CN106555002A - 乳脂肪球表皮生长因子8在心脏重构和心力衰竭的诊断及治疗中的应用 - Google Patents

乳脂肪球表皮生长因子8在心脏重构和心力衰竭的诊断及治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了乳脂肪球表皮生长因子8（MFG‑E8）在心脏重构和心力衰竭的诊断及治疗中的应用，属于基因的功能与应用领域。本发明发现：在心衰病人的患者血清中，MFG‑E8蛋白水平明显降低，并且与心脏重构和心力衰竭严重程度密切相关；在主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚疾病模型中，MFG‑E8基因敲除显著促进了心肌肥厚、纤维化以及心功能的恶化，MFG‑E8基因过表达显著抑制了心肌肥厚、纤维化，改善了心功能。基于MFG‑E8的功能，MFG‑E8可用于制备心力衰竭早期诊断或心脏重构诊断的试剂，可用于筛选或制备保护心脏功能、抗心肌肥厚、心肌纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心脏重构和心力衰竭的药物。

Description

乳脂肪球表皮生长因子8在心脏重构和心力衰竭的诊断及治 疗中的应用
技术领域
本发明属于基因的功能与应用领域，具体涉及乳脂肪球表皮生长因子8(milk fatglobule-epidermal growth factor-factor 8，MFG-E8)在心脏重构和心力衰竭的诊断及治疗中的应用。
背景技术
慢性心力衰竭是心室充盈和(或)射血功能受损，心脏排血量不能满足机体组织代谢需要的临床综合征，临床上主要表现为呼吸困难、疲乏和液体潴留，轻者活动能力下降，重者则完全丧失活动能力，具有较高发病率和死亡率，是大多数心血管疾病和部分其它***器官疾病的终末阶段[1]。
随着中国社会经济的发展，居民生活方式的改变，人口老龄化进程的加速以及高血压、糖尿病等各种危险因素的流行，心血管疾病和心力衰竭发病率持续增加。中国心血管病报告(2014)显示全国有心血管病患者2.9亿，其中高血压患者2.7亿，心力衰竭患者450万，每年直接医疗费用超过500亿人民币[2]。心力衰竭给家庭和社会带来巨大的经济负担，并成为严重威胁我国居民健康和社会发展的重大公共卫生问题。
慢性心力衰竭是一个进行性发展的过程，而其症状的出现也可能是病症累积多年后的结果。病人一旦发生心力衰竭，就步入了一个进行性恶化的过程，美国Framingham连续40年研究显示心力衰竭5年生存率在男性为25％、女性为38％；10年生存率男性为11％、女性为21％。罹患心力衰竭的男性患者平均生存期为1.66年，女性为3.17年，与恶性肿瘤相当。尽管近年来心血管疾病的介入治疗以及血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂及β受体阻滞剂的应用可以改善部分心力衰竭患者的预后，但心力衰竭的总生存率仍很低[3,4]。因此寻找心力衰竭的早期诊断指标以及积极有效的干预措施，从而遏制甚至逆转心力衰竭的进展迫在眉睫，有重大的科学意义和社会意义。
研究证实，心脏重构是心力衰竭发生发展的一个基本病理过程。当心脏在机械牵张、压力负荷以及多种神经体液因素等病理性刺激下，心肌细胞会发生包括基因表达、代谢、结构以及功能上的一系列的模式重建[5]。心脏重构主要包括心肌肥厚和心肌纤维化。在大体形态水平上，心脏重构多表现为局部或大部分甚至整个心室壁和/或心房壁增厚、质量增加或者变薄。在细胞水平上则包括心肌细胞代偿性的肥大，间质成分如成纤维细胞增殖，细胞外基质蛋白变性、降解，胶原蛋白网中断和破裂，心肌细胞与基质膜的连接强度降低，细胞外血管网减少，伴随心肌细胞凋亡，心肌结构排列紊乱等。在分子水平上，心肌细胞核内基因表型模式改变，胚胎型基因如β-MHC被激活，成熟型基因如α-MHC表达下降，细胞蛋白合成增加，收缩力降低，寿命缩短；同时，促进心肌纤维化的基因表达增加，如***生长因子(CTGF)、转化生长因子β(TGF-β)、Ⅰ型和Ⅲ型胶原等，使心室壁的僵硬度增加，心肌顺应性下降[6]。近年来，国内外诸多学者对心脏重构的发病基础和临床防治进行了大量研究，并发现多种细胞外配体和细胞膜受体以及细胞内信号转导通路和核内转录因子参与了这一系列改变，包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)、钙调神经磷酸酶(Calcineurin)/NFAT、Janus激酶/信号转导与转录激活子(JAK/STAT)、蛋白激酶C(PKC)、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)和转化生长因子β(TGF-β)/Smad等多种经典信号转导通路及信号通路效应分子都可能与心肌重构有关[7]。
MFG-E8即乳脂肪球表皮生长因子8，最早被发现于小鼠***上皮细胞，是一种分泌型糖蛋白，越来越多的研究发现其广泛表达于多种组织、细胞中[8]。人MFG-E8基因定位于15q25，由8个外显子组成，现已在巨噬细胞、***上皮细胞、表皮细胞、正常及粥样硬化的动脉、心脏、肝脏、肺脏、肠组织中检测到MFG-E8的表达，并证明其表达水平与多种疾病相关联[9]。初始MFG-E8的N-端有一信号肽序列引导其进入胞浆。MFG-E8通过其N-端包含的高度保守的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)模体识别吞噬细胞表面的整合素αVβ3/αVβ5，通过C-端的凝血因子V/Ⅷ样结构域结合至凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸，介导凋亡细胞的吞噬。由此可见，这两个结构域对MFG-E8清除凋亡细胞的功能至关重要[10,11]。此外，人和鼠内皮细胞的凋亡能够触发MFG-E8以caspase-3依赖性的形式释放并且通过STAT3的磷酸化使巨噬细胞重新编程为抗炎细胞。重组蛋白MFG-E8预处理的巨噬细胞在LPS刺激下，可通过STAT3途径导致抑制细胞因子信号3(Suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)的活化[12,13]。此外，越来越多的研究侧重于MFG-E8在肿瘤方面的作用。研究发现MFG-E8表达于多种肿瘤细胞，如甲状腺癌、***癌、黑色素瘤、乳腺癌、结肠癌以及淋巴癌等。据报道MFG-E8能诱导吞噬血管内皮细胞瘤[14]。Jinushi等人进行的一项研究确定了主要来自CSC相关巨噬细胞的MFG-E8，在触发致瘤性和肿瘤干细胞抗癌药物的耐药性上起主要作用[15]。另一项研究表明，MFG-E8可能是黑色素瘤肿瘤进展的标志物，MFG-E8表达对黑色素瘤是独立而显著的预后不良因素。此外，他们证明了MFG-E8能增强黑色素瘤细胞的抗凋亡、诱导上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)、刺激侵袭和血管生成，而MFG-E8沉默的小鼠黑色素瘤细胞显示减弱的EMT表型，并且基底膜实验显示受损的入侵性[16]。MFG-E8通过引起FoxP3+调节性T细胞浸润和抑制NK细胞和CD8+T细胞的细胞毒作用促进局部的免疫抑制[17]。
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发明内容
为改进临床防治心脏重构和心力衰竭现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于确定MFG-E8的表达水平与心脏重构和心力衰竭间的相互关系，以及MFG-E8在其病理过程中的功能与作用，提供一个用于诊断和治疗心脏重构和心力衰竭的靶基因MFG-E8的新用途，进而将MFG-E8基因应用于制备心脏重构和心力衰竭的诊断和治疗药物。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
1、血清MFG-E8蛋白水平与心脏重构和心力衰竭严重程度密切相关
本发明选取已确诊为扩张型心肌病(DCM)的心衰患者162例，肥厚型心肌病(HCM)的心衰患者43例，以及100例健康体检者为健康对照组(Control)，采集血清测定MFG-E8含量，并通过测量左室射血分数(LVEF)、左室舒张末期内径(LVEDd)、室间隔厚度(IVsd)评价心功能。结果表明，血清MFG-E8蛋白水平在DCM和HCM等心衰病人中显著降低。更重要的是Pearson单因素相关分析表明，在DCM患者血清中MFG-E8水平与左室射血分数(LVEF)呈正相关(r＝0.5975，p<0.0001)，而与左室舒张末期内径(LVEDd)呈负相关(r＝-0.3551，p<0.0001)；在HCM患者血清中MFG-E8水平与室间隔厚度(IVSd)呈负相关(r＝-03987，p＝0.0081)。另外，将患者按照美国纽约心脏病学会(NYHA)心功能分级，发现NYHA分级越高血清MFG-E8水平越低。以上结果表明，血清MFG-E8蛋白水平与心脏重构和心力衰竭严重程度密切相关。
2、MFG-E8基因敲除显著促进了心脏重构的发生发展以及心功能的恶化
本发明选用野生型小鼠、MFG-E8基因敲除小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组12-15只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究MFG-E8基因敲除对主动脉弓缩窄诱导的心脏重构的影响。结果表明敲除基因所致的MFG-E8缺陷显著促进了心脏重构的发生发展以及心功能的恶化。
3、MFG-E8基因过表达显著抑制了心脏重构的发生发展以及心功能的恶化
本发明选用心脏特异性MFG-E8转基因小鼠和非转基因小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组12-15只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究MFG-E8基因过表达对主动脉弓缩窄诱导的心脏重构的影响。结果表明过表达MFG-E8基因显著抑制了心脏重构的发生发展以及心功能的恶化。
4、MFG-E8干扰(AdshMFG-E8)及过表达(AdMFG-E8)腺病毒对经Ang II诱导的心肌细胞肥大模型的影响
本发明通过构建重组腺病毒AdshMFG-E8及AdMFG-E8感染SD乳鼠原代心肌细胞，予以Ang II刺激构建心肌细胞肥大模型，对照组则予以PBS，经免疫荧光监测及心肌细胞表面积统计表明，在Ang II刺激下MFG-E8干扰病毒明显促进心肌细胞肥大，心肌细胞表面积增大；MFG-E8过表达病毒显著抑制心肌细胞肥大，心肌细胞表面积减小。
由上述结果可知在心衰患者中，MFG-E8的表达水平与心脏重构和心力衰竭严重程度密切相关。另外，在主动脉缩窄术造成心脏重构模型中，抑制MFG-E8表达显著促进了心肌肥厚、心肌纤维化以及心功能的恶化，而促进MFG-E8表达则抑制心肌肥厚、心肌纤维化，改善心功能。本发明的研究证明了：MFG-E8的表达水平与心力衰竭的发生发展具有密切的相关性，并且MFG-E8具有抑制心脏重构，改善心功能的作用。
一种MFG-E8在心脏重构和心力衰竭的诊断和治疗中的功能与作用，主要体现在MFG-E8的水平高低与心脏重构和心力衰竭的严重程度密切相关，能够作为诊断心力衰竭的生物学指标。另外，MFG-E8具有保护心功能、抑制心肌肥厚和心脏纤维化的作用。
针对MFG-E8的上述功能，本发明提供MFG-E8作为一种检测靶标在制备心脏重构诊断试剂或心力衰竭早期诊断试剂中的应用。所述的诊断试剂包括特异性扩增MFG-E8基因的引物、特异性识别MFG-E8基因的探针或特异性结合MFG-E8的抗体或配体等。通过采用所述诊断试剂检测待检样品中MFG-E8基因的表达水平或蛋白水平与其所在标准样品中的水平的差异，根据检测结果进行心脏重构的诊断或心力衰竭早期的诊断。
针对MFG-E8的上述功能，本发明还提供MFG-E8在筛选或制备保护心脏功能、抗心肌纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心脏重构和心力衰竭的药物中的应用，所述的心脏重构主要包括心肌肥厚、心肌纤维化。所述应用包括：MFG-E8直接作为保护心脏功能、抗心肌纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心脏重构和心力衰竭的药物或药物的有效成分；筛选包括能够促进MFG-E8表达或增强MFG-E8作用的化学物质间接作为保护心脏功能、抗心肌纤维化和/或预防、缓解和/或治疗心脏重构和心力衰竭的药物或药物的有效成分。上述应用是非诊断和非治疗的目的。
本发明相对于现有技术具有以下优点及效果：
(1)本发明发现心衰病人血清中的MFG-E8水平明显降低，并且与心脏重构和心力衰竭严重程度显著相关。
(2)本发明发现MFG-E8基因的新功能，即MFG-E8基因具有抑制心肌肥厚及其纤维化，改善心功能的作用。
(3)基于MFG-E8与心力衰竭发生发展的相关性，其可以用于制备心脏重构和心力衰竭的诊断试剂。
(4)基于MFG-E8抑制心肌肥厚及其纤维化的作用，其可以应用于制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚及其纤维化疾病的药物。
附图说明
图1是正常对照组(Ctrl)、扩心病病人组(DCM)和肥心病病人(HCM)组血清中的MFG-E8水平对比结果柱状图(***：p＜0.001；n.s.：没有显著差异)。
图2是DCM患者血清中MFG-E8水平与左室射血分数(LVEF)、左室舒张末期内径(LVEDd)的相关性分析结果图。
图3是HCM患者血清中MFG-E8水平与室间隔厚度(IVSd)的相关性分析结果图。
图4是不同纽约心脏病学会(NYHA)心功能分级的DCM患者血清的MFG-E8水平对比结果柱状图(***：p＜0.001；n.s.：没有显著差异)。
图5是心脏特异性MFG-E8转基因小鼠的构建策略及MFG-E8蛋白表达结果图。其中，A为构建策略图；B为蛋白表达量结果图，图中TG1-TG4是不同个体的MFG-E8转基因小鼠。
图6是野生型(WT)和MFG-E8基因敲除(KO)小鼠AB术4周后HW/BW、HW/TL统计结果图(*：p＜0.05；#：p＜0.05)。
图7是野生型(WT)和MFG-E8基因敲除(KO)小鼠AB术4周后心脏组织切片后H&E染色及心肌细胞横截面积统计柱状图(*：p＜0.05vs WT Sham组；#：p＜0.05vs WT AB组)。
图8是野生型(WT)和MFG-E8基因敲除(KO)小鼠AB术4周后心脏组织切片后PSR染色及心肌间质纤维化面积统计柱状图(*：p＜0.05vs WT Sham组；#：p＜0.05vs WT AB组)。
图9是野生型(WT)和MFG-E8基因敲除(KO)小鼠AB术4周后心脏组织中心肌肥厚标志物Anp、Bnp、Myh7以及心肌纤维化标志物CTGF、Collagen I(Col1)和Collagen III(Col3)的mRNA水平统计柱状图(*：p＜0.05vs WT Sham组；#：p＜0.05vs WT AB组)。
图10是野生型(WT)和MFG-E8基因敲除(KO)小鼠AB术4周后超声检测心功能结果统计柱状图，图中，LVEDD为左室舒张末期内径、LVESD为左室收缩末期内径、FS为左室短轴缩短率(*：p＜0.05；#：p＜0.05)。
图11是非转基因(NTG)和心脏特异性MFG-E8转基因小鼠(TG)小鼠AB术4周后HW/BW、HW/TL统计结果图(*：p＜0.05；#：p＜0.05)。
图12是非转基因(NTG)和心脏特异性MFG-E8转基因小鼠(TG)小鼠AB术4周后心脏组织切片后H&E染色及心肌细胞横截面积统计柱状图(*：p＜0.05vs WT Sham组；#：p＜0.05vs WT AB组)。
图13是非转基因(NTG)和心脏特异性MFG-E8转基因小鼠(TG)小鼠AB术4周后心脏组织切片后PSR染色及心肌间质纤维化面积统计柱状图(*：p＜0.05vs WT Sham组；#：p＜0.05vs WT AB组)。
图14是非转基因(NTG)和心脏特异性MFG-E8转基因小鼠(TG)小鼠AB术4周后心脏组织中心肌肥厚标志物Anp、Bnp、Myh7以及心肌纤维化标志物CTGF、Collagen I和CollagenIII的mRNA水平统计柱状图(*：p＜0.05WT Sham组；#：p＜0.05vs WT AB组)。
图15是非转基因(NTG)和心脏特异性MFG-E8转基因小鼠(TG)小鼠AB术4周后超声检测心功能结果统计柱状图，图中，LVEDD为左室舒张末期内径、LVESD为左室收缩末期内径、FS为左室短轴缩短率(*：p＜0.05；#：p＜0.05)。
图16是SD乳鼠原代心肌细胞体外培养后用腺病毒AdshRNA、AdshMFG-E8、AdGFP、AdMFG-E8感染，经Ang II刺激后的免疫荧光及细胞表面积统计柱状图(*：p＜0.05vsAdshRNA/AdGFP PBS组；#：p＜0.05vs AdshRNA/AdGFP AngⅡ组)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进行一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1血清MFG-E8蛋白水平与心脏重构和心衰严重相关性研究
1.研究对象：选取确诊为扩张型心肌病(DCM)和肥厚型心肌病(HCM)的心衰患者，其中包含DCM心衰患者162例，HCM心衰患者43例。入院患者按照美国纽约心脏病学会(NYHA)标准进行心功能分级。健康对照组(Control)为100例健康体检者。研究对象的基线资料见表1。
表1
2.血清收集：清晨空腹采集静脉血5mL，1500r/min离心5min后，收集血清，-80℃冻存。
3.血清MFG-E8水平的测定：血清MFG-E8含量测定采用ELISA法，所用试剂盒为人乳脂球表皮生长因子8(MFG-E8)ELISA试剂盒，由美国R&D SYSTEMS公司提供(DFGE80)。
4.统计方法：计量资料以均数±标准差表示，两组数据间比较采用t检验，多组数据间的比较采用方差分析检验，双变量相关采用Pearson单因素相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
分析结果表明，血清中MFG-E8蛋白水平在DCM和HCM等心衰病人中显著降低(表1和图1)。更重要的是Pearson单因素相关分析表明，在DCM患者血清中MFG-E8水平与左室射血分数(LVEF)呈正相关(图2，r＝0.5975，p<0.0001)，而与左室舒张末期内径(LVEDd)呈负相关(图2，r＝-0.3551，p<0.0001)；在HCM患者血清中MFG-E8水平与室间隔厚度(IVSd)呈负相关(图3，r＝-03987，p＝0.0081)。另外，将患者按照美国纽约心脏病学会(NYHA)心功能分级，发现NYHA分级越高MFG-E8血清水平越低(表2、图4)。
表2
NYHA分级 例数(％) LVEF(％) MFG-E8(pg/mL)
II 33(20.4) 46.5±11.7 3977.2±1254.7
III 83(51.2) 32.1±6.8 2918.1±1027.4
IV 46(28.4) 25.7±6.5 2303.4±1010.5
以上结果表明，血清MFG-E8蛋白水平与心脏重构和心力衰竭严重程度密切相关。
实施例2实验用动物及饲养
1.实验动物：选用8-10周龄、体重23.5-27.5g，背景为雄性的C57BL/6小鼠(命名WT，购自北京华阜康生物科技股份有限公司)、全身性MFG-E8基因敲除小鼠(MFG-E8-KO，购自RIKEN，货号01726)。心脏特异性MFG-E8转基因小鼠(MFG-E8-TG)及非转基因小鼠(NTG，同龄同窝对照非转基因小鼠)为实验对象。
2.饲养环境：所有实验小鼠均饲养在武汉大学SPF级实验动物中心。SRF级小鼠饲料购自北京华阜康生物科技股份有限公司。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70％之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。
实施例3心脏特异性MFG-E8转基因小鼠的构建(构建策略见图5A)
以C57BL/6J小鼠MFG-E8基因的cDNA为模板，用如下引物PCR扩增小鼠MFG-E8基因(NCBI，Gene ID：17304，CCDS21379.1)：
上游引物：5’-AGCTTTGTTTAAACGCCACCATGCAGGTCTCCCGTGTGC-3’，
下游引物：5’-CTAGCTAGCTTAACAGCCCAGCAGCTCCA-3’。
把扩增得到的产物和用限制性内切酶PmeI和NheI酶切后的pCAG-CAT-LacZ载体(北京协和医学院基础学院杨青林老师实验室提供，制备过程参见参考文献：Kim T,Zhelyabovska O,Liu J,et al.Generation of an Inducible,Cardiomyocyte-SpecificTransgenic Mouse Model with PPAR b/d Overexpression[J].PeroxisomeProliferator-Activated Receptors(PPARs),57.)连接，得到转基因载体pCAG-CAT-MFG-E8-polyA，MFG-E8的表达由CAG启动子驱动。
将构建的pCAG-CAT-MFG-E8-polyA载体通过显微注射构造成受精胚胎(C57BL/6J背景)，得到MFG-E8-floxed转基因小鼠。心脏特异性MFG-E8转基因小鼠由MFG-E8-floxed转基因小鼠和α-MHC-Cre(购自Jackson Laboratory，货号005650)小鼠杂交繁殖得到。
取出生一周后的小鼠脚趾或尾部组织，提取对应组织总蛋白，使用Western Blot方法筛选MFG-E8表达量最高的小鼠(图5B)。将其同窝阳性鼠继续繁殖，从而获得稳定遗传心脏特异性MFG-E8转基因小鼠品系。
实施例4心肌肥厚模型的获得
1.实验动物分组：雄性背景C57BL/6野生型小鼠(WT)、MFG-E8基因敲除小鼠(MFG-E8-KO)及心脏特异性MFG-E8转基因小鼠(TG)和非转基因小鼠(NTG)，通过主动脉缩窄术(AB)建立心肌肥厚模型。随机分为8组，分组如下：C57BL/6背景野生型小鼠假手术组(WTSham)及AB术组(WT AB)、MFG-E8基因敲除小鼠假手术组(MFG-E8-KO Sham)及AB术组(MFG-E8-KO AB)、非转基因小鼠假手术组(NTG Sham)及AB术组(NTG AB)、心脏特异性MFG-E8转基因小鼠假手术组(TG Sham)及AB术组(TG AB)。
2.心肌肥厚模型采用主动脉弓缩窄(AB)手术，模型操作流程：
2.1术前准备
(1)麻醉：先给小鼠称重，按照90mg/kg体重计算所需麻药(3％戊巴比妥钠)量，通过腹腔注射，并记录注射时间点。夹尾、夹趾无明显反应且小鼠状态良好为麻醉成功标准(一般注射后约10min无明显反应，以麻醉后约50min小鼠夹趾有反应，麻醉后30min左右为最佳手术时间)。
(2)术区准备：将小鼠左胸部、左侧胸部及左前肢腋下的皮肤去毛。剃毛后用湿纱布擦拭术区去除鼠毛，以不影响手术视野为宜。
(3)气管插管：用橡皮筋将小鼠上门齿固定于V形板斜面上，并迅速将气管插管经声门准确***气管内，随后右侧卧位置于加热垫上(加热垫需提前预热)，然后将气管插管与呼吸机连接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏与呼吸机频率一致，说明气管插管成功。
2.2主动脉弓降支结扎术
取右侧卧位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用医用胶带将两前肢固定。右胸部下方垫入棉签，抬高胸廓，依次用碘酒及体积分数为75％的酒精对手术区域皮肤消毒。左手持眼科镊将左胸部皮肤捏起，右手持眼科剪剪开皮肤约1cm，依次分离肌肉及软组织，于第2-3肋水平打开胸腔，用棉签稍拨开左肺，游离主动脉弓降支，将7-0手术缝线穿过血管，并在血管上方平行放置一段26G(25.0-27.5g小鼠)或者27G(23.5-25.0g)注射器针头，将血管及针头一起结扎好，再抽出针头即可达到相应程度的血管缩窄。结扎完毕后依次缝合，关闭胸腔，用注射器从缝口处***胸腔并抽出1cc气体以恢复胸腔内负压，拔出注射器后迅速缝合皮肤切口。假手术组(Sham)在游离出主动脉降支后只穿线不结扎，其余步骤同心肌肥厚模型组。
2.3术后护理
主动脉弓降支结扎术后，待小鼠出现自主呼吸、夹趾出现强烈反应，拔出气管插管，并将小鼠放入装有高压灭菌过的垫料、饲料和饮用水的饲养笼内，于饲养室继续饲养观察。野生型及MFG-E8基因敲除小鼠小鼠术后4周、非转基因小鼠及心脏特异性MFG-E8转基因小鼠术后4周分别进行各项指标的检测。
实施例5心肌肥厚模型小鼠病理学检测及心功能检测
一、病理学检测
1.取材
(1)前期工作：预先准备装有20mL的体积分数10％甲醛的尿杯，并贴好标签(小鼠编号、组别、手术类型及取材日期)。将倒满质量分数10％KCl溶液的培养皿置于取材处。打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。
(2)取材：眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于质量分数10％KCl溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测。
(3)相关测量及计算：取出小鼠心脏、肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算心重与体重的比值(HW/BW)以及心重与胫骨长度的比值(HW/TL)。
2.病理学检测
2.1制备石蜡标本切片
主要操作程序包括修剪心脏→包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。
2.2苏木精-伊红(HE)染色
主要步骤为：55℃烘烤30min→二甲苯5min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液(珠海贝索，BA-4021)5min→水洗1min→1％盐酸酒精(取3mL浓盐酸与297mL 70％酒精充分混合均匀)1-3s→水洗1min→Scott液(碳酸氢钠0.35g，七水硫酸镁2g，两者溶于100mL蒸馏水)1min→水洗1min→伊红溶液(珠海贝索，BA-4024)3-5min→蒸馏水洗去浮色→70％酒精1s→95％酒精1s→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干，显微镜拍照。
HE染色图片统计：每张图片选择3个以上边界清楚，核大致位于中央的细胞，用Image-Pro Plus 6.0软件统计细胞横截面积。
2.3天狼星红(PSR)染色
主要步骤为：55℃烘烤30min→二甲苯2min，3次→100％酒精1min→95％酒精1min→70％酒精1min→流水冲洗10min→双蒸水1min→质量分数0.2％磷钼酸2min→0.1％天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min→去除残液→0.01N盐酸4s→70％酒精1次→90％酒精1次→100％酒精30s，3次→二甲苯2min，3次→趁二甲苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。
心肌组织由心肌细胞和间质组织组成，心脏是一终末分化器官，心肌细胞失去增殖能力，各种生理或病理性刺激引起的心肌细胞反应，只能是单个细胞的体积增大而不能在数量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理过程中，主要表现为心肌细胞体积增大，肌节数量增多，细胞排列紊乱，心脏间质改变包括心肌成纤维细胞的增殖与转化，胶原纤维密度增加，胶原分泌增加，胶原比例平衡失调等。
二、实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测心肌肥厚和心肌纤维化标志物水平
1.提取RNA
(1)预冷离心机，自-80℃冰箱将待提取RNA的样本取出，液氮充分预冷冻存管后，使用显微剪将冻存管中组织样本剪碎并转移至1.5mL EP管。向每管心脏组织样品中加入1mL Trizol，静置10min。
(2)按照200μL/1mL Trizol的量向每个EP管加入三氯甲烷，上下颠倒混15-30sec后室温静置5min。4℃离心15min(12000g)。
(3)RNA沉淀：将上层水相小心转移至新的EP管中(一般300-400μL)，加入等量体积的异丙醇，混匀后，室温静置10min，12000g的转速4℃离心10min。配制75％乙醇(用25％DEPC处理过的去离子水配制)。
(4)离心后管底及管壁可见白色絮状沉淀(RNA)，去掉上清，加入1mL的75％乙醇，使用振荡器使RNA沉淀重悬，并颠倒EP管，充分漂洗RNA沉淀。并用7500g的转速4℃离心5min。
(5)RNA沉淀的溶解：去除上清，室温干燥10min直至白色沉淀变为无色即可。提前解冻RT-buffer、dT primer、一支PCR等级水、dNTPs。用适量体积(20μL)的DEPC水溶解RNA沉淀，将EP管放至55℃水浴，持续10min促进RNA溶解。
2.测定RNA浓度：使用NanoDrop 2000测定每个样品的RNA浓度。
3.反转录(RT)
(1)逆转录反应体系(总体积13μL)，1μL的dT primer、2μL的Random primer、根据测定的RNA浓度通过加不同量的PCR等级的水将总RNA浓度校正至2μg。
(2)混匀后将上述反应体系置于PCR仪中(70℃，10min)，反应结束后将PCR反应管取出后冰浴5min。
(3)将以上PCR反应管置于冰盒上并加以下试剂，最终体积为20ul。4μL的5×RT-buffer、2μL的dNTPs、0.5μL的inhibitor、0.5μL的RTase。
(4)按以下程序进行反转录：25℃10min；50℃60min；90℃5min；4℃1min，待程序结束，取出反应管，保存于-80℃冰箱。
4.实时荧光定量PCR
(1)PCR反应体系，总体积20μL：10μL的480SYBR Green I Maste(2X)、1μL的primer(10μM)、8μL的PCR等级的水、1μL的cDNA模板。
(2)按照上述体系配混合液(每个基因三复孔)：25.6μL的PCR等级的水，32μL的480SYBR Green I Maste(2X)，3.2μL的引物。
(3)向上述混合液中加入cDNA模板：每管3.2μL。
(4)混匀后在96孔板上点样，每管点三个复孔，将96孔板3000rpm离心2min。
(5)将离心的96孔板置于检测仪上，按设定程序检测。
用于实时荧光定量PCR的引物序列如下表3：
表3
基因 正向引物(5’to 3’) 反向引物(5’to 3’)
Anp-Mouse ACCTGCTAGACCACCTGGAG CCTTGGCTGTTATCTTCGGTACCGG
Bnp-Mouse GAGGTCACTCCTATCCTCTGG GCCATTTCCTCCGACTTTTCTC
Myh7-Mouse CCGAGTCCCAGGTCAACAA CTTCACGGGCACCCTTGGA
Ctgf-Mouse TGACCCCTGCGACCCACA TACACCGACCCACCGAAGACACAG
Collagen I-Mouse AGGCTTCAGTGGTTTGGATG CACCAACAGCACCATCGTTA
Collagen III-Mouse CCCAACCCAGAGATCCCATT GAAGCACAGGAGCAGGTGTAGA
Gapdh-Mouse ACTTGAAGGGTGGAGCCAAA GACTGTGGTCATGAGCCCTT
三、超声检测心功能
1.前期准备
(1)麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋钮，出气压力维持在0.2-0.3mPa。
(2)待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1.5-2.0％异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。
2.心功能检测
本实施例运用M型超声心动图检测评价心肌肥厚和心功能。小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂(天津成信公司)。采用高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室***肌短轴切面，测量左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)及短轴缩短率(LVFS)。
四、结果
WT和MFG-E8-KO小鼠AB术后的病理学检测结果见图6-8。Sham(假手术)组中WT小鼠和MFG-E8-KO小鼠的HW/BW和HW/TL之间的差异均无统计学意义；WT小鼠AB术后4周的HW/BW和HW/TL高于其Sham组；AB术后4周，MFG-E8-KO小鼠的HW/BW及HW/TL均较WT小鼠升高(图6)。HE染色切片可观察到：Sham组心脏无明显差异，AB组较Sham组的心脏均增大，MFG-E8-KO小鼠的心脏明显大于WT组小鼠；Sham组心肌肌原纤维细胞排列整齐、致密，形态完整，胞核及核仁结构清晰；AB组肌丝排列紊乱、松散，心肌细胞体积明显增大，形态不规整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，MFG-E8-KO组则较WT组细胞肥大加重，差异有统计学意义。心肌细胞横截面积统计结果表明，MFG-E8-KO组则较WT组心肌细胞横截面积明显增大(图7)。PSR染色显示，AB组心室心肌间质胶原含量较Sham组增加，动脉血管周围胶原增加更为明显，胶原增粗，排列紊乱成网络状；AB术后MFG-E8-KO小鼠心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量高于WT组小鼠(图8)。实时定量PCR的结果显示，主动脉缩窄术后4W，和WT组相比，MFG-E8-KO组小鼠心脏组织中的心肌肥厚标志物(Anp、Bnp和Myh7)和心肌纤维化标志物(Collagen I、Collagen III和CTGF)的mRNA水平明显上升(图9)。另外，对术后4W的各组小鼠行超声心动图检测，评价其心室扩张和心脏功能，发现和Sham组相比，WT和MFG-E8-KO小鼠左心室心腔均显著扩张，表现为左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVESd)增大，而心功能指标左心室短轴缩短率(LVFS)显著降低，更重要的是MFG-E8的基因敲除进一步促进了AB手术诱导的左心室的扩大和心功能的恶化(图10)。以上结果说明，MFG-E8基因敲除明显促进了压力诱导的心脏重构的发生发展。
图11-13是NTG和MFG-E8-TG小鼠AB术后的病理学检测结果。在假手术组中，NTG和MFG-E8-TG小鼠的各项指标均无差异。而AB术后4周，NTG小鼠的HW/BW及HW/TL明显高于其Sham组，而与NTG小鼠比较，MFG-E8-TG小鼠的HW/BW和HW/TL显著降低(图11)。HE染色切片可观察到：AB术后，NTG小鼠心脏大小和心肌细胞横截面积明显大于Sham组，而MFG-E8-TG小鼠的上述指标较NTG小鼠明显降低(图12)。PSR染色可见：TG小鼠AB术后心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量均低于NTG小鼠AB组(图13)。实时定量PCR的结果显示，主动脉缩窄术后4W，和NTG组相比，MFG-E8-TG组小鼠心脏组织中的心肌肥厚标志物(Anp、Bnp和Myh7)和心肌纤维化标志物(Collagen I、Collagen III和CTGF)的mRNA水平明显下降(图14)。超声心动图检测显示，和NTG小鼠相比，MFG-E8-TG组小鼠显著抑制了压力负荷诱导的左室心腔内径的扩大和心功能的恶化。表现为表现为左室舒张末期内径(LVEDd)，左室收缩末期内径(LVESd)减小，而心功能指标左心室短轴缩短率(LVFS)显著上升(图15)。以上结果说明经心脏特异性MFG-E8过表达明显抑制了压力负荷诱导的心脏重构和心功能恶化。
实施例5MFG-E8干扰(AdshMFG-E8)及过表达(AdMFG-E8)腺病毒对Ang II刺激的原代心肌细胞肥大的影响
1.原代新生SD大鼠心肌细胞培养
(1)新生1天Sprague-Dawley乳鼠8只，颈部以下75％酒精消毒，用眼科剪和显微镊取下心脏，放入盛有10mL DMEM/F12培养基的玻璃平皿中。再取另一只，重复以上过程。
(2)用DMEM/F12培养基清洗心脏，并将心脏剪成1-2mm3的碎片。转入到放有转子的血清瓶中，吸去DMEM/F12，加入胰酶消化液。转速为120r/min，消化15min，静止数秒钟，弃去上清液。
(3)加入胰酶消化液，转速为120r/min，消化15min。静止数秒钟，吸取上清液，用20％小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，并置于4℃冰箱保存。重复该步骤，循环若干次。取上清时应尽量取尽，当组织块变白并明显变小时，终止消化。
(4)将收集好的心肌细胞悬液以1500rpm转速离心8min，弃去上清液。在离心管中加入适量培养基，轻柔吹打重悬细胞，集中至1个50mL离心管中，细胞悬液用细胞40μm过滤网过滤。
(5)将细胞接种在100mm的培养皿中，差时贴壁90min，吸取未贴壁的细胞悬液过滤。根据细胞悬液的总量加入Brdu(终浓度0.1mM)，混匀之后，加入到用0.1％明胶包被的器皿中。
(6)轻摇分散细胞，勿漩涡摇晃。37℃、5％CO2孵育48小时用PBS清洗1次，更换培养基。
2.MFG-E8干扰(AdshMFG-E8)及过表达(AdMFG-E8)腺病毒对经Ang II诱导的心肌细胞肥大模型的影响
2.1重组腺病毒构建
本发明所用重组腺病毒包含AdshRNA(含shRNA(沉默RNA)的腺病毒，用作对照)、AdshMFG-E8(含shRNA-MFG-E8(沉默RNA-MFG-E8融合蛋白)的腺病毒，沉默MFG-E8表达)、AdGFP(含GFP(绿色荧光蛋白)的腺病毒，用作对照)及AdMFG-E8(含GFP-MFG-E8(绿色荧光蛋白-MFG-E8融合蛋白)的腺病毒，MFG-E8过表达)。
从美国InvivoGen公司购得MFG-E8的表达载体，应用腺病毒表达***AdenoVec构建重组AdGFP、AdMFG-E8；从美国SuperArray公司购得shRNA、shMFG-E8载体，应用腺病毒表达***AdenoVec构建重组AdshRNA、AdshMFG-E8。
2.2重组腺病毒的鉴定
取病毒粗提液加入裂解液，经混匀、离心后取上清液作为模板进行PCR扩增，产物通过凝胶电泳鉴定。
2.3重组腺病毒的扩增
转染前接种HEK293细胞，待细胞达到50-70％汇合时换液，加入含有重组腺病毒载体的新鲜培养液，培养90分钟后再添加新鲜培养液，培养至大约有50％的细胞从培养板上脱落时，收集细胞悬液。反复冻融以制备病毒粗提液，通过CsCl密度梯度超速离心法纯化病毒液。
2.4重组腺病毒滴度测定
在96孔板中接种HEK293细胞，24小时后加入倍比稀释的病毒液，1-10列加入稀释的病毒液，每个浓度8个重复孔，11-12列加入无病毒完全培养液，培养10天后在显微镜下观察细胞病变效应(CPE)，计算每个浓度的阳性率。病毒滴度采用Spearman-Karber Method计算：滴度(pfu/mL)＝10(x+0.8)，x＝各浓度阳性率总和。前提条件：阴性对照无CPE和生长抑制现象；最小稀释浓度组均有CPE；最大稀释浓度组均无CPE。
2.5重组腺病毒作用的鉴定
用2×108pfu/virus浓度的AdMFG-E8和AdGFP及AdshMFG-E8和AdshRNA感染6孔培养板中培养心肌细胞(约80％汇合度)，24小时后收集细胞，加入蛋白裂解液裂解50分钟后收集上清，取50μg样品经10％SDS-PAGE电泳分离后，用MFG-E8特异性抗体做Western blot分析。根据MFG-E8蛋白的表达，确定腺病毒AdMFG-E8和AdGFP及AdshMFG-E8和AdshRNA是否能发挥预期作用。由AdGFP和AdshRNA感染的细胞MFG-E8蛋白表达含量不变。由AdshMFG-E8感染的细胞MFG-E8蛋白表达含量显著减少；相反的，由AdMFG-E8感染的细胞MFG-E8蛋白表达含量显著增加。
腺病毒10MOIs分别感染培养3天的原代心肌细胞，12小时后用1μM血管紧张素II(Ang II，购自Sigma，A9525)或对照PBS刺激48小时，然后进行免疫荧光试验。结果表明，经AdshMFG-E8腺病毒感染的心肌细胞表面积与对照组相比AdshRNA明显增大，而经AdMFG-E8腺病毒感染后的心肌细胞表面积较AdGFP对照组显著减小(图16)。即MFG-E8的干扰腺病毒则促进心肌细胞肥大，MFG-E8过表达的腺病毒则抑制心肌细胞肥大。
由以上实施例结果可知：
1.在心衰病人的患者血清中，MFG-E8蛋白水平明显降低，并且与心脏重构和心力衰竭严重程度密切相关。MFG-E8可成为诊断心脏重构和心力衰竭的新型生物学指标。
2.在主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚疾病模型中，MFG-E8基因敲除显著促进了心肌肥厚、纤维化以及心功能的恶化，MFG-E8基因过表达显著抑制了心肌肥厚、纤维化，改善了心功能。因此MFG-E8基因具有抑制压力负荷诱导的心脏重构、保护心功能的作用。MFG-E8可成为治疗心脏重构和改善心力衰竭的新型药物。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉大学
<120> 乳脂肪球表皮生长因子8在心脏重构和心力衰竭的诊断及治疗中的应用
<130> 1
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 上游引物
<400> 1
agctttgttt aaacgccacc atgcaggtct cccgtgtgc 39
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 下游引物
<400> 2
ctagctagct taacagccca gcagctcca 29
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anp正向引物
<400> 3
acctgctaga ccacctggag 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 反向引物
<400> 4
ccttggctgt tatcttcggt accgg 25
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Bnp正向引物
<400> 5
gaggtcactc ctatcctctg g 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Bnp反向引物
<400> 6
gccatttcct ccgacttttc tc 22
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Myh7正向引物
<400> 7
ccgagtccca ggtcaacaa 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Myh7反向引物
<400> 8
cttcacgggc acccttgga 19
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Ctgf正向引物
<400> 9
tgacccctgc gacccaca 18
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Ctgf反向引物
<400> 10
tacaccgacc caccgaagac acag 24
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Collagen I正向引物
<400> 11
aggcttcagt ggtttggatg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Collagen I反向引物
<400> 12
caccaacagc accatcgtta 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Collagen III正向引物
<400> 13
cccaacccag agatcccatt 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Collagen III反向引物
<400> 14
gaagcacagg agcaggtgta ga 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Gapdh正向引物
<400> 15
acttgaaggg tggagccaaa 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Gapdh反向引物
<400> 16
gactgtggtc atgagccctt 20

Claims (9)

1.MFG-E8在制备心脏重构诊断试剂中的应用。
2.MFG-E8在制备心力衰竭早期诊断试剂中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的诊断试剂包括特异性扩增MFG-E8基因的引物、特异性识别MFG-E8基因的探针、特异性结合MFG-E8的抗体或配体。
4.MFG-E8在筛选预防、缓解和/或治疗心脏重构的药物中的应用，其特征在于：所述的应用是非诊断和非治疗的目的。
5.MFG-E8在筛选预防、缓解和/或治疗心力衰竭的药物中的应用，其特征在于：所述的应用是非诊断和非治疗的目的。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述的筛选是指筛选包括能够促进MFG-E8表达或增强MFG-E8作用的化学物质。
7.MFG-E8在制备预防、缓解和/或治疗心脏重构的药物中的应用。
8.MFG-E8在制备预防、缓解和/或治疗心力衰竭的药物中的应用。
9.根据权利要求1、4或7所述的应用，其特征在于：所述心脏重构包括心肌肥厚、心肌纤维化。
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