Ile Glu Ala His

20 25 30

Leu Asn Trp Val Ser Asp Val His Arg Arg Ser Leu Asn Lys Arg Asp

35 40 45

Thr Ser Gly Val Glu Lys Lys Phe Asn Ile Ser Ser Trp Asn Ala Tyr

50 55 60

Ser Gly Glu Phe Asp Lys Ala Thr Ile Asp Glu Ile Lys Lys Ser Pro

65 70 75 80

Glu Val Ala Phe Val Glu Pro Asp Tyr Thr Val Tyr Leu Asp Phe Glu

85 90 95

Thr Glu Leu Thr Asp Arg Ala Leu Thr Thr Gln Ser Gly Ala Pro Trp

100 105 110

Gly Leu Ala Ser Ile Ser Arg Arg Thr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Thr

115 120 125

Tyr Asp Thr Thr Ala Gly Ser Gly Ser Tyr Gly Tyr Val Val Asp Ser

130 135 140

Gly Ile Asn Val Asn His Arg Asp Phe Gly Gly Arg Ala Ser Leu Gly

145 150 155 160

Tyr Asn Ala Ala Gly Gly Ser His Val Asp Thr Leu Gly His Gly Thr

165 170 175

His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ser Ser Thr Tyr Gly Val Ala Lys Ala

180 185 190

Ala Asn Val Ile Ser Val Lys Val Phe Thr Gly Asn Ser Ala Ser Thr

195 200 205

Ser Thr Ile Leu Ala Gly Phe Asn Trp Ala Val Asn Asp Ile Thr Ser

210 215 220

Lys Gly Arg Ala Gly Arg Ser Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Ala Gln Thr Trp Thr Thr Ala Ile Asn Ala Ala Tyr Asn Ser Gly

245 250 255

Val Leu Ser Val Val Ala Ala Gly Asn Gly Asp Asp Phe Gly Arg Pro

260 265 270

Leu Pro Val Ser Gly Gln Ser Pro Ala Asn Val Pro Asn Ala Leu Thr

275 280 285

Val Ala Ala Ile Asp Ser Ser Trp Arg Thr Ala Ser Phe Thr Asn Tyr

290 295 300

Gly Ala Gly Val Asp Val Phe Ala Pro Gly Val Gly Ile Leu Ser Thr

305 310 315 320

Trp Tyr Thr Ser Asn Thr Ala Thr Asn Ser Ile Ser Gly Thr Ser Met

325 330 335

Ala Cys Pro His Val Ala Gly Leu Ala Leu Tyr Leu Gln Val Leu Glu

340 345 350

Gly Leu Ser Thr Pro Ala Ala Val Thr Asn Arg Ile Lys Ala Leu Ala

355 360 365

Thr Thr Gly Arg Val Thr Gly Thr Leu Asn Gly Ser Pro Asn Leu Ile

370 375 380

Ala Phe Asn Gly Ala Ser Thr

385 390

<210> 15

<211> 926

<212> DNA

<213> 禾谷镰刀菌

<220>

<221> misc_feature

<223> 编码成熟形式的禾谷镰刀菌ALKO1726蛋白酶的氨基酸序列的核苷酸序列

<400> 15

gctctgacca cccagagcgg cgctccttgg ggtctcgcct ccatctcccg ccgaacctcc 60

ggtggcagca cctacaccta cgacaccact gccggctccg gttcttacgg atacgtcgtt 120

gacagcggca tcaacgtcaa ccaccgagac ttcggtggcc gtgcttctct cggttacaac 180

gctgccggtg gttcccacgt cgacaccctg ggccacggta cccacgttgc tggaaccatt 240

gcttcttcca cctacggtgt tgccaaggct gtaagtaaac cccacattat atggtagcat 300

ctgaacttta tacttactat ctttaggcca acgtcatctc tgtcaaggtc ttcactggca 360

acagtgcctc tacctccact atcctcgctg gtttcaactg ggctgtcaac gacatcactt 420

ccaagggccg tgctggtcgc tctgtcatca acatgtctct cggcggtccc tctgctcaga 480

cctggaccac tgctatcaac gctgcctaca actctggtgt cctctccgtt gttgctgccg 540

gtaacggtga cgatttcggc cgccctcttc ccgtctctgg ccagtctcct gccaacgtcc 600

ccaacgctct gaccgttgct gccattgact ccagctggcg cactgcctct ttcaccaact 660

acggtgccgg tgttgatgtc ttcgcccctg gtgtcggcat cctctccacc tggtacacct 720

ccaacactgc taccaactcc atcagcggta cctccatggc ctgccctcac gttgctggtc 780

ttgctctcta cctccaggtt ctcgagggtc tttccacccc tgctgccgtc accaaccgca 840

tcaaggctct tgctaccact ggccgtgtca ctggcaccct caacggcagc cccaacctga 900

tcgccttcaa cggtgcctct acttaa 926

<210> 16

<211> 289

<212> PRT

<213> 禾谷镰刀菌

<220>

<221> MISC_FEATURE

<223> 成熟形式的禾谷镰刀菌ALKO1726蛋白酶的氨基酸序列，包括全长酶的氨基酸Ala123到Thr411

<400> 16

Ala Leu Thr Thr Gln Ser Gly Ala Pro Trp Gly Leu Ala Ser Ile Ser

1 5 10 15

Arg Arg Thr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Thr Tyr Asp Thr Thr Ala Gly

20 25 30

Ser Gly Ser Tyr Gly Tyr Val Val Asp Ser Gly Ile Asn Val Asn His

35 40 45

Arg Asp Phe Gly Gly Arg Ala Ser Leu Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Gly

50 55 60

Ser His Val Asp Thr Leu Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile

65 70 75 80

Ala Ser Ser Thr Tyr Gly Val Ala Lys Ala Ala Asn Val Ile Ser Val

85 90 95

Lys Val Phe Thr Gly Asn Ser Ala Ser Thr Ser Thr Ile Leu Ala Gly

100 105 110

Phe Asn Trp Ala Val Asn Asp Ile Thr Ser Lys Gly Arg Ala Gly Arg

115 120 125

Ser Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Ala Gln Thr Trp Thr

130 135 140

Thr Ala Ile Asn Ala Ala Tyr Asn Ser Gly Val Leu Ser Val Val Ala

145 150 155 160

Ala Gly Asn Gly Asp Asp Phe Gly Arg Pro Leu Pro Val Ser Gly Gln

165 170 175

Ser Pro Ala Asn Val Pro Asn Ala Leu Thr Val Ala Ala Ile Asp Ser

180 185 190

Ser Trp Arg Thr Ala Ser Phe Thr Asn Tyr Gly Ala Gly Val Asp Val

195 200 205

Phe Ala Pro Gly Val Gly Ile Leu Ser Thr Trp Tyr Thr Ser Asn Thr

210 215 220

Ala Thr Asn Ser Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Cys Pro His Val Ala

225 230 235 240

Gly Leu Ala Leu Tyr Leu Gln Val Leu Glu Gly Leu Ser Thr Pro Ala

245 250 255

Ala Val Thr Asn Arg Ile Lys Ala Leu Ala Thr Thr Gly Arg Val Thr

260 265 270

Gly Thr Leu Asn Gly Ser Pro Asn Leu Ile Ala Phe Asn Gly Ala Ser

275 280 285

Thr

Claims

1. 一种真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶具有丝氨酸蛋白酶活性，并且包含如SEQ ID NO:10中定义的成熟Tr Prb1酶的氨基酸序列或其具有相似性质的变体，其中所述酶可在低温或中等温度应用于修饰、降解或去除蛋白质性质的材料。

2. 根据权利要求1的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶可作为去垢剂添加剂应用。

3. 根据权利要求1或2的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶可得自丝状真菌木霉属。

4. 根据权利要求1 – 3中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶具有丝氨酸蛋白酶活性，并且包含所述氨基酸序列SEQ ID NO:10。

5. 根据权利要求1 – 4中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于成熟形式的所述酶具有25 - 35 kDa的分子质量。

6. 根据权利要求1 – 5中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于使用15分钟反应时间和酪蛋白作为底物，所述酶在pH 9的最适温度是30℃ - 70℃。

7. 根据权利要求1 – 6中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于使用15分钟反应时间和酪蛋白作为底物，所述酶在50℃具有在至少pH 6 – pH 11的pH范围的最适pH。

8. 根据权利要求1 – 7中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶能够在10℃ - 60℃在去垢剂的存在下降解且去除蛋白质性质的污物。

9. 根据权利要求1 – 8中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由分离的核酸分子编码，所述分离的核酸分子编码包含特征在于SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其具有相似性质的变体的多肽。

10. 根据权利要求1 – 9中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由包含核苷酸序列SEQ ID NO:9的分离的核酸分子编码。

11. 根据权利要求1 – 10中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由包括在pALK2650中的多核苷酸序列SEQ ID NO:5编码，所述pALK2650在登记号DSM 22635下保藏于大肠埃希氏菌RF8052中。

12. 根据权利要求1 – 11中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由包含与调节序列可操作地连接的核酸分子的重组表达载体产生，所述核酸分子编码根据权利要求1 – 11中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，所述调节序列能够指导所述丝氨酸蛋白酶编码基因在合适宿主中的表达。

13. 根据权利要求1 – 12中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在异源宿主中产生。

14. 根据权利要求1 – 13中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在微生物宿主中产生。

15. 根据权利要求1 – 14中任一项的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在木霉属、曲霉属、镰刀菌属、腐质霉属、金孢属、链孢霉属、根霉属、青霉属和被孢霉属的宿主中产生。

16. 根据权利要求15的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在木霉属或曲霉属中产生。

17. 根据权利要求16的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在里氏木霉中产生。

18. 一种编码真菌丝氨酸蛋白酶的分离的核酸分子，所述酶可在低温或中等温度应用于修饰、降解或去除蛋白质性质的材料，所述核酸分子选自下述：

（a）编码具有丝氨酸蛋白酶活性且包含如SEQ ID NO:10中所述的氨基酸序列或其具有相似性质的变体的多肽的核酸分子；

（b）包含如SEQ ID NO:9中所述的多核苷酸序列的核酸分子；

19. 根据权利要求18的真菌丝氨酸蛋白酶，其特征在于所述真菌丝氨酸蛋白酶可作为去垢剂添加剂应用。

20. 一种包含与调节序列可操作地连接的根据权利要求18的核苷酸序列的重组表达载体，所述调节序列能够指导所述丝氨酸蛋白酶编码基因在合适宿主中的表达。

21. 一种宿主细胞，其包含根据权利要求20的重组表达载体。

22. 根据权利要求21的宿主细胞，其特征在于所述宿主是微生物宿主。

23. 根据权利要求21或22的宿主细胞，其特征在于所述宿主是丝状真菌。

24. 根据权利要求21 – 23中任一项的宿主细胞，其特征在于所述宿主是木霉属、曲霉属、镰刀菌属、腐质霉属、金孢属、链孢霉属、根霉属、青霉属和被孢霉属。

25. 根据权利要求24的宿主细胞，其特征在于所述宿主是木霉属或曲霉属。

26. 根据权利要求25的宿主细胞，其特征在于所述宿主是里氏木霉。

27. 一种产生具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括培养根据权利要求21 – 26中任一项的宿主细胞和回收所述多肽的步骤。

28. 一种具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽，其由根据权利要求18的核酸序列编码且可通过根据权利要求27的方法获得。

29. 一种用于获得酶制剂的方法，其包括培养根据权利要求21 – 26中任一项的宿主细胞和从所述细胞中回收所述多肽或使所述细胞与所述培养基分离且获得所述上清液的步骤。

30. 一种酶制剂，其可通过根据权利要求29的方法获得。

31. 一种酶制剂，其包含根据权利要求1 – 17中任一项的丝氨酸蛋白酶。

32. 根据权利要求30或31的酶制剂，其特征在于所述制剂包含具有或不具有媒介剂的选自蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角质酶、果胶酶或氧化酶的其他酶。

33. 根据权利要求30 – 32中任一项的酶制剂，其特征在于所述制剂包含选自下述的合适添加剂：稳定剂、缓冲剂、表面活性剂、助洗剂、漂白剂、媒介剂、防蚀剂、抗再沉积剂、腐蚀剂、研磨剂、荧光增白剂、染料、色素和防腐剂。

34. 根据权利要求30 – 33中任一项的酶制剂，其特征在于所述酶制剂以液体、粉末或颗粒的形式。

35. 根据权利要求1 – 17中任一项的丝氨酸蛋白酶或根据权利要求30 – 34中任一项的酶制剂用于去垢剂、用于处理纤维、用于处理羊毛、用于处理毛发、用于处理皮革、用于处理食物或饲料、或用于涉及修饰、降解或去除蛋白质性质的材料的任何应用的用途。

36. 根据权利要求1 – 17中任一项的丝氨酸蛋白酶或根据权利要求30 – 34中任一项的酶制剂作为去垢剂添加剂的用途。

37. 根据权利要求36在去垢剂液体中的用途。

38. 根据权利要求36在去垢剂粉末中的用途。