CN101918536B

CN101918536B - 用于人类和/或动物的营养的组合物、它们的应用和酵母菌

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Publication number: CN101918536B
Application number: CN2008801228126A
Authority: CN
Inventors: 让-吕克·西蒙; 乔治·皮涅德; 帕斯卡尔·范德克尔克奥韦; 达尼埃尔·普兰; 皮埃尔·德勒莫; 阿莱特·达尔弗耶-米肖; 阿德琳·西维尼恩
Original assignee: Lesaffre et Cie SA; Universite Lille 2 Droit et Sante; Universite Clermont Auvergne
Current assignee: Lesaffre et Cie SA; Universite Lille 2 Droit et Sante; Universite Clermont Auvergne
Priority date: 2007-12-26
Filing date: 2008-12-12
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2028-12-12
Also published as: MY159379A; LT2227539T; BRPI0820068A2; EP2227539A2; NZ586417A; CA2709850C; SI2227539T1; KR101654537B1; EP2227539B1; AU2008351156B2; RU2010131018A; RU2490324C2; US8476058B2; DK2227539T3; JP2011509651A; TN2010000239A1; MX2010007011A; NO2227539T3; WO2009103884A2; KR20110066118A

Abstract

本发明涉及新的酵母菌菌株、从这些菌株中获得的酵母菌、含有至少一种酿酒酵母菌和/或特别感兴趣的酵母菌衍生物的组合物，该组合物作为食品添加剂和/或益生菌和/或功能食品和/或营养品和/或功能成分和/或药妆品和/或药物活性试剂。本发明同样涉及同样的物质在人类和/或动物营养中的应用，或用于炎性疾病的治疗或预防。

Description

用于人类和/或动物的营养的组合物、它们的应用和酵母菌

技术领域

本发明涉及人类和/或动物营养和健康领域。

本发明更具体地涉及新的酵母菌菌株和从新菌株中获得的新的酵母菌。这些酵母菌对于消化道的舒适和/或预防和/或治疗人类或动物消化道紊乱特别有用。

背景技术

在文献中已经描述了许多微生物在人类消化道中的有益应用，以及它们营养的益处，例如，在WO 2006/021965中所描述的。

然后通常依据益生菌的范围指定这些微生物，益生菌对应于当施用充分量的微生物时，能够为宿主提供健康好处的活的微生物(结合FAO/WHO Expert Consultation Probiotics in food，FAO Food and nutritionpaper Nr85，ISBN 92-5-105513-0)。

由口服施用微生物产生的好处非常广泛地依赖于所使用的微生物菌株，但也依赖于它的施用形式。在同一种中，根据使用的菌株，观察到的效果确实是上下起伏，有时候有益，有时候无益或中性，例如在大肠杆菌种中可能既找到致病菌株(例如产肠毒素或肠出血类型)，又找到有益菌株例如Nissle 1917菌株(M.de Vrese；P.R.Marteau.Probiotics andPrebiotics：Effects on Diarrhea，2007，J.Nutr.，137(3 Suppl.2)，803S-811S)。因此，目前不可能预测对于给定菌株是否可以计算施用这个菌株在人类健康方面的益处，或甚至不可能预测它的可能的益处或它的强度的性质。

一些数量的微生物菌株，特别是在酵母菌和乳酸菌中，已经鉴别了对胃肠道的一些有益的效果。然而，要获得对于胃肠道的完全的有益作用，通常需要伴随施用几种不同性质的菌株(I.Goktepe；V.K.Juneja；M.Ahmedna(eds.)Probiotics in Food Safety and Human Health 2006，CRCTaylor & Francis，ISBN I-57444-514-6)。

此外，已经观察到很多微生物，特别是乳酸菌，具有促炎作用。该促炎作用可以证明是特别地有害和不需要的，例如在自身免疫性疾病或免疫缺陷中。

已经描述了酵母菌的一些片段和/或酵母菌的一些衍生物对消化道的有益效果。

因此，已经描述了源于酵母菌的甘露糖蛋白抑制病原体粘附的效果。同样，已经描述了酵母菌壁的纤维效果。但是存在许多酿酒酵母菌菌株，并且它们没有有益的效果或相同的效果。

此外，根据使用的菌株和施用的酵母菌形式，所述的效果可能同样非常不同。

同样，存在对微生物新菌株的需要，微生物新菌株可能发挥对健康的关于特定的病状或功能紊乱或不是的预防和/或治疗的有益效果，或对身体和精神通常的健康状态的有益效果。

发明内容

因此，本发明的目的是保藏在国家微生物培养物保藏中心(CollectionNationale de Cultures de Microorganismes)的CNCM I-3856号的酿酒酵母菌新菌株，和保藏在国家微生物培养物保藏中心的CNCM I-3799号的酿酒酵母var.boulardii新菌株。

它的目的同样是从保藏在国家微生物培养物保藏中心的CNCMI-3856号菌株获得的酿酒酵母菌，和从保藏在国家微生物培养物保藏中心的CNCM I-3799号菌株获得的酿酒酵母var.boulardii酵母菌。

本发明的另一个目的是一种组合物，该组合物包括从保藏在国家微生物培养物保藏中心的CNCM I-3856号菌株获得的酿酒酵母菌和/或从保藏在国家微生物培养物保藏中心的CNCM I-3799号菌株中获得的酿酒酵母var.boulardii酵母菌和/或至少一种选自酵母提取物、壁衍生物、壁葡聚糖、壁甘露糖蛋白、酵母脂质片段、酵母菌核酸(RNA、DNA)片段的酿酒酵母菌衍生物。

根据本发明的组合物具有以下优势：

-特别是以它的干燥的形式，通过胃屏障时的抵抗和存活能力，允许了它对胃肠道效果的最优化；

-抗炎作用；

-没有任何促炎效果或非常小的效果；

-减轻肠内疼痛的能力，以及最后

-预防或减少致病菌和/或具有胃肠道入侵性的那些细菌的吸附和增殖的能力，特别是小肠和结肠入侵性的细菌。

这样具有上述特征的组合的新组合物，还没有被描述或鉴别。

因此，它具有异常的重要性。

本发明的另一个目的是前述组合物用于制备食品增补剂和/或益生菌和/或功能食品和/或营养品和/或功能成分和/或美容品和/或药物有效成分的应用，意欲用于人类和/或动物。

此外，本发明涉及前述组合物用于食品组合物的制备的应用，食品组合物意欲改善胃肠道舒适和/或改进肠菌类。

本发明的目的同样是前述组合物用于制备药物的应用，药物意欲用于和/或预防肠内紊乱、肠功能紊乱或胃肠疾病。

本发明的一个目的是前述组合物用于制备药物的应用，药物意欲用于治疗和/或预防由痛觉过敏症状显示的肠内病状或紊乱。

最后，本发明最后一个目的是包括以适于口服施用形式的前述至少一种酵母菌和/或至少一种酵母菌衍生物的试剂盒。

申请人根据布达佩斯条约保藏在国家微生物培养物保藏中心(巴斯德研究所，巴黎)的CNCM I-3856号菌株，出于简明的目的将被称为“ScPro1”。

申请人同样根据布达佩斯条约保藏在国家微生物培养物保藏中心(巴斯德研究所，巴黎)的CNCM I-3799号菌株，出于简明的目的将被指定为“SCB1”。

最后，出于简明的目的，选自酵母菌提取物、壁衍生物、壁多聚糖、壁甘露糖蛋白、酵母菌脂质片段、酵母菌核酸(RNA、DNA)片段和它们的混合物的酿酒酵母菌衍生物将被指定为“衍生物”。

有益菌有意指定为活的微生物，其中它们以足够量合并，发挥对于健康状态、舒适和健康的超过传统营养效果的积极效果。

营养食品或营养品或功能食品或药妆品意思是含有对健康具有有益效果或能够改善生理机能的成分的食品。

食品增补剂意思是具有完成标准食品饮食目的的食品。当营养物或其它具有营养或生理效应的物质被独自使用或以小量作为一种组合时，食品增补剂是它们的浓缩来源。

意欲用于特定给食的食品(DDAP)的意思是具有特定营养目的、意欲用于明确定义的人群组的食品，如婴儿、初学走路的孩子、运动员。

在本发明中提及的食品组合物可以是食品增补剂或DDAP。

本发明的菌株已经由申请人详细说明了它们许多优势和特别显著地它们对人类消化道、特别是小肠和结肠产生有益效果的能力，通常也对身体起作用。

事实上，可以观察到，令人惊讶地，酵母菌ScPro1和/或SCB1和/或衍生物能够诱导抗炎作用，不同于许多酵母菌菌株，并且没有任何促炎作用。

事实上，ScPro1和/或SCB1酵母菌和/或衍生物引起涉及抗炎信号中的白细胞介素IL-10的分泌。此外，不同于乳酸菌类型的益生细菌的作用，ScPro1和/或SCB1菌株和/或衍生物不诱导促炎细胞因子IL-12的合成。同样，相对于细菌益生菌，TNFα和IFNγ促炎细胞因子的生产显著降低。此外，试验已经证明了酵母菌ScPro1的体内抗炎效果，显著地大肠的炎症降低了一半，肠内坏死减少了三分之一。

此外，ScPro1和/或SCB1酵母菌和/或衍生物，以它们干燥的形式，能够横过胃屏障而对它的存活或它的完整性没有任何负面影响，并且该酵母菌不在结肠环境中驻留。

本申请人第一次并特别令人惊奇地证明，ScPro1和/或SCB1酵母菌和/或衍生物能够增加对疼痛的抵抗，显著地对体内大鼠模型。

除这些有益效果之外，ScPro1和/或SCB1酵母菌和/或衍生物能够抑制致病微生物和/或在肠内具有入侵性的那些的增殖和/或入侵。施用所述酵母菌引起结肠中肠道菌的减少和耐抗生素的肠菌类的减少。

具体地，它已经显示了抗白色念珠菌的肠内增殖和该病菌引起并保持的炎症的预防和治疗能力。此外，所述酵母菌具有对致病菌株和/或具有大肠杆菌致病类型的入侵性的那些的吸附和入侵能力的抑制效果，大肠杆菌致病类型从感染有克罗恩病的病患的回肠活检样品中分离得到。

根据本发明，ScPro1和/或SCB1酵母菌和/或衍生物可以以活的或可生存的形式施用，优选地口服地。

根据本发明，“活的形式”或“活的”的意思是酵母菌，它的新陈代谢是活跃的或起作用的或能够繁殖的。显著地以酵母菌干燥形式或新鲜形式。

典型地，新鲜形式的酵母菌看起来是压制的或弄碎的酵母菌。它也可能看起来是悬浮在水相中的酵母菌，因而它被指定为液体酵母菌。在这种情况下，所述酵母菌优选被封装。封装方法和不同类型的胶囊是本领域技术人员熟知的。

在干燥的酵母菌形式中，酵母菌可以是瞬间干燥形式或活性干燥形式。干燥的酵母菌意思是具有干物质水平超过90％的任何酵母菌，优选地在大约92％-96％范围内。

在干燥的酵母菌中，酵母菌可以进一步是中湿度的，深度冷冻的或非深度冷冻的。

瞬间干燥的酵母菌主要意欲供产业工人和熟练的面包师使用。其它的应用和途径基于食品参考***是可能的(药剂学，酒精发酵)。该干燥的酵母菌的特性是在融合进面粉前，它不需要再水化。

它源于通过热风梯度作用的酵母菌的脱水，热风梯度作用使得糊状产物(加压的或液体酵母菌)转变成薄的干燥的蠕虫而仍然保持活性。对于它保持稳定，所述产物然后应当缺氧保存。

活性的干酵母是活的酵母，在低温下被干燥，为了保持它的发酵能力并拥有长期的保存。它看起来是小球。

这个酵母菌源于所述酵母菌的脱水，通过热和机械行为的共同的作用，使得糊状形式的酵母菌转化成干燥产物，而保留它的生存能力。

选择的活性酵母菌通过挤出获得，并在生物量流动床中干燥(活的酵母菌细胞)。这个活性的干燥的酵母菌，即，具有高含量的活酵母细胞的干酵母菌看上去如同小颗粒，通常具有0.1μm-2.5mm的直径，和按质量计4-8％的水含量。

这些干燥形式与新鲜形式比较，具有提供更好的胃抗性的优势和根据本发明的酵母菌的优化的有益效果。根据本发明，根据本发明的酵母菌将优选地以活性干酵母的形式。

通常公认促炎细胞因子刺激炎症机制，然后可能造成大量的临床问题，特别是在自身免疫疾病或免疫缺陷的情况中。

因此，根据本发明的酵母菌可以用于预防和/或治疗肠内疾病或发炎引起的紊乱，不管它们是慢性的还是急性的，可能与腹泻或便秘关联或不关联。

在第一个实施方式中，所述紊乱和疾病与腹泻关联或不关联。

在第二个实施方式中，所述紊乱和疾病与腹泻不关联。显著地，ScPro1和/或SCB1酵母菌和/或衍生物可以用于预防或治疗实质上特点是结肠发炎的大肠炎。

具体地，所述酵母菌非常适合预防和/或治疗慢性炎症肠道疾病(CIBD)，特别地溃疡性结肠炎、出血性直肠结肠炎、腹腔疾病或克罗恩病。

这些疾病的显著特点是恶化的免疫反应，其中包括多样的炎性层级。因此，在用益生菌和/或药物食品和/或功能食品和/或营养品和/或药妆品预防或治疗这些疾病的范围内，促炎效果尽可能的弱是重要的。

因此根据本发明的ScPro1和/或SCB1酵母菌和/或衍生物最适于这些应用。所述酵母菌具有几个额外的优势。

第一个是它具有增加对疼痛抗性的能力。第二个是，特别对于克罗恩病，所述酵母菌能够显著地抑制大肠杆菌致病菌株和/或来自患有所述疾病的病患的具有入侵性的那些致病菌株的吸附和入侵能力。

炎症反应可能特别地归咎于所有致病微生物的入侵。

因此，根据本发明的ScPro1和/或SCB1酵母菌和/或衍生物显示了预防或治疗胃肠紊乱或疾病的有益效果，胃肠紊乱或疾病归咎于致病微生物和/或具有入侵性的那些，原核生物、如细菌，或真核生物、如真菌的肠内增殖。

胃肠紊乱或疾病可以是肠内慢性炎症疾病如溃疡性结肠炎、腹腔疾病、克罗恩病和出血性结肠直肠病。

此外，ScPro1和/或SCB1酵母菌和/或衍生物使得对疼痛的抵抗的增加，它同样在特点是痛觉过敏的情形的肠病状或紊乱的预防或医疗治疗中具有优势。这些肠病状或紊乱可能特别地是功能性肠紊乱、慢性炎症性肠道疾病(CIBD)或特点是慢性内脏疼痛的食物不耐受(过敏、条件作用等)。

它显著地适合痛觉过敏和特别地不论形式的肠道易激综合症(IBS)(便秘、腹泻或两个的结合)的预防或医疗治疗，但同样适合不在IBS范围内的慢性内脏疼痛，如没有任何***物排除紊乱的功能性腹痛(FAPS：功能性腹痛)和与食品不耐受和腹部疾病相关的疼痛。

ScPro1和/或SCB1酵母菌和/或衍生物或包括它的任何组合物因此可以预防性地使用在对这类紊乱或疾病具有易患体质或敏感性的主体中，或医疗性地，例如在一段时间期间或经历比较久的周期。本发明的组合物和方法可以减少主体的痛苦，减轻这些紊乱的症状或原因。

根据本发明的酵母菌和/或衍生物对疼痛、炎症和致病微生物和/或具有入侵性的那些微生物的效果的联合的确引起健康、健康状态和/或人类或动物胃肠道的舒适的改善。

根据本发明的组合物可以包括ScPro1和/或SCB1酵母菌和/或至少一种选自酵母提取物、壁衍生物、壁葡聚糖、壁甘露糖蛋白、酵母菌脂质片段、酵母菌核酸(RNA、DNA)片段的酿酒酵母衍生物，以在大约10⁷和6.10¹⁰CFU之间的量，优选地在10⁸和2.10¹⁰CFU之间，或者，在1mg和10g之间，优选地在1mg和1g之间。这个量可以每日的量，一次服用或在一天内几次服用。

优选地，ScPro1和/或SCB1酵母菌和/或衍生物用在治疗性或非治疗性的应用中，日剂量包括10⁷和6.10¹⁰CFU(克隆形成单位)之间，优选地在10⁸和2.10¹⁰CFU之间。

当酵母菌和/或衍生物是活的形式但不能生存的情况时，在治疗或非治疗应用中的有用的日剂量将优选地包括1mg和10g之间，优选地1mg和1g之间。有效日剂量可以以一次、两次、三次或四次施用。

根据本发明的酵母菌和/或衍生物或包括它的组合物优选地口服施用。可能以治疗上有效量给药，这意味着至少一种症状被减轻或抑制。

ScPro1和/或SCB1酵母菌和/或衍生物可以包括在人类或动物的食品组合物中和/或与适于口服施用的赋形剂或载体一起施用。

意欲用于人类食品的组合物可以是液体、糊团或固体。特别地，组合物可以是乳制品如干酪、黄油、酸奶酪或奶油，基于水果的产品如果汁、糖渍水果或果冻，饮料或固体食品，如小吃、饼干或其它食品。因此，所述组合物包括ScPro1和/或SCB1酵母菌和/或衍生物和食品或饮料的成分。

ScPro1和/或SCB1酵母菌和/或衍生物同样可以包括在药物组合物中。所述药物组合物适合口服施用。它因此包括ScPro1和/或SCB1酵母菌和/或衍生物以及选自批准用于药物制剂制备的赋形剂的适当的常规载体。它可以被制成液体，如糖浆或药水，或制成药片、明胶胶囊、小袋、胶囊或粉末或其它合适的医学形式。

ScPro1和/或SCB1酵母菌和/或衍生物可以进一步与其它益生菌和/或其它功能性成分一起给药，特别是显著地用于更完善的预防作用的益生细菌。

作为一个例子，可以是乳酸菌属(Lactobacillus)乳酸菌、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、小球菌属(Pediococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)或明串珠菌属(Leuconostoc)。

ScPro1和/或SCB1酵母菌和/或衍生物同样可以与其它活性成分一起施用，如抗生素、止痛剂、抗腹泻剂、轻泻剂或它们的混合物。

附图说明

本发明现在将用以下的实施例和图片说明，以图片的形式给出，没有任何的限制，其中：

-图1说明了模拟人类结肠的人工消化***中ScPro1酵母菌的存活的监测，根据实施例2；

-图2说明了ScPro1酵母菌对结肠菌群的作用，根据实施例2；

-图3和图4说明了实施例5的实验1和2的小鼠粪便中白色念珠菌的细胞数的发展，相应于预防模型(图3)和治疗模型(图4)；

-图5说明了依赖于预培养的ScPro1酵母菌的量的大肠杆菌AIEC

LF82细胞对人类肠内上皮细胞的残余粘附的百分比；所述酵母菌细胞与肠内上皮细胞一起培养一个小时。在ScPro1酵母菌存在时用AIEC LF82菌株对细胞进行感染，根据实施例6；

-图6说明了依赖于共培养的ScPro1的量的大肠杆菌AIEC LF82对人类肠内上皮细胞的残余的粘附的百分比；酵母菌细胞和大肠杆菌细胞同时与肠内上皮细胞培养1小时，根据实施例6；

-图7说明了施用ScPro1和SCB1酵母菌后，根据肉眼可见的***分值，对小鼠肠内的炎症强度的估计，根据实施例4；

-图8说明施用ScPro1和SCB1酵母菌后，根据组织学Ameho分值，对小鼠肠内上皮细胞的炎症强度的估计，根据实施例4；

-图9说明单独或组合施用ScPro1和SCB1酵母菌后，根据肉眼可见的***分值，对小鼠肠内的炎症强度的估计，根据实施例4；

-图10说明单独或组合施用ScPro1和SCB1酵母菌后，根据组织学Ameho分值，对小鼠肠内上皮细胞的炎症强度的估计，根据实施例4；

-图11说明将根据本发明的酵母菌或衍生物与人类肠内上皮细胞接触1小时和3小时后，编码IL-10蛋白的基因的mRNA表达水平，根据实施例7；

-图12说明将根据本发明的酵母菌或衍生物与人类肠内上皮细胞接触1小时和3小时后，编码核受体PPARα的基因的mRNA表达水平，根据实施例7；

-图13说明将根据本发明的酵母衍生物与人类肠内上皮细胞接触1小时和3小时后，编码IL-10蛋白的基因的mRNA表达水平的调节，根据实施例7；

-图14说明施用根据本发明的酵母菌和/或衍生物后，编码IL-10蛋白的基因在小鼠肠内上皮细胞中的表达(实施例4)；

-图15说明施用根据本发明的酵母菌和/或衍生物后，编码核受体PPARα的基因在小鼠肠内上皮细胞中的表达(实施例4)；以及

-图16显示在将它们与根据本发明的酵母菌和衍生物接触后，来自患有克罗恩病或不患有克罗恩病的病患的活检样品的肠细胞分泌的细胞因子IL-10的量，以pg/ml计(实施例8)；

-图17显示在将它们与根据本发明的酵母菌和/或衍生物接触后，来自患有克罗恩病或不患有克罗恩病的病患的活检样品的肠细胞分泌的TNF-α细胞因子的量，以pg/ml计(实施例8)；

-图18显示测量ScPro1酵母菌的甘露糖蛋白片段(EL05和EL06)与I类纤毛的结合能力试验的结果；

-图19A和19B分别显示在与增加酵母菌浓度的共培养中，AIECLF82菌株相对于T84细胞的平均残余入侵和粘附百分比(实施例6)-*p＜0.05，**p＜0.01；

-图20A和20B分别显示在与增加EL05酵母菌甘露糖蛋白浓度的共培养中，AIEC LF82菌株相对于T84细胞的平均入侵和粘附百分比-(实施例6)；

-图21A和21B分别显示在与增加浓度的酵母菌预培养中，AIECLF82菌株相对于T84细胞的平均残余入侵和粘附百分比(实施例6)-*p＜0.05，和**p＜0.01；

-图22A和22B分别显示在与增加浓度的EL05酵母菌甘露糖蛋白的预培养中，AIEC LF82菌株相对于T84细胞的平均入侵和粘附百分比(实施例6)-*p＜0.05，和**p＜0.01；

-图23显示在与增加浓度的瞬间干燥的ScPro1酵母菌预培养中，AIEC LF82菌株相对于CHO-K1和CHO-K1/CEACAM6细胞的残余的粘附百分比(实施例6)-*p＜0.05，和**p＜0.01；

-图24显示AIEC LF82菌株或无纤毛的LF82-δfimH突变体对患有克罗恩病的细胞的3个样品的肠上皮细胞的刷状缘的粘附(实施例6)；

-图25显示在健康的大鼠上相对于不同的酵母菌的痛觉阈的测量值(以mm汞柱计)(实施例9)；以及

-图26显示了在具有内脏超敏性的大鼠上相对于不同的酵母菌的痛觉阈的测量值(以mm汞柱计)(实施例9)。

具体实施方式

实施例1：ScPro1和/或SCB1酵母菌在模拟人类肠的人工消化环境中的存活

ScPro1和/或SCB1酵母菌在胃肠运输中的结局的研究

在模拟人类消化的人工消化环境中体内检测和研究ScPro1和/或SCB1酵母菌，特别地通过研究在胃肠运输中被测试的活酵母菌的存活。

活性干酵母形式的ScPro1的两个样品和活性干酵母形式的SCB1的两个样品被检测。

两个样品通过在室温下真空中保存的时间而区分：少于6个月陈化或2年陈化。

·实验条件：

消化在被称为T1M1的***(胃+小肠)中进行，根据从文献中的数据确定的实验条件，并再制造液体食品(水)在具有空的胃的健康成年人中的消化，通过透析和吸收去除消化产物。每一次消化超过5个小时。所有的消化在同样的普通的操作条件下进行，即：

温度：

温度是37℃。

胃排空参数：

胃排空遵循Elashoff等(1982)定义的规则，规定为：

F＝t.2e{-(1/T)^b}

其中F说明了递送的膳食片段，t是时间，T是排空一半食物的时间，b是描述曲线方面的参数。所述参数是T＝15分钟，b＝1。

回肠排空参数：

回肠排空参数遵循修改的Elashoff规则(引进参数d，使得排空在消化结尾时慢下来，

F_m＝F+d*t³)。

所述参数是：T＝150分钟，b＝2.4，d＝-10-⁷(参照图2)。

pH给定值：

胃(分钟/pH)：0/6.0、10/3.2、20/2.4、40/1.8、60/1.6、90/1.5、300/1.5

十二指肠：6.4

空肠：6.9

回肠：7.2

胃分泌物：

HCl

胃蛋白酶

脂肪酶

肠分泌物：

在小肠三个部分的NaHCO₃

在十二指肠中的胆汁提取物

在十二指肠中的胰腺提取物

透析和/吸收：

肠内半流体消化物的“小”分子的移除在具有人造肾脏的两个水平的T1M1(空肠和回肠)中进行。肠内半流体消化物的透析在抗盐溶液中持续进行，其成分与血浆的成分接近。透析液收集在透析袋中。

在消化时在不同水平的消化道中提出样品以监控被检测的酵母菌的存活。

酵母菌的计数根据标准微生物方法学实行，并在10、20、30和45分钟的胃中、累积超过一小时周期的回肠出口和最后的残渣中提取的样品中完成。

计数方法如下：

每一个样品快速地用灭菌的生理盐水(NaCl 8.5g/L)以1∶10连续稀释。然后取0.1ml每一种稀释液并涂布在分布在培养皿中的琼脂糖培养基的表面上(每种稀释液两个平皿)。平皿在35℃下培养48小时，然后接着计算“克隆形成单位”(CFU)。

计算的结果以CFU/ml(原始数据)表示，以及活酵母细胞相对于最初引进的酵母菌数量的百分比，以测定酵母菌在胃中和脱离小肠时的存活率。

下表总结了理论的(如果100％生存)和每一菌株在胃中、消化5个小时后在全部的回肠出口中以及消化5个小时后在全部的***中的实际存活率。

·结果：

消化的产物	引进的酵母菌，以CFU	胃出口，T＝45分钟	回肠出口，T＝5小时	全部的存活，T＝5小时
					ScPro1第一批	3.510¹⁰	89％	100％	106％
ScPro1第二批	2.010¹⁰	88％	95％	106％
					SCB 1	1.510¹⁰	83％	76％	81％
SCB 2	1.510¹⁰	85％	69％	76％

·结论：

这些结果实际上证明了ScPro1和SCB1酵母菌极好的胃肠存活。

实施例2：在模拟人类肠的人工消化环境中的ScPro1酵母菌的存活

在结肠发酵中ScPro1酵母菌的存活和它们对肠内菌群的影响的研究

在模拟人类消化的人工消化环境中体外检测和研究活性干燥形式的ScPro1酵母菌，并特别地通过研究在结肠发酵中被检测的活酵母的结局和环境效果。

结肠发酵涉及顺次补充培养基以保持菌群的连续发酵。所述培养基主要包含复杂的碳水化合物，在消化道上部不消化的(淀粉、胶质、纤维素等)，或多或少水解的蛋白化合物和粘液素。

结肠培养基同样以顺次方式从发酵桶中移除。所述培养基由透析***覆盖，使得连续地移除可溶性的发酵产物。

收集透析液以分析短链脂肪酸(SCFA)。所述培养基在由特定的发酵气体产生的缺氧条件下保持并且它具有小于-300mV的氧化还原势。最终，控制pH值在给定的点值6。

每一种消化包括：在结肠中播种后稳定化处理菌群2-3天的时期，至少每日添加产物的处理时期(至少3天)，和停止处理3天的时期。

在每一次实验中，遵循和/或记录以下参数：

-酵母菌的生存能力；

-不同的需氧和厌氧细菌群的发展；

-主要发酵产物(SCFA和气体)的发展；

-标准酶活性的探测；和

-温度、pH和氧化还原势。

在60ml的青霉素瓶、以褶皱隔膜密封、在30ml的结肠培养基(培养基加新鲜的***物菌群)中进行。所述的酵母菌样品添加至30ml的培养基中。

由微生物悬浮液组成的结肠培养基同样用于培养人工结肠中的结肠菌群，其中微生物悬浮液源于在磷酸缓冲液中的典型食品的新鲜粪便。

在混合结肠培养基与被检测的产物后，瓶子被塞紧并压褶。

所有的这些操作都在厌氧罩中进行(没有氧气的气体混合物)。瓶子放置在旋转培养箱(37℃-200rpm)中24小时。

对于每一个产物，检测都是一式两份。此外，在同样的条件下准备4个对照的瓶子(没有任何产物)。两个瓶子立即处理(初始时间)，两个瓶子如检测瓶一样培养。

24小时之后停止发酵，然后处理瓶子。

发酵气体的产生：由发酵产生的气体的体积依靠马里奥特***测定(基于通过包含在青霉素瓶中的加压气体排出水的排水量的测量原理)。在瓶中存在的气体的分析然后通过GPC实现(H₂、CO₂、CH₄、O₂)。

短链脂肪酸的生产：进行结肠内含物的第一次取样。然后将它冷冻，或直接处理以测定培养物上清液的SCFA浓度(不稳定的短链脂肪酸)。这个分析通过GPC实现。要寻找的代谢物是：乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸、异己酸和庚酸。

微生物分析：进行结肠内含物的第二次取样并立即处理(在减少的稀释培养基中连续稀释至十分之一)以计算：总的厌氧菌群、可选择的需氧-厌氧菌群和真菌菌群。

涉及ScPro1酵母菌存活的结果在图1中说明。在这个图中，每一个垂直箭头象征ScPro1酵母菌的施用。

可以注意到，ScPro1酵母菌显示在施用后第三天良好的生存，和在施用期间的第4和第7天之间强烈的死亡率。这显示了酵母菌没有植入至结肠环境中。

微生物分析的结果在图2中说明。它们显示了在ScPro1酵母菌存在时肠杆菌的减少及在停止施用酵母菌后的升高。在施用ScPro1酵母菌期间，同样可以注意到抵抗抗生素(氯霉素、庆大霉素)的菌群明显地减少。

涉及ScPro1酵母菌对不稳定的短链脂肪酸(SCFA)的生产的影响的结果总结在下面的表中(在结肠培养基中表示为mM)。

	处理前	处理中	处理后
				乙酸盐	71.4±2.3	57.6±4.2	60.6±0.7
丙酸盐	22.8±0.6	26.5±4.2	35.7±1.1
				丁酸盐	35.0±1.6	36.5±2.2	26.6±4.2
异丁酸盐	3.2±0.3	3.3±0.2	3.4±0.1
				异戊酸盐	5.6±0.5	5.2±0.2	5.3±0.0
戊酸盐	8.0±0.6	7.8±1.4	9.1±0.9
				异己酸盐	0.1±0.1	0.0±0.0	0.0±0.0
己酸盐	9.0±1.1	7.3±0.3	5.7±0.7

庚酸盐	0.2±0.2	0.0±0.1	0.0±0.0
				总计	155.3±2.7	144.1±6.8	146.4±3.4

在处理中，注意到部分有利于丙酸盐的乙酸盐的减少，暗示产乙酸菌群活性的降低。

在其它监测的参数中，没有观察到处理的公认的效果，关于：

√气体生产(总量和比例)；

√总的和单糖的浓度(随时间而稳定)；以及

√酶活性。

实施例3：ScPro1、SCB1酵母菌对细胞因子的生产的诱导的影响的研究

研究活的ScPro1和SCB1酵母菌对人类外周血单个核细胞(PBMC)上的细胞因子的生产的诱导的影响。

以它们瞬间干燥形式和活的干燥形式检测ScPro1和SCB1酵母菌诱导人类PBMC中的IL-10、ILK-12、TNFα、TNFδ细胞因子生产的能力。

人类外周血单个核细胞的制备

在输血中心从健康的实验者中获的新鲜的人类血液，用PBS-Ca(GIBCO)稀释两次，用菲可(Ficoll)密度梯度(GIBCO)纯化。在20℃，400x g离心30分钟后，外周血单个核细胞(PBMC)在血清中形成环形层。仔细地吸取PBMC，使用PBS-Ca悬浮在50ml终体积中，用同样的缓冲溶液清洗三次，20℃，350x g离心10分钟。PBMC然后通过使用完全RPMI培养基(GIBCO)重悬浮，富含10％w/v胎牛血清(56℃下灭活30分钟)，1％w/v的L-谷氨酰胺(GIBCO)和庆大霉素(150μg/ml)(GIBCO)。用显微镜计算PBMC，调节PBMC至2×10⁶细胞/ml浓度，并分布(在1ml等分溶液中)在24孔细胞培养板(Corning公司)上。

微生物制备

过夜培养的乳酸菌、乳球菌和大肠杆菌(对照菌株)的培养物用pH7.2的PBS缓冲液清洗两遍，然后用PBS重悬至2.10⁹CFU/ml的浓度。

在第一个实验中使用的酵母菌的浓度是2.10⁸CFU/ml。对于初始剂量比较研究，可以进行10至10的连续稀释以比较2.10⁷CFU/ml、2.10⁸CFU/ml和2.10⁹CFU/ml的效果。

人类外周血单个核细胞的培养

10μL的这些工作悬浮液被转移至含有PBMC的平板的孔中，设定在37℃的由5％的CO₂和95％的空气组成的气体混合物中培养。培养24小时后，吸取上清液，在2,000rpm下离心(Eppendorf模型)，移除并保存在-20℃。

对照由革兰氏阳性菌(乳酸菌和乳球菌)、革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和没有任何酵母菌的缓冲液组成。

细胞因子的量化

通过ELISA测定细胞因子的表达水平。ELISA板用抗体覆盖(一夜)，所述抗体用PBS/1％BSA(胎牛血清蛋白)浸透。用已知浓度的细胞因子制备标度，其检测阈从15.62至2,000pg/ml(过夜培养)。抗细胞因子的检索和量化通过使用TMB底物(四甲基联苯胺，Pharmingen2)测量链霉亲和素活性实现。商业的Pharmingen试剂盒根据生产商的说明使用。4个细胞因子选自：3个促炎细胞因子(TNFα、INFγ、IL-12)和1个抗炎细胞因子(IL-10)。

结果

4个细胞因子在5个不同的捐献者上的反应在1/1，酵母菌/PBMC比例下评估。

在培养物上清液中的4个分泌的细胞因子的剂量结果总结在下面的表A中。数据以5个捐献者的剂量的平均值(Avg)表示。所述表同样给出了平均数标准误差的值(Sem)。

表A

1)对于酵母菌ScPro1和SCB1，不同于参考的细菌，观察到由PBMC诱导的非常小量或无法觉察量的IL-12的生产。

2)对于两个活的酵母菌均观察到IL-10的真实水平，暗示SCB1具有比ScPro1更好的结果。

3)至于INFγ和TNFα，在ScPro1和SCB1酵母菌的作用下分泌的量与不同的检测的益生菌比较明显地较少。

结论：

-清楚地显示在PBMC存在下ScPro1和SCB1酵母菌不诱导促炎细胞因子IL-12，不同于通常在益生乳酸菌中观察到的。

-在PBMC存在下ScPro1和SCB1酵母菌诱导真实水平的IL-10(抗炎性)。

-在ScPro1和SCB1酵母菌存在下经PBMC的IFN-γ和TNF-α的分泌量明显比益生菌小。

实施例4：在鼠化学诱导模型(TNBS)中ScPro1和SCB1酵母菌对大肠炎的保护效果的评估

目前使用假定的动物模型以适应于测量酵母菌的抗炎效果。

6周大的Balb/c小鼠在这个检测中使用。在实验前使小鼠适应实验室条件一周，随意提供水和食物。每一个样品在一组10个小鼠中检测。大肠炎通过随意分配含有5％(w/v-1)的TNBS的饮用水7天的循环而诱导。通过每天一次强制喂入口服给药酵母菌，在由TNBS开始诱导大肠炎3天前和在TNBS处理的过程中(7天)。

除了两个检测组之外，对照组(阴性对照)被采取仅使用生理盐溶液。

处理后的检测参数如下：

-肠炎的肉眼可见的评估(***评分)。在显微镜下检查解剖的每一只小鼠的结肠(放大倍率，x5)以根据***评分***评估肉眼可见的损害；其中***评分***范围在0-10，依赖于揭示炎症的严重性的评价标准，如充血、结肠壁的厚度和溃疡的范围。

-炎症的组织学评价(Ameho评分)。从***通道2cm处精确取样结肠片段，用于根据Ameho评分进行组织学评价；其中Ameho评分范围在0-6，依赖于炎症的渗透度，侵蚀、溃疡或坏死的存在，和损害的深度以及表面的范围。通过2个独立的操作者完成肠内损害和降解的量化。

-编码IL-10和PPARα的基因的表达的量化。为了做这个，通过RNeasy试剂盒(Macherey Nagel，Hoerdt，法国)根据生产商的说明从结肠组织中分离总RNA。信使RNA的量化通过使用分光光度计实现。在37℃下，用20-50单位的无RNase的DNase I处理30分钟后(罗氏诊断公司，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)，寡聚DT引物(罗氏诊断公司，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)被用于合成环状单链DNA。信使RNA用SYBR绿色Master Mix(Applera，Courtaboeuf，法国)和体外研究使用的特定人类寡核苷酸(见下面的表B)定量，通过装置GeneAmp Abiprism 700(Applera，Courtaboeuf，法国)。校准或非校准的对照包括在每一个检测中。每一个样品被测量3次。绿色SYBR的颜色强度使用软件包Abiprism 7000SDS分析(Applera，Courtaboeuf，法国)。所有的结果将被相对于编码β-肌动蛋白的基因标准化。

基因	核苷酸引物序列
		β-肌动蛋白	F：5’-AAgTCCCTCACCCTCCCAAAAg-3’R：5’-AAgCAATgCTgTCACCTTCCC-3’
PPARα	F：5’-ACgATgCTgTCCTCCTTgATg-3’R：5’-gTgTgATAAAgCCATTGCCgT-3’
		IL-10	F：5’-CAgTCAgCCAgACCCACAT-3’R：5’-gCTCCACTgCCTTgCTTT-3’

表B

在上面描述的标准的预防性模型中检测ScPro1和SCB1酵母菌。在诱导大肠炎之前的动物重量监测显示对小鼠施用的酵母菌制品非常好的忍受。

通过***评分的肠炎，与阳性对照比较，使用ScPro1酵母菌(活的干酵母，1mg/天)和SCB1酵母菌减少了60％。SCB1酵母菌同样诱导了炎症的减少。同样，通过Ameho评分评估的肠内坏死，与阳性对照比较，使用ScPro1酵母菌(瞬间干燥酵母菌，1mg或100μg/天)减少了三分之一。

ScPro1和SCB1酵母菌，单独或一起施用，增加了编码抗炎白细胞介素IL-10和核受体PPARα基因的表达水平。

图7-10充分地说明了以不同日剂量的ScPro1和SCB1酵母菌的卓越的肉眼可见的***和Amebo评分值。

瞬间干燥形式的ScPro1和SCB1酵母菌的肉眼可见的***和组织学Ameho分值，采用10μg和1mg的日剂量，分别在图7和图8中说明。

图7和图8的图表的每一纵列的数值代表以下元素：

1代表单独的TNBS，

2代表TNBS+ScPro1(1mg)，

3代表TNBS+ScPro1(100μg)，

4代表TNBS+SCB1(1mg)，

5代表TNBS+SCB1(100μg)。

可以注意的是瞬间干燥的ScPro1酵母菌，剂量为100μg/天，明显地降低了肉眼可见和组织学水平的损害。

ScPro1和SCB1酵母菌的肉眼可见的***评分和组织学Ameho评分，单独或组合采用，以瞬间干燥或活的干燥形式，采用100μg和1mg的日剂量，分别在图9和图10中说明。

图14和图15分别显示了编码抗炎性白细胞介素和肠内细胞的PPARα核受体的基因的表达水平。

图9、10、14和15的图表的每一纵列的数值代表以下元素：

1代表单独的TNBS，

2代表TNBS+瞬间干燥的ScPro1(100μg)，

3代表TNBS+活的干燥的ScPro1(10μg)，

4代表TNBS+活的干燥的SCB1(100μg)，

5代表TNBS+活的干燥的ScPro1(1μg)，

6代表TNBS+活的干燥的ScPro1(100μg)，

7代表TNBS+活的干燥的ScPro1(100μg)+SCB1(100μg)。

结论：

可以注意到活的干燥形式的ScPro1明显降低了肉眼可见水平的损害，以及在肉眼可见水平和组织学水平上的由ScPro1和SCB1的联合的协同抗炎效应。

在100μg剂量时，ScPro1和SCB1已经分别增加了2.9倍和3.1倍的编码抗炎细胞因子IL-10的基因的表达水平。组合的ScPro1+SCB1(柱状图第7号)增加了2.7倍该表达水平(图14)。

在100μg剂量时，ScPro1和SCB1已经分别增加了1.5和1.6倍的编码PPARα核受体基因的表达水平。组合的ScPro1+SCB1(柱状图第7号)增加了1.7倍该表达水平(图15)。

实施例5：在化学诱导炎症的鼠模型中，ScPro1和SCB1酵母菌对肠中白色念珠菌的增殖的影响的研究

所述研究针对在化学诱导大肠炎鼠模型中，测定益生菌类型的ScPro1和SCB1酵母菌的施用对致病酵母菌白色念珠菌的肠内增殖的影响和对炎症的潜在的作用。

被检测的酵母菌是瞬间干燥的形式。

·实验条件：

Balb/C菌株的雌鼠是4-6周大。从第0天到第14天，动物接受含有1.5％DSS(葡聚糖硫酸钠)的饮用水，用于炎症的化学诱导。

执行3个实验。

在第一个实验中，在第5天，通过套管对小鼠强制喂入含有5.10⁷ScPro1酵母菌细胞的200μL的PVS(磷酸缓冲液)。这个操作每天重复，共19天。在第0天，通过套管对小鼠强制喂入含有5×10⁷酵母菌细胞的白色念珠菌SC5314菌株的200μL的PBS。

在第二个实验中，在第0天，通过套管对小鼠强制喂入含有5.10⁷酵母菌细胞的白色念珠菌SC5314菌株的200μL的PBS。4天后，一批小鼠被强制喂入含有5.10⁷ScPro1酵母菌细胞的200μL的PBS。这个操作每天重复，共14天。

在第三个实验中，在第0天，通过套管对小鼠强制喂入含有5.10⁷酵母菌细胞的白色念珠菌SC5314菌株的200μL的PBS。一个小时以后，一批小鼠被强制喂入含有5.10⁷ScPro1酵母菌细胞的200μL的PBS。这个操作每天重复，共14天。

每天监测这些动物(实验1、2和3中)的涉及以下要点：

-粪便硬度、***出血、它们的身体质量(临床分值)；

-1g匀质化的粪便在1mlPBS中的再分离培养系，每种10μL接种在Candi选择培养基上；37℃培养24小时后，计算白色念珠菌(蓝色)和酿酒酵母(绿色)的CFU；

-在检查的最后捐献出动物。通过心脏穿刺立即取血样，在室温移入其它容器，通过离心收获血清，并保存在-80℃；对结肠取样并分成4个片段，它们中的3个被深度冷冻，1个置于固定器中(4％PFA)用于组织学研究。

·结果：

如在图3可以见到，在第一个实验中(预防效果测试)，在化学诱导大肠炎的模型中可以观察到，从第四天DSS给药明显增加了白色念珠菌引起的肠内黏膜的增殖(DSS+Ca)。非常有趣地，可以看出19天给药ScPro1益生酵母菌明显降低由DSS诱导的白色念珠菌的增殖。

如在图4中所示的，在第二个实验中(治疗测试)，观察到ScPro1或SCB1益生酵母菌的给药减少了由DSS诱导的增殖。此外，ScPro1酵母菌的效果是显著的，甚至在停止用DSS治疗后第14天。

·结论：

它显现出ScPro1酵母菌或SCP1酵母菌的给药明显减少了白色念珠菌的增殖，既在预防条件下，也在治疗条件下。应当注意到这个预防的效果持续甚至到停止治疗。

实施例6：ScPro1或SCB1酵母菌或衍生物对大肠杆菌致病菌株的粘附性和入侵能力的抑制效果的研究，其中大肠杆菌致病菌株从患有克罗恩病的病患的回肠活检样品中分离

研究活酵母菌、ScPro1、SCB1和衍生物的影响，它的对从患有克罗恩病的病患的回肠活检样品中分离的大肠杆菌致病菌株的粘附性和入侵能力的抑制效果。

从患有克罗恩病(CD)的病患的回肠活检样品中分离的对于粘附-入侵大肠杆菌被指定为AIEC的大肠杆菌菌株能够粘附和侵入肠内的上皮细胞。

从患有克罗恩病的病患的慢性回肠损害中分离的LF82大肠杆菌菌株，具有入侵的细菌病原体的所有特征。已经在大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌中记述的LF82菌株的粘附-入侵表型的特征和入侵遗传决定因子的缺乏已经导致确认可能与克罗恩病联合的新的致病组的大肠杆菌的存在，指定为AIEC。在鼠或人的巨噬细胞的噬菌作用后，AIEC LF82菌株在大的空泡中存在并繁殖，而保留了宿主细胞的完整性。在感染之后，巨噬细胞分泌显著速率的TNFα。在患有CD的病患的回肠损害中，AIEC菌株的流行是36.4％。

细菌到真核细胞的粘附过程起因于配基和受体之间的特异的交互作用；其中配基存在于细菌表面，称为粘附素；受体是在宿主的上皮细胞的表面上表达的蛋白质、糖蛋白或糖脂类受体。至于细菌，显示出I类纤毛的FimH粘附素包括在AIEC细菌至肠内上皮细胞的粘附中。所述的细菌FimH粘附素识别CEACAM6肠上皮细胞受体(同样指定为CD66c或NCA)，是富含甘露糖残基的糖蛋白并且在90％的患有CD的病患中在回肠水平不正常的过量表达。

实验条件：

特征在于对培养的肠内上皮细胞的粘附性和入侵能力的菌株AIECLF82被用作原型菌株。

这个研究扩大至10个从患有CD的病患中分离的AIEC菌株以确定由AIEC LF82菌株获得的结果。

DAEC(扩散粘附性大肠杆菌)C1845大肠杆菌菌株，其通过独立于甘露糖的机制(Afa/Dr粘附素)粘附上皮细胞，被用作阴性对照。

凝集试验

用活的ScPro1和SCB1酵母菌，在存在AIEC细菌时，或在存在根据在Boudeau等描述的程序从AIEC LF82菌株中制备的纯化的I类纤毛提取物时实现定量凝集试验。(2001Mol.Microbiol.39：1272-84)。凝集指数用指定酵母菌浓度和细菌或纯化的I类纤毛的可变浓度测定。

在没有观察到凝集的甘露糖蛋白的酵母菌片段的情况下，I类纤毛的结合能力的测量通过ELISA技术完成。

这些试验通常在微孔板中执行。所述的酵母菌片段固定在微孔板上。纯化的I类纤毛的不同稀释液与酵母菌片段接触。清洗后，I类纤毛利用在兔子中获得的I类抗纤毛抗体显示(Boudeau等，2001)。清洗后，使用连有过氧化物酶的二抗。使用过氧化物酶底物(H₂O₂)和发色试剂(四甲基联苯胺)并通过读450纳米光密度的微孔板完成量化。

通过ScPro1和SCB1酵母菌抑制AIEC细菌和在肠内上皮细胞的表面表达的CEACAM6受体的交互作用的试验

使用的细胞：

对于体外抑制试验(培养前或共培养)，保留强烈表达受体CEACAM6的未分化的T84肠内上皮细胞。所述的T84细胞在37℃、5％的CO₂下，在DMEM(Dulbecco改进的Eagle培养基)基础培养基中培养，基础培养基中添加有50％的Ham-F12(生命科技)和通过加热补充10％的胎牛血清。对于这个培养基，向MEM(最小必要培养基)培养基(生命科技)添加1％非必需氨基酸(生命科技)、1％的谷氨酰胺(生命科技)、200U/L的青霉素、50mg/L的链霉素、0.25mg/L的两性霉素B和1％的X-100维他命混合物。按每ml每孔4.105个细胞接种细胞，并在37℃、5％的CO₂下培养48小时。T84细胞毯然后用PBS清洗，然后1ml的感染的培养基(DMEM/F12+10％的FCS)添加至每一个孔中。从AIEC LF82菌株在37℃下在Luria-Bertani肉汤(LB)里的过夜培养物中，制备在PBS中OD620为0.1的细菌悬浮液。通过在OD620为0.1的感染培养基中添加25μL细菌悬浮液，对T84细胞感染1个细胞有10个细菌的感染多样性(MOI)。37℃时，在富含CO₂的空气下，将24孔平板培养3小时。细菌的粘附和残余的入侵如后面描述的完成。

使用采用不表达CEACAM6的CHO-K1细胞实验和稳定表达CEACAM6的这些同样遗传改良的细胞(CHO-K1/CEACAM6)。在DMEM/F12培养基、5％的胎牛细胞血清、1％的L-谷氨酰胺、200U/L的青霉素、50mg/L的链霉素和0.25mg/L的两性霉素B中培养细胞。所述细胞接种在24孔板中，2.10⁵细胞/孔。在37℃下培养7-8小时后，用添加有5mM丁酸钠的新的培养基替换所述培养基，以减少CEACAM6的表达。实施免疫印迹以监测由转染的细胞的CEACAM6蛋白的表达。

在37℃下培养20-24小时后，所述细胞与增加浓度的瞬间干燥的ScPro1酵母菌菌株一起培养1小时(预培养实验)，然后用20的MOI感染它们(4.10⁶细菌/孔)，以观察之前在操作T84细胞实验中使用的细菌/酵母菌比率。在37℃下培养3个小时后，在如下描述的存在或不存在酵母菌时计算粘附的细菌。

另一个实验使用来自疾病患者的活体的部分。来自患有克罗恩病的3个病患的回肠活检样品的肠上皮细胞在PBS中清洗，然后在2ml的Oppendorf管中预培养，管中有1ml的DMEM培养基，20％的胎牛血清，含有0、1.25、2.5或5mg/ml的瞬间干燥的ScPro1酵母菌菌株。通过37℃下旋转15分钟使管子搅拌，然后所述肠上皮细胞用含有酵母菌的50μL的AIEC LF82菌株的过夜LB培养物感染。搅拌培养3小时。在PBS中清洗肠上皮细胞两次，然后放置在载玻片和薄片之间，在相衬显微镜中观察。在存在或不存在酵母菌时完成粘附肠上皮细胞的刷状缘的细菌计数。这个实验同样用无毛突变体LF82-delta fimH操作，以测定不发挥CEACAM6受体上的I类纤毛的识别的AIEC细菌的基础粘附水平。同样，在存在抗CEACAM6抗体时操作粘附抑制实验。

随后的用于测量细菌对肠内上皮细胞T84的粘附和残余入侵的过程

用1ml的PBS清洗细胞毯4次，然后通过用500μL的1％的蒸馏水中的Triton X-100在室温培养5分钟溶解细胞。稀释溶解物然后平铺在LB-琼脂糖上以测定CFU的数，相应于粘附细菌的数。

为计算入侵细菌，在感染后3小时用PBS清洗所述的细胞毯，然后用1ml含有100μg/ml庆大霉素的感染培养基培养1小时，以破坏胞外细菌。在细胞溶解、连续稀释和平铺在LB-琼脂糖上后计算入侵细菌。

与被没有经历任何酵母菌或酵母菌衍生物处理的AIEC LF82菌株感染的细胞比较分析AIEC LF82菌株的粘附和入侵水平。

根据速率R表示所有的结果：

R＝存在ScPro1酵母菌时粘附或入侵细菌数/没有任何处理的粘附或入侵细菌数。

程序1：共培养模型

如上面在粘附和入侵试验中所描述的，制备所述的T84细胞和细菌悬浮液。酵母菌或酵母菌衍生物在PBS中悬浮至设定的浓度，然后25μL这种悬浮液加入至T84细胞的感染培养基中(1ml)。所述细胞然后迅速地用细菌菌株感染至MOI＝10。将含有细胞的细菌/培养的酵母菌的悬浮液匀质化，24孔板在37℃下培养3小时。如上面描述的测定细菌菌株的粘附和入侵水平，并且这在感染期间不含有或含有酵母菌或酵母菌提取物。在不含有酵母菌时细菌的粘附或入侵水平(100％)和含有酵母菌时细菌的粘附或入侵水平之间的比率代表了细菌的残余的粘附和入侵水平。

程序2：预培养模型

如上面在粘附和入侵试验中所描述的，制备所述的T84细胞和细菌悬浮液。向T84细胞的感染培养基(1ml)中加入25μL体积的酵母菌或酵母菌提取物的悬浮液。将酵母菌悬浮液匀质化，并在37℃下培养24孔板细胞1小时。这个培养之后，所述的T84细胞用细菌菌株感染，MOI＝10，含有酵母菌，在37℃下感染3小时。在含有或不含有酵母菌时，如上面所述的计算粘附的和入侵的细菌，以测定残余的粘附或入侵百分比，其中100％代表不含有酵母菌时的粘附或入侵。

-CEACAM6的表达的确认

对每一批培养的细胞执行免疫细胞化学标注，以确认CEACAM6的存在和估计CEACAM6的表达量。所述细胞培养在灭菌玻璃薄片上。用PBS清洗细胞毯，然后在室温用3％的多聚甲醛在pH7.4时混合10分钟。所述细胞用抗CECAM6单克隆抗体(克隆9A7，Genovac)在潮湿的空气中培养1个小时，抗CECAM6单克隆抗体在PBS-5％马血清中稀释至1/100。用PBS清洗后，所述细胞与连接荧光染料的二抗在潮湿的空气中(FITC-抗鼠，Zymed)接触1小时，连接荧光染料的二抗在PBS-5％马血清中稀释至1/500。玻璃薄片固定在含有Moewiol的载玻片上，然后用荧光显微镜观察。

-检查细胞毒性的缺乏

由不同剂量的酵母菌诱导的细胞毒性的缺乏通过在酵母菌/细胞或FDL/细胞培养基中定量提供乳酸脱氢酶(LDH)(Glasser等，2001)检测。

结果：

LF82的凝集实验

从含有培养的(＝新鲜形式)或干燥形式(瞬间干燥形式或冷冻干燥形式)的ScPro1或SCB1酵母菌的LF82中获得的凝集滴定量总结在下表中，这是3-5个独立实验的结果。

完全地，好的LF82的凝集结果从干的酵母菌、瞬间干燥的ScPro1和瞬间干燥的SCB1中获得。

对于这些酵母菌，显示了方法的有利影响的重要性，特别是关于它的凝集潜能的干燥方法的重要性。

纯化的纤毛的凝集试验

在含有培养的ScPro1酵母菌(＝新鲜形式)或瞬间干燥形式的酵母菌和含有(干的)SCB1酵母菌的纯化的纤毛中获得的凝集滴定度总结在下表中：

这个实验确定了对于凝集，实际上需要纤毛-酵母菌的交互作用。由于纤毛具有识别甘露糖结构的性质，后者是在酵母菌上被识别的并包含在观察到的凝集现象中。最好的结果从瞬间干燥的ScPro1酵母菌中获得。

测量I类纤毛与ScPro1酵母菌的甘露糖蛋白片段的结合能力的试验的结果

图18清楚地显示了菌株AIEC LF82中的纯化的I类纤毛特异地结合酵母甘露糖蛋白。注意到，这些甘露糖蛋白(EL05和EL06)的制备方法(热法或酶法)对纤毛的结合常数具有轻微的影响。

AIEC细菌与在上皮细胞表面表达的CEACAM6受体的交互作用的抑制的结果

1、在共培养模型中筛选酵母菌或酵母菌衍生物样品的抑制AIECLF82菌株对T84肠内上皮细胞的粘附和入侵能力的结果。

研究了瞬间干燥的ScPro1酵母菌(3.09.10⁷酵母菌/mg)、干的ScPro1酵母菌(1.86.10⁷酵母菌/mg)和瞬间干燥的SCB1酵母菌(5.83.10⁷酵母菌/mg)，以及EL05酵母菌(干的形式)的甘露糖蛋白。

作为比较，添加了(具有2.054.10⁷酵母菌/mg的Biocodex)。

在共培养模型中具有同样的酵母菌数的酵母菌抑制能力的比较。

在用PBS清洗和在7,500rpm离心15分钟之后，所述的酵母菌样品在PBS中重悬至4.10⁸酵母菌/ml的浓度。在PBS中的酵母菌的稀释为1/2、1/10^th、1/20^th和1/100^th。

通过使用程序1操作三个独立的实验。图19A和19B中的结果(残余的粘附和残余的入侵)被显示为残余的粘附和入侵比率和相应的平均数标准误差误差棒(Error bar)的方式。

图19A和19B使得获得以下的数据：

粘附：

-瞬间干燥的ScPro1和干燥的ScPro1酵母菌以剂量依赖的方式强烈地抑制了菌株LF82对T84细胞的粘附。抑制是明显的，对于瞬间干燥的ScPro1酵母菌是5.10⁵酵母菌/ml，对于干燥的ScPro1酵母菌是5.10⁶酵母菌/ml。

-瞬间干燥的SCB1酵母菌比其它2个酵母菌样品较少强烈地抑制粘附，在1.10⁷酵母菌/ml时具有45.7％的残余粘附，而对于瞬间干燥的ScPro1菌株和干燥的ScPro1菌株分别为18.7％和8％的残余粘附。

入侵：

-瞬间干燥的ScPro1酵母菌从1.10⁵酵母菌/ml开始明显抑制AIECLF82菌株入侵T84细胞。在1.10⁷酵母菌/ml时，残余粘附比率是16.3％。

-对于干燥的ScPro1和瞬间干燥的SCB1酵母菌，抑制效果是更加延后的，分别从1.10⁶酵母菌/ml和5.10⁶酵母菌/ml开始。

在共培养模型中EL05甘露糖蛋白的抑制试验

EL05酵母菌甘露糖蛋白在PBS中悬浮至160mg/ml的浓度。在PBS中完成系列稀释：1/2、1/4、1/8、1/40，25μL的每种甘露糖蛋白悬浮液被添加至感染培养基中，其中使用程序1。

操作3个独立的实验。由图20A和20B说明的结果(残余粘附和残余入侵)被显示为残余的粘附比率和相应的平均数标准误差误差棒的方式。

这些图显示了在共培养模型中，EL05酵母菌甘露糖蛋白具有以依赖剂量方式的抑制AIEC LF82菌株对T84细胞的粘附和入侵的能力。

2、在预培养模型中筛选酵母菌或酵母菌产物的样品的抑制AIECLF82菌株对T84肠内上皮细胞的粘附和入侵能力。

在共培养模型中使用的相同的酵母或它们的片段的样品用在这个预培养模型中。

在预培养模型中，具有同样的酵母菌数的酵母菌抑制能力的比较

在用PBS清洗和在7,500rpm离心15分钟之后，所述的酵母菌样品在PBS中重悬至4.10⁸酵母菌/ml的浓度。在PBS中的酵母菌的稀释为1/2、1/10、1/20和1/100。通过使用程序2操作三个独立的实验。

由图21A和21B说明的结果(残余粘附和残余入侵)被显示为残余的粘附和入侵比率和相应的平均数标准误差误差棒的方式。

通过用酵母菌预处理T84细胞，对于瞬间干燥的ScPro1和干燥的ScPro1菌株，从5.10⁶酵母菌/ml剂量开始，可能获得LF82菌株的粘附的明显抑制。但是，在这个剂量，没有观察到瞬间干燥的ScB1酵母菌的明显抑制。

通过用酵母菌预处理T84细胞，对于干燥的ScPro1酵母菌菌株，从1.10⁵酵母菌/ml剂量开始，可能获得LF82菌株的入侵的抑制。

从5.10⁵酵母菌/ml剂量开始，所述的3个酵母菌样品诱导了LF82菌株的入侵的明显减少。

在预培养模型中，EL05甘露糖蛋白的抑制试验

EL05酵母菌的甘露糖蛋白在PBS中悬浮成160mg/ml的浓度。在PBS中完成系列稀释：1/2、1/4、1/8和1/40，25μL的每种甘露糖蛋白悬浮液被添加至感染培养基中，其中使用程序2。操作3个独立的实验。由图22A和22B的结果(残余粘附和残余入侵)被显示为残余的粘附比率和相应的平均数标准误差误差棒的方式。

EL05甘露糖蛋白使得从2mg/ml的浓度开始，LF82菌株的粘附和入侵的以剂量依赖方式的抑制。

酵母菌对在预培养模型中，AIEC LF82菌株对表达CEACAM6受体或不表达该受体的CHO-K1细胞的粘附的抑制试验的结果

操作5个独立实验，使用之前提及的程序2。

图23显示了AIEC LF82菌株的粘附的明显抑制，从具有25μg/ml酵母菌的预培养中的CEACAM6/CHO细胞观察到的。在这些细胞中观察到剂量依赖的抑制效果。

同样观察到AIEC LF82菌株对CHO-K1细胞的粘附，毫无疑问地由于在这些细胞表面上表达的糖基化蛋白的表达。但是，LF82菌株与瞬间干燥的ScPro1酵母菌的预培养没有使得对非感染细胞的粘附的非常明显的抑制。

因此，这确定了所述的酵母菌干涉LF82菌株对由这些细胞表达的CEACAM6受体的粘附。

在预培养模型中，AIEC LF82菌株在患有克罗恩病的病患的肠上皮的刷状缘上的粘附的抑制结果。

图24显示了在实验中获得的平均粘附指数，并在存在或不存在增加浓度的瞬间干燥的ScPro1酵母菌(mg/ml)或在存在抗CEACAM6抗体时计算它们。根据这幅图的结果，当存在瞬间干燥的ScPro1酵母菌菌株时，AIEC LF82菌株的明显的和剂量依赖的减少在病患的肠上皮细胞的刷状缘上被报导。在5mg/ml的酵母菌菌株剂量时，AIEC LF82菌株的残余的粘附与存在抗CEACAM6抗体中观察到的或对没有任何I类纤毛的突变体观察到的相似。

结论：

从这个研究，它显示了：

-ScPro1和SCB1酵母菌，特别是瞬间干燥形式，具有对于LF82菌株的凝聚的强烈的能力。

-ScPro1和SCB1酵母菌能够以剂量依赖方式体外抑制大肠杆菌对人类上皮细胞(T84，回肠活检样品肠上皮细胞)和表达人类CEACAM6受体的CHO细胞的粘附和入侵。

-甘露糖蛋白能够以剂量依赖方式体外抑制大肠杆菌对人类上皮细胞(T84，回肠活检肠上皮细胞)和表达人类CEACAM6受体的CHO细胞的粘附和入侵。

-在体外，所述的ScPro1酵母菌能够在高浓度下部分保护大约80％的细胞免于细菌感染。

实施例7：在体外培养的人类肠内上皮细胞中，ScPro1、SCB1酵母菌，和酵母菌衍生物关于编码IL-10和PPARα基因的表达的调节作用的研究

研究了ScPro1和SCB1酵母菌的益生性，采用单独或以组合的方式，和/或酵母菌片段，和它们抑制由与特定的肠内受体交互作用引发炎症的能力。

体外试验

根据本发明的酵母菌和酵母菌衍生物的效果特别地在不同的肠内上皮细胞受体上研究，通过体外分析两个结肠癌细胞系CaCo-2(ATCCHTB-37)和HT-29(ATCC HTB-38)。

对于这个，根据以下方法，通过提取RNA实现转录分析。

所述细胞在Trizol中裂解。关于可溶解的片段，通过添加含有10U的核糖核酸酶抑制剂和10U的脱氧核糖核酸酶的200μL溶液完成脱氧核糖核酸酶步骤。

在存在200U的逆转录酶、二硫苏糖醇、寡聚dT15和脱氧核苷酸时，逆转录10μg的RNA。

通过已知的聚合酶链式反应技术(PCR)扩增cDNA，同时通过使用特定的正义和反义引物作为竞争者，特别是以下基因：IL-10和PPARα。

在含有1.25U的Ampli Taq Gold 5000时操作40个循环，并将不同的样品转移到3％琼脂糖凝胶上后，通过图像分析仪测定条带的亮度。

所述的结果表示成相对10⁵个分子的内标：β-肌动蛋白，mRNA分子的数。

这些结果，聚集在图11中，包括将酵母菌或衍生物置于与编码抗炎性蛋白IL-10的基因的肠内上皮细胞接触后1个小时(参考A)和3个小时(参考B)后的mRNA的表达值。

在图11中，下面的参考指定了检测的酵母菌/酵母菌衍生物，检测的酵母菌/酵母菌衍生物已经显示了好于4倍的参考信号的早期的表达水平：

3指定酿酒酵母，

5指定本发明的ScPro1酵母，

6指定酿酒酵母提取物，以及

12指定酿酒酵母的RNA片段。

这些结果实际上显示了酵母菌和酿酒酵母提取物，根据本发明，在一个小时后，诱导了编码抗炎性细胞因子IL-10基因的早期表达。

事实上，与未处理的对照比较，根据本发明的酵母菌和衍生物的mRNA表达在纵坐标轴上大于4，这个值已经完全符合极好的早期表达水平。

其它的结果聚集在图13中。这幅图显示了依赖于提供的酵母菌衍生物的量，编码IL-10蛋白的基因的mRNA的表达的调节。

在这个图13中，在1小时和3小时后测量表达。可以看到根据本发明的酵母菌和酿酒酵母提取物的表达，根据如下参考指定：

5指定根据本发明的ScPro1酵母菌，

6指定酿酒酵母提取物，

8指定酿酒酵母的壁β-葡聚糖，

9指定酿酒酵母的壁甘露糖蛋白，

11指定酿酒酵母的DNA片段，以及

12指定酿酒酵母的RNA片段。

用不同浓度的酵母和/或衍生物测量表达。

在图13中，柱的颜色越黑，酵母菌/衍生物的浓度越高。

图13的结果显示了根据本发明的酿酒酵母提取物过早地诱导抗炎性细胞因子(IL-10)的mRNA。

聚集在图12的结果包括将酵母菌或衍生物置于与肠内上皮细胞接触1小时(参考A)和3小时(参考B)后，编码核受体PPARα的基因的mRNA表达值。

在这个图12中，以下的参考指定了被检测的酵母菌/酵母提取物，其已经显示了高于3倍参考信号的延迟的表达水平：

1指定活性干燥形式的根据本发明的酿酒酵母ScPro1酵母菌，

4指定酿酒酵母，

5指定活性干燥形式的根据本发明的酿酒酵母ScPro1酵母菌，

8指定酿酒酵母壁的片段，

9指定酿酒酵母壁β-葡聚糖的片段，

10指定酿酒酵母壁甘露糖蛋白的片段，

11指定酿酒酵母DNA片段，以及

12指定酿酒酵母的RNA片段。

这些结果实际上显示了根据本发明的酵母菌和酿酒酵母衍生物在3个小时后以延迟的方式诱导编码核受体PPARα的基因的表达。

事实上，根据本发明的酵母菌和衍生物的mRNA表达在纵坐标轴上大于3，这个值已经相应于极好的延迟的表达信号。

实施例8：在从含有克罗恩病的病患的活检样品中分离的人类肠内上皮细胞中，酵母菌和酵母衍生物对编码IL-10和TNF-α的基因的表达的调节作用的体外研究

酵母菌和/或酵母衍生物对细胞因子分泌物，IL-10(抗炎)和TNF-α(促炎)的影响，在患有克罗恩病或不患有克罗恩病的病患的活检样品中被体外研究。

在患有或不患有克罗恩病的患者中取样肠内活检样品，然后放置在补充有青霉素和链霉素的HBSS-CMF培养基中24小时，置于37℃下、含有5％CO₂的空气中。在清洗之后，将活检样品与酵母菌或酵母衍生物在RPMI 1640培养基中接触4小时。收获上清液用于ELISA分析。然后裂解活检样品以使得抽出mRNA或总蛋白。

细胞因子分泌物的确认通过细胞培养物的上清液的免疫学分析和由ELISA提出的蛋白的免疫学分析完成。在沉积缓冲液中(体积/体积；75mM Tris pH 6.8；5％甘油；0.25％溴酚蓝；2％SDS，5％β-巯基乙醇)在95℃下变性5分钟的蛋白被沉淀(50μg)并在10％的聚丙烯酰胺凝胶上分解。在移动后，所述的蛋白被转移至PVDF膜上(Hybond-P，AmershamPharmacia Biotech，Orsay，法国)，通过16V下半干电转移(Hoefer TE77，Amersham Pharmacia Biotech，Orsay，法国)1小时。PPARα和IL-10通过人类抗PPARα和抗IL-10兔多克隆抗血清的方式显示，稀释至1/500并通过在Biomax-MR膜(柯达)上的化学发光(E.C.L.AmershamPharmacia Biotech，Orsay，法国)与软件包Gel Analyst(CLARA VISION，巴黎，法国)定量。

图16和17显示了分别对IL-10和TNF-α获得的结果。纵坐标轴显示了以pg/ml计的细胞因子的量。每一个点对应于患有急性状态的克罗恩病的病患的活检样品的测量值(黑色环)，处于克罗恩病好转期的病患活检样品的测量值(灰色环)和健康病患的活检样品的测量值(白色环)。棒表示测量值的平均值。

在这些图中：

-1指定活性干燥形式的根据本发明的酿酒酵母ScPro1酵母菌，

-3指定酿酒酵母，

-8指定酿酒酵母菌壁的片段，

-11指定酿酒酵母DNA片段，以及

-12指定酿酒酵母的RNA片段。

在图16中，根据本发明的ScPro1酵母菌增加2倍抗炎细胞因子，IL-10的分泌，通过患有克罗恩病的病患的上皮细胞或处于好转期的病患的上皮细胞，与健康的病患比较，以及与相应于在仅存在生理盐实行的测量值的阴性对照(-)比较。

图17显示了根据本发明的ScPro1酵母菌不引起由肠内细胞的促炎细胞因子，TNF-α的分泌的任何增加，肠内细胞从患有克罗恩病的病患或处于克罗恩病好转期的病患的活检样品中分离。ScPro1，或任何其它的被检测的酵母菌或酵母菌衍生物都不诱导TNF-α的任何分泌。

实施例9：在鼠结肠直肠扩张模型中，酵母菌和酵母菌衍生物的止痛性质的研究

在健康的大鼠中

1、设备和方法

在这些实验中使用重量在175和200g之间的雄性Sprague Dawley大鼠(Charles River，l’Arbresle，France)。在实验前一周，使大鼠对动物房的环境适应。它们在每笼5只动物下喂养，随意地喂水和食物。所有的这些试验根据研究和伦理出版痛觉研究国际联合会的委员会(Committeefor Research and Ethical Issues of the International Association for the Studyof Pain)[6]的建议操作。

2、结肠敏感性评估

通过测量诱导行为反应必须的结肠内压力来估计动物的疼痛。这个压力由结肠直肠扩张产生，结肠直肠扩张通过引进结肠的气囊的胀大的方式。所述的行为反应的特点是动物身体的背后部分的升高和符合剧烈收缩的明显可见的腹部收缩[7-9]。大鼠用可挥发性麻醉剂(2％异氟醚)麻醉，所述气囊(根据Bourdu描述的程序制备[8])通过直肠内路径以尽可能少入侵的方式***在距***7cm处。导尿管用胶带粘在尾部的底部。5分钟后，将所述大鼠置于树脂玻璃盒的中间，导尿管与电子恒压器连接(Distender Series IIRTM，G & J Electronics)。持续地使用增加的压力，直到引发疼痛反射或达到限制的80mm汞柱的压力。

3、施用的组合物

通过强制喂入地施用酵母菌，每天一次，共15天。

以1mg/kg的剂量腹膜内注射的***被用作阳性对照，在结肠直肠膨胀前30分钟。

研究了8组大鼠：

-10只接受PBS的对照鼠，

-10只接受瞬间干燥的ScPro1(100μg/d)，参考1)

-10只接受活性干燥的ScPro1菌株(100μg/d)，(参考2)

-10只接受SCB1菌株(100μg/d)，(参考3)

-10只接受瞬间干燥的ScPro1(50μg/d)+瞬间干燥的SCB1(50μg/d)菌株(参考4)

-10只接受一次***注射(1mg/kg，膨胀前30分钟)(参考5)。

4、结果

图26显示了一方面ScPro1酵母菌以瞬间干燥的形式，单独施用(参考1)或与SCB1菌株联合(参考4)，和另一方面以它的活性干燥形式(参考2)增加了痛觉阈，因此与没有施用任何物质的大鼠比较，明显减轻了内脏疼痛的感觉。

以下的结果与对照比较以mm汞柱给出：

-对于瞬间干燥的ScPro1菌株，74.5±3.07vs.53.6±3.9，p＝0.07-(参考1)

-对于瞬间干燥的ScPro1和SCB1菌株的组合，66.5±3.36vs.53.6±3.9，p＝0.04-(参考4)，

-对于瞬间干燥的菌株，72±2.59vs.53.6±3.9，p＜0.01-(参考2)。

另一方面，这个效果与由***诱导的结果比较-参考5-使用的剂量是1mg/kg，痛阈是72±2.59mm汞柱。

所述的瞬间干燥的SCB1菌株同样诱导了在健康大鼠中的止痛效果，70.6±3.10mm汞柱，p＝0.026。

在具有内脏超敏性的大鼠中

1、设备和方法

使用重量在175和200克之间的雌性Sprague Dawley大鼠(CharlesRiver，L’Arbresle，法国)。在实验前一周，使大鼠对实验室环境适应。它们在每笼5只动物下喂养，随意地喂水和食物。所有的试验根据研究和伦理出版痛觉研究国际联合会的委员会[6]的建议操作。对生活环境采取重大防范以避免或最小化动物的不适。

2、通过丁酸盐清洗的结肠超敏性感应

对于每一次清洗，将导尿管(2mm导管)引进结肠内距***7cm处，所述的动物接受1ml的200mM的具有中性pH(pH6.9)的丁酸钠溶液，一天两次，共3天。“健康的”动物接受盐溶液。

3、用根据本发明的酵母菌的动物的治疗

使用10组具有内脏超敏性的动物(每组n＝10)。治疗的动物通过胃强制喂入接受100μg的酵母菌，每天一次，共15天。对照动物接受根据之前的同样的程序的PBS。所述酵母菌在PBS溶液中悬浮。在第一次强制喂入的7天后，开始输入丁酸盐或盐溶液，共3天。在通过口服途径治疗开始的14天后测量结肠超敏性，即结肠输入的7天前。

4、研究的动物组

研究了几组大鼠。数字参考对应于图26。

-10只大鼠接受PBS(对照)，

-10只大鼠接受瞬间干燥的ScPro1干燥的酵母菌(100μg/d)-(参考1)，

-10只大鼠接受活性干燥的ScPro1干燥的酵母菌(100μg/d)-(参考2)，

-10只大鼠接受瞬间干燥的ScPro1酵母菌(100μg/d)-(参考3)，

-10只大鼠接受瞬间干燥的ScPro1(50μg/d)和瞬间干燥的SCB1(50μg/d)-(参考4)，

-10只接受***-(参考5)，

-10只接受贝特-(参考6)。

5、结果

首先应当注意到对于对照的大鼠，在实验中的痛阈，超敏的大鼠低于健康的大鼠。

瞬间干燥的ScPro1酵母菌，单独采用或与SCB1酵母菌联合，在模型中显示了有趣的止痛效果。

所述的数值如下：

参考 mm汞柱

1 56.5±4.27p＝0.03

4 59±4.33p＝0.02

根据本发明的酵母菌使得与在健康的大鼠中观察到的一致的疼痛感知水平恢复。由酵母菌诱导的止痛效果与由***诱导的止痛效果相等。

此外图26显示了非诺贝特强烈的止痛效果，其在具有内脏超敏性的大鼠中增长了系数2的痛觉阈(70±4.48p＝0.001)。

这个结果确定了在内脏疼痛调节中PPARα受体的作用。

Claims

1.保藏在国家微生物培养物保藏中心的CNCM I-3856号酿酒酵母菌株。

2.保藏在国家微生物培养物保藏中心的CNCM I-3799号酿酒酵母var.boulardii菌株。

3.从保藏在国家微生物培养物保藏中心的CNCM I-3856号菌株培养得到的酿酒酵母菌。

4.从保藏在国家微生物培养物保藏中心的CNCM I-3799号菌株培养得到的酿酒酵母菌var.boulardii。

5.一种组合物，其特征是，它包括根据权利要求3的酵母菌和/或根据权利要求4的酵母菌。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征是，所述酵母菌是干燥形式或新鲜形式。

7.根据权利要求6所述的组合物，其特征是，所述酵母菌是瞬间干燥形式或活性干燥形式。

8.根据权利要求5-7任何一项所述的组合物，其特征是，它包括10000000至60000000000CFU的根据权利要求3的酵母菌、10000000至60000000000CFU的根据权利要求4的酵母菌或10000000至60000000000CFU的权利要求3的酵母菌和权利要求4的酵母菌的混合物。

9.根据权利要求5-7任何一项所述的组合物，其特征是，它包括1mg至10g的根据权利要求3的酵母菌、1mg至10g的根据权利要求4的酵母菌、或1mg至10g的权利要求3的酵母菌和权利要求4的酵母菌的混合物。

10.根据权利要求5-9任何一项的组合物的应用，用于制备意欲供人类和/或动物使用的食品增补剂和/或药物活性成分；其中食品增补剂是具有完成标准食品饮食目的的食品，当营养物或其它具有营养或生理效应的物质被独自使用或以小量作为一种组合时，食品增补剂是它们的浓缩来源。

11.根据权利要求5-9任何一项的组合物的应用，用于制备意欲改善胃肠舒适和/或改善肠菌群的食品组合物。

12.根据权利要求5-9任何一项的组合物的应用，用于制备意欲治疗和/或预防胃肠疾病的药物。

13.根据权利要求12的应用，其中胃肠疾病包括肠紊乱和肠功能紊乱。

14.根据权利要求5-9任何一项的组合物的应用，用于制备意欲治疗和/或预防由痛觉超敏症状指示的肠的病状或紊乱的药物。

15.根据权利要求10-14任何一项的应用，其特征在于，所述酵母菌是干燥形式或新鲜形式。

16.根据权利要求15的应用，其特征在于，所述的酵母菌是瞬间干燥形式或活性干燥形式。

17.根据权利要求10-14任何一项的应用，所述酵母菌以10000000至60000000000CFU的日剂量施用。

18.根据权利要求10-14任何一项所述的应用，其中酵母菌以1mg至10g的日剂量施用。

19.一种试剂盒，包括适于口服给药形式的根据权利要求3的酵母菌和/或根据权利要求4的酵母菌。