ES2649914T3 - Composición para la alimentación humana y/o animal, sus usos, levaduras - Google Patents
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Abstract
Cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos con el nº CNCM I-3856.
Description
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DESCRIPCION
Composición para la alimentación humana y/o animal, sus usos, levaduras
La presente invención se refiere a los campos de la nutrición y la salud humana y/o animal.
Atañe más particularmente a nuevas cepas de levadura y nuevas levaduras obtenidas a partir de las nuevas cepas. Estas levaduras son especialmente útiles para el confort del tracto digestivo y/o para la prevención y/o el tratamiento de trastornos del tracto digestivo humano o animal.
Se han descrito ya numerosos microorganismos en la bibliografía por sus aplicaciones beneficiosas en el hombre sobre el tracto digestivo y por su interés nutricional como se describe, por ejemplo, en el documento WO 2006/021965.
Estos microorganismos se designan comúnmente entonces por el término probióticos y corresponden a microorganismos vivos capaces de aportar al hospedador un beneficio sobre la salud cuando se administran en cantidad suficiente (Joint FAO/WHO Expert Consultation Probiotics in food, FAO Food and nutrition, artículo n° 85, ISBN 92-5-105513-0).
Los beneficios resultantes de la administración por vía oral de microorganismos dependen en gran medida de la cepa de microorganismo usada, pero también de su forma de administración. Dentro de una misma especie, según las cepas empleadas, los efectos observados son efectivamente muy fluctuantes, a veces beneficiosos, a veces negativos o neutros, como por ejemplo dentro de la especie Escherichia coli, donde se pueden encontrar a la vez cepas patógenas (tipos enterotoxigénicos o enterohemorrágicos por ejemplo) y cepas beneficiosas como la cepa Nissle 1917 (M. de Vrese; P.R. Marteau. Probiotics and Prebiotics: Effects on Diarrhea. 2007, J. Nutr., 137 (3 Supl. 2), 803S-811S). Así, es actualmente imposible predecir para una cepa dada si puede esperarse un beneficio en términos de salud humana de la administración de esta cepa, siquiera prever la naturaleza de su eventual beneficio o su intensidad.
Cierto número de cepas de microorganismos, especialmente entre las levaduras y las bacterias lácticas, se han identificado ya por ciertos efectos beneficiosos sobre el tracto gastrointestinal. No obstante, la obtención de una acción beneficiosa completa sobre el tracto gastrointestinal necesita a menudo la administración concomitante de varias cepas de naturaleza diferente (I. Goktepe; V.K. Juneja; M. Ahmedna (eds). Probiotics in Food Safety and Human Health. 2006, CRC Taylor & Francis, ISBN 1-57444-514-6).
Además, se ha observado que un buen número de microorganismos, en particular bacterias lácticas, tienen una acción proinflamatoria. Este efecto proinflamatorio puede resultar particularmente nocivo y no deseable, por ejemplo en las enfermedades autoinmunitarias o deficiencias inmunitarias.
Se han descrito ciertas fracciones de levaduras y/o derivados de levaduras por sus efectos beneficiosos sobre el tracto digestivo.
Así, se han descrito manoproteínas derivadas de levaduras por su efecto inhibidor de la adhesión de patógenos. De igual modo, se han descrito paredes de levaduras por su efecto de fibra. Sin embargo, existen numerosas cepas de levaduras Saccharomyces cerevisiae, y no todas presentan efectos beneficiosos o los mismos efectos.
Además, según las cepas usadas y las formas de levadura administradas, los efectos pueden ser igualmente muy variables.
Así, persiste la necesidad de poder disponer de nuevas cepas de microorganismos que puedan ejercer un efecto beneficioso sobre la salud, de manera preventiva y/o curativa sobre patologías o disfunciones precisas o no, o sobre el estado de salud general tanto física como psíquica.
La invención tiene por tanto como objeto una nueva cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos con el n° CNCM I-3856, y una nueva cepa de Saccharomyces cerevisiae var. boulardii depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos con el n° CNCM I-3799.
Se describen igualmente aquí una levadura Saccharomyces cerevisiae obtenida a partir de la cepa depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos con el n° CNCM I-3856 y una levadura Saccharomyces cerevisiae var. boulardii obtenida a partir de la cepa depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos con el n° CNCM I-3799.
Es otro objeto de la invención una composición que comprende la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos con el n° CNCM I-3856, la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae var. boulardii depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos n° CNCM I-3799 o una de sus mezclas. En ciertos modos de realización, la composición comprende además al menos un derivado de levadura Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces var. boulardii elegido entre extractos de levadura, derivados de paredes, glucanos parietales, manoproteínas parietales, fracciones lipídicas de levadura y fracciones de ácidos nucleicos de levadura (ARN, ADN).
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La composición según la invención presenta las ventajas siguientes:
- la capacidad, en particular en sus formas secas, de resistir y sobrevivir al paso de la barrera gástrica, lo que permite optimizar sus efectos sobre el tacto gastrointestinal;
- una acción antiinflamatoria;
- la ausencia de efecto proinflamatorio o un efecto muy débil;
- la capacidad de reducir los dolores intestinales, y en conclusión
- la capacidad de impedir y reducir la adhesión y la colonización por bacterias patógenas y/o de carácter invasivo del tracto gastrointestinal, en particular del intestino delgado y del colon.
Tal nueva composición, que presenta esta combinación de características, no se ha descrito ni identificado nunca todavía.
Presenta por tanto un interés excepcional.
Es otro objeto de la invención un uso de la composición anterior para la preparación de un complemento alimenticio y/o de un probiótico y/o de un alicamento y/o de un nutracéutico y/o de ingredientes funcionales y/o de un cosmético destinado a hombres y/o animales.
La invención se refiere, por otro lado, a un uso de la composición tal como se define anteriormente para la preparación de composiciones alimenticias destinadas a mejorar el confort gastrointestinal y/o a mejorar la flora intestinal.
La invención tiene igualmente como objeto un uso de la composición tal como se define anteriormente para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento y/o a la prevención de trastornos intestinales, afecciones funcionales intestinales o enfermedades gastrointestinales.
Es un objeto de la invención un uso de la composición tal como se define anteriormente para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento y/o a la prevención de patologías o afecciones del intestino señaladas por un estado de hiperalgesia.
En conclusión, es un ultimo objeto de la invención un kit que comprende al menos una cepa de levadura tal como se define anteriormente en una forma adaptada para administración oral. En ciertos modos de realización, el kit comprende además al menos un derivado de levadura tal como se define anteriormente.
La cepa, depositada por la solicitante bajo el Tratado de Budapest en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (Instituto Pasteur, París) con el n° CNCM I-3856, se denominará "ScProl" con fines de concisión.
La cepa, depositada igualmente por la solicitante bajo el Tratado de Budapest en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (Instituto Pasteur, París) con el n° CNCM I-3799, se denominará "SCB1" con fines de concisión.
En conclusión, con un último fin de concisión, el derivado de levadura Saccharomyces cerevisiae elegido entre extractos de levadura, derivados de pared, glucanos parietales, manoproteínas parietales, fracciones lipídicas de levadura, fracciones de ácidos nucleicos de levadura (ARN, ADN) y sus mezclas se denominará "derivado".
Se entiende por probiótico designar microorganismos vivos que, cuando se integran en cantidad suficiente, ejercen un efecto positivo sobre la salud, el confort y el bienestar más allá de los efectos nutricionales tradicionales.
Se entiende por alicamento o nutracéutico o alimento funcional o cosmecéutico un alimento que contiene ingredientes que tienen efectos beneficiosos para la salud o capaces de mejorar las funciones fisiológicas.
Se entiende por complemento alimenticio un artículo alimenticio que tiene como fin completar el régimen alimenticio normal. Un complemento alimenticio constituye una fuente concentrada de nutrientes o de otras sustancias que tienen un efecto nutritivo o fisiológico cuando se toman solas o en combinación en bajas cantidades.
Se entiende por artículos alimenticios destinados a una alimentación particular (DDAP) un alimento que tiene un objetivo nutricional particular, destinado a un grupo de población bien definido, tal como los lactantes, los niños de poca edad o los deportistas.
La composición alimenticia tal como se menciona en la invención puede ser un complemento alimenticio o un DDAP.
Las cepas de la invención se han identificado por la solicitante por sus numerosas ventajas y especialmente su capacidad de inducir efectos beneficiosos sobre el tracto digestivo humano, en particular el intestino delgado y el colon, pero también sobre el organismo en general.
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Efectivamente, se ha observado que, sorprendentemente, la levadura ScProl y/o SCB1 y/o derivado es capaz de inducir una acción antiinflamatoria, contrariamente a buen número de cepas de levadura, y esto sin efecto proinflamatorio.
Efectivamente, la levadura ScPro1 y/o SCB1 y/o derivado provoca el aumento de la secreción de la interleucina IL- 10 implicada en las señales antiinflamatorias. Además, a diferencia de las acciones de las bacterias probióticas de tipo lactobacilos, la levadura ScPro1 y/o SCB1 y/o derivado no induce la síntesis de la citocina proinflamatoria IL-12. De igual modo, la producción de las citocinas proinflamatorias TNFa e IFNy es netamente menor con relación a los probióticos bacterianos. Por otro lado, varias pruebas permitieron demostrar el efecto antiinflamatorio in vivo de la levadura ScPro1, especialmente una disminución de la mitad de la inflamación del intestino grueso y una reducción de un tercio de la necrosis intestinal.
Además, la levadura ScPro1 y/o SCB1 y/o derivado, en sus formas secas, es capaz de atravesar la barrera gástrica sin ningún impacto negativo sobre su supervivencia o su integridad y esta levadura no se implanta en un entorno cólico.
La solicitante demostró, por primera vez y de manera particularmente sorprendente, que la levadura ScPro1 y/o SCB1 y/o derivado es capaz de aumentar la resistencia al dolor, especialmente sobre un modelo in vivo de rata.
Además de estos efectos beneficiosos, esta levadura ScPro1 y/o SCB1 y/o derivado es capaz de inhibir la colonización y/o la invasión al nivel del intestino de microorganismo patógenos y/o de carácter invasivo. La administración de esta levadura conlleva una disminución de las enterobacterias al nivel del colon y de la flora intestinal resistente a los antibióticos.
En particular, mostraba una capacidad profiláctica y terapéutica contra la colonización intestinal por Candida albicans e inflamaciones provocadas y mantenidas por este patógeno. Por otro lado, esta levadura presenta un efecto inhibidor sobre la potencia de adhesión e invasión de cepas patógenas y/o de carácter invasivo de patotipos de Escherichia coli aislados de biopsias ileales por enfermedad de Crohn.
Según la presente invención, esta levadura ScPro1 y/o SCB1, en presencia o no de un derivado, puede administrarse en forma viva o revivible, preferiblemente por vía oral.
Se entiende por "forma viva" o "viva", según la invención, una levadura cuyo metabolismo es activo o reactivable o capaz de multiplicarse. Se trata especialmente de la levadura en forma seca o en forma fresca.
Típicamente, la levadura en forma fresca se presenta en forma de levadura comprimida o fraccionada. Puede presentarse igualmente en forma de levadura en suspensión en fase acuosa y se habla entonces de levadura líquida. En este caso, la levadura estará preferiblemente encapsulada. Los procedimientos de encapsulación y los diversos tipos de cápsulas son bien conocidos por el especialista en la materia.
Entre las formas de levadura seca, se puede citar la levadura que puede presentarse en forma seca instantánea o seca activa. Se entiende por levadura seca cualquier levadura que tenga una tasa de materia seca superior al 90 %, preferiblemente que vaya de aproximadamente 92 % a 96 %.
Entre las levaduras secas, se pueden citar también las levaduras de humedad intermedia, congeladas o no.
La levadura seca instantánea está destinada principalmente a los industriales y artesanos de la panadería. Son posibles otras aplicaciones y salidas basadas en los sistemas de referencia alimenticios (farmacia, fermentación alcohólica). La particularidad de esta levadura seca es no necesitar rehidratación antes de incorporarse a la harina.
Proviene de la deshidratación de la levadura por la acción de un gradiente de aire caliente que permite transformar un producto pastoso (levadura comprimida o líquida) en fideos finos secos que permanecen activos. El producto a continuación, para permanecer activo, debe acondicionarse en ausencia de oxígeno.
La levadura seca activa es una levadura viva, secada a baja temperatura con el fin de conservar su potencia fermentativa y asegurar una conservación muy larga. Se presenta en forma de esférulas.
Esta levadura proviene de la deshidratación de la levadura por la acción conjunta del calor y una actividad mecánica que permite transformar la levadura en forma pastosa en un producto seco guardando su viabilidad.
Las levaduras secas activas seleccionadas se obtienen por extrusión y secado en lecho fluidizado de la biomasa (células vivas de levadura). Esta levadura seca activa, es decir, levadura seca que tiene un contenido elevado de células vivas de levadura, se presenta en forma de gránulos generalmente de un diámetro de 0,1 |im a 2,5 mm y un contenido de H2O de 4 a 8 % en masa.
Estas formas secas presentan la ventaja de procurar una mejor gastrorresistencia con relación a la forma fresca y optimizan los efectos beneficiosos de la levadura según la invención. La levadura según la invención estará preferiblemente en forma de una levadura seca activa.
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Se reconoce generalmente que las citocinas proinflamatorias estimulan los mecanismos inflamatorios que pueden ser entonces responsables de buen número de problemas clínicos, en particular en los casos de enfermedades autoinmunitarias o deficiencias inmunitarias.
Así, la levadura según la presente invención puede servir para prevenir y/o tratar las enfermedades o afecciones inflamatorias del intestino, sean crónicas o agudas, eventualmente asociadas o no a diarreas o estreñimiento.
En un primer modo de realización, las afecciones y enfermedades están asociadas a diarreas.
En un segundo modo de realización, las afecciones y enfermedades no están asociadas a diarreas. Especialmente, la levadura ScPro1 y/o SCB1 y/o derivado puede ser útil para la prevención o el tratamiento de colitis que se caracterizan esencialmente por una inflamación del colon.
En particular, esta levadura está bien adaptada para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas del intestino (EICI), especialmente colitis ulcerosa, rectocolitis hemorrágica, enfermedad celíaca o enfermedad de Crohn.
Estas enfermedades se caracterizan especialmente por una respuesta inmunitaria exacerbada en la que están implicada múltiples cascadas inflamatorias. Así, en el marco de la prevención o del tratamiento de estas enfermedades por un probiótico y/o un alicamento y/o un alimento funcional y/o un nutracéutico y/o un cosmecéutico, es importante que los efectos proinflamatorios sean los menores posibles.
La levadura ScPro1 y/o SCB1 y/o derivado según la invención está por tanto muy particularmente adaptada a estos usos. Esta levadura posee varias ventajas suplementarias.
La primera es que posee la capacidad de aumentar la resistencia al dolor. La segunda, especialmente para la enfermedad de Crohn, es que esta levadura es especialmente capaz de inhibir la potencia de adhesión e invasión de cepas patógenas y/o de carácter invasivo de E. coli procedente de pacientes que padecen esta enfermedad.
La respuesta inflamatoria puede ser especialmente debida a la invasión de cualquier microorganismo patógeno.
Así, la levadura ScPro1 y/o SCB1 y/o derivado según la invención muestra una buena eficacia para prevenir o tratar los trastornos o enfermedades gastrointestinales debidos a la colonización de los intestinos por microorganismos patógenos y/o de carácter invasivo procarióticos tales como bacterias o eucarióticos tales como hongos.
Los trastornos o enfermedades gastrointestinales pueden ser enfermedades inflamatorias crónicas intestinales, tales como colitis ulcerosa, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn y rectocolitis hemorrágica.
Por otro lado, al permitir la levadura ScPro1 y/o SCB1 y/o derivado aumentar la resistencia al dolor, presenta igualmente interés en el tratamiento preventivo o curativo de patologías o de afecciones de los intestinos caracterizadas por un estado de hiperalgesia. Estas patologías o afecciones pueden ser especialmente afecciones funcionales intestinales, enfermedades inflamatorias crónicas del intestino (EICI) o intolerancias alimentarias (alergias, acondicionamientos, etc.) caracterizadas por un dolor visceral crónico.
Está particularmente adaptada al tratamiento preventivo o curativo de hiperalgesias y en particular del síndrome del intestino irritable (SII) cualquiera que sea su forma (estreñimiento, diarrea o una combinación de los dos), pero igualmente de dolores viscerales crónicos que no entran en el marco del SII, tales como dolores abdominales funcionales sin afección de eliminación fecal (FAPS: Functional Abdominal Pain) y los dolores ligados a las intolerancias alimentarias y a la enfermedad celíaca.
La levadura ScPro1 y/o SCB1 y/o derivado o cualquiera composición que la comprenda puede usarse por tanto de manera preventiva en sujetos que presenten predisposiciones o sensibilidad a este tipo de trastornos o enfermedades, o de manera curativa, por ejemplo en crisis o durante periodos más largos. Las composiciones y métodos de la invención pueden reducir el sufrimiento de los sujetos, atenuar los síntomas o la causa de estos trastornos.
La conjunción de los efectos de esta levadura y/o derivado según la invención sobre el dolor, la inflamación y los microorganismos patógenos y/o de carácter invasivo provoca de manera cierta esta mejora del bienestar, de la salud y/o del confort del tracto gastrointestinal humano o animal.
La composición puede comprender una levadura ScPro1 y/o una levadura SCB1 y/o al menos un derivado de levadura Saccharomyces cerevisiae elegido entre extractos de levadura, derivados de pared, glucanos parietales, manoproteínas parietales, fracciones lipídicas de levadura y fracciones de ácidos nucleicos de levadura (ARN, ADN) en una cantidad que va de aproximadamente entre 107 y 6.1010 UFC, y preferiblemente entre 108 y 2.1010UFC, o entre 1 mg y 10 g, y preferiblemente entre 1 mg y 1 g. Esta cantidad puede ser una cantidad diaria tomada en una o varias veces a lo largo del día.
Preferiblemente, la levadura ScPro1 y/o SCB1 y/o derivado se usa en aplicaciones terapéuticas o no terapéuticas a una dosis diaria comprendida entre 107 y 6.1010 UFC (unidades formadoras de colonia), y preferiblemente entre 108
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En el caso en que la levadura esté en forma viva pero no revivible, la dosis diaria útil en las aplicaciones terapéuticas o no terapéuticas estará preferiblemente comprendida entre 1 mg y 10 g, preferiblemente entre 1 mg y 1 g. La dosis eficaz diaria puede administrarse en una, dos, tres o cuatro veces.
La levadura y/o derivado según la invención o las composiciones que la comprenden se administran preferiblemente por vía oral. Puede serlo por cantidad terapéuticamente eficaz, lo que significa que disminuye o suprime al menos uno de los síntomas.
La levadura ScPro1 y/o SCB1 y/o derivado puede incluirse en una composición alimenticia humana o animal y/o administrarse con excipientes o vehículos apropiados para la administración oral
La composición destinada a la alimentación humana puede ser un líquido, una pasta o un sólido. Especialmente, la composición puede ser un producto lácteo tal como queso, mantequilla, un yogur o una crema, un producto basado en fruta como un zumo de fruta, una compota o una pasta de frutas, una bebida o un alimento sólido, por ejemplo un refrigerio, una galleta u otro. Así, la composición comprende la levadura ScPro1 y/o SCB1 y/o derivado y los componentes del alimento o de la bebida.
La levadura ScPro1 y/o SCB1 y/o un derivado puede incluirse también en una composición farmacéutica. La composición farmacéutica está adaptada para administración oral. Comprende por tanto la levadura ScPro1 y/o SCB1 y/o derivado así como un soporte clásico adecuado elegido entre los excipientes autorizados para la fabricación de preparación farmacéutica. Puede formularse en forma líquida, como un jarabe o una ampolla, o en forma de comprimidos, de cápsulas o de polvo y otras formas galénicas apropiadas.
La levadura ScPro1 y/o SCB1 y/o derivado pueden administrarse además con otros probióticos y/u otros ingredientes funcionales, en particular bacterias probióticas, especialmente para una acción preventiva aún más completa.
Se podrán citar a modo de ejemplo las bacterias lácticas de los géneros Lactobacillus, Bifidobacterium, Pediococcus, Propionibacterium o Leuconostoc.
La levadura ScPro1 y/o SCB1 y/o derivado puede administrarse igualmente con otros principios activos tales como antibióticos, analgésicos, antidiarreicos, laxantes y sus mezclas.
La presente invención se va a ilustrar ahora con la ayuda de los ejemplos y las figuras siguientes, que se dan a modo de ilustración y no son en absoluto limitantes, y en cuyas figuras:
- la figura 1 representa el seguimiento de la supervivencia de la levadura ScPro1 en un sistema digestivo artificial que simula el colon humano, según el ejemplo 2,
- la figura 2 representa los efectos de la levadura ScPro1 sobre la microflora cólica, según el ejemplo 2,
- las figuras 3 y 4 representan la evolución del número de células de Candida albicans en heces de ratón para los experimentos 1 y 2 del ejemplo 5 correspondiente a los modelos profiláctico (figura 3) y curativo (figura 4),
- la figura 5 representa el porcentaje de adhesión residual de las células de Escherichia coli AIEC LF82 a células epiteliales intestinales humanas en función de la cantidad de levadura ScPro1 con preincubación; las células de levadura se incubaron con las células epiteliales intestinales durante una hora. Se efectuó la infección de las células con la cepa AIEC LF82 en presencia de la levadura ScPro1, según el ejemplo 6,
- la figura 6 representa el porcentaje de adhesión residual de las células de Escherichia coli AIEC LF82 a células epiteliales intestinales humanas en función de la cantidad de levadura ScPro1 con coincubación; las células de levadura y las células de Escherichia coli se incubaron simultáneamente con las células epiteliales intestinales durante una hora según el ejemplo 6,
- la figura 7 representa la estimación de la intensidad de la inflamación de intestinos de ratón según la puntuación macroscópica de Wallace después de la administración de las levaduras ScPro1 y SCB1, según el ejemplo 4,
- la figura 8 representa la estimación de la intensidad de la inflamación del epitelio intestinal de intestino de ratón según la puntuación histológica de Ameho después de la administración de las levaduras ScPro1 y SCB1, según el ejemplo 4,
- la figura 9 representa la estimación de la intensidad de la inflamación de los intestinos de ratón según la puntuación macroscópica de Wallace después de la administración de las levaduras ScPro1 y SCB1 tomadas solas o en combinación, según el ejemplo 4,
- la figura 10 representa la estimación de la intensidad de la inflamación del epitelio intestinal de ratón según la puntuación histológica de Ameho después de la administración de las levaduras ScPro1 y SCB1, tomadas solas o
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en combinación, según el ejemplo 4,
- la figura 11 representa el nivel de expresión de ARNm del gen que codifica la proteína IL-10 1 hora y 3 horas después de la puesta en contacto de las levaduras o derivados según la invención con las células epiteliales intestinales humanas según el ejemplo 7,
- la figura 12 representa el nivel de expresión de ARNm del gen que codifica el receptor nuclear PPARa 1 hora después y 3 horas después de la puesta en contacto de las levaduras o derivados según la invención con las células epiteliales intestinales humanas según el ejemplo 7,
- la figura 13 representa la modulación de la expresión de ARNm del gen que codifica la proteína IL-10 después de 1 hora y 3 horas después de la puesta en contacto de los derivados de levadura según la invención con las células epiteliales intestinales humanas según el ejemplo 7,
- la figura 14 representa la expresión del gen que codifica la proteína IL-10 en células epiteliales intestinales de ratón después de la administración de la levadura y/o derivado según la invención (ejemplo 4),
- la figura 15 representa la expresión del gen que codifica el receptor nuclear PPARa en células epiteliales intestinales de ratón después de la administración de levadura y/o derivado según la invención (ejemplo 4),
- la figura 16 muestra las cantidades de citocina IL-10 secretadas, medidas en pg/ml, por células intestinales de biopsias de pacientes aquejados o no de enfermedad de Crohn después de su puesta en contacto con las levaduras y/o derivados según la invención (ejemplo 8),
- la figura 17 muestra las cantidades de citocina TNF-a secretadas, medidas en pg/ml, por las células intestinales de biopsias de pacientes aquejados o no de enfermedad de Crohn después de su puesta en contacto con las levaduras y/o derivados según la invención (ejemplo 8),
- la figura 18 muestra el resultado del ensayo de determinación de la capacidad de enlace de pili de tipo 1 con fracciones manoproteicas (EL 05 y EL 06) de la levadura ScPro1,
- las figuras 19A y 19B muestran, respectivamente, los porcentajes medios de adhesión y de invasión residual de la cepa AIEC LF82 con relación a células T84 con coincubación con concentraciones crecientes de levadura (ejemplo 6)-*p<0,05, **p<0,01,
- las figuras 20A y 20B muestran, respectivamente, los porcentajes medios de adhesión e invasión de la cepa AIEC LF82 con relación a células T84 con coincubación con concentraciones crecientes de manoproteínas de levadura EL05 - (ejemplo 6),
- las figuras 21A y 21B muestran, respectivamente, los porcentajes medios de adhesión y de invasión residual de la cepa AIEC LF82 con relación a células T84 con preincubación con concentraciones crecientes de levadura (ejemplo 6)-*p<0,05 y **p<0,01,
- las figuras 22A y 22B muestran, respectivamente, los porcentajes medios de adhesión e invasión de la cepa AIEC LF82 con relación a células T84 con preincubación con concentraciones crecientes de manoproteínas de levadura EL05 (ejemplo 6) - *p<0,05 y **p<0,01,
- la figura 23 muestra los porcentajes de adhesión residual de la cepa AIEC LF82 con relación a las células CHO-K1 y CHO-K1/CEACAM6 con preincubación con concentraciones crecientes de levadura ScPro1 seca instantánea (ejemplo 6) - *p<0,05 y **p<0,01,
- la figura 24 muestra la adhesión de la cepa AIEC LF82 o del mutante no piliado LF82-8fmH al borde en cepillo de enterocitos de 3 extracciones de células aquejadas de enfermedad de Crohn (ejemplo 6),
- la figura 25 muestra la medida de los umbrales de percepción del dolor (medidos en mm de mercurio) con relación a diferentes levaduras sobre ratas sanas (ejemplo 9) y
- la figura 26 muestra la medida de los umbrales de percepción del dolor (medidos en mm de mercurio) con relación a diferentes levaduras sobre ratas que tienen una hipersensibilidad visceral (ejemplo 9).
Ejemplos:
Ejemplo 1: Supervivencia de la levadura ScProl y/o SCB1 en un entorno digestivo artificial que simula el intestino humano
Estudio del destino de la levadura ScPro1 y/o SCB1 en el transcurso del tránsito gastrointestinal
Se ensayaron y estudiaron in vivo las levaduras ScPro1 y SCB1 en un entorno digestivo artificial que simula la digestión humana, y especialmente mediante el estudio de la supervivencia de las levaduras ensayadas viables en el transcurso del tránsito gastrointestinal.
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Se ensayaron dos muestras de la forma de levadura seca activa ScProl y dos muestras de la forma de levadura seca activa SCB1.
Las dos muestras se diferencian por el tiempo de almacenamiento a temperatura ambiente a vacío: sea el envejecimiento inferior a 6 meses o sea el envejecimiento de 2 años.
• Condiciones experimentales:
Se realizaron las digestiones en el sistema denominado TIM1 (estómago + intestino delgado) siguiendo condiciones experimentales establecidas a partir de datos procedentes de la bibliografía y reproduciendo la digestión de un alimento líquido (agua) en el hombre adulto sano en ayunas, con eliminación de los productos de digestión por diálisis y absorción. Se realizó cada digestión durante 5 horas. Se realizaron todas las digestiones en las mismas condiciones operativas generales, a saber:
Temperatura: La temperatura era de 37 °C.
Parámetros de vaciado gástrico: El vaciado gástrico sigue la ley definida por Elashoff et al. (1982) enunciada como sigue:
F= 1 - 2"(t/T)b
en que F representa la fracción de comida suministrada, t el tiempo, T el tiempo de semivaciado del alimento y b un parámetro que describe el aspecto de la curva. Los parámetros son T= 15 min; b= 1.
Parámetros de vaciado ileal: El vaciado ileal sigue la ley de Elashoff modificada (introducción de un parámetro d que permite la ralentización del vaciado al final de la digestión, Fm= F + d * t3). Los parámetros son: T= 150 min; b= 2,4; d= -10-7 (cf. Figura 2).
Ajustes de pH:
Estómago (min/pH): 0/6,0; 10/3,2; 20/2,4; 40/1,8; 60/1,6; 90/1,5; 300/1,5 Duodeno: 6,4 Yeyuno: 6,9 Íleon: 7,2
Secreciones gástricas:
HCl
Pepsina
Lipasa
Secreciones intestinales:
NaHCO3 en las tres partes del intestino delgado Extracto de bilis en el duodeno Extracto pancreático en el duodeno Diálisis/absorción:
Se realizó la eliminación de moléculas "pequeñas" del quimo intestinal con dos niveles de TIM1 (yeyuno e íleon) con la ayuda de hemodializadores. Se realizó la diálisis del quimo intestinal en continuo frente a una solución salina cuya composición era cercana a la del plasma sanguíneo. Se recogieron los dializados en bolsas de diálisis.
Se realizaron extracciones en el transcurso de la digestión a diferentes niveles del tracto con el fin de seguir la supervivencia de las levaduras ensayadas.
Se realizaron los recuentos de levaduras de acuerdo con metodologías microbiológicas clásicas y se efectuaron sobre las extracciones practicadas en el estómago a los 10, 20, 30 y 45 min, en las salidas ileales acumuladas durante periodos de una hora y en el residuo final.
El método de recuento era el siguiente:
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Cada extracción experimentó rápidamente una dilución en serie x2 con agua fisiológica (NaCI 8,5 g/l) estéril. Luego, se depositaron 0,1 ml de cada dilución y luego se extendieron por la superficie de un medio gelosado repartido por una placa de Petri (dos placas por dilución). Se incubaron las placas 48 h a 35 °C antes de proceder al conteo de las "unidades formadoras de colonias" (UFC).
Se expresaron el resultado de los conteos en ULC/ml (datos brutos) y en porcentaje de células de levaduras vivas con relación al número de levaduras inicialmente introducidas, con el fin de determinar las tasas de supervivencia de las levaduras en el estómago y a la salida del intestino delgado.
La tabla siguiente resume las tasas de supervivencia teóricas (si la viabilidad es del 100 %) y reales obtenidas para cada cepa al nivel de estómago, del conjunto de salidas ileales después de 5 h de digestión y del conjunto del sistema después de 5 h de digestión.
• Resultados:
- Productos digeridos
- Levaduras introducidas en UFC Salida del estómago a T= 45 min Salida ileal a T= 5 h Supervivencia global a T= 5 h
- Scprol lote 1
- 3,5 1010 89 % 100 % 106 %
- Scprol lote 2
- 2,0 1010 88 % 95 % 106 %
- SCB1 1
- 1,5 1010 83 % 76 % 81 %
- SCB1 2
- 1,5 1010 85 % 69 % 76 %
• Conclusión
Estos resultados demuestran bien una excelente supervivencia gastrointestinal para las levaduras ScProl y SCB1.
Ejemplo 2: Supervivencia de la levadura ScProl en un entorno digestivo artificial que simula el intestino humano
Estudio de la supervivencia de la levadura ScPro1 durante la fermentación cólica y de su influencia sobre la microflora intestinal
Se ensayaron y estudiaron in vivo la levadura ScProl en forma seca activa en un entorno digestivo artificial que simula la digestión humana, y especialmente mediante el estudio del destino y del impacto ambiental de levaduras ensayadas viables durante la fermentación cólica.
La fermentación cólica se asemeja a una fermentación continua con aportes secuenciados de medio para el mantenimiento de la flora. Este medio abarca principalmente compuestos glucídicos complejos y no digeridos en la parte alta del tracto digestivo (almidón, pectina, celulosa...), compuestos proteicos más o menos hidrolizados y mucina.
Se retira el medio cólico del fermentador igualmente de forma secuenciada. El medio está recorrido por un sistema de diálisis que permite la eliminación continua de los productos solubles de la fermentación.
Se recoge el dializado para análisis de los ácidos grasos de cadena corta (AGCC). Se mantiene el medio en anaerobiosis creada por los propios gases de fermentación y presenta un potencial de oxidorreducción inferior a - 300 mV. Por último, se regula el pH con un punto de ajuste de 6.
Cada digestión constaba de: un periodo de estabilización de la flora de 2-3 días después de la siembra del colon, un periodo de tratamiento (al menos 3 días) con al menos una adición diaria de producto y un periodo de detención del tratamiento de 3 días.
En cada experimento, se siguieron y/o registraron los parámetros siguientes:
- la viabilidad de las levaduras,
- la evolución de las diferentes poblaciones bacterianas aeróbicas y anaeróbicas,
- la evolución de los principales productos de fermentación (AGCC y gas),
- la detección de actividades enzimáticas estándares, y
- la temperatura, el pH y el potencial de oxidorredución.
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Se realizó la fermentación en un matraz de penicilina de 60 ml, cerrado con un septo encapsulado, en 30 ml de medio cólico (medio de cultivo más flora fecal fresca). Se añadió la muestra de levadura a 30 ml de medio.
El medio cólico estaba constituido por una parte de una suspensión microbiana procedente de heces frescas en un tampón fosfato y otra parte de un alimento tipo, igualmente usado para el cultivo de la flora cólica en el colon artificial.
Después del mezclado del medio cólico con el producto para ensayar, se tapó y encapsuló el matraz.
Se realizaron todas estas manipulaciones en una campana extractora anaeróbica (mezcla de gas sin oxígeno). Se colocaron los matraces en incubadora giratoria (37 °C- 200 rpm) durante 24 h.
Para cada producto, se duplicó la prueba. Por otra parte, se prepararon 4 matraces testigo (sin producto) en las mismas condiciones. Se trataron dos matraces inmediatamente (tiempo inicial) y se incubaron dos matraces como los matraces de prueba.
Se detuvieron las fermentaciones a las 24 h y se trataron entonces los matraces.
Producción de gases fermentativos: Se determinó el volumen de gas producido por la fermentación con la ayuda de un sistema de Mariotte (principio de medida del desplazamiento de aire expulsado por el gas a presión contenido en el matraz de penicilina). Se realizó entonces un análisis de los gases presentes en el matraz por CPG (H2, CO2, CH4, O2).
Producción de ácidos grasos de cadenas cortas: Se efectuó una primera extracción del contenido cólico. Se congeló o bien trató directamente con el fin de determinar las concentraciones de AGCC (ácidos grados volátiles de cadenas cortas) del sobrenadante de cultivo. Se realizó este análisis por CPG. Los metabolitos buscados eran los ácidos: acético, propiónico, butírico, isobutírico, valérico, isovalérico, caproico, isocaproico y heptanoico.
Análisis microbiológico: Se efectuó una segunda extracción del contenido cólico y se trató inmediatamente (dilución en serie x2 en un medio de dilución reducido) con el fin de recontar: la flora anaeróbica total, la flora aeróbica-anaeróbica facultativa y la flora fúngica.
Se representan los resultados referentes a la supervivencia de la levadura ScProl en la figura 1. En esta figura, cada flecha vertical indica la administración de levadura ScProl.
Se comprobó que la levadura ScProl muestra una buena supervivencia al 3er día después de la administración y una alta mortalidad entre el 4o y el 7o días en el periodo de administración. Esto muestra que esta levadura no se implanta en un entorno cólico.
Se representan los resultados del análisis microbiológico en la figura 2. Muestran la disminución de las enterobacterias en presencia de levadura ScPro1 con una subida después de la detención de la administración de levadura. En la administración de la levadura ScProl, se comprobó igualmente que la flora resistente a los antibióticos (cloranfenicol, gentamicina) disminuye significativamente.
Se resumen los resultados referentes al efecto de la levadura ScPro1 sobre la producción de ácidos grasos volátiles de cadena corta (AGCC) en la tabla siguiente (expresados en mM en el medio cólico).
- Antes del tratamiento Durante el tratamiento Después del tratamiento
- Acetato
- 71,4 ± 2,3 57,6 ± 4,2 60,6 ± 0,7
- Propionato
- 22,8 ± 0,6 26,5 ± 4,2 35,7 ± 1,1
- Butirato
- 35,0 ± 1,6 36,5 ± 2,2 26,6 ± 4,2
- Isobutirato
- 3,2 ± 0,3 3,3 ± 0,2 3,4 ±0,1
- Isovalerato
- 5,6 ± 0,5 5,2 ± 0,2 5,3 ± 0,0
- Valerato
- 8,0 ± 0,6 7,8 ± 1,4 9,1 ±0,9
- Isocaproato
- 0,1 ± 0,1 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0
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- Antes del tratamiento Durante el tratamiento Después del tratamiento
- Caproato
- 9,0 ± 1,1 7,3 ± 0,3 5,7 ± 0,7
- Heptanoato
- 0,2 ± 0,2 0,0 ±0,1 0,0 ± 0,0
- Total
- 155,3 ± 2,7 144,1 ± 6,8 146,4 ± 3,4
Durante el tratamiento, se comprobó una disminución del acetato, en parte en beneficio del propionato, lo que sugiere una disminución de la actividad de la microflora acetogénica.
Entre los otros parámetros seguidos, no se observó un efecto notable del tratamiento sobre
s - la producción de gas (en cantidad y en proporción);
s - Las concentraciones de azúcares totales y simples (estables con el tiempo); y s - Las actividades enzimáticas.
Ejemplo 3: Estudio de la influencia de la levadura ScProl o SCB1 sobre la inducción de la producción de citocinas
Se estudió la influencia de las levaduras vivas ScPro1 y SCB1 sobre la inducción de la producción de citocinas sobre células periféricas mononucleares sanguíneas humanas (PBMC).
Se ensayaron las levaduras ScPro1 y SCB1 en su forma seca instantánea y seca activa desde el punto de vista de su capacidad de inducir la producción de las citocinas IL-10, IL-12, TNFa y TNFy en PBMC humanas.
Preparación de células periféricas mononucleares sanguíneas humanas
Se diluyó dos veces con PBS-Ca (GIBCO) sangre humana fresca obtenida a partir de sujetos con buena salud del Centro de Transfusión y se purificó con un gradiente de Ficoll (GIBCO). Después de centrifugación a 400 x durante 30 minutos a 20 °C, las células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) formaban una capa circular en el suero. Se aspiraron cuidadosamente las PBMC, se pusieron en suspensión en un volumen final de 50 ml usando PBS-Ca y se lavaron 3 veces con la misma solución tampón con etapas de centrifugación de 10 minutos a 20 °C a 350 x g. Se volvieron a poner en suspensión entonces las PBMC usando un medio RPMI completo (GIBCO) enriquecido con 10 % p/v de suero de ternero fetal (inactivado a 56 °C durante 30 minutos), 1 % p/v de L-glutamina (GIBCO) y gentamicina (150 pg/ml) (GIBCO). Se recontaron las PBMC al microscopio, ajustadas a una concentración de 2x106 células/ml y se repartieron (en 1 ml de solución alícuota) en placas de cultivo celular de 24 pocillos (Corning, Inc.).
Preparaciones microbiológicas
Se lavaron 2 veces con tampón PBS a pH 7,2 cultivos de Lactobacillus, Lactococcus y Escherichia coli (cepas de control), realizados durante la noche, antes de volver a poner en suspensión en PBS a una concentración de 2.109 UFC/ml.
La concentración de levadura usada en los primeros experimentos era de 2.108 ufc/ml. Para un estudio de comparación de dosis inicial, pudieron hacerse diluciones en serie de 10 en 10 para comparar los efectos de 2.107 UFC/ml, 2x108 UFC/ml y 2.109 UFC/ml.
Incubación de células periféricas mononucleares sanguíneas humanas
Se transfirieron 10 pl de estas suspensiones de trabajo a los pocillos de las placas que contenían las PBMC, que se pusieron a incubar a 37 °C en una mezcla gaseosa compuesta por 5 % de CO2 y 95% de aire atmosférico. Después de 24 h de incubación, se aspiró el sobrenadante, se centrifugó a 2.000 rpm (modelo Eppendorf), se retiró y se conservó a -20 °C.
El control se compone de bacterias grampositivas (Lactobacillus y Lactococcus), una bacteria gramnegativa (Escherichia coli) y tampón sin levadura.
Cuantificación de las citocinas
Se determinaron los niveles de expresión de citocinas por ELISA. Se recubrieron las placas ELISA con un anticuerpo (durante una noche) y se saturó el anticuerpo con PBS/1 % de BSA (seroalbúmina bovina). Se preparó un calibrado
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con concentraciones conocidas de citocinas, con un umbral de detección de 15,62 a 2000 pg/ml (incubación durante la noche). Se realizó la investigación y cuantificación de anticitocina por medida de la actividad estreptavidina con el sustrato TMB (tetrametilbencidina, Pharmigen2). Se usaron los kit Pharmingen comerciales de acuerdo con la descripción del fabricante. Se eligieron cuatro citocinas: 3 proinflamatorias (TNFa, IFNy, IL-12) y una antiinflamatoria (IL-10).
Resultados
Se evaluaron las respuestas de las 4 citocinas sobre 5 donantes distintos a una relación 1/1, levaduras/PBMC.
Se resumen los resultados de las valoraciones de las 4 citocinas secretadas en el sobrenadante de cultivo en la tabla A siguiente. Se expresan los datos como el valor medio (Moy) procedente de las valoraciones de los 5 donantes. La tabla da igualmente el valor (Sem) del error estándar de la media.
- IL-10 (pg/ml) ifny (pg/ml) TNFa (pg/ml) IL-12 (pg/ml)
- Moy
- SEM Moy SEM Moy SEM Moy SEM
- Testigo negativo
- 0 0 50 0 50 0 0 0
- E. coli
- 2474 839 57376 29591 11185 3875 15 15
- Lactococcus lactis
- 111 43 136103 62706 25362 9818 1101 543
- Bifidobacterium longum
- 1072 355 33780 27164 14517 5601 22 20
- Lactobacilus acidophilus
- 435 259 85543 46838 18369 6857 529 343
- SCB1
- 569 291 27807 19231 6492 2698 14 10
- ScPro1
- 442 292 15218 9304 3643 1847 8 5
Tabla A
Se observó:
1) Para las levaduras ScProl y SCB1, la producción de cantidades muy bajas, hasta indetectables, de IL-12 inducida por las PBMC, al contrario que las bacterias de referencia.
2) Niveles sustanciales de IL-10 a la vez para las levaduras vivas, revelando que SCB1 presenta un mejor resultado de ScPro1.
3) En lo referente a IFNy y TNFa, las cantidades secretadas bajo la acción de las levaduras ScPro1 y SCB1 son netamente menores en comparación con las diferentes bacterias probióticas ensayadas.
Conclusiones:
- Parece claramente que las levaduras ScPro1 y SCB1 en presencia de PBMC no inducen la citocina proinflamatoria IL-12, al contrario que lo que se observa clásicamente con los lactobacilos probióticos.
- Las levaduras ScPro1 y SCB1 en presencia de PMBC inducen niveles sustanciales de IL-10 (antiinflamatoria).
- Las cantidades secretadas de IFN-y y TNF-a por las PBMC en presencia de las levaduras ScPro1 o SCB1 son netamente menores que con las bacterias probióticas.
Ejemplo 4: Evaluación del efecto protector de las levaduras ScProl y SCB1 frente a la colitis en un modelo quimioinducido (TNBS) de ratón
El modelo animal propuesto se usa corrientemente y se adaptó para medir los efectos antiinflamatorios de las levaduras.
Se usaron ratones Balb/c de 6 semanas de edad en el transcurso de este ensayo. Se aclimataron los ratones a las condiciones de laboratorio una semana antes del experimento, con agua y comida proporcionadas a voluntad. Se ensayó cada muestra en un grupo de 10 ratones. Se indujeron las colitis mediante un ciclo de distribución de agua de bebida a voluntad que contenía 5 % (p/v-1) de TNBS durante 7 días. Se administraron las levaduras por vía oral por sonda una vez al día, 3 días antes del inicio de la inducción de la colitis por TNBS y durante el curso del tratamiento con TNBS (7 días).
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Además de los dos grupos ensayados, se recurrió a un grupo testigo (control negativo) para el que solo se usó una solución fisiológica.
Los parámetros ensayados son los siguientes al término de los tratamientos:
- La evaluación macroscópica de la inflamación intestinal (puntuación de Wallace). Se examinó el colon de cada ratón bajo microscopio de disección (x5 aumentos) para evaluar las lesiones macroscópicas según el sistema de puntuación de Wallace, que va de 0 a 10 en función de criterios de evaluación reveladores de la gravedad de la inflamación, tales como hiperemia, grosor de las paredes del colon y extensión de las ulceraciones.
- La evaluación histológica de las inflamación (puntuación de Ameho). Se usó una sección del colon extraída exactamente a 2 cm del canal anal para realizar la evaluación histológica según la puntuación de Ameho, que va de 0 a 6 según el grado de infiltración de la inflamación, la presencia de erosión, ulceraciones o necrosis y la profundidad así como la extensión de la superficie de las lesiones. Se efectuó la cuantificación de las degradaciones y lesiones intestinales por 2 operarios independientes.
- Cuantificación de la expresión de los genes que codifican IL-10 y PPARa Para hacer esto, se aisló el ARN total de los tejidos colónicos mediante el kit RNeasy (Macherey Nagel, Hoerdt, Francia) según las instrucciones del fabricante. Se efectuó la cuantificación del ARN mensajero usando un espectrofotómetro. Después de un tratamiento a 37 °C durante 30 minutos con 20-50 unidades de ADNasa I exenta de ARN (Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis, IN, EE.UU.), se emplearon cebadores oligo-DT (Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis, IN, EE.UU.) para sintetizar los ADN circulares monocatenarios. Se cuantificaron los ARN mensajeros con SYBR Green Master Mix (Applera, Courtaboeuf, Francia) y con oligonucleótidos humanos específicos para estudios in vitro (véase la tabla B siguiente), mediante el aparato GeneAmp Abiprism 700 (Applera, Courtaboeuf, Francia). Se incluyeron controles calibrados y no calibrados en cada ensayo. Se midió cada muestra tres veces. Se analizó la intensidad del color de SYBR verde con el software Abiprism 7000 SDS (Applera, Courtaboeuf, Francia). Se normalizarán todos los resultados con relación al gen que codifica la p-actina.
- Genes
- Secuencias de cebadores nucleotídicos
- p-actina
- F: 5'-AAgTCCCTCACCCTCCCAAAAg-3' R: 5'-AAgCAATgCTgTCACCTTCCC-3'
- PPARa
- F: 5'-ACgATgCTgTCCTCCTTgATg-3' R: 5'-gTgTgATAAAgCCATTGCCgT-3'
- IL-10
- F: 5'-CAgTCAgCCAgACCCACAT-3' R: 5'-gCTCCACTgCCTTgCTTT-3'
Tabla B
Se han ensayado las levaduras ScProl y SCB1 en el modelo preventivo estándar descrito anteriormente. Un seguimiento del peso de los animales antes de la inducción de la colitis mostró que las preparaciones de levaduras administradas a ratones se han tolerado bien.
Se ha reducido la inflamación intestinal, estimada por la puntuación de Wallace, un 60 % con las levaduras ScProl (seca activa, 1 mg/día) y SCB1 en comparación con el control positivo. La levadura SCB1 indujo igualmente una reducción de la inflamación. De igual modo, se ha reducido la necrosis intestinal, estimada por la puntuación de Ameho, un tercio con la levadura ScProl (seca instantánea, 1 mg o 100 pg/día) en comparación con el control positivo.
Las levaduras ScPro1 y SCB1, administradas solas o en conjunto, aumentaban el nivel de expresión de los genes que codifican la interleucina inflamatoria IL-10 y el receptor nuclear PPARa.
Las figuras 7 a 10 ilustran bien los excelentes valores de las puntuaciones macroscópicas de Wallace y Ameho de las levaduras ScPro1 y SCB1 a dosificaciones diarias diferentes.
En las figuras 7 y 8, se han representado, respectivamente, la puntuación macroscópica de Wallace y la puntuación histológica de Ameho de las levaduras ScPro1 y SCB1 en forma seca instantánea, dosificada diariamente a 10 pg y 1 mg.
Las cifras de cada columna de la gráfica de las figuras 7 y 8 representan los elementos siguientes:
1 representa el TNBS solo,
2 representa TNBS + ScPro1 (1 mg),
5
10
15
20
25
30
35
40
45
3 representa TNBS + ScProl (100 pg),
4 representa TNBS + SCB1 ( 1mg),
5 representa TNBS +SCB1 (100 pg).
Se puede señalar que la levadura ScProl seca instantánea, dosificada a 100 pg/día, reduce de manera significativa las lesiones a niveles macroscópico e histológico.
En las figuras 9 y 10, se han representado respectivamente la puntuación macroscópica de Wallace y la puntuación histológica de Ameho de las levaduras ScPro1 y SCB1, tomadas solas y en combinación, en forma seca instantánea
0 seca activa, dosificadas diariamente a 100 pg y 1 mg.
Las figuras 14 y 15 muestran, respectivamente, el nivel de expresión de los genes que codifican la interleucina antiinflamatoria y el receptor nuclear PPARa al nivel de las células intestinales.
Las cifras de cada columna de la gráfica de las figuras 9, 10, 14 y 15 representan los elementos siguientes:
1 representa el TNBS solo,
2 representa TNBS + ScPro1 seca instantánea (100 pg),
3 representa TNBS + ScPro1 seca activa (100 pg),
4 representa TNBS + SCB1 seca activa (100 mg),
5 representa TNBS +ScPro1 seca activa (1 mg),
6 representa TNBS + ScPro1 seca activa (100 pg),
7 representa TNBS + ScPro1 seca activa (100 pg) + SCB1 (100 pg).
Conclusiones:
Se puede señalar que ScPro1 en forma seca activa induce de manera significativa las lesiones al nivel macroscópico, y que existe un efecto antiinflamatorio sinérgico para la combinación de ScPro1 y SCB1, tanto a nivel macroscópico como a nivel histológico.
ScPro1 y SCB1 aumentaban, respectivamente en 2,9 y 3,1, el nivel de expresión del gen que codifica la interleucina antiinflamatoria IL-10 a dosis de 100 pg. La combinación de ScPro1 + SCB1 (histograma n° 7) multiplica por 2,7 este nivel de expresión (figura 14).
ScPro1 y SCB1 aumentaban respectivamente por 1,5 y 1,6 el nivel de expresión del gen que codifica el receptor nuclear PPARa a dosis de 100 pg. La combinación de ScPro1 + SCB1 (histograma n° 7) multiplica por 1,7 este nivel de expresión (figura 15).
Ejemplo 5: Estudio de la influencia de las levaduras ScProl y SCB1 sobre la colonización al nivel intestinal de Candida albicans en un modelo múrido de inflamación quimioinducida.
El estudio aspira a determinar los efectos de la administración de levaduras ScPro1 y SCB1 de tipo probiótico sobre la colonización intestinal de la levadura patógena Candida albicans y su efecto de potenciación de la inflamación en un modelo múrido de colitis quimioinducida.
Las levaduras ensayadas estaban en forma seca instantánea.
• Condiciones experimentales:
Los ratones hembra de cepa Balb/C son de 4 a 6 semanas de edad. A partir del D0 hasta el D14, los animales recibieron DSS (dextrano-sulfato de sodio) al 1,5 % en el agua de bebida, para la quimioinducción de la inflamación.
Se han realizado tres experimentos.
En el primero, el D-5 se han alimentado por cánula a los ratones 5.107 células de levadura ScPro1 en 200 pl de PBS (tampón fosfato). Se ha repetido esta operación todos los días durante 19 días. El D0 se alimentaron por cánula a los ratones 5x107 células de levadura de la cepa de C. albicans SC5314 en 200 pl de PBS.
En el segundo, el D0 se alimentaron por cánula a los ratones 5x107 células de levadura de la cepa de C. albicans SC5314 en 200 pl de PBS. 4 días después, fue objeto un lote de ratones de alimentación por sonda de 5x107 células de levadura ScPro1 en 200 pl de PBS. Se ha repetido esta operación todos los días durante 14 días.
En el tercero, el D0 se alimentaron por cánula a los ratones 5.107 células de levadura de la cepa de C. albicans
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SC5314 en 200 |jl de PBS. 1 hora después, fue objeto un lote de ratones de alimentación por sonda de 5.107 células de levadura ScPro1 en 200 |il de PBS. Se ha repetido esta última operación todos los días durante 14 días.
Los animales (procedentes de los experimentos 1, 2 y 3) se han seguido diariamente en lo referente a los puntos siguientes:
- la consistencia de las heces, el sangrado anal y su masa corporal (puntuación clínica),
- retrocultivos de 1 mg de heces homogeneizadas en 1 ml de PBS del que se han sembrado 10 |il sobre medio Candi-select; después de 24 h de cultivo a 37 °C, se recontaron las UFC de C. albicans (coloreadas de azul) y de C. cerevisiae (coloreadas de verde),
- se han sacrificado los animales al término de los ensayos. Se ha extraído sangre inmediatamente por punción cardiaca y decantada a temperatura ambiente, se ha recuperado el suero por centrifugación y almacenado a -80 °C; se ha extraído el colon y repartido en 4 secciones, de las que 3 se han congelado y 1 se ha colocado en el fijador (PFA al 4 %) para estudio histológico.
•Resultados:
Como puede verse en la figura 3, en el primer experimento (prueba del efecto profiláctico), se observó en este modelo de colitis quimioinducida que la administración de DSS aumenta significativamente la colonización de mucosas intestinales por C. albicans a partir del D4 (DSS + Ca). De manera muy interesante, se ve que la administración de la levadura probiótica ScPro1 durante 19 días reduce significativamente la colonización de C. albicans inducida por DSS.
Como se muestra en la figura 4, en el segundo experimento (prueba de tratamiento), se observó que la administración de la levadura probiótica ScPro1 o SCB1 reduce la colonización inducida por DSS. Además, los efectos de la levadura ScPro1 son visibles incluso después de la detención del tratamiento por DSS el D14.
• Conclusión:
Se concluye que la administración de la levadura ScPro1 o de la levadura SCB1 reduce de forma significativa la colonización de C. albicans, y esto a la vez en condición profiláctica y en condición de tratamiento. Ha de señalarse que este efecto protector perdura incluso con la detención del tratamiento.
Ejemplo 6: Estudio del efecto inhibidor de la levadura ScProl o SCB1 o derivados sobre la potencia de adhesión e invasión de las cepas patógenas de E. coli aisladas de biopsias ileales de pacientes aquejados de enfermedad de Crohn.
Se ha estudiado la influencia de las levaduras vivas ScPro1, SCB1 y derivados por sus efectos inhibidores sobre la potencia de adhesión e invasión de las cepas patógenas de E. coli aisladas de biopsias ileales de pacientes aquejados de enfermedad de Crohn.
Las cepas de E. coli denominadas AIEC por E. coli adherentes-invasivas aisladas de biopsias ileales de pacientes aquejados de enfermedad de Crohn (EC) son capaces de adherirse e invadir las células epiteliales intestinales.
La cepa de E. coli LF82, aislada de una lesión ileal crónica en un paciente aquejado de enfermedad de Crohn, posee todas las características de un patógeno bacteriano invasivo. La caracterización de un fenotipo de adhesión-invasión de la cepa LF82 y la ausencia de determinante antigénicos de invasión ya descritos en E. coli, Shigella y Salmonella condujo a definir la existencia de un nuevo grupo patógeno de E. coli que puede estar asociado a la enfermedad de Crohn, designado AIEC. Después de la fagocitosis por macrófagos múridos o humanos, la cepa AIEC LF82 sobrevive y se multiplica en una vacuola grande, manteniendo la integridad de la célula hospedadora. Después de la infección, los macrófagos segregan una tasa importante de TNFa. La prevalencia de las cepas AIEC es del 36,4 % al nivel de las lesiones ileales de pacientes aquejados de EC.
El proceso de adhesión de una bacteria a células eucarióticas es el resultado de una interacción específica entre un ligando presente en la superficie de la bacteria, llamado adhesina, y un receptor de naturaleza proteica, glicoproteica o glicolipídica expresado en la superficie de la célula epitelial del hospedador. En lo referente a las bacterias, se ha mostrado que la adhesina FimH de los pili de tipo 1 está implicada en la adhesión de las bacterias AIEC a células epiteliales intestinales. La adhesina bacteriana FimH reconoce el receptor enterocítico CEACAM6 (denominado igualmente CD66c o NCA), que es una glicoproteína rica en residuos de manosa y anormalmente sobreexpresada al nivel ileal en el 90 % de los pacientes aquejados de EC.
Condiciones experimentales:
Se usó la cepa AIEC LF82, caracterizada por su potencia de adhesión e invasión de células epiteliales intestinales en cultivo, como cepa prototipo.
Este estudio se ha extendido a 10 cepas AIEC aisladas de pacientes aquejados de EC con el fin de confirmar los
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resultados obtenidos con la cepa AIEC LF82.
Se usa la cepa de E. coli DAEC (Escherichia coli difusa adherente) C1845, que se adhiere a células epiteliales a través de un mecanismo independiente de manosa (adhesinas Afa/Dr) como control negativo.
Ensayos de aglutinación
Con las levaduras ScPro1 y SCB1 vivas, se han realizado ensayos de aglutinación cuantitativos en presencia de bacterias AIEC, o bien en presencia de extractos purificados de pili de tipo 1 preparados a partir de la cepa AIEC LF82 según el protocolo descrito en Boudeau y col. (2001 Mol Microbiol. 39: 1272-84). Se ha determinado el índice de aglutinación con la ayuda de una concentración fija de levadura y concentraciones variables de bacterias o de pili de tipo 1 purificados.
En el caso de fracciones de levadura de tipo manoproteico para las que no se observa aglutinación, se realizó una determinación de la capacidad de enlace de los pili de tipo 1 por la técnica ELISA.
Estos ensayos se practican habitualmente en microplacas. Se fijan las fracciones de levaduras sobre una microplaca. Se ponen en contacto diversas diluciones de pili de tipo 1 purificados con las fracciones de levaduras. Después de los lavados, se revelan los pili de tipo 1 con la ayuda de anticuerpos antipili de tipo 1 obtenidos en conejo (Boudeau y col. 2001). Después de los lavados, se usan anticuerpos secundarios acoplados con peroxidasa. Se realizó la cuantificación con la ayuda del sustrato de peroxidasa (H2O2) y un cromógeno (tetrametilbencidina) y la lectura de la microplaca a la densidad óptica de 450 nanometros.
Ensayos de inhibición de la interacción de las bacterias AIEC con el receptor CEACAM6 expresado en la superficie de células epiteliales intestinales por la levadura ScPro1 o SCB1.
Células usadas:
Para los ensayos de inhibición in vitro (pre- o coincubación), se han seleccionado células epiteliales intestinales T84 no diferenciadas, que expresan fuertemente el receptor CEACAM6. Se han cultivado las células T84 bajo 5 % de CO2 a 37 °C en medio básico DMEM (medio Dulbecco modificado por Eagle) con adición de 50 % de Ham-F12 (Life Technology) y 10 % de suero de ternero fetal descomplementado por calor. Se han añadido a este medio 1 % de aminoácidos no esenciales (Life Technology), 1 % de glutamina (Life Technology), 200 U/I de penicilina, 50 mg/l de estreptomicina, 0,25 mg/l de anfotericina B y 1 % de mezcla vitaminada X-100 para medio MEM (medio mínimo esencial) (Life Technology). Se han sembrado las células a 4.105 células por pocillo y por ml y se han incubado 48 h a 37 °C bajo 5 % de CO2. Se han lavado a continuación los tapices de células T84 con PBS, luego se ha añadido 1 ml de medio de infección (DMEM/F12 + 10 % de SVF) a cada pocillo. A partir de un cultivo de la cepa AIEC LF82 de una noche a 37 °C en caldo Luria-Bertani (LB), se ha preparado una suspensión bacteriana con una DO620 de 0,1 en PBS. Se han infectado las células T84 con una multiplicidad de infección (MOI) de 10 bacterias por 1 célula añadiendo 25 |il de suspensión bacteriana a DO620 de 0,1 en el medio de infección. Se ha incubado una placa de 24 pocillos 3 h a 37 °C en atmósfera enriquecida en CO2. Se ha realizado la adhesión e invasión residuales de bacterias como se describe anteriormente.
Se ha usado un experimento que recurre a células CHO-K1 que no expresan CEACAM6 y a estas mismas células modificadas genéticamente que expresan de manera estable CEACAM6 (CHO-K1/CEACAM6). Se han cultivado las células CHO-K1 en medio DMEM/F12, 5 % de suero fetal de ternero, 1 % de L-glutamina, 200 U/I de penicilina, 50 mg/l de estreptomicina y 0,25 mg/l de anfotericina B. Se han cultivado las células CHO-K1/CEACAM6 en medio DMEM/F12, 5 % de suero fetal de ternero, 1 % de L-glutamina y 600|ig/ml de higromicina. Se han sembrado las células en placa de 24 pocillos a 2.105 células/pocillo. Después de 7 a 8 h de incubación a 37 °C, se reemplaza el medio por medio de cultivo nuevo, con adición de butirato de sodio 5 mM, con el fin de inducir la expresión de CEACAM6. Se ha realizado una transferencia Western con el fin de controlar la expresión de la proteína CEACAM6 por las células transfectadas.
Después de 20-24 h de incubación a 37 °C, se han incubado las células con concentraciones crecientes de la cepa de levadura ScPro1 seca instantánea durante 1 h (experimento de preincubación), y luego se han infectado a una MOI de 20 (4.106 bacterias/pocillo) con el fin de respetar la relación de bacterias/levaduras anteriormente usada en los experimentos conducidos con células T84. Después 3 h de incubación a 37° C, se han recontado las bacterias adherentes en ausencia o en presencia de levaduras como se describen a continuación.
Otro experimento usó especímenes operatorios procedentes de pacientes enfermos. Se han lavado los enterocitos, procedentes de biopsias ileales de 3 pacientes aquejados de enfermedad de Crohn, con PBS y luego se han preincubado en un tubo Eppendorf de 2 ml, en 1 ml de medio DMEM, 20 % de suero fetal de ternero, en presencia de 0, 1,25, 2,5 o 5 mg/ml de la cepa de levadura ScPro1 en forma seca instantánea. Se ha colocado el tubo con agitación por rotación durante 15 min a 37 °C y luego se han infectado los enterocitos, en presencia de levadura, con 50 |jl de un cultivo en LB de una noche de la cepa AIEC LF82. Se ha realizado una incubación de 3 h con agitación. Se han lavado los enterocitos con 2 repeticiones con PBS, y se han depositado luego entre portaobjetos y cubreobjetos y observado por microscopio de contraste de fase. Se han efectuado los conteos de bacterias adherentes en el borde en cepillo de los enterocitos en ausencia o en presencia de las levaduras. Se ha realizado
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igualmente el experimento con el mutante no piliado LF82-delta-fimH, con el fin de determinar el nivel de adhesión basal de las bacterias AIEC no poniendo en juego el reconocimiento de los pili de tipo 1 en receptores CEACAM6. De igual modo, se han conducido experimentos de inhibición de la adhesión en presencia de anticuerpo anti- CEACAM6.
Protocolo seguido para medir la adhesión e invasión residual de bacterias en células epiteliales intestinales T84.
Se ha lavado el tapiz celular con 4 repeticiones con 1 ml de PBS y luego se han lisado las células por incubación de 5 min a temperatura ambiente con 500 pl de Triton X-100 al 1 % en agua destilada. Se han diluido los lisados y luego se han extendido sobre LB-agar gelosado para determinar el número de ufc, correspondiente a los números de bacterias adherentes.
Para recontar las bacterias invasivas, se ha lavado el tapiz celular con PBS seguido de 3 h de infección y luego se ha incubado 1 h con 1 ml de medio de infección que contiene 100 pg/ml de gentamicina, con el fin de destruir las bacterias extracelulares. Se han recontado las bacterias invasivas después de la lisis de las células, diluciones en serie y extensión sobre LB-agar gelosado.
Se han analizado los niveles de adhesión e invasión de la cepa AIEC LF82 en comparación con células infectadas por la cepa AIEC LF82 que no han experimentado tratamiento con levaduras o derivados de levadura.
Se expresarán todos los resultados según la relación R:
R= Número de bacterias adherentes o invasivas en presencia de la levadura ScPro1/número de bacterias adherentes o invasivas sin tratamiento.
Protocolo 1: modelo de coincubación
Se prepararon las células T84 y la suspensión de bacterias como se describe a continuación en los ensayos de adhesión e invasión. Se pusieron las levaduras o derivados de levadura en suspensión en PBS a una concentración determinada, y se añadieron luego 25 pl de esta suspensión al medio de infección de células T84 (1 ml). Se infectaron inmediatamente a continuación las células a MOI= 10 con la cepa bacteriana. Se homogeneizó la suspensión de bacterias/levaduras incubadas en presencia de células, se incubó luego la placa de 24 pocillos durante 3 h a 37 °C. Se determinaron los niveles de adhesión e invasión de la cepa bacteriana como se describe a continuación, y esto en ausencia y en presencia de levaduras o de extractos de levaduras en la infección. La relación entre el nivel de adhesión o invasión bacteriana en ausencia de levadura (100 %) y el nivel de adhesión o invasión bacteriana en presencia de levaduras representa el nivel de adhesión o invasión residual de las bacterias.
Protocolo 2: modelo de preincubación
Se prepararon las células T84 y la suspensión de bacterias como se describe a continuación en los ensayos de adhesión e invasión. Se añadió la suspensión de levaduras o derivados de levadura al medio de infección (1 ml) de células T84 a un volumen de 25 pl. Se homogeneizó la suspensión de levaduras y luego se incubó la placa de células de 24 pocillos durante 1 h a 37 °C. A continuación de esta incubación, se infectaron las células T84 por la cepa bacteriana a MOI= 10, en presencia de levaduras, y esto durante 3 h a 37 °C. Se realizó el recuento de las bacterias adherentes e invasivas como se describe anteriormente, en presencia o en ausencia de levaduras, con el fin de determinar el porcentaje de adhesión o invasión residual, donde 100 % representa la adhesión o invasión en ausencia de levadura.
- Verificación de la expresión de CEACAM6.
Se realizaron marcajes inmunocitoquímicos sobre cada lote de células en cultivo para verificar la presencia y estimar la cantidad de CEACAM6 expresado. Se cultivaron las células sobre cubreobjetos de vidrio estériles. Se lavó el tapiz celular con PBS y se fijó luego con paraformaldehído al 3 %, pH 7,4 durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se incubaron las células con el anticuerpo monoclonal anti-CEACAM6 (clon 9A7, Genovac) diluido a 1/100 en PBS-5 % de suero de caballo, en atmósfera húmeda durante 1 hora. Después de lavado con PBS, se pusieron en contacto las células con un anticuerpo secundario acoplado con un fluorocromo (FITC-anti-ratón, Zymed) diluido a 1/500 en PBS- 5 % de suero de caballo, durante 1 hora en atmósfera húmeda. Se fijaron los cubreobjetos de vidrio sobre los portaobjetos con Moewiol y luego se visualizaron con un microscopio de fluorescencia.
- Control de ausencia de citotoxicidad celular.
Se ensayó la ausencia de citotoxicidad celular inducida por diferentes dosis de levadura por valoración de la lactato deshidrogenasa (LDH) en medio de incubación de levaduras/células o FDL/células (Glasser y col, 2001).
Resultados:
Ensayos de aglutinación con LF82
Se resumen los títulos de aglutinación obtenidos con LF82 en presencia de la levadura ScProl o SCB1 en cultivo (=forma fresca) o en forma seca (secado de seca instantánea o liofilizada) en la tabla siguiente, que es el resultado de 3 a 5 manipulaciones independientes:
- Título de aglutinación
- Levadura
- Forma Media Título mini Título maxi
- ScProl
- Cultivo fresco 1/7 1/3 1/12
- ScProl
- Seca instantánea 1/58 1/20 1/96
- ScPro1
- Seca liofilizada 1/43 1/24 1/64
- SCB1
- Cultivo fresco 1/28 1/12 1/40
- SCB1
- Seca instantánea 1/16 1/12 1/20
- SCB1
- Seca liofilizada 1/19 1/16 1/24
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De manera absoluta, se obtienen buenos resultados de aglutinación con LF82 con la levadura seca ScPro1 seca instantánea y la levadura SCB1 seca instantánea.
Para estas levaduras, se mostró la importancia del impacto favorable del procedimiento, y especialmente del procedimiento de secado, sobre su potencial de aglutinación.
10 Ensayos de aglutinación con pili purificados
Se resumen en la tabla siguiente los títulos de aglutinación obtenidos con los pili purificados en presencia de la levadura ScPro1 en cultivo (= forma fresca) o en forma seca instantánea y de la levadura SCB1 (seca):
- Título de aglutinación
- Levadura
- Forma exp 1 exp 2 exp 3
- ScPro1
- Fresco - levadura comprimida 1/300 1/300 1/400
- ScPro1
- Seca instantánea 1/600 1/600 1/300
- SCB1
- seca liofilizada 1/300 1/300 1/200
Este experimento confirma que la interacción pili-levadura es muy necesaria para la aglutinación. Los pili que tienen 15 como propiedad reconocer las estructuras de manosa, son estos últimos los reconocidos por las levaduras y que
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participan en el fenómeno de aglutinación observado. Se obtienen los mejores resultados con la levadura ScProl seca instantánea.
Resultado de los ensayos de determinación de la capacidad de enlace de pili de tipo 1 sobre fracciones manoproteicas de levadura ScProl.
La figura 18 muestra claramente que los pili de tipo 1 purificados a partir de la cepa AIEC LF82 se fijan específicamente sobre las manoproteínas de levadura. Se destaca que el método de preparación (térmico o enzimático) de estas manoproteínas (EL05 y EL06) influye un poco sobre la constante de afinidad de los pili.
Resultados de la inhibición de la interacción de bacterias AIEC con el receptor CEACAM6 expresado en la superficie de células epiteliales.
1/ Resultados del cribado en muestras de levadura o de derivados de levaduras de su potencia de inhibición de la adhesión e invasión de la cepa AIEC LF82 en células epiteliales intestinales T84 en un modelo de coincubación.
Se estudiaron las levaduras ScPro1 seca instantánea (3,09.107 levaduras/mg), ScPro1 seca (1,86.107 levaduras/mg) y ScB1 seca instantánea (5,83.107 levaduras/mg), así como las manoproteínas de levadura EL05 (forma seca).
A modo de comparación, se añadio Ultra-levure® (Biocodex a 2,054.107 levaduras/mg).
Comparación de la potencia inhibidora de las levaduras con números de levaduras idénticos en el modelo de coincubación
Después de un lavado con PBS y una centrifugación de 15 min a 7500 rpm, se volvieron a poner en suspensión las muestras de levaduras a una concentración de 4.108 levaduras/ml en PBS. Se efectuaron diluciones de levaduras en PBS: 1/2, 1/10, 1/20 y 1/100.
Se realizaron tres experimentos independientes usando el protocolo 1. Se presentan los resultados presentados en las figuras 19 A y 19 B (adhesión residual e invasión residual) en forma de medias de las tasas de adhesión e invasión residuales y las barras de error corresponden al error estándar de la media.
Las figuras 19 A y 19 B permiten obtener los resultados siguientes:
Adhesión:
- Las levaduras ScPro1 seca instantánea y ScPro1 seca inhiben fuertemente la adhesión de la cepa LF82 a células T84 de manera dependiente de la dosis. La inhibición es significativa a partir de 5.105 levaduras/ml para la levadura ScPro1 seca instantánea, contra 5.106 levaduras/ml para la levadura ScPro1 seca.
- La levadura ScB1 seca instantánea inhibe menos fuertemente la adhesión que las otras 2 muestras de levaduras, con un 45,7 % de adhesión residual a 1.107 levaduras/ml, contra 18,7 % y 8 % de adhesión residual respectivamente para las cepas ScPro1 seca instantánea y ScPro1 seca.
Invasión:
- La levadura ScPro1 seca instantánea inhibe significativamente la invasión de células T84 por la cepa AIEC LF82 a partir de 1.105 levaduras/ml. A 1.107 levaduras/ml, la tasa de invasión residual es del 16,3 %.
- Para las levaduras ScPro1 seca y SCB1 seca instantánea, el efecto inhibidor es más tardío, respectivamente a partir de 1.106 levaduras/ml y 5.106 levaduras/ml.
Ensayos de inhibición con manoproteínas EL05 en el modelo de coincubación
Se pusieron en suspensión manoproteínas de levadura EL05 en PBS a una concentración de 160 mg/ml. Se realizaron las diluciones en serie en PBS: 1/2, 1/4, 1/8 y 1/40 y se añadieron 25 pl de cada suspensión de manoproteínas al medio de infección usando el protocolo 1.
Se realizaron tres experimentos independientes. Se presentan los resultados presentados en las figuras 20 A y 20 B (adhesión residual e invasión residual) en forma de medias de las tasas de adhesión residual y las barras de error corresponden al error estándar de la media.
Estas figuras muestran que las manoproteínas de levadura EL05 tienen la capacidad de inhibir la adhesión y la invasión de la cepa AIEC LF82 en células T84 de manera dependiente de la dosis en el modelo de coincubación.
2/ Cribado en muestras de levaduras o de productos de levaduras de su potencia de inhibición de la adhesión y la invasión de la cepa AIEC LF82 en células epiteliales intestinales T84 en un modelo de preincubación.
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Las mismas muestras de levadura y fracciones de estas que se han usado para el modelo de coincubación sirvieron en el modelo de preincubación.
Comparación de la potencia inhibidora de las levaduras a números de levaduras idénticos en el modelo de preincubación.
Después de un lavado con PBS y una centrifugación de 15 min a 7500 rpm, se volvieron a poner en suspensión las muestras de levaduras a una concentración de 4.108 levaduras/ml en PBS. Se efectuaron las diluciones de levaduras en PBS: 1/2, 1/10, 1/20 y 1/100. Se realizaron tres experimentos independientes usando el protocolo 2.
Se presentan los resultados presentados en las figuras 21 A y 21 B (adhesión residual e invasión residual) en forma de medias de las tasas de adhesión e invasión residuales y las barras de error corresponden al error estándar de la media.
El pretratamiento de células T84 con las levaduras permite obtener una inhibición significativa de la adhesión de la cepa LF82 a partir de la dosis de 5.106 levaduras/ml para la cepa ScPro1 seca instantánea y la cepa scPro1 seca. Sin embargo, a esta dosis, no se observó ninguna inhibición significativa con la levadura ScB1 seca instantánea.
El pretratamiento de células T84 con las levaduras permite obtener una inhibición de la invasión de la cepa LF82 a partir de la dosis de 1.105 levaduras/ml para la cepa de levaduras ScPro1 seca.
A partir de la dosis de 5.105 levaduras/ml, las 3 muestras de levaduras inducen una disminución significativa de la invasión de la cepa LF82
Ensayos de inhibición con las manoproteínas EL05 en el modelo de preincubación
Se pusieron en suspensión manoproteínas de levadura EL05 en PBS a una concentración de 160 mg/ml. Se realizaron las diluciones en serie en PBS: 1/2, 1/4, 1/8 y 1/40 y se añadieron 25 pl de cada suspensión de manoproteínas al medio de infección usando el protocolo 2. Se realizaron tres experimentos independientes. Se presentan los resultados presentados en las figuras 22 A y 22 B (adhesión residual e invasión residual) en forma de medias de las tasas de adhesión residual y las barras de error corresponden al error estándar de la media.
Las manoproteínas EL05 permiten inhibir de forma dependiente de la dosis la adhesión e invasión de la cepa LF82 a partir de la concentración de 2 mg/ml.
Resultados de la prueba de inhibición por las levaduras de la adhesión de la cepa AIEC LF82 a CHO-K1 que expresan o no el receptor CEACAM6 en el modelo de preincubación.
Se realizaron cinco experimentos independientes usando el protocolo 2 mencionado anteriormente.
La figura 23 muestra que se observa una inhibición significativa de la adhesión de la cepa AIEC LF82 con las células CHO/CEACAM6 a partir de la preincubación con 25 pg/ml de levaduras. Se observa un efecto inhibidor dependiente de la dosis con estas células.
Se observa igualmente una adhesión de la cepa AIEC LF82 a células CHO-K1, ciertamente debida a la expresión de proteínas manosiladas expresadas en la superficie de estas células. Sin embargo, la preincubación de la cepa LF82 con la levadura ScPro1 seca instantánea no permite inhibir de forma muy significativa la adhesión a células no transfectadas.
Esto certifica por tanto que la levadura interfiere en la adhesión de la cepa LF82 a receptores CEACAM6 expresados por las células.
Resultados de la inhibición de la adhesión de la cepa AIEC LF82 al nivel del borde en cepillo de enterocitos de pacientes aquejados por enfermedad de Crohn en el modelo de preincubación.
La figura 24 muestra los índices de adhesión medios obtenidos en el transcurso del experimento y que se calculan en presencia o en ausencia de concentraciones crecientes de levaduras ScPro1 en forma seca instantánea (mg/ml) o en presencia de anticuerpos anti-CEACAM6. De acuerdo con los resultados de esta figura, se comprobó una disminución significativa y dependiente de la dosis de la cepa AIEC LF82 en el borde en cepillo de enterocitos de pacientes cuando está en presencia de la cepa de levadura ScPro1 seca instantánea. A la dosis de 5 mg/ml de levaduras, la adhesión residual de la cepa AIEC LF82 es similar a la observada en presencia del anticuerpo anti- CEACAM6 o a la observada para un mutante desprovisto de pili de tipo 1.
Conclusión:
Se concluye de este estudio que:
- Las levaduras ScPro1 y SCB1, en particular en forma seca instantánea, presentan una alta potencia de aglutinación de la cepa LF82.
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- Las levaduras ScProl y SCB1 son capaces de inhibir in vitro la adhesión e invasión de células epiteliales humanas (T84, enterocitos de biopsia ileal) y de células CHO que expresan el receptor CEACAM6 human por E. coli de manera dependiente de la dosis.
- Las manoproteínas son capaces de inhibir in vivo la adhesión e invasión de células epiteliales humanas (T84, enterocitos de biopsia ileal) y de células CHO que expresan el receptor CEACAM6 humano por E. coli de manera dependiente de la dosis.
- In vitro, la levadura ScPro1 es capaz, a altas concentraciones, de proteger parcialmente a aproximadamente un 80 % de las células de la infección bacteriana.
Ejemplo7: Estudio del papel regulador de las levaduras ScProl, SCB1 y derivados de levadura sobre la expresión de genes que codifican IL-10 y PPARa en células epiteliales intestinales humanas cultivadas in vitro
Se estudió el carácter probiótico de las levaduras ScPro1 y SCB1, tomadas solas o en combinación, y/o de fracciones de levadura, y su facultad de inhibir el desencadenamiento de inflamaciones por interacción con ciertos receptores intestinales.
Ensayos in vitro
Se estudiaron especialmente los efectos de la levadura y derivados de levadura según la invención sobre diferentes receptores de células epiteliales intestinales por un análisis in vitro sobre dos estirpes celulares de cáncer de colon Caco-2 (ATCC HTB-37) y HT-29 (ATCC HTB-38).
Para ello, se efectuó un análisis transcripcional por extracción del ARN según el método siguiente.
Se lisan las células en Trizol. Sobre la fracción soluble, se realiza a continuación una etapa de desoxirriboncleasa añadiendo 200 pl de una solución que contiene 10 U de inhibidor de ribonucleasa y 10 U de desoxirrobinucleasa.
Se retrotranscribieron 10 pg de ARN en presencia de 200 U de transcriptasa inversa, ditiotreitol, oligo-dT15 y desoxirribonucleótidos.
Se amplifican los ADNc mediante la técnica conocida como reacción en cadena de la polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction en inglés) al mismo tiempo que un competidor que usa cebadores codificantes y anticodificantes específicos, especialmente de los genes siguientes: IL-10 y PPARa.
Después de 40 ciclos de amplificación, realizados en presencia de 1,25 U de Ampli Taq Gold 5000 y migración de diferentes muestras sobre gel de agarosa al 3 %, se determina la intensidad de las bandas por un analizador de imágenes.
Se expresan los resultados en número de moléculas de ARN por 105 moléculas de un patrón interno: la p-actina.
Los resultados, reunidos en la figura 11, comprenden los valores de expresión de ARNm una hora después (con referencia A), y 3 horas después (con referencia B) de la puesta en contacto de las levaduras o derivados con las células epiteliales intestinales del gen que codifica la proteína antiinflamatoria IL-10.
Sobre esta figura 11, las referencias siguientes designan las levaduras/derivados de levadura experimentados que mostraron un nivel de expresión precoz superior a 4 veces la señal de referencia:
3 designa una levadura Saccharomyces cerevisiae,
5 designa la levadura ScPro1 de la invención,
6 designa un extracto de levadura Saccharomyces cerevisiae, y
12 designa una fracción de ARN de levadura Saccharomyces cerevisiae.
Estos resultados muestran bien que la levadura y los derivados de levadura Saccharomyces cerevisiae según la invención inducen la expresión de manera precoz, después de 1 hora, del gen que codifica la citocina antiinflamatoria IL-10.
Efectivamente, con relación al testigo no tratado, la expresión de ARNm para la levadura y los derivados según la invención es superior a 4 en el eje de ordenadas, valor que corresponde ya a una excelente señal de expresión precoz.
Se presentan otros resultados en la figura 13. Esta figura muestra la modulación, en función de las cantidades de derivados de levadura aportados, de la expresión de ARNm del gen que codifica la proteína IL-10.
Sobre esta figura 13, se midió la expresión después de una hora (1h) y después de tres horas (3 h). Se puede ver la
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expresión de levaduras y extractos de levadura Saccharomyces cerevisiae según la invención, designados por las referencias siguientes:
5 designa la levadura ScProl según la invención,
6 designa un extracto de levadura Saccharomyces cerevisiae, y
8 designa un p-glucano parietal de Saccharomyces cerevisiae,
9 designa una manoproteína parietal de levadura Saccharomyces cerevisiae,
11 designa una fracción de ADN de levadura Saccharomyces cerevisiae y
12 designa una fracción de ARN de levadura Saccharomyces cerevisiae.
Se midió la expresión con concentraciones de levadura y/o derivado diferentes.
Cuanto más oscuro es el color de las columnas sobre la figura 13, más elevada es la concentración de levadura/derivado.
Los resultados de esta figura 13 muestran que los extractos de levadura Saccharomyces cerevisiae según la invención inducen de forma precoz los ARNm de citocina antiinflamatoria (IL-10).
Los resultados, reunidos en la figura 12, comprenden los valores de expresión de ARNm una hora después (con referencia A), y 3 horas después (con referencia B) de la puesta en contacto de las levaduras o derivados con las células epiteliales intestinales del gen que codifica el receptor nuclear PPARa.
Sobre esta figura 12, las referencias siguientes designan las levaduras/derivados de levadura ensayados que mostraron un nivel de expresión tardía superior a 3 veces la señal de referencia:
I designa la levadura Saccharomyces cerevisiae ScPro1 según la invención en una forma seca activa.
4 designa una levadura Saccharomyces cerevisiae,
5 designa la levadura Saccharomyces cerevisiae ScPro1 según la invención en una forma seca activa.
8 designa una fracción de pared de levadura Saccharomyces cerevisiae,
9 designa una fracción de p-glucanos parietales de levadura Saccharomyces cerevisiae,
10 designa una manoproteína parietal de levadura Saccharomyces cerevisiae,
II designa una fracción de ADN de levadura Saccharomyces cerevisiae y 12 designa una fracción de ARN de levadura Saccharomyces cerevisiae.
Estos resultados muestran bien que la levadura y los derivados de levadura Saccharomyces cerevisiae según la invención inducen la expresión de manera tardía, después de 3 horas, del gen que codifica el receptor nuclear PPARa.
Efectivamente, la expresión de ARNm para la levadura y los derivados según la invención es superior a 3 en el eje de ordenadas, valor que corresponde ya a una excelente señal de expresión tardía.
Ejemplo 8: Estudio ex vivo del papel regulador de las levaduras y derivados de levadura sobre la expresión de genes que codifican IL-10 y TNF-a en las células epiteliales intestinales humanas aisladas de biopsias de pacientes aquejados de la enfermedad de Crohn.
Se estudió la influencia de las levaduras y/o derivados de levadura sobre la secreción de citocinas IL-10 (antiinflamatoria) y TNF-a (proinflamatoria) ex vivo sobre biopsias de pacientes aquejados de la enfermedad de Crohn o no.
Se extrajeron biopsias intestinales de pacientes aquejados de la enfermedad de Crohn o no, y luego se colocaron durante 24 h en medio HBSS-CML suplementado con penicilina y estreptomicina a 37 °C en atmósfera que contiene 5 % de CO2. Después del lavado, se pusieron las biopsias en contacto con las levaduras o los derivados de levadura durante 4 horas en medio RPMI 1640. Se recuperó el sobrenadante para análisis por ELISA. Se lisaron a continuación las biopsias para permitir una extracción de ARNm o bien de proteínas totales.
Se realizó la confirmación de la secreción de citocinas por análisis inmunológico de los sobrenadantes de cultivos de células y proteínas extraídas por ELISA. Se depositaron proteínas desnaturalizadas durante 5 minutos a 95 °C en tampón de deposición (vol/vol: Tris 75 mM, pH 6,8, 5 % de glicerol, 0,25 % de azul de bromofenol, 2 % de SDS, 5 %
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de p-mercaptoetanol (50 |jg) y se resolvieron sobre gel de poliacrilamida al 10 %. Después de la migración, se transfirieron las proteínas sobre una membrana de PVDF (HybondP-, Amersham Pharmacia Biotech, Orsay, Francia) por electrotransferencia semiseca (Hoefer TE77, Amersham Pharmacia Biotech, Orsay, Francia) durante 1 hora a 16 V. Se revelaron PPARa e IL-10 gracias a antisueros policlonales de conejo anti-PPARa humanos y anti-IL-10 humanos diluidos 1/500e y cuantificados por quimioluminiscencia (E.C.L Amersham Pharmacia Biotech, Orsay, Francia) sobre una película Biomax-MR (Kodak) con la ayuda del software Gel Analyst (CLARA VISION, París, Francia).
Las figuras 16 y 17 muestran los resultados obtenidos, respectivamente, para IL-10 y TNF-a. El eje de ordenadas indica las cantidades de citocinas medidas en pg/ml. Cada punto corresponde a la medida de una biopsia sobre un paciente aquejado de la enfermedad de Crohn en fase aguda (círculo negro), sobre un paciente en remisión de la enfermedad de Crohn (circulo gris) y sobre pacientes sanos (círculo blanco). Una barra indica la media de las medidas.
En estas figuras:
-1 designa la levadura Saccharomyces cerevisiae ScPro1 según la invención en una forma seca activa,
- 3 designa la levadura Saccharomyces cerevisiae,
-8 designa una fracción de pared de levadura Saccharomyces cerevisiae,
-11 designa una fracción del ADN de levadura Saccharomyces cerevisiae, y -12 designa una fracción de ARN de levadura Saccharomyces cerevisiae.
En la figura 16, la levadura ScPro1 de la invención multiplica por 2 la secreción de la citocina antiinflamatoria IL-10 por células epiteliales de pacientes aquejados de la enfermedad de Crohn o en remisión con relación a los pacientes sanos y de testigo negativo (-) correspondientes a medidas efectuadas en presencia de agua fisiológica solo.
La figura 17 muestra que la levadura ScPro1 según la invencion no conlleva el aumento de la secreción de la citocina proinflamatoria TNF-a por las células intestinales aisladas de biopsias de pacientes aquejados de la enfermedad de Crohn o en remisión. Ni ScPro1, ni ninguna de las otras levaduras o derivados de levadura ensayados, induce ninguna secreción de TNF-a.
Ejemplo 9: Estudio de las propiedades analgésicas de las levaduras y derivados de levadura en un modelo múrido de distensión colorrectal.
En rata sana
1/ Materiales y métodos
Se usan ratas macho Sprague Dawley (Charles River, l'Arbresle, Francia) que pesan entre 175 y 200 g en el transcurso de estos ensayos. Se aclimatan las ratas a las condiciones del animalario una semana antes de la experimentación. Se mantienen a razón de cinco animales por jaula, con agua y comida a voluntad. Se conducen todos los ensayos según las recomendaciones del Comité de Investigación y Problemas Éticos de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor [6]. Se toman precauciones para evitar o minimizar la incomodidad de los animales.
2/ Evaluación de la sensibilidad del colon
Se estima la nocicepción de los animales midiendo la presión intracolónica necesaria para inducir una respuesta conductual. Esta presión se genera por distensión colorrectal mediante hinchamiento de un globo introducido en el colon.
La respuesta conductual se caracteriza por una elevación de la parte trasera del cuerpo del animal y una contracción abdominal claramente visible correspondiente a contracciones graves [7-9]. Se anestesian las ratas con un anestésico volátil (isoflurano al 2 %) y se inserta el globo (preparado según el procedimiento descrito por Bourdu [8] por vía intrarrectal de la manera menos invasiva posible a 7 cm del ano. Se adhiere el catéter de la base de la cola con una cinta adhesiva. Después de 5 minutos, se colocan las ratas en medio de una caja de Plexiglas y se conecta el catéter a un barostato electrónico (Distender Series IIRTM, G & J Electronics). Se aplica continuamente una presión creciente hasta el desencadenamiento del reflejo de dolor o hasta que se alcance la presión límite de 80 mm de mercurio.
3/ Compuestos administrados
Se administraron las levaduras por sonda una vez al día durante 15 días.
Se usa morfina inyectada por vía intraperitoneal a una dosis de 1 mg/kg como testigo positivo, 30 min antes de la
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distensión colorrectal.
Se estudiaron 8 grupos de ratas:
-10 ratas de control receptoras de PBS,
-10 ratas receptoras de ScProl seca instantánea (100 |jg/d), (referencia 1)
-10 ratas receptoras de la cepa ScPro1 seca activa (100 jg/d), (referencia 2)
-10 ratas receptoras de la cepa SCB1 (100 jg/d), (referencia 3)
- 10 ratas receptoras de las cepas ScPro1 seca instantánea (50 jg/d) + SCB1 seca instantánea (50 jg/d), (referencia 4),
-10 ratas receptoras de 1 inyección de morfina (1 mg/kg, 30 min antes de la distensión) (referencia 5).
4/ Resultados
La figura 26 muestra por un lado que la levadura ScPro1 en su forma seca instantánea, administrada sola (referencia 1) o en combinación con la cepa SCB1 (referencia 4), y por otro lado en su forma seca activa (referencia 2), aumenta el umbral de percepción del dolor, reduciendo así significativamente la percepción del dolor visceral en comparación con ratas a las que no se administró nada.
Se dan los resultados siguientes en mm de mercurio en comparación con el control:
- 74,5 ± 3,07 frente a 53,6 ± 3,9, p= 0,07 para la cepa ScPro1 seca instantánea - (referencia 1),
- 66,5 ± 3,36 frente a 53,6 ± 3,9, p= 0,04 para la combinación de cepas ScPro1 y SCB1 seca instantánea - (referencia 4),
-72 ± 2,59 frente a 53,6 ± 3,9, p<0,01 para la cepa ScPro1 seca instantánea - (referencia 2).
Por otro lado, este efecto es comparable al inducido por la morfina - referencia 5, usada a la dosis de 1 mg/kg con un umbral de dolor de 72 ± 2,59 mm de mercurio.
La cepa SCB1 seca instantánea induce igualmente un efecto analgésico en ratas sanas a 70 ± 3,16 mm de mercurio, p= 0,026.
En rata con hipersensibilidad visceral 1/ Materiales y métodos
Se usaron ratas hembra Sprague Dawley (Charles River, l'Arbresle, Francia) que pesan entre aproximadamente 175 y 200 g. Se aclimataron las ratas a las condiciones del laboratorio una semana antes de la experimentación. Se mantuvieron a razón de cinco animales por jaula, con agua y comida a voluntad. Se condujeron todos los ensayos según las recomendaciones del Comité de Investigación y Problemas Éticos de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor [6]. Se tomaron grandes precauciones en lo referente a las condiciones de vida para evitar o minimizar la incomodidad de los animales.
2/ Inducción de hipersensibilidad del colon por lavativas con butirato
Para cada lavativa, se introdujo un catéter (Fogarty de 2 mm) en el colon a 7 cm del ano y los animales recibieron, 2 veces al día durante 3 días, 1 ml de una solución de butirato de sodio 200 mM de pH neutro (pH 6,9). Los animales "sanos" recibieron una solución salina.
3/ Tratamiento de los animales con las levaduras según la invención
Se usaron 10 grupos de animales que presentaban hipersensibilidad visceral (n= 10 por grupo). Los animales tratados recibieron 100|ig de levaduras por sonda gástrica, una vez al día durante 15 días. Los animales testigo recibieron PBS según el mismo protocolo que anteriormente. Se pusieron en suspensión las levaduras en una solución de PBS. Las instilaciones de butirato o de soluciones salinas comienzan 7 días después de la primera alimentación con sonda, durante 3 días. Se midió la hipersensibilidad cólica 14 días después del inicio del tratamiento por vía oral, o bien 7 días después de las instilaciones cólicas.
4/ Grupos de animales estudiados
Se estudiaron 7 grupos de ratas. Las referencias numéricas corresponden a la figura 26.
10 ratas receptoras de PBS (testigo),
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10 ratas receptores de levadura seca ScProl seca instantánea (100 |ig/día) - (referencia 1),
10 ratas receptoras de levadura seca ScPro1 seca activa (100 |ig/día) - (referencia 2),
10 ratas receptoras de levadura SCB1 seca instantánea (100 |ig/día) - (referencia 3),
10 ratas receptoras de ScPro1 seca instantánea (50 |ig/día) y SCB1 seca instantánea (50 |ig/día) - (referencia 4),
10 ratas receptoras de morfina - (referencia 5),
10 ratas receptoras de fibratos - (referencia 6).
5/ Resultados
Se puede señalar en primer lugar que, para todas las ratas testigo, el umbral de dolor en los ensayos sobre ratas hipersensibilizadas es inferior al de las ratas sanas.
La levadura ScPro1 en forma seca instantánea, tomada sola o en combinación con la levadura SCB1, muestra efectos analgésicos interesantes en este modelo.
Los valores numéricos son los siguientes:
Referencias mm de mercurio
1 56,5 +/- 4,27 p= 0,03
4 59 +/- 4,33 p= 0,02
Las levaduras según la invención permiten restaurar un nivel de percepción del dolor idéntico al observado en ratas sanas. El efecto analgésico inducido por las levaduras es equivalente al inducido por la morfina.
La figura 26 muestra por otra parte un efecto fuertemente analgésico del fenofibrato, que aumenta por un factor de 2 el umbral de percepción del dolor en ratas con hipersensibilidad visceral (70 +/- 4,48, p= 0,001).
Este resultado confirma el papel del receptor PPARa en la modulación del dolor visceral.
Claims (17)
- 510152025303540REIVINDICACIONES1. Cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos con el n° CNCM I-3856.
- 2. Cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae var. boulardii depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos con el n° CNCM I-3799.
- 3. Composición caracterizada porque comprende la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae según la reivindicación 1, o la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae según la reivindicación 2 o una de sus mezclas.
- 4. Composición según la reivindicación 3, caracterizada porque la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae está en forma seca o fresca, preferiblemente en forma seca instantánea o seca activa.
- 5. Composición según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, que comprende además al menos un derivado de la cepa de levadura según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, elegido entre extractos de levadura, derivados de pared, glucanos parietales, manoproteínas parietales, fracciones lipídicas de levaduras y fracciones de ácidos nucleicos de levadura (ARN, ADN).
- 6. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizada porque comprende entre 107 y 6.1010 UFC, y preferiblemente entre 108 y 2.1010 UFC, de cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae.
- 7. Composición según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, caracterizada porque comprende entre 1 mg y 10 g, preferiblemente entre 1 mg y 1 g, de cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae.
- 8. Composición según la reivindicación 5, caracterizada porque comprende entre 1 mg y 10 g, y preferiblemente entre 1 mg y 1 g, de cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae y derivado de cepa de levadura.
- 9. Uso de la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 para la preparación de un complemento alimenticio y/o un probiótico y/o un alicamento y/o un nutracéutico y/o ingredientes funcionales y/o un cosmético destinado al hombre y/o a animales.
- 10. Uso de la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 para la preparación de composiciones alimenticias destinadas a mejorar el confort gastrointestinal y/o a mejorar la flora intestinal.
- 11. Uso de la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento y/o a la prevención de trastornos intestinales, de afecciones funcionales intestinales o de enfermedades gastrointestinales.
- 12. Uso de la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento y/o a la prevención de patologías o afecciones del intestino señaladas por un estado de hiperalgesia.
- 13. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que la levadura está en forma seca o fresca, preferiblemente en forma seca instantánea o seca activa.
- 14. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 de la levadura a una dosis diaria comprendida entre 107 y 6.1010 UFC, y preferiblemente entre 108 y 2.1010 UFC.
- 15. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 de la levadura y/o del derivado de levadura a una dosis diaria comprendida entre 1 mg y 10 g, y preferiblemente entre 1 mg y 1 g.
- 16. Kit que comprende la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae según la reivindicación 1, o la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae según la reivindicación 2, o una de sus mezclas en un forma adaptada para administración oral.
- 17. Kit según la reivindicación 16 que comprende además al menos un derivado de la cepa de levadura según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, elegido entre extractos de levadura, derivados de pared, glucanos parietales, manoproteínas parietales, fracciones lipídicas de levaduras y fracciones de ácidos nucleicos de levadura (ARN, ADN).
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