CN113981103B

CN113981103B - 罗氏沼虾微卫星亲子鉴定的微卫星引物对及检测试剂盒和鉴定方法

Info

Publication number: CN113981103B
Application number: CN202111110152.3A
Authority: CN
Inventors: 王卫民; 虞炯莹
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-09-18
Filing date: 2021-09-18
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2041-09-18
Also published as: CN113981103A

Abstract

本发明公开一种罗氏沼虾微卫星亲子鉴定的微卫星引物对及检测试剂盒和鉴定方法；所述微卫星引物对的正向引物5’端进行荧光基团修饰，该方法首先对不同的待鉴定个体分别提取DNA；以提取DNA为模板，进行PCR；得到荧光PCR产物；荧光标记的扩增产物在ABI 3730XL遗传分型仪上进行检测，以GS‑500LIZ为分子量内标，用GeneMapper 4.0软件读取每个位点的片段长度，采用CERVUS 3.0软件对亲本和子代的基因型进行分析，确定每个子代的父母本，并与已知的实际亲缘关系进行比较，判断亲子鉴定成功率。本发明的微卫星位点多态性高，利用少数位点即可在罗氏沼虾亲子鉴定中得到较好的鉴定效果。

Description

罗氏沼虾微卫星亲子鉴定的微卫星引物对及检测试剂盒和鉴定方法

技术领域

本发明涉及动物分子学遗传领域，具体涉及一种罗氏沼虾微卫星亲子鉴定的微卫星引物对及检测试剂盒和鉴定方法。

背景技术

罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)又称为马来西亚大虾、淡水长臂大虾，在分类上隶属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、游泳亚目(Natantia)、长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium)，是一种溯河性生物，原产于东南亚，广泛分布于热带、亚热带。罗氏沼虾于1976年首次引入我国，因其个体大、食性广、生长快、营养价值高等优点，被广泛养殖于广东、浙江、江苏等十多个省市。目前，我国养殖产量占全球一半以上，已经成为全球罗氏沼虾养殖产量最高的国家。但是在人工养殖模下，长期近亲繁殖和小群体间近交导致种质资源发生越来越严重的退化，主要表现为生长速度减缓、个体趋于小型化、性成熟提前、繁殖率下降和病害增多。因此，为了促进罗氏沼虾养殖业的可持续发展，开展其良种选育工作是目前急需进行的工作之一。

在水产动物选育过程中，清晰的系谱信息对于遗传参数的研究和家系的选育至关重要。罗氏沼虾有着特殊及复杂的自然交配繁殖方式，期间会进行两性遭遇及识别，雄虾占位，雌虾蜕壳，交配和雌虾产卵及抱卵孵化等过程，因此罗氏沼虾全同胞家系的建立不同于其他能进行人工繁殖的水产动物，只能依靠亲子鉴定或者效率低下的单个雌雄配对。此外，在传统的罗氏沼虾选育工作中，为了区分不同家系的后代，一般在混养前通过尾部注射可视嵌入性荧光标记等物理标记来达到混养后再区分的目的，但是这种方法要求罗氏沼虾成长到幼体阶段才能实施，并且实施过程会对幼体造成物理损伤，标记后常出现个体死亡的现象。甲壳动物在生长过程中还会经历多次蜕壳，导致个别个体的物理标记随着蜕壳而消失。有研究表明，在动物和植物种群中，由于个别标签脱落、荧光标签漂移和人为错误等原因导致的系谱错误时有发生，概率在10％左右，这些错误的发生在一定程度上会导致基于家系选育的遗传参数预测存在误差。基于上述问题，如何在养殖过程中保持准确的系谱信息，成为罗氏沼虾选育工作面临的主要困难之一。

亲子鉴定(Parentage Identification)，或亲缘关系鉴定，是一种基于分子遗传学理论，利用分子标记判断子代与亲本之前是否存在亲缘关系的技术。能够为现代动物家系选育和综合选育提供完整，准确的系谱信息。同时，该技术的建立能够允许水产动物在孵化早期就能实现家系混养，进而降低由于单独养殖造成的环境因素的影响，使得家系生长性能、杂交优势和遗传参数的评估更加精确。目前水产动物亲子鉴定主要采用微卫星(Simple Sequence Repeat，SSR)分子标记，微卫星标记因其分布广泛、共显性、高多态性、对DNA样品质量要求较低等优点，被广泛应用于团头鲂、草鱼、黄金鲈，石斑鱼等水产动物的亲子鉴定和群体遗传多样性分析中。目前，将微卫星标记应用于罗氏沼虾亲子鉴定的研究仅见于Karaket等开展的利用二碱基重复微卫星位点进行家系亲缘关系的重建，但是对该研究中的引物对进行扩增效果检测后，发现存在严重的影子带，影子带的存在会对分型结果造成一定程度的错误，此外，由于种群分化的原因，不同的微卫星引物对组合在不同的群体中具有不同的鉴定效果。因此，构建一个由扩增稳定且高度多态的三碱基及以上重复碱基微卫星位点组成的亲子鉴定体系对罗氏沼虾的遗传育种具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种罗氏沼虾微卫星亲子鉴定的微卫星引物对及检测试剂盒和鉴定方法。本发明利用高度多态的微卫星位点的荧光标记引物和毛细管电泳分型进行家系的鉴定，为罗氏沼虾分子标记辅助育种建立一个有效的亲子鉴定体系，从而为罗氏沼虾的良种选育工作提供有意义的分子技术。

为实现上述目的，本发明所设计一种罗氏沼虾微卫星亲子鉴定的微卫星引物对，所述微卫星引物对的正向引物5’端进行荧光基团修饰，所述微卫星引物对如下：

MRO1	F:	cgaaaaagttgaagcaccgt	R:	Actgcaacacgctacatggt
					MRO4	F:	ctgcaaagctgtatgtgcgt	R:	tgaccaggaacgacattttg
MRO5	F:	agcggaggtccctaggaata	R:	gccattcttttcaataagacctgt
					MRO7	F:	gtgaggtgcactgacggc	R:	gacaaggaggacggtgacag
MRO9	F:	gaagaaggtacgaacgcat	R:	gtgagccgccttattccttt
					MRO12	F:	ccacgaatgccatagttcct	R:	tcgcgacctagacctatgct
MRO16	F:	actgttctccccgatgagc	R:	tccagggctattttgactgg
					MRO17	F:	cgtccaagcctatgggacta	R:	gatgctggtgatgatgatgc
Mr-70	F:	catcagcatttggcagtc	R:	cattggagcccttgaact
					51708	F:	gtgagatctccacgcccaaa	R:	tcagcgcattcagtcggttt

进一步地，所述荧光基团选自FAM(蓝色)、HEX(绿色)、TAMRA(黑色)、ROX(红色)。

本发明还提供了一种罗氏沼虾微卫星亲子鉴定的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括权利要求1所述微卫星引物对。

进一步地，所述检测试剂盒还包括细胞裂解液、蛋白酶K、7.5M醋酸铵、异丙醇、70％乙醇、无水乙醇、2×Premix Taq、ddH₂O；其中2×Premix Taq的主要成分为0.05U/μLTaq DNA聚合酶、3mM Mg²⁺和0.4mM dNTPs

再进一步地，所述细胞裂解液的成分为：Tris-HCL 100mM，pH 8.0；EDTA 50mM，pH8.0；SDS 1％，pH 8.0；NaCl 125mM。

本发明还提供了一种利用上述试剂盒进行罗氏沼虾微卫星亲子鉴定方法，包括以下步骤：

1)对不同的待鉴定个体分别提取DNA；

2)以提取DNA为模板，进行PCR；得到荧光PCR产物；

3)荧光标记的扩增产物在ABI 3730XL遗传分型仪上进行检测，以引物GS-500LIZ为分子量内标，用GeneMapper 4.0软件读取每个位点的片段长度，采用CERVUS 3.0软件对亲本和子代的基因型进行分析，确定每个子代的父母本，并与已知的实际亲缘关系进行比较，判断亲子鉴定成功率。

作为优选方案所述提取DNA的方法如下：

1)取100mg样品，用滤纸吸干乙醇，置于2ml的离心管中，加入600mL细胞裂解液，用剪刀将组织剪碎，然后每管加入6μL蛋白酶K(20mg/L)，混匀后放入65℃水浴锅中水浴2-4h，每30min上下颠倒离心管，直至组织裂解完全；

2)取出离心管冷却至室温，每管加入200mL 7.5M醋酸铵，充分摇匀后置于冰上5min，4℃条件下12000rpm离心10min，取570μL上清液至新的1.5mL离心管中，然后再次4℃下12000rpm离心10min，取500μL上清液至新的1.5mL的离心管中，加入等量(500mL)异丙醇，轻摇混匀，冰上放置1-2min，12000rpm，4℃离心10min，弃上清；

3)加入1mL 70％乙醇，进行清洗，12000rpm，4℃离心10min，弃上清，重复清洗一遍；

4)加入1mL无水乙醇，进行清洗，12000rpm，4℃离心5min，弃上清，离心管倒扣在滤纸上干燥15-20min，加入适当的双蒸水进行溶解；检测浓度和质量后，稀释至100ng/μL保存在-20℃备用。

作为优选方案，所述步骤2)中，PCR反应体系为：总体积12.5μL：2×Premix Taq6.25μL，正反引物各0.5μL，DNA模板0.5μL，ddH₂O 4.75μL。

作为优选方案，所述步骤2)中，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，适合的退火温度下退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃延伸7min，4℃暂存。

本发明的有益效果：

1)本发明开发和筛选的微卫星位点多态性高，利用少数位点即可在罗氏沼虾亲子鉴定中得到较好的鉴定效果。

2)本发明利用不同的荧光基团修饰引物，可将不同荧光修饰的位点混合后上机检测，大大降低了检测的成本。

3)本发明允许在早期就能进行不同家系个体的混养，减少了家系单养的成本和因单独养殖造成的环境影响，使选育结果更加准确可靠。

附图说明

图1为实施例1中部份位点的聚丙烯凝胶电泳图，每个位点以8个个体的全基因组DNA为模板进行PCR扩增。

图2实施例3中部分位点的基因分型图，子代的两个等位基因分别来自父本和母本，符合孟德尔分离定律。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

实施例1多态型微卫星位点筛选

基于转录组数据和已发表的文章选择150个3碱基重复以上的微卫星位点合成引物，在8个野生个体中进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳选择条带清晰，扩增稳定的引物用于后续多态性检测，然后通过聚丙烯凝胶电泳选择如图1所示条带数大于3的引物合成荧光引物，每条引物的正向引物5’端分别用FAM，HEX，TAMRA，ROX进行修饰，普通引物和荧光引物均由武汉擎科生物技术有限公司合成。

合成的荧光引物在32个个体中进行扩增，扩增产物在ABI 3730XL遗传分型仪上进行检测，校准后的分型数据整理在excel表格中，然后通过Cervus软件分析每个位点的观测杂合度、期望杂合度、多态性、平均排除率和累计排除率(表1)最后综合考虑累计排除率和鉴定成本选择多态性排名前十的10对引物为亲子鉴定的引物，引物信息见表2。

PCR反应体系为12.5μL，包括6.25μL Premix Taq(Takara Bio Inc，大连，中国)，0.5μL正反引物(10μm/L)，0.5μL DNA模板(100ngμL^-1)，4.75μL双蒸水。PCR反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，Ta退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；之后72℃延伸7min，最后4℃保存。

表1 21个候选罗氏沼虾微卫星位点在32个个体中的遗传信息

注：ND表示未作检验，，NS表示不显著偏离(P>0.05),*表示显著偏离(P<0.05)，**表示显著偏离(P<0.01)，***表示极显著偏离(P<0.001)。

表2用于罗氏沼虾亲子鉴定的微卫星引物信息

注：F为正向引物，R为反向引物

实施例2

罗氏沼虾微卫星亲子鉴定的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括微卫星引物对、细胞裂解液、蛋白酶K、7.5M醋酸铵、异丙醇、70％乙醇、无水乙醇、2×Premix Taq、ddH₂O。

其中，所述细胞裂解液的成分为：Tris-HCL 100mM，pH 8.0；EDTA 50mM，pH 8.0；SDS 1％，pH 8.0；NaCl 125mM。

微卫星引物对如下：

实施例3

利用上述试剂盒进行罗氏沼虾微卫星亲子鉴定方法如下：

1.罗氏沼虾全同胞家系的建立

选择较大、健康无病、附肢完整的雌雄个体，以雌雄1：3的比例进行人工配组，每组虾在单独的网箱里进行交配和发育，共建立了30个家系，同时剪取每尾亲本的附肢保存在无水乙醇中用于DNA的提取。30个家系的子代在单独的圆桶内进行幼体培育，待溞状幼体发育至Ⅹ期时，从每个家系中选择30尾幼体，保存于无水乙醇中，作为亲子鉴定的样本。

2.亲本和子代DNA的提取

取每尾亲本的附肢100mg和采集的每尾幼体，用滤纸吸干乙醇，置于2ml的离心管中，加入600mL细胞裂解液(Tris-HCL 100mM，pH 8.0；EDTA 50mM，pH 8.0；SDS 1％，pH 8.0；NaCl 125mM)，用剪刀将组织剪碎，然后每管加入6μL蛋白酶K(20mg/L)，混匀后放入65℃水浴锅中水浴2-4h，每30min上下颠倒离心管，直至组织裂解完全。取出离心管冷却至室温，每管加入200mL 7.5M的醋酸铵，充分摇匀后置于冰上5min，4℃条件下12000rpm离心10min，取570μL上清液至新的1.5mL离心管中，然后再次4℃下12000rpm离心10min，取500μL上清液至新的1.5mL的离心管中，加入等量(500mL)异丙醇，轻摇混匀，冰上放置1-2min，12000rpm，4℃离心10min，弃上清。加入1mL 70％乙醇，进行清洗，12000rpm，4℃离心10min，弃上清，重复该步骤。加入1mL无水乙醇，进行清洗，12000rpm，4℃离心5min，弃上清，离心管倒扣在滤纸上干燥15-20min，加入适当的双蒸水进行溶解，检测浓度和质量后，稀释至100ng/μL保存在-20℃备用。

3.微卫星位点基因分型和亲子鉴定分析

对选择的10对引物在所有样本中进行PCR扩增，扩增产物在ABI 3730XL遗传分型仪上进行检测，以GS-500LIZ为分子量内标，用GeneMapper 4.0软件读取每个位点的片段长度。用Cervus软件计算每个微卫星位点的等位基因频率，期望杂合度，观测杂合度，多态信息含量，平均排除概率，哈迪-温伯格平衡和无效等位基因概率(表3)。然后依次进行模拟分析和亲缘关系分析，根据LOD值鉴定每个子代的亲本对。

4.亲子鉴定结果

在模拟分析中，用50对亲本模拟产生10000个子代，在80％和95％的置信区间范围内亲子鉴定成功的概率均可达100％。在实际鉴定的30个家系的852个个体中，827个个体找到了与家系记录相一致的父母本，并且每一个位点在父母本和子代中的基因型符合孟德尔分离定律，以位点MRO1、MRO4、MRO5为例，子代的两个等位基因分别来自父本和母本(图2)。此外有12例没有找到真正的父本，16例没有找到真正的母本，其中3例的父母本均发生错配。因此，从候选父母本中找到真实父母本的概率分别为98.6％和98.1％，总体鉴定成功率为97.1％，能够满足遗传育种系谱关系重建的要求。

表3 10个微卫星位点的遗传多样性统计及排除率

注：***表示极显著偏离(P<0.001)

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 罗氏沼虾微卫星亲子鉴定的微卫星引物对及检测试剂盒和鉴定方法

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 1

cgaaaaagtt gaagcaccgt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 2

actgcaacac gctacatggt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 3

ctgcaaagct gtatgtgcgt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 4

tgaccaggaa cgacattttg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 5

agcggaggtc cctaggaata 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 6

gccattcttt tcaataagac ctgt 24

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 7

gtgaggtgca ctgacggc 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 8

gacaaggagg acggtgacag 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 9

gaagaaggta cgaacgcat 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 10

gtgagccgcc ttattccttt 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 11

ccacgaatgc catagttcct 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 12

tcgcgaccta gacctatgct 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 13

actgttctcc ccgatgagc 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 14

tccagggcta ttttgactgg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 15

cgtccaagcc tatgggacta 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 16

gatgctggtg atgatgatgc 20

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 17

catcagcatt tggcagtc 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 18

cattggagcc cttgaact 18

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 19

gtgagatctc cacgcccaaa 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 20

tcagcgcatt cagtcggttt 20

Claims

1.一种罗氏沼虾微卫星亲子鉴定的微卫星引物对，其特征在于：所述微卫星引物对的正向引物5’端进行荧光基团修饰，所述微卫星引物对如下：

所述荧光基团选自FAM、HEX、TAMRA、ROX。

2.一种罗氏沼虾微卫星亲子鉴定的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括权利要求1所述微卫星引物对、细胞裂解液、蛋白酶K、7.5M醋酸铵、异丙醇、70％乙醇、无水乙醇、2×Premix Taq、ddH₂O，其中，2×Premix Taq的主要成分为0.05U/μL Taq DNA聚合酶、3mM Mg²⁺、0.4mM dNTPs。

3.根据权利要求2所述检测试剂盒，其特征在于：所述细胞裂解液的成分为：Tris-HCL100mM，pH 8.0；EDTA50mM，pH 8.0；SDS 1％，pH 8.0；NaCl 125mM。

4.一种利用权利要求2所述试剂盒进行罗氏沼虾微卫星亲子鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)对不同的待鉴定个体分别提取DNA；

2)以提取DNA为模板，进行PCR；得到荧光PCR产物；

3)荧光标记的扩增产物在ABI 3730XL遗传分型仪上进行检测，以GS-500LIZ为分子量内标，用GeneMapper 4.0软件读取每个位点的片段长度，采用CERVUS 3.0软件对亲本和子代的基因型进行分析，确定每个子代的父母本，并与已知的实际亲缘关系进行比较，判断亲子鉴定成功率。

5.根据权利要求4所述鉴定方法，其特征在于：所述提取DNA的方法如下：

1)取100mg样品，用滤纸吸干乙醇，置于2ml的离心管中，加入600mL细胞裂解液，用剪刀将组织剪碎，然后每管加入6μL蛋白酶K，混匀后放入65℃水浴锅中水浴2-4h，每30min上下颠倒离心管，直至组织裂解完全；

2)取出离心管冷却至室温，每管加入200mL 7.5M醋酸铵，充分摇匀后置于冰上5min，4℃条件下12000rpm离心10min，取570μL上清液至新的1.5mL离心管中，然后再次4℃下12000rpm离心10min，取500μL上清液至新的1.5mL的离心管中，加入等量异丙醇，轻摇混匀，冰上放置1-2min，12000rpm，4℃离心10min，弃上清；