CN101910411A - 使用mfg-e8预防和治疗缺血/再灌注后的炎症和器官损伤 - Google Patents

Abstract

提供了用于预防和治疗缺血/再灌注后的炎症和器官损伤的方法，和用于治疗肺损伤的方法，其包括对受试者施用乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)。还提供了包含MFG-E8的药物组合物，其以用于预防和治疗缺血/再灌注后的炎症和器官损伤以及用于治疗肺损伤的剂型存在，以及制备用于预防和治疗缺血/再灌注后的炎症和器官损伤以及用于治疗肺损伤的药物组合物的方法，其包括将MFG-E8配制于药物组合物中。

Description

使用MFG-E8预防和治疗缺血/再灌注后的炎症和器官损伤

交叉参考相关申请

本申请要求2007年11月15日提交的美国临时专利申请61/003,478的权益，其内容通过引用合并入本申请。

政府支持的声明

本文中公开的发明在美国政府支持(来自国立卫生研究院(National Institutes of Health)的基金GM057468)下进行。因此，美国政府在本发明中具有某些权利。

发明领域

本发明涉及使用乳脂肪球EGF-因子8(milk fat globuleEGF-factor 8，MFG-E8)预防和治疗缺血/再灌注后，特别地肠道(gut)或肠缺血/再灌注后的炎症和器官损伤以及治疗肺损伤例如急性肺损伤。

发明背景

在整个本申请中，在括号中提及各种出版物。这些参考文献的完全引用可见于权利要求之前的本说明书的结尾。这些出版物的公开内容以它们的全文通过引用合并入本申请以更全面地描述本申请所属的领域。

再灌注损伤是指当在一段时间的缺血后血液供给返回组织时引起的对组织的损伤。肠缺血可在多种临床状况中发生，包括小肠移植、肠系膜上动脉闭塞、与低血流状态(low flow state)相关的心功能不全以及出血性休克和坏死性小肠结肠炎。

肠系膜缺血仍然是至关重要的问题，其导致高达60-80％的死亡率(1)。多器官功能衰竭，包括急性肺损伤(ALI)是肠缺血/再灌注(I/R)损伤的常见并发症并且促成其高死亡人数(2)。ALI由因促炎细胞因子和细菌源性内毒素从再灌注的缺血组织释放而导致的全身性炎性应答引起(3-6)。到目前为止，只发现有限数量的在I/R和急性肺损伤中提供一些益处的药物治疗选择，其中大多数靶向炎性介体(inflammatory mediator)和氧化应激途径(7)。I/R损伤的至关重要的方面是肠和支气管上皮细胞以及II型肺泡巨噬细胞的凋亡细胞死亡的增加的发生(2，8-11)。细胞凋亡与肺上皮细胞中的Fas和Fas-配体的显著上调以及胱天蛋白酶-3(caspase-3)的激活相关(12，13)。促炎细胞因子样IL-1β或TNF-α似乎在牵涉Bid、Bax上调和Bcl-2下调的细胞凋亡诱导中起着重要作用(9，14，15)。

虽然平衡的细胞凋亡和吞噬作用维持着正常功能，但缺血后凋亡细胞的清除缺陷可能导致增加的炎症和受损的组织修复(16，17)。凋亡细胞暴露可被可溶性分子和受体识别的磷脂酰丝氨酸(PS)，从而使得它们能够被吞噬(18)。此类分子之一是乳脂肪球EGF-因子8(MFG-E8)，其对于凋亡细胞的清除是至关重要的(19)。例如Hanayama等人发现脾中凋亡B细胞的有效清除预防了不适当的促炎免疫应答和自身抗体的产生(20)。在使用盲肠结扎和穿孔的大鼠脓毒症模型中，MFG-E8在脾和肝中下调。这与此类动物中受损的凋亡细胞清除和增加的死亡率相关(21)。与脓毒症相似，肠道I/R损伤伴随着全身性炎性应答。

乳脂肪球EGF-因子8(MFG-E8)是用于清除凋亡细胞的有效调理素(opsonin)，其由免疫活性器官包括脾和肺的单核细胞产生。肠道的缺血-再灌注(I/R)损伤诱导细胞凋亡、严重的炎症和远隔器官损害包括急性肺损伤(ALI)。增强凋亡细胞清除在这样的状况下是否有益仍然还不清楚。存在对I/R损伤的改善的治疗和预防的明确需要。

发明概述

本发明涉及预防和/或治疗受试者中缺血/再灌注后的炎症和/或器官损伤的方法，其包括以有效地预防和/或治疗炎症和/或器官损伤的量对受试者施用乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)。

本发明还涉及以用于预防和/或治疗缺血/再灌注后的炎症和/或器官损伤的剂型存在的包含乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)的药物组合物。

本发明还提供了制备用于预防和/或治疗缺血/再灌注后的炎症和/或器官损伤的药物组合物的方法，所述方法包括以有效地预防和/或治疗缺血/再灌注后的炎症和/或器官损伤的量将乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)配制于药物组合物中。

本发明还提供治疗受试者中的肺损伤例如急性肺损伤的方法，其包括以有效地治疗受试者中的肺损伤的量对受试者施用乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)。

本发明提供了以用于治疗肺损伤的剂型存在的包含乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)的药物组合物。

本发明还提供了用于制备用于治疗肺损伤的药物组合物的方法，所述方法包括以有效地治疗肺损伤的量将乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)配制于药物组合物中。

附图概述

图1A-1B.肠I/R后脾MFG-E8的抑制。使肠系膜上动脉(SMA)闭塞90分钟，然后进行4小时的再灌注。(A)通过qPCR测量脾中MFG-E8mRNA的水平，(B)通过Western印迹评估MFG-E8蛋白的水平。数据表示为平均值±SEM，*P＜.05对模拟(Sham)，利用学生氏t检验，n＝6。

图2A-2F.肠I/R后重组鼠MFG-E8(rmMFG-E8)减弱器官损伤。使SMA闭塞90分钟，然后进行4小时的再灌注。(A)肠I/R后小肠的H&E染色显示广泛的粘膜损伤(中图)，而使用rmMFG-E8的治疗显示有益的局部作用(右图)。左图：模拟对照。在再灌注后4小时测量(B)乳酸盐、(C)LDH、(D)ALT、(E)AST和(F)肌酐。数据表示为平均值±SEM，*P＜.05对模拟，#P＜.05对媒介物，利用单因素方差分析(One-WayANOVA)和Student Newman Keul′s检验，n＝6。

图3A-3C.肠I/R后rmMFG-E8抑制血浆细胞因子。使SMA闭塞90分钟，然后进行4小时的再灌注。通过ELISA评估血液细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)。数据表示为平均值±SEM，*P＜.05对模拟，#P＜.05对媒介物，利用单因素方差分析和Student Newman Keul′s检验，n＝6。

图4A-4C.rmMFG-E8减弱急性肺损伤(ALI)。使SMA闭塞90分钟，然后进行4小时的再灌注。固定肺并且用H&E进行染色。(A)100x和400x(插图)放大率的代表性显微照片。(B)如方法部分中所述，对组织损伤进行评分。(C)通过MPO测定评估嗜中性粒细胞的活性。数据表示为平均值±SEM，*P＜.05对模拟，#P＜.05对媒介物，利用单因素方差分析和Student Newman Keul′s检验，n＝6。

图5A-5C.肠I/R后的减少的肺MFG-E8以及rmMFG-E8治疗恢复凋亡细胞清除。(A)通过qPCR测量MFG-E8mRNA的水平，(B)通过Western印迹评估MFG-E8蛋白的水平。数据表示为平均值±SEM，*P＜0.05对模拟，利用学生氏t检验，n＝6。(C)肺用TUNEL进行染色，然后用碘化丙啶进行复染。

图6A-6B.MFG-E8缺乏使得在肠道I/R后小鼠肺中的炎性应答恶化。在再灌注后4小时，收集肺组织并且就(A)IL-1β和(B)IL-6对其进行评估。数据表示为平均值±SEM，*P＜.05对模拟，#P＜.05对WT，利用两因素方差分析和Student Newman Keul′s检验，n＝6。WT：野生型小鼠；KO：敲除小鼠。

图7A-7C.MFG-E8缺乏使ALI恶化。使SMA闭塞90分钟，然后进行4小时的再灌注。固定肺，并且用H&E进行染色。(A)100x和400x(插图)放大率的显微照片。(B)如方法部分中所述对组织进行评分。(C)通过MPO测定评估嗜中性粒细胞的活性。数据表示为平均值±SEM，*P＜.05对模拟，#P＜.05对WT，利用两因素方差分析和StudentNewman Keul′s检验，n＝6。

图8.肠道I/R损伤后rmMFG-E8治疗的小鼠中的存活益处。使SMA闭塞90分钟，然后进行4小时的再灌注。各组小鼠在再灌注开始时i.p.接受一个剂量的rmMFG-E8或生理盐水(媒介物)，观察24小时。*P＜.05对媒介物，利用Kaplan Meyer时序检验(Log-rank test)，n＝15。

发明详述

本发明涉及预防和/或治疗受试者中缺血/再灌注后的炎症和/或器官损伤的方法，其包括以有效地预防和/或治疗炎症和/或器官损伤的量对受试者施用乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)。缺血/再灌注包括，但不限于胃肠道、肝、肺、肾、心脏、脑、脊髓和/或受挤压的四肢的缺血/再灌注。特别地，本发明涉及预防和/或治疗受试者中肠缺血/再灌注后的炎症和/或器官损伤的方法，其包括以有效地预防和/或治疗炎症和/或器官损伤的量对受试者施用乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)。

优选，该方法预防或降低了肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-1β、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、乳酸盐或乳酸脱氢酶中的一个或多个的血清升高。

优选，其中预防或治疗器官损伤的器官包括但不限于胃肠道、肝、肺、肾、心脏、脑、脊髓和受挤压的四肢。肺损伤可以是急性肺损伤(ALI)。

优选，受试者的存活得到改善。

优选，MFG-E8具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2(其分别为人MFG-E8和小鼠MFG-E8的序列)至少80％，更优选至少90％，更优选95％，更优选99％同一的氨基酸序列。最优选，MFG-E8序列与SEQ IDNO：1完全同源。此类方法可用于任何哺乳动物，包括人。

此类实施方案中的MFG-E8可以为纯化的形式，例如从天然来源纯化的蛋白质或从重组细胞表达的转基因蛋白质。备选地，MFG-E8可以只是部分纯化的(例如，还包含细胞组分，例如为来源于骨髓树突细胞或来自其他哺乳动物细胞(包括用转基因MFG-E8转化的细胞)的富含MFG-E8的外来体(exosome)形式)。在MFG-E8来自富含MFG-E8的外来体的情况下，外来体优选来自与治疗的哺乳动物相同的物种；更优选，外来体来自相同的个体。MFG-E8可具有来自任何哺乳动物物种的野生型序列，或可包含突变，只要突变不消除蛋白质的预防和/或治疗炎症和/或器官损伤的活性。可产生这样的突变体而无需过度的实验。此类突变体的活性还可通过已知的方法和本文中描述的方法来容易地测定。

MFG-E8还可包含拟肽(peptidomimetic)。如本文中所使用的，氨基酸模拟物或拟肽是能够模拟蛋白质中的天然亲本氨基酸的化合物，因为用拟肽置换氨基酸不显著影响蛋白质的目的活性(在本发明中，外源MFG-E8的治疗活性)。包含拟肽的蛋白质通常是蛋白酶的不良底物并且与天然蛋白质相比较，可能在体内具有更长期的活性。此外，它们的抗原性较低并且显示总体更高的生物利用度。本领域技术人员理解，包含拟肽的水溶性蛋白质的设计和合成不需要过度的实验(例如，39-41)。

本发明还提供了以用于预防和/或治疗缺血/再灌注后的炎症和/或器官损伤的剂型存在的包含乳脂肪球表皮生长因子-因子VI I I(MFG-E8)的药物组合物。缺血/再灌注包括但不限于胃肠道、肝、肺、肾、心脏、脑、脊髓和/或受挤压的四肢的缺血/再灌注。肠缺血/再灌注是缺血/再灌注的优选的形式。

本发明还提供了制备用于预防和/或治疗缺血/再灌注后的炎症和/或器官损伤的药物组合物方法，该方法包括以有效地预防和/或治疗缺血/再灌注后的炎症和/或器官损伤的量将乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)配制于药物组合物中。缺血/再灌注包括但不限于胃肠道、肝、肺、肾、心脏、脑、脊髓和/或受挤压的四肢的缺血/再灌注。肠缺血/再灌注是优选的缺血/再灌注。

优选将上述MFG-E8制剂配制于药物组合物中。根据特定应用的需要，可配制用于给哺乳动物包括人施用的此类组合物而无需过度实验。此外，可使用标准剂量应答方案确定组合物的适当剂量而无需过度实验。

因此，可利用本领域内熟知的方法，例如使用惰性稀释剂或使用可食用载体制备经设计用于口服、经舌、舌下、口腔和口内施用的组合物而无需过度实验。可将组合物封装在明胶胶囊中或压制成片剂。为了进行口服治疗施用，可将本发明的药物组合物与赋形剂混合并且以片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸囊剂(wafer)、口香糖等形式使用。

片剂、丸剂、胶囊、锭剂等还可包含粘合剂、受体(recipient)、崩解剂、润滑剂、甜味剂和芳香剂。粘合剂的一些实例包括微晶纤维素、黄蓍胶或明胶。赋形剂的实例包括淀粉或乳糖。崩解剂的一些实例包括海藻酸、玉米淀粉等。润滑剂的实例包括硬脂酸镁或硬脂酸钾。助流剂的实例是二氧化硅胶体。甜味剂的一些实例包括蔗糖、糖精等。芳香剂的实例包括薄荷(peppermint)、水杨酸甲酯、桔子香精(orangeflavoring)等。用于制备此类不同组合物的材料应当是药学上纯的并且在所用的量上是无毒的。

可以例如通过静脉内、肌内、鞘内或皮下注射容易地胃肠外施用本发明的组合物。可以通过将本发明的组合物掺入溶液或悬浮液来进行胃肠外施用。此类溶液或悬浮液还可包含无菌稀释剂，例如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂。胃肠外制剂还可包括抗菌剂例如苯甲醇或尼泊金甲酯，抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，和螯合剂例如EDTA。还可加入缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调整张力的试剂例如氯化钠或葡萄糖。可将胃肠外制剂封装入安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶(由玻璃或塑料制造)中。

直肠施用包括将药物组合物施用入直肠或大肠。这可使用栓剂或灌肠剂来进行。可利用本领域内已知的方法来容易地制备栓剂。例如，可通过将甘油加热至大约120℃，将组合物溶解在甘油中，混合加热的甘油(之后可加入纯水)，然后将热混合物倒入栓剂模来制备栓剂。

经皮施用包括组合物通过皮肤的经皮肤吸收。经皮制剂包括贴剂(例如熟知的尼古丁贴剂)、软膏、乳膏、凝胶、药膏等。

本发明包括经鼻给哺乳动物施用治疗有效量的组合物。如本文中所使用的，经鼻施用或鼻腔施用包括给患者的鼻道或鼻腔的粘膜施用组合物。如本文中所使用的，用于组合物的鼻腔施用的药物组合物包含治疗有效量的待施用的通过熟知的方法制备的组合物，例如作为鼻腔喷雾剂、滴鼻剂、悬浮液、凝胶、软膏、乳膏或粉剂。还可使用鼻塞或鼻腔海绵(nasal sponge)进行组合物的施用。

本发明还提供了乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)用于预防和/或治疗缺血/再灌注后的炎症和/或器官损伤的用途。本发明还提供了乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)用于制备用于预防和/或治疗缺血/再灌注后的炎症和/或器官损伤的药物组合物的用途。

本发明还提供了治疗受试者中的肺损伤例如急性肺损伤的方法，其包括以有效地治疗受试者中的肺损伤的量对受试者施用乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)。本发明提供了以用于治疗肺损伤的剂型存在的包含乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)的药物组合物。本发明还提供了制备用于治疗肺损伤的药物组合物的方法，该方法包括以有效地治疗肺损伤的量将乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)配制于药物组合物中。

本发明还提供了乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)用于治疗肺损伤例如急性肺损伤的用途。本发明还提供了乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)用于制备用于治疗肺损伤的药物组合物的用途。

根据下面的实验详述可更好地理解本发明。然而，本领域技术人员将容易地理解，所述的特定方法和结果只是举例说明本发明，如在之后的权利要求中更详尽地描述的。

实验详述

材料和方法

实验模型：在使用异氟烷进行全身麻醉的情况下通过夹紧肠系膜上动脉(SMA)90分钟来在C57BL/6J野生型(WT)小鼠和MFG-E8敲除(KO)小鼠中诱导缺血。用0.5ml盐水使小鼠苏醒，然后用重组鼠MFG-E8(rmMFG-E8)(0.4mg/kg于0.5ml生理盐水中，腹膜内注射)或生理盐水(媒介物)处理小鼠。除了SMA夹紧外，对照动物经历相同的操作过程(模拟I/R)(n＝6)。在再灌注后4小时，麻醉动物，并收集EDTA血液(用于血浆)和组织样品，立即冷冻于液氮中，在-80℃下贮藏直至测量。进行另外的实验以观察24小时内的存活(n＝15)。所有实验按照美国国立卫生研究院(Bethesda，MD)的实验动物使用指南来进行并且之前已获得Feinstein Institute for Medical Research(Manhasset，NY)的Institutional Animal Care and Use Committee的批准。

MFG-E8 Western印迹和基因表达：在Bis-Tris凝胶上分级分离25μg来自脾和肺样品的蛋白质，将其转移至0.22-μm硝酸纤维素膜。用含有0.1％v/v Tween 20的Tris缓冲盐溶液中的5％BSA封闭印迹，然后用仓鼠抗小鼠MFG-E8mAb(克隆2422，MBL，Nagoya，Japan)进行温育。在用5％BSA-TBST中的HRP-标记的山羊抗仓鼠IgG(SantaCruz，CA)温育和用TBST清洗后，通过使用化学发光过氧化物酶底物(ECLplus，Amersham，Little Chalfont，Buckinghamshire，UK)和将其暴露于射线胶片上来检测条带。使用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)从脾和肺组织样品提取RNA。使用鼠白血病病毒逆转录酶(Applied Biosystems，Foster City，CA)将5μg RNA逆转录成cDNA，然后使用SYBR green PCR Master Mix(Applied Biosystems)通过qPCR进行扩增。使用下列引物组：小鼠MFG-E8(正向：5′-GGG CCT GAAGAA TAA CAC GA-3′(SEQ ID NO：3)；反向：5′-AGG GCA ACT TGG ACAACA AC-3′(SEQ ID NO：4))；小鼠β-肌动蛋白(内源对照；正向：5′-TGTTAC CAA CTG GGA CGA CA-3’(SEQ ID NO：5)；反向：5′-GGG GTG TTGAAG GTC TCA AA-3′(SEQ ID NO：6))。

细胞因子和器官损伤参数：使用特异性小鼠ELISA试剂盒(BDPharmingen，Franklin Lakes，NJ)定量EDTA血浆、小肠和肺组织中的TNF-α、IL-1β和IL-6。使用商业测定试剂盒(Pointe Scientific，Canton，MI)测定AST、ALT、LDH、乳酸盐和肌酐的血浆水平。

组织病理学：将小肠(非坏死区域)和肺的样品固定在10％***中，然后包埋在石蜡中。将组织块切成5μm厚的切片，转移至载玻片上，用苏木精/曙红染色。使用光学显微镜进行形态学检查，由富有经验的不知情的研究者基于渗出物(exudate)、充血/淤血(congestion)、嗜中性粒细胞浸润、肺泡内出血/碎片和细胞增生的存在将肺损伤分析为不存在损伤、轻微损伤、中度损伤或严重损伤(评分0-3)(22)。计算不同动物的评分之和的平均值。根据Stallion等人，通过评估绒毛对隐窝的比(正常：5比1)、淋巴细胞浸润、上皮细胞变性/坏死、糜烂(erosion)、腺扩张和透壁变化(transmuralchange)给肠损伤评分(评分0-4)(23)。

细胞凋亡测定：将样品组织脱蜡，用蛋白酶K温育，用绿色荧光标记的TUNEL试剂盒(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)染色，用碘化丙啶复染，在荧光显微镜下进行检查。凋亡细胞在红色背景染色上呈现绿色荧光。

组织髓过氧化物酶(MPO)测定：在含有0.5％十六烷基三甲基溴化铵的KPO₄缓冲液中匀浆组织(在60℃下进行2小时)。在离心后，将上清液稀释于反应溶液中，在460nm处测量ΔOD以计算MPO活性(24)。

统计：数据表示为平均值±SEM，并且使用Student-Newman-Keuls′检验通过方差分析进行比较。如果只存在两个组，则使用学生t检验。使用Kaplan-Meier时序检验分析存活研究。如果P＜0.05，则差异被认为是显著的。

结果

肠道I/R后脾中的MFG-E8的抑制：为了研究MFG-E8水平在肠I/R损伤后是否发生改变，在90分钟缺血后的再灌注后4小时测量WT小鼠中的MFG-E8mRNA和蛋白质的水平。结果显示，在肠道I/R后，脾的mRNA水平平均显著下降63％(图1A)，蛋白质水平下降68％(图1B)。

rmMFG-E8的施用在肠I/R后减弱多器官损伤：肠道I/R引起广泛的肉眼可见的坏死，在紧靠肉眼可见的缺血的肠的肠区域中存在严重的肠粘膜损伤(平均评分2.25±0.14)(图2A)。类似地，与经模拟手术的动物相比较，远隔器官损害的多个血液标志物显著升高，包括乳酸盐(80％的增加)、乳酸脱氢酶(LDH)(17.5倍的增加)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)(4.8倍的增加)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)(18.3倍的增加)和肌酐(2倍的增加)(图2B-F)，这表明在该模型中诱导了***性程度的损伤。在再灌注开始时使用一个剂量的rmMFG-E8(0.4μg/20g BW，i.p.)的治疗极大地减弱了I/R诱导的多器官损伤。在组织病理学上，甚至大部分的肠在治疗后得到保护而免受二次粘膜损害(损伤评分：1.25±0.14)(图2A)。使用rmMFG-E8的治疗也完全阻止了乳酸盐、AST和ALT的升高，同时其对LDH和肌酐水平分别抑制了58％和21％。因此rmMFG-E8对肠粘膜、一般性灌注、肝损伤具有重大的保护作用，并且对普通组织损害和肾功能具有较低但仍然显著的保护作用(图2B-F)。

rmMFG-E8的施用抑制了肠I/R后的全身性炎性应答：促炎细胞因子是肠I/R后造成远隔器官损伤的主要原因。因此，调查3种细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)是否受到使用rmMFG-E8的治疗的影响。虽然细胞因子的血液水平在肠道I/R后显著增加(TNF-α增加5.6倍，IL-1β增加3.9倍以及IL-6增加96倍)，但rmMFG-E8显著减少了促炎反应(分别减少72％、42％和48％，图3A-C)。为了研究MFG-E8是否影响组织中细胞因子的产生，使用ELISA分析小肠和肺中细胞因子的蛋白质水平。可在组织细胞因子水平上发现rmMFG-E8的相似抑制作用，这表明MFG-E8通过减少细胞因子产生和从损伤源以及从靶器官释放而具有抗炎作用(表1)。

表1.肠I/R后rmMFG-E8对局部细胞因子的抑制

C57BL6/J小鼠经历SMA I/R 90分钟，然后进行4小时的再灌注。6只小鼠在再灌注开始时还接受rmMFG-E8(0.4μg/20g BW，腹膜内注射)。通过ELISA测定组织细胞因子水平，其表示为平均值±SEM，*P＜0.05对模拟，#P＜0.05对媒介物，利用单因素方差分析和StudentNewman Keul′s检验，n＝6。

rmMFG-E8的施用在肠I/R后减弱了ALI：肺是受肠I/R损伤影响最严重的器官之一(25)。肺的组织病理学分析显示中度至严重损伤，渗出物、充血、细胞浸润和细胞内出血平均达到9.7±0.8的组织病理学评分(图4A-B)。细胞形态学和细胞肺浸润的时间选择(timing)表明嗜中性性质。因此，评估肺中的髓过氧化物酶的活性，该酶的活性在肠道I/R后同样升高3.3倍(图4C)。使用rmMFG-E8的治疗在组织病理学以及生物化学上显著减少了急性肺损伤(图4A-C)。组织病理学评分减少了38％并且MPO活性被抑制了47％(图4B-C)。

肠I/R后肺MFG-E8的抑制和细胞凋亡：虽然Northern印迹显示脾为产生MFG-E8的主要免疫活性器官(20)，但肺仍表达大量的MFG-E8mRNA(大约50％的脾水平；未公开的观察结果)。J inushi等人显示在正常条件下肺泡巨噬细胞包含肺中大部分MFG-E8蛋白(26)。定量PCR和Western印迹表明，肠道I/R还在mRNA水平上抑制MFG-E8水平48％且在蛋白质水平上抑制49％(图5A-B)。同时，通过TUNEL染色在肺组织中发现增加的凋亡细胞的数量(图5C)，这与胱天蛋白酶3的活化相关(数据未显示)。然而，使用rmMFG-E8的治疗显著抑制了肠道I/R损伤后肺中可检测的凋亡细胞的数量(图5C)。

MFG-E8缺乏增加了肺炎症和使ALI恶化：为了进一步阐明MFG-E8在肠道I/R介导的ALI中的作用，在MFG-E8缺陷型小鼠中研究炎性应答和肺组织损伤。与WT小鼠相比较，MFG-E8KO小鼠在肠道I/R后于肺中产生几乎增加2倍的IL-1β和IL-6蛋白水平(图6A-B)。肺中促炎细胞因子产量的该显著增加与MFG-E8KO小鼠中进一步恶化(与它们的WT对照相比)的ALI相关，所述恶化包括增加的充血、渗出物、***浸润和硬化(consolidation)(图7A-B)。在MFG-E8KO小鼠中，肺嗜中性粒细胞的活性在肠道I/R后也显著增加(图7C)。总之，这清楚地表明MFG-E8的不存在在该模型中引起更严重的炎症和对肺的损害。

使用rmMFG-E8的治疗改善了肠I/R损伤后的存活：上述结果表明MFG-E8在I/R介导的损伤中是有益的。因此，在15只在再灌注开始时接受rmMFG-E8的小鼠中进行存活研究，将其与用生理盐水处理的对照小鼠相比较。所有对照小鼠在24小时内死亡，中位存活时间为8小时(95％CI：5.5-10.5小时，图8)。然而用rmMFG-E8治疗的15只动物中有7只在肠道I/R后24小时仍然存活(中位存活时间：20小时，图8)。存活时间的该显著提高显示MFG-E8对于由受肠I/R损伤引起的多器官功能衰竭和死亡具有保护作用。

讨论

本研究证明肠I/R负面影响肺形态学，增加MPO，和局部细胞因子的产量(与ALI一致)以及证明使用rmMFG-E8的治疗减弱器官损伤、炎症和改善存活。治疗的动物在它们的肺中也显示较少的细胞凋亡，从而表明增强的MFG-E8介导的凋亡细胞的清除。MFG-E8KO小鼠显示显著恶化的ALI和炎症，从而为MFG-E8在I/R介导的远隔器官损伤中的至关重要的作用提供了进一步的证据。

急性肺损伤是由急性肺水肿和炎症引起的呼吸衰竭的综合征(2)。据美国国立卫生研究院估计，在美国ALI和ARDS的联合发病率为每100,000人口75例，来自Scandinavia的最新数据显示单独的ALI占据大约每100,000人口18例(25，27)。虽然在过去20至30年中，ALI和ARDS的死亡率下降，但它们仍然是不可接受的高死亡率(25)。多种因素可在患者中导致ALI，包括脓毒症、带休克的严重创伤和多次输血(25)。在这些病理状况下，ALI由压倒性全身性炎性应答驱动，并且通常与其他器官的功能衰竭一起发生(3)。因SMA的短暂闭塞而引起的肠缺血，例如，引起大量局部组织损伤，并且缺血的肠的再灌注导致炎性应答的强烈激活，从而导致具有多器官功能衰竭(包括ALI)的非常严重的临床现象(28)。在病理生理学上，ALI与肺泡渗出物和出血、免疫细胞的流入和活化(释放大量的细胞因子和酶)相关，这可进一步并发感染和机械通气诱导的损伤(ventilation-induced injury)(3，25)。肺上皮和内皮的受损的屏障功能在ALI和ARDS的发展中起着主要作用，并且该衰竭的一个至关重要的方面是细胞通过细胞凋亡丧失(2)。特别地I I型肺细胞经历由Fas-配体-Fas途径的活化和胱天蛋白酶-3的活化介导的细胞凋亡(12，13)，本实验中凋亡细胞的性质也极可能是上皮的。特别地已报导，细胞因子如IL-1β或TNF-α在肺中在细胞凋亡诱导中起着主要作用(9，14，15)。肠系膜I/R损伤主要由从再灌注的肠释放的促炎介体介导，这可能促成远隔器官中细胞凋亡的诱导(29)。然而，活性氧在I/R后肺细胞死亡的诱导中的作用不应当被低佑(30)。II型肺泡肺细胞的细胞凋亡直接引起肺水肿且减少表面活性物质的产生。然而，细胞凋亡还在组织损伤的起始期之外起作用，因为其对于疾病晚期中的炎症消退与ALI的进展之间的不平衡是关键的(31)。通过调节细胞凋亡或凋亡细胞的吞噬作用进行的受控的组织修复可阻止肺纤维化、疾病的进展和其总体严重性(2，12，25，31)。

MFG-E8是分泌分子并且主要在脾中产生。然而，其还可以以显著的量发现于***和肺中(20，26)。其主要由巨噬细胞和树突细胞产生并且到目前为止主要与凋亡细胞的调理作用相关。Hanayama等人发现MFG-E8在脾中在凋亡B细胞的清除中起着主要作用，其防止了自身免疫疾病的发展(16，19，20)。在小鼠中，MFG-E8是具有两个EGF样结构域(E1和E2)的64kDa糖蛋白，所述结构域含有可结合某些在巨噬细胞和其他吞噬细胞上高度表达的整联蛋白(体外连接蛋白受体(vitronectin receptor)，αvβ3或αvβ5)的RGD-基序。该结构域通过富含P/T的区域与两个凝血因子V/VIII样结构域(C1和C2)(具有对磷脂酰丝氨酸(PS)的强亲和力)相分隔。这些性质使其在将凋亡细胞(所述细胞在它们的表面上表达大量PS)结合至吞噬细胞中成为重要因子(19)。虽然表达PS的凋亡细胞还可结合至巨噬细胞上的其他受体，包括假定的PS受体和CD36，但通过MFG-E8与αvβ3或αvβ5-整联蛋白的结合是诱导它们的吞噬所必需的(19)。在非常高的浓度上，也已显示MFG-E8调节固有凝血级联(由于其竞争PS结合部位)和增加凝血酶原50％(32)。其还参与VEGF-依赖性新生血管形成(33)和参与肠细胞的迁移和肠修复(34)。已提出其在动脉粥样硬化(35)和阿尔茨海默病(36)中是有益的，虽然机制仍然不清楚。在慢性和急性炎性疾病中，MFG-E8明确地在凋亡细胞的吞噬作用与炎症之间的层次上起着重要作用。凋亡细胞清除的MFG-E8-依赖性增加可阻止因脓毒症引起的死亡(21)。

脓毒症和肠系膜I/R损伤共有事实，即两者都导致全身性炎性应答(23)。也已显示肠道I/R导致增加的微生物移位(microbialtranslocation)和细菌毒素至血流内的释放(4，5)。事实上已显示，toll样受体的活化在体外和体内抑制MFG-E8水平((26)和未公开的数据)。到目前为止，仅已知粒细胞/单核细胞集落刺激因子调节MFG-E8的表达(26)。其他细胞因子是否具有改变MFG-E8的表达的潜能以及以什么样的动力学改变所述表达目前还不清楚。本研究已显示在缺血90分钟的肠道的再灌注后4小时脾和肺中MFG-E8被显著抑制。如在肠道I/R小鼠的肺中发现的，抑制MFG-E850％似乎足以削弱凋亡细胞的吞噬作用，如之前在脓毒症模型中所报导的(21)。虽然肺中凋亡细胞的数量不是很高，但受影响的细胞很可能是II型肺细胞，这将促成ALI的进展(9)。使用rmMFG-E8的治疗减少了凋亡细胞的数量且抑制了局部炎症。减少的细胞凋亡不由直接的抗凋亡作用介导而是通过刺激凋亡细胞的清除来介导(21)。本研究还发现，在用rmMFG-E8治疗后，肠道I/R后的肺损伤减弱，如通过改善的组织损伤和减少的嗜中性粒细胞活性所证明的。虽然促炎细胞因子在用rmMFG-E8治疗后在小肠、肺和血液中通常被抑制，但在缺血的肠的再灌注后4小时，在MFG-E8KO小鼠与它们的WT对照之间的小肠和血液的细胞因子水平上不存在差异。然而，在MFG-E8KO小鼠中，肺显示了IL-6和IL-1β的2倍增加，这表明在该模型中MFG-E8的缺乏主要影响肺。这是相当有趣的，因为这暗示肺不仅是全身性炎性应答的受害者而且还强烈地促成炎症。

MFG-E8的该抗炎效应在该ALI模型中是如何起作用的仍然不清楚。凋亡细胞的清除明确地抑制了巨噬细胞的炎症应答性(17，31)。由于肺泡巨噬细胞可能是I/R后丧失MFG-E8的细胞，因此通过凋亡细胞吞噬作用的抑制作用的不足，可能引发这些肺泡巨噬细胞产生和释放更多的炎性细胞因子(17)。这可解释肺中增加的炎症和损伤以及炎性介体至循环内的释放。该机制可牵涉肺泡巨噬细胞中的细胞内抗炎途径、抗炎细胞因子(例如IL-10和TGF-β)的释放(31，37)以及免疫抑制细胞例如调节性T细胞的产生(26，35)。只除去具有释放毒性和促炎内容物的潜能的濒死细胞可以是MFG-E8籍以赋予其有益作用的另一个可能机制(38)。

本研究已明确地显示，MFG-E8在体内具有抗炎作用并且在肠道I/R后保护免受多器官功能障碍，包括肺损伤。这与显著提高的存活率相关。因此，通过促进组织修复和正面影响受影响的患者的发病率和死亡率，MFG-E8可用作I/R后或其他病因学的ALI的新型治疗选择。

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附录-SEO ID Nos

SEQ ID NO：1-人MFG-E8-来自GenBank NP005919

  1    mprprllaal cgallcapsl lvaldicskn pchngglcee isqevrgdvf psytctclkg

 61    yagnhcetkc veplgmengn iansqiaass vrvtflglqh wvpelarlnr agmvnawtps

121    snddnpwiqv nllrrmwvtg vvtqgasrla sheylkafkv ayslnghefd fihdvnkkhk

181    efvgnwnkna vhvnlfetpv eaqyvrlypt schtactlrf ellgcelngc anplglknns

241    ipdkqitass syktwglhlf swnpsyarld kqgnfnawva gsygndqwlq vdlgsskevt

301    giitqgarnf gsvqfvasyk vaysndsanw teyqdprtgs skifpgnwdn hshkknlfet

361    pilaryvril pvawhnrial rlellgc

SEQ ID NO：2-小鼠MFG-E8-来自GenBank NP032620

  1    mqvsrvlaal cgmllcasgl faasgdfcds slclnggtcl tgqdndiycl cpegftglvc

 61    netergpcsp npcyndakcl vtldtqrgdi fteyicqcpv gysgihcete tnyynldgey

121    mfttavpnta vptpaptpdl snnlasrcst qlgmeggaia dsqisasyvy mgfmglqrwg

181    pelarlyrtg ivnawhasny dskpwiqvnl lrkmrvsgvm tqgasragra eylktfkvay

241    sldgrkfefi qdesggdkef lgnldnnslk vnmfnptlea qyirlypvsc hrgctlrfel

301    lgcelhgcle plglknntip dsqmsasssy ktwnlrafgw yphlgrldnq gkinawtaqs

361    nsakewlqvd lgtqrqvtgi itqgardfgh iqyvesykva hsddgvqwtv yeeqgsskvf

421    qgnldnnshk knifekpfma ryvrvlpvsw hnritlrlel lgc

Claims (23)

1.预防和/或治疗受试者中缺血/再灌注后的炎症和/或器官损伤的方法，其包括以有效地预防和/或治疗炎症和/或器官损伤的量对所述受试者施用乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)。

2.权利要求1的方法，其中所述MFG-E8具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2至少90％同一的氨基酸序列。

3.权利要求1或2的方法，其中所述MFG-E8是重组MFG-E8。

4.权利要求1至3的任一项的方法，其中所述方法预防或减少肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、白细胞介素-1β、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、乳酸盐或乳酸脱氢酶中的一种或多种的血清升高。

5.权利要求1至4的任一项的方法，其中受试者的存活得到改善。

6.权利要求1至5的任一项的方法，其中炎症得到预防或治疗。

7.权利要求1至6的任一项的方法，其中器官损伤得到预防或治疗。

8.权利要求7的方法，其中所述器官是胃肠道、肝、肺、肾、心脏、脑、脊髓或受挤压的四肢中的一个或多个。

9.权利要求7的方法，其中所述器官损伤是急性肺损伤。

10.权利要求1至9的任一项的方法，其中所述缺血/再灌注是胃肠道、肝、肺、肾、心脏、脑、脊髓或受挤压的四肢的缺血/再灌注中的一个或多个。

11.权利要求1至9的任一项的方法，其中所述缺血/再灌注是肠缺血/再灌注。

12.包含乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)的药物组合物，其以用于预防和/或治疗缺血/再灌注后的炎症和/或器官损伤的剂型存在。

13.权利要求12的药物组合物，其中所述缺血/再灌注是胃肠道、肝、肺、肾、心脏、脑、脊髓或受挤压的四肢的缺血/再灌注中的一个或多个。

14.权利要求12的药物组合物，其中所述缺血/再灌注是肠缺血/再灌注。

15.用于制备药物组合物的方法，所述药物组合物用于预防和/或治疗缺血/再灌注后的炎症和/或器官损伤，所述方法包括以有效地预防和/或治疗缺血/再灌注后的炎症和/或器官损伤的量将乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)配制于药物组合物中。

16.权利要求15的方法，其中所述缺血/再灌注是胃肠道、肝、肺、肾、心脏、脑、脊髓或受挤压的四肢的缺血/再灌注中的一个或多个。

17.权利要求15的方法，其中所述缺血/再灌注是肠缺血/再灌注。

18.治疗受试者中的肺损伤的方法，其包括以有效地治疗受试者中的肺损伤的量对所述受试者施用乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)。

19.权利要求18的方法，其中所述MFG-E8具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2至少90％同一的氨基酸序列。

20.权利要求18或19的方法，其中所述MFG-E8是重组MFG-E8。

21.权利要求18至20的任一项的方法，其中所述肺损伤是急性肺损伤。

22.包含乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)的药物组合物，其以用于治疗肺损伤的剂型存在。

23.用于制备药物组合物的方法，所述药物组合物用于治疗肺损伤，所述方法包括以有效地治疗肺损伤的量将乳脂肪球表皮生长因子-因子VIII(MFG-E8)配制于药物组合物中。

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