CN102127599A - 快速生长的大口黑鲈微卫星标记筛选及其应用 - Google Patents

Abstract

快速生长的大口黑鲈微卫星标记筛选及其应用，属于鱼类分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及快速生长的大口黑鲈微卫星标记筛选，及利用这些标记辅助大口黑鲈快速生长品系的选育工作。筛选到5个与大口黑鲈生长性状紧密相关的等位基因，并建立一种快速、准确、有效地利用分子标记检测大口黑鲈优良个体的方法，以早期鉴定出具有优良性状的个体，为筛选优良亲本提供参考。利用本方法将生产中同时具有这5个优势等位基因的个体选作亲本，有目的的选择优良种质，从而保证后代种质优良，可提高生长速度。该方法与传统的方法相比，具有目的性强，作用效果直接的优点。且操作简单、检测快速、检测成本低，便于广泛推广使用。

Description

快速生长的大口黑鲈微卫星标记筛选及其应用

技术领域

大口黑鲈属于我国重要的淡水养殖鱼类之一。本发明属于鱼类分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及快速生长的大口黑鲈微卫星标记筛选，及利用这些标记辅助大口黑鲈快速生长品系的选育工作。

背景技术

大口黑鲈(Micropterus salmoides L.)，俗名加州鲈，原产于北美洲，属于鲈形目、鲈亚目、太阳鱼科、黑鲈属，具有生长快、耐低温、肉质鲜美和易捕捞等特点，是重要的淡水养殖鱼类之一。从上世纪70年代开始推广到世界各地，1983年从台湾引种到广东省，现在全国大部分地区均有养殖。2000 年，广东省大口黑鲈的养殖面积约为 10 万亩，产量 6.67 万吨，全国大口黑鲈的年产量在 10 万吨左右。2004 年，仅广东大口黑鲈产量 9.48 万吨，产值约 12.86 亿元。但是目前我国引进的大口黑鲈是由野生种家养驯化而成的，缺少定向选育，加上引种 20 多年来不注重亲本留种需遵守的操作规程，甚至有的苗种生产单位为了生产上的方便，选择个体小，性成熟早的个体作为亲本，致使我国目前养殖大口黑鲈种质的质量急剧下降，主要表现在生长速度下降、性成熟年龄普遍提前、饵料转化效率低、对环境不利影响和疾病的抵抗力也大幅下降，已严重制约我国大口黑鲈养殖业的发展。

生长速度是关系到养殖户所养殖大口黑鲈产量的高低，效益的高低的关键。近年来，由于大口黑鲈有小型化趋势，市场价格也受到极大影响，大大影响了大口黑鲈养殖者的信心，制约了大口黑鲈养殖业的发展。提高养殖鱼类生长速度的方法很多，如强化喂养，保持良好水质环境，控制合适的放养密度，挑选优质亲鱼进行繁殖等。其中，挑选个体较大、身体健壮的鱼作繁殖用亲本，其后代可能具有亲本生长快、抗病等优良品质，但这种方法对亲本的选择目的性还不够强，仍具有很多人为地因素和不确定的因素。大口黑鲈属于肉食性为主的鱼类，掠食性强，饵料不足是会互相残食，致使其生长悬殊较大，仅从表型判断大口黑鲈亲本质量是否优良还是不精确，但从DNA水平上进行选择，可以大大提高选择的准确性，并可在早期鉴定出具有优良性状的个体，筛选优良亲本，从而缩短育种周期，加快育种进程。

本实验室通过研究，在人工养殖的大口黑鲈群体中对 40 个微卫星位点进行扩增，运用卡方检验分析微卫星位点在极端大个体组和极端小个体组中的基因型分布差异，选择差异显著的 16 个微卫星位点对大口黑鲈随机群体进行基因型与性状的关联分析。结果表明：关联分析得到 5 个微卫星位点（ JZL60、JZL67、JZL72、MiSaTPW76 和 MiSaTPW117 ）与体重、体长和体高显著或极显著相关（ P<0.05 或 P<0.01 ），同时对差异显著的位点进行不同等位基因与生长性状的多重比较，找到了与体重、体长和体高性状相关的最有利等位基因为JZL60 的等位基因A、 JZL67 的等位基因B、JZL72 等位基因A，MiSaTPW76 的等位基因B 和 MiSaTPW117 的等位基因B。

本实验室根据筛选到的5个具有优势等位基因的微卫星标记引物（ JZL60、JZL67、JZL72、MiSaTPW76 和 MiSaTPW117 ），建立快速、有效地鉴定具有优良性状的个体。利用本方法将生产中具有该 5 个优势等位基因的个体保留，以提高大口黑鲈的品种质量。该方法与传统的方法相比，具有目的性强，作用效果直接的优点。且操作简单、检测快速、检测成本低，便于广泛推广使用。

发明内容

本发明筛选到 5 个与大口黑鲈生长性状紧密相关的等位基因，并建立一种快速、准确、有效地利用分子标记检测大口黑鲈优良个体的方法，以早期鉴定出具有优良性状的个体，为筛选优良亲本提供参考。

一、微卫星标记筛选

本申请人于2006年11月从广州市顺德南水大口黑鲈养殖基地选择300对亲鱼，2007年4月对选择的亲鱼进行人工繁殖，繁殖后代在同一养殖池中进行养殖。同年12月份选择该养殖池中的大口黑鲈160尾，建立体重的正态分布图，取15%的高值个体即体重为750g以上的记为“极端大群体”，15%低值个体即体重为315g以下的记为“极端小群体”，从两个群体中各随机选择12尾用于与生长相关微卫星位点的初步筛选。然后从相同的养殖池中随机选择121尾大口黑鲈用于生长性状关联分析，此121尾大口黑鲈记为“随机群体”。

本申请人利用实验室拥有的具有多态性且分型效果好的40个微卫星标记对极端群体进行扩增，扩增结果运用卡方检验分析40个微卫星标记在极端大个体组和极端小个体组中的基因型分布差异，选择差异显著的16个微卫星对大口黑鲈随机群体进行基因型与性状的关联分析。结果表明：关联分析得到 5 个微卫星位点（ JZL60、JZL67、JZL72、MiSaTPW76 和 MiSaTPW117 ）与体重、体长和体高显著或极显著相关（ P<0.05 或 P<0.01 ），同时对差异显著的位点进行不同等位基因与生长性状的多重比较，找到了与体重、体长和体高性状相关的最有利等位基因为JZL60 的等位基因A、 JZL67 的等位基因B、JZL72 等位基因A，MiSaTPW76 的等位基因B 和 MiSaTPW117 的等位基因B。

二、筛选的微卫星标记应用

利用筛选到的 5 个具有优势等位基因的微卫星标记，对待选择个体或亲本的大口黑鲈DNA样品进行PCR检测，扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺进行分析，将同时存在JZL60的等位基因A（227bp）、 JZL67的等位基因B（262bp）、 JZL72等位基因A（202bp）、 MiSaTPW76的等位基因B（257bp） 和 MiSaTPW117的等位基因B（214bp）的个体保留，去除不存在优势等位基因的个体。利用本方法将生产中同时具有这5个优势等位基因的个体选作亲本，有目的的选择优良种质，从而保证后代种质优良，可以大大提高大口黑鲈后代的生长速度。该方法与传统的方法相比，具有目的性强，作用效果直接的优点。且操作简单、检测快速、检测成本低，便于广泛推广使用。

三、具体检测方法

（一）微卫星引物

（二）模板DNA的提取

（1）取待检测鱼的鳍条组织3mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液（10 mmol/L Tris-HCl；0.1 mol/L EDTA；0.5% SDS；30mg/L RNase；100mg/L 蛋白酶K，pH8.0），55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动。

（2）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液。

（3）加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟。

（4）用70%乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE（10mmol/L Tris－HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0）溶解DNA，4℃贮存备用。

（三）PCR反应体系

ddH₂O                          14.9μL

10×PCR Buffer                    2.0μL

MgCl₂（25 mmol/L）              0.8μL

4×dNTP（10mmol/L）             0.3μL

Taq酶（5U/μL）                  0.2μL

上、下游引物（10μmol/L）         0.4μL

模板DNA（40ng/μL）             1.0μL

（四）PCR反应条件

（五）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

（1）8%非变性聚丙烯酰胺凝胶配制（35ml）：

单蒸水H2O	22.259ml
		30﹪聚丙烯酰胺原液	9.33ml
10×TBE	3.27ml
		20﹪AP	0.117 ml
TEMED	0.024ml

配制步骤：

①玻璃板的清洗：用水沾上洗剂把玻璃板擦洗干净后，再用超纯水冲洗，晾干备用。

②凝胶的灌制：先将固定好的玻璃架倾斜，将凝胶沿着梳子插槽边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，然后立即插上梳子，让凝胶溢出，这样可以避免产生气泡。在胶液和梳子接触面加少量单蒸水，以免空气氧化胶液表面。等待胶液凝聚时，仔细观察有无漏胶或气泡产生。一般在灌胶后4-6min即开始凝聚，室温25℃左右20min便可以聚合完全。如室温较低时，聚合时间相应延长。

（2）上样与凝胶电泳：

扩增产物与上样缓冲液按体积比3:1混匀后，用毛细管进样器吸取4μL混合物上样，在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压230V，电泳2-3h。

（六）硝酸银染色

（1）电泳完毕将胶取出，放于盛有单蒸水的塑料容器（面积比胶稍大）中轻轻漂洗10s，去掉蒸馏水；

（2）加入1%的AgNO₃溶液，在脱色摇床上轻摇3～4 min，倒掉AgNO₃溶液；用蒸馏水漂洗两次，每次不超过10s，倒掉蒸馏水；

（3）快速加入显色液（NaOH 10g，Na₂CO₃ 0.2g，HCHO 2ml，加蒸馏水定容至500ml）50ml，振荡30s后倒去；

（4）加入500mL显色液。一般3min内，带型显现；

（5）待带型清晰时，将胶取出放于凝胶成相***拍照，并进行条带分析。

有益效果

本检测方法大约可以在一天内操作完成，能为接下来要进行的大口黑鲈优良品种选育和鉴定提供快速准确的检测结果。我们通过对优势等位基因的鉴定，是在DNA水平上对大口黑鲈种质质量的评估，目的性更强。用该方法检测一个样品所需的成本大约为0.6元，成本低，适合推广应用。

附图说明

附图为大口黑鲈生长相关的微卫星标记筛选步骤。

另外，附有五个微卫星标记序列表，注：方框为引物序列。

Claims (2)

1.快速生长的大口黑鲈微卫星标记筛选，其特征是：

选择300对亲鱼，对选择的亲鱼进行人工繁殖，繁殖后代在同一养殖池中进行养殖，选择大口黑鲈160尾，建立体重的正态分布图，取15%的高值个体即体重为750g以上的记为“极端大群体”，15%低值个体即体重为315g以下的记为“极端小群体”，从两个群体中各随机选择12尾用于与生长相关微卫星位点的初步筛选，然后从相同的养殖池中随机选择121尾大口黑鲈用于生长性状关联分析，此121尾大口黑鲈记为“随机群体”；

利用实验室拥有的具有多态性且分型效果好的40个微卫星标记对极端群体进行扩增，扩增结果运用卡方检验分析40个微卫星标记在极端大个体组和极端小个体组中的基因型分布差异，选择差异显著的16个微卫星对大口黑鲈随机群体进行基因型与性状的关联分析,结果表明：关联分析得到 5 个微卫星位点：JZL60、JZL67、JZL72、MiSaTPW76 和 MiSaTPW117 ，与体重、体长和体高显著或极显著相关，如P<0.05 或 P<0.01 ，同时对差异显著的位点进行不同等位基因与生长性状的多重比较，找到了与体重、体长和体高性状相关的最有利等位基因为JZL60 的等位基因A、 JZL67 的等位基因B、JZL72 等位基因A，MiSaTPW76 的等位基因B 和 MiSaTPW117 的等位基因B。

2.快速生长的大口黑鲈微卫星标记筛选的应用，其特征是：

利用筛选到的 5 个具有优势等位基因的微卫星标记，对待选择个体或亲本的大口黑鲈DNA样品进行PCR检测，扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺进行分析，将同时存在JZL60的等位基因A（227bp）、 JZL67的等位基因B（262bp）、 JZL72等位基因A（202bp）、 MiSaTPW76的等位基因B（257bp） 和 MiSaTPW117的等位基因B（214bp）的个体保留，去除不存在优势等位基因的个体，利用本方法将生产中同时具有这5个优势等位基因的个体选作亲本，有目的的选择优良种质，从而保证后代种质优良，可以大大提高大口黑鲈后代的生长速度；

具体检测方法：

（一）微卫星引物

（二）模板DNA的提取

（1）取待检测鱼的鳍条组织3mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液（10 mmol/L Tris-HCl；0.1 mol/L EDTA；0.5% SDS；30mg/L RNase；100mg/L 蛋白酶K，pH8.0），55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动；

（2）加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；

（3）加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟；

（4）用70%乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE（10mmol/L Tris－HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0）溶解DNA，4℃贮存备用；

（三）PCR反应体系

ddH₂O                          14.9μL

10×PCR Buffer                    2.0μL

MgCl₂（25 mmol/L）              0.8μL

4×dNTP（10mmol/L）             0.3μL

Taq酶（5U/μL）                  0.2μL

上、下游引物（10μmol/L）         0.4μL

模板DNA（40ng/μL）             1.0μL

（四）PCR反应条件

（五）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

（1）8%非变性聚丙烯酰胺凝胶配制（35ml）：

单蒸水H₂O 22.259ml 30﹪聚丙烯酰胺原液 9.33ml 10×TBE 3.27ml 20﹪AP 0.117 ml TEMED 0.024ml

配制步骤：

①玻璃板的清洗：用水沾上洗剂把玻璃板擦洗干净后，再用超纯水冲洗，晾干备用；

②凝胶的灌制：先将固定好的玻璃架倾斜，将凝胶沿着梳子插槽边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，然后立即插上梳子，让凝胶溢出，这样可以避免产生气泡，在胶液和梳子接触面加少量单蒸水，以免空气氧化胶液表面，等待胶液凝聚时，仔细观察有无漏胶或气泡产生，一般在灌胶后4-6min即开始凝聚，室温25℃左右20min便可以聚合完全，如室温较低时，聚合时间相应延长；

（2）上样与凝胶电泳：

扩增产物与上样缓冲液按体积比3:1混匀后，用毛细管进样器吸取4μL混合物上样，在8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压230V，电泳2-3h；

（六）硝酸银染色

（1）电泳完毕将胶取出，放于盛有单蒸水的塑料容器（面积比胶稍大）中轻轻漂洗10s，去掉蒸馏水；

（2）加入1%的AgNO₃溶液，在脱色摇床上轻摇3～4 min，倒掉AgNO₃溶液；用蒸馏水漂洗两次，每次不超过10s，倒掉蒸馏水；

（3）快速加入显色液（NaOH 10g，Na₂CO₃ 0.2g，HCHO 2ml，加蒸馏水定容至500ml）50ml，振荡30s后倒去；

（4）加入500mL显色液，一般3min内，带型显现；

（5）待带型清晰时，将胶取出放于凝胶成相***拍照，并进行条带分析。

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