CN101891722B

CN101891722B - 一种制备松萝酸的方法

Info

Publication number: CN101891722B
Application number: CN2010102368429A
Authority: CN
Inventors: 石波; 梁平; 迟春艳
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-07-26
Filing date: 2010-07-26
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2030-07-26
Also published as: CN101891722A

Abstract

本发明公开了一种制备松萝酸的方法。该方法包括如下步骤：1)将长松萝粉碎后与有机溶剂混匀，进行回流提取，得到松萝酸粗提物；2)选择两相溶剂体系，采用高速逆流色谱法，将所述步骤1)得到的松萝酸粗提物进行分离，得到所述松萝酸。本发明采用高效逆流色谱进行松萝酸的分离，与以往的试验是制备技术手段相比具有明显的优点：一次进样量大、分离能力强、分离时间短、样品损失小，以及分离和纯化可同步完成。本发明提供的方法适于柱容量325ml的高速逆流色谱仪的高速逆流色谱仪，利用该方法制备所得松萝酸的纯度高达99％，具有重要的应用价值。

Description

一种制备松萝酸的方法

技术领域

本发明涉及地衣植物中天然抗生素的分离制备方法，特别涉及松萝酸的制备方法。

背景技术

松萝酸是长松萝的主要生物活性成分之一。长松萝(Usnea.longissima)为松萝科松罗属的一种地衣植物，亦称树挂、天蓬草，主要生长于新疆、内蒙古、云南、甘肃、西藏、黑龙江、吉林、辽宁等地，具有清热解毒、止咳化痰、消炎等功效。松萝酸对金黄色葡萄球菌显示出较强的抑制效应，对大肠杆菌、霉菌、酵母菌及病原菌也有一定的抑制作用，可作为天然防腐剂用于食品和饲料中并且具有清热解毒、止咳化痰、抗病毒、消炎、促进伤口愈合等作用。

松萝酸的制备一般采用有机溶剂提取，再经过反复重结晶或硅胶柱层析纯化的方式，获得高纯度的产物。松萝酸一般在长松萝中的含量为1.4％左右。由于多次重结晶以及硅胶柱层析会对目标产物造成较大的损失，使得收率大大降低，同时其过程繁琐冗长，制备量小。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备松萝酸的方法。

本发明提供的制备松萝酸的方法，包括如下步骤：

1)将长松萝粉碎后与有机溶剂混匀，进行回流提取，得到松萝酸粗提物；

2)选择两相溶剂体系，采用高速逆流色谱法，将所述步骤1)得到的松萝酸粗提物进行分离，得到所述松萝酸。

上述方法的步骤1)中，长松萝可由公开商业途径购买得到，所述粉碎后的长松萝的目数为20-80目，优选60目，所述有机溶剂选自***、乙酸乙酯和石油醚中的任意一种，优选石油醚或***，更优选石油醚；所述石油醚为沸程为60℃～90℃的石油醚；所述有机溶剂与所述长松萝的用量比为4-10毫升∶1克，优选5-8毫升∶1克；所述回流提取步骤中，每次回流提取的时间为3-6小时，优选为4-5小时，次数为2-4次。

所述步骤2)中，所述两相溶剂体系是下述两相溶剂体系a-c中的任意一种，所述两相溶剂体系a为由体积比为8-13∶7-11∶5-8∶0.8-1.5的正己烷、乙腈、乙酸乙酯和水组成，所述两相溶剂体系b为由体积比为8-13∶7-11∶5-8∶0.8-1.5的正己烷、乙醇、乙酸乙酯和水组成，所述两相溶剂体系c为由体积比为8-13∶7-11∶5-8∶0.g-1.5的正己烷、甲醇、乙酸乙酯和水组成，优选为体积比为8∶7∶6∶0.9的由正己烷、乙腈、乙酸乙酯和水组成的两相溶剂体系，更优选为体积比为8∶7∶5∶0.8的由正己烷、乙腈、乙酸乙酯和水组成的两相溶剂体系、体积比为8∶7∶5∶0.8的由正己烷、乙醇、乙酸乙酯和水组成的两相溶剂体系或体积比为8∶7∶5∶0.8的由正己烷、甲醇、乙酸乙酯和水组成的两相溶剂体系。所述高速逆流色谱分离柱的转速为500rpm-1000rpm，优选为600rpm-800rpm。所述高速逆流色谱法所用的高速逆流色谱分离柱的总体积为325mL。

所述高速逆流色谱法所用的样品，是将所述步骤1)所得松萝酸粗提物溶于溶样溶剂中形成的溶液；所述溶样溶剂是由所述两相溶剂体系中的5ml上相和5ml下相组成的溶剂；所述松萝酸粗提物与所述溶样溶剂的用量比为10mg-300mg∶10ml，具体可为10mg-50mg∶10ml、10mg-25mg∶10ml、25mg-300mg∶10ml、25mg-50mg∶10ml或50mg-300mg∶10ml。

所述高速逆流色谱法所用高速逆流色谱分离柱中，流动相为所述两相溶剂体系中的下相，所述流动相的流速为0.5-4ml/min，具体为1.5-2ml/min，优选1-3ml/min，流动相的流动方向为由所述高速逆流色谱分离柱的首端泵入；固定相为所述两相溶剂体系中的上相，所述固定相的流速为6ml/min。

所述高速逆流色谱分离柱的分离温度为20℃-30℃。所述高速逆流色谱分离柱的检测波长为254nm。

另外，在所述步骤1)之后，所述步骤2)分离步骤之前，为了避免分离过程中有气泡生成，还可进行超声波脱气，该超声波脱气的条件是在100KHz脱气10分钟。

本发明采用高效逆流色谱(High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC)进行松萝酸的分离纯化，与以往的试验是制备技术手段相比具有明显的优点：一次进样量大、分离能力强、分离时间短、样品损失小，以及分离和纯化可同步完成。本发明提供的方法适于柱容量325ml的高速逆流色谱仪的高速逆流色谱仪，利用该方法制备所得松萝酸的纯度高达99％，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中转速为600转/分钟的HSCCC谱图。

图2为实施例1制备所得HSCCC分离组分峰A(松萝酸)的液相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1

1)称取粉碎后的目数为20目长松萝100g，加入600ml沸程为60℃-90℃的石油醚，回流提取6h，抽滤。重复以上回流提取步骤3次。合并滤液，45℃真空(真空度为0MPa)浓缩至15ml，室温下静置过夜，得到松萝酸粗提物。

2)以体积比为8∶7∶5∶0.8的由正己烷、乙腈、乙酸乙酯和水组成的混合液作为两相溶剂体系，采用高速逆流色谱仪，将步骤1)得到的松萝酸粗提物溶于该两相溶剂体系中进行分离纯化。具体步骤如下：将该两相溶剂体系充分混合后，静置分相，两相依次在100KHz超声波条件下脱气30min。取上相为固定相，下相为流动相。将固定相以6ml/min的流速泵入分离柱总体积为325ml的高速逆流色谱分离柱中，启动高速逆流色谱主机，调节分离柱转速为600rpm，将流动相以1.5ml/min的流速由首端向尾端泵入。分离柱温度调至25℃。将25mg步骤1)得到的松萝酸粗提物溶于5ml上相和5ml下相组成的溶剂中得到该松萝酸粗提物的溶液。待高速逆流色谱分离柱达到平衡，将该松萝酸粗提物的溶液注入进样环中，检测波长为254nm。使用分步收集器收集含有松萝酸的目标流出组分。由连接检测器上的色谱工作站即在线数据采集分析仪上，得到图1所示HSCCC谱图，其中峰A为松萝酸。将含有该目标组分的收集液合并，氮气吹干，得到产物11.2mg，得率为44.8％。

该产物的核磁检测结果如下：

¹H-NMR(300MHz，CDCL₃)：76(3H，s)，2.10(3H，s)，2.66(3H，s)，2.68(3H，s)，5.98(1H，s)，11.03(1H，s)，13.33(1H，s)；

¹³C-NMR(75MHz，CDCL₃)：197.80(s，C-1)，104.98(s，C-2)，205.10(s，2-OCCH₃)，27.58(q，2-OCCH₃)，191.44(s，C-3)，98.06(d，C-4)，179.10(s，C-4a)，101.27(s，C-6)，200.03(s，6-OCCH₃)，30.97(q，6-OCCH₃)，154.95(s，C-5a)，63.6(s，C-9)，103.69(s，C-7)，109.07(s，C-8)，7.25(q，8-CH3)，157.25(s，C-9)，103.69(s，C-9a)，58.81(s，C-9b)，31.84(q，9b-CH₃)。

此外，按照下述条件对该峰A产物进行高效液相色谱(HPLC)检测：色谱柱：Agilent反相C18柱(150×4.6mm，id 10μm；流动相：由体积比为60∶40的由乙腈与质量百分浓度为0.1％的乙酸水溶液组成的混合液；流速：1.0ml/min；检测波长：254nm；检测温度：30℃；上样量：10μl。所得结果如图2所示。

由上述核磁共振及HPLC检测结果可知，该HSCCC谱图中峰A产物结构正确，为松萝酸，纯度为99％。

实施例2

1)称取粉碎后的目数为60目的长松萝100g，加入800ml沸程为60-90℃的石油醚，回流提取4h，抽滤。重复以上回流提取步骤3次。合并滤液，45℃真空(真空度为0.01MPa)浓缩至15ml，室温下静置过夜，得到松萝酸粗提物。

2)以体积比为8∶7∶5∶0.8的由正己烷、乙腈、乙酸乙酯和水组成的混合液作为两相溶剂体系，采用高速逆流色谱仪，将步骤1)得到的松萝酸粗提物溶于该两相溶剂体系中进行分离纯化。具体步骤如下：将该两相溶剂体系充分混合后，静置分相，两相依次在100KHz超声波条件下脱气30min。取上相为固定相，下相为流动相。将固定相以6ml/min的流速泵入分离柱总体积为325ml的高速逆流色谱分离柱中，启动高速逆流色谱主机，调节分离柱转速为800rpm，将流动相以2ml/min的流速由首端向尾端泵入。分离柱温度调至30℃。将50mg松萝酸粗提物溶于5ml上相和5ml下相组成的溶剂中得到该松萝酸粗提物的溶液。待高速逆流色谱分离柱达到平衡，将该松萝酸粗提物的溶液注入进样环中，检测波长为254nm。使用分步收集器收集流出组分。根据色谱工作站谱图收集含有松萝酸的目标组分。将含有该目标组分的收集液合并，氮气吹干，得到产物22.8mg，得率为45.4％。

按照与实施例1完全相同的检测条件对峰A产物进行HPLC检测，所得检测结果与实施例1相同。该产物的核磁检测结果亦与实施例1相同。由上述核磁共振及HPLC检测结果可知，该HSCCC谱图中峰A产物结构正确，为松萝酸，纯度为99％。

实施例3

按照与实施例2完全相同的步骤制备松萝酸，仅将步骤1)中的长松萝的目数改为80目，提取溶剂为***，用量1000mL/次，回流提取3小时，提取2次，35℃真空浓缩滤液至10ml；步骤2)中松萝酸粗提物量改为10mg，流动相流速改为4ml/min，分离柱温度20℃，分离柱转速改为500rpm。

按照与实施例1完全相同的检测条件对峰A产物进行HPLC检测，所得检测结果与实施例1相同。该产物的核磁检测结果亦与实施例1相同。由上述核磁共振及HPLC检测结果可知，该HSCCC谱图中峰A产物结构正确，为松萝酸，纯度为99.5％，得率为40.08％。

实施例4

按照与实施例1完全相同的步骤制备松萝酸，仅将步骤1)中的提取溶剂改为乙酸乙酯，用量400mL/次，回流6小时，提取4次，50℃真空浓缩滤液至30ml；步骤中2)中两相溶剂体系改为体积比为8∶7∶5∶0.8的由正己烷、甲醇、乙酸乙酯和水组成的混合液，松萝酸粗提物量改为300mg，分离柱转速改为1000rpm。

按照与实施例1完全相同的检测条件对峰A产物进行HPLC检测，所得检测结果与实施例1相同。该产物的核磁检测结果亦与实施例1相同。由上述核磁共振及HPLC检测结果可知，该HSCCC谱图中峰A产物结构正确，为松萝酸，纯度为99％，得率为43.6％。

实施例5

按照与实施例1完全相同的步骤制备松萝酸，仅将步骤2)中两相溶剂体系改为体积比为8∶7∶5∶0.8的由正己烷、乙醇、乙酸乙酯和水组成的混合液，流动相流速改为0.5ml/min。

按照与实施例1完全相同的检测条件对峰A产物进行HPLC检测，所得检测结果与实施例1相同。该产物的核磁检测结果亦与实施例1相同。由上述核磁共振及HPLC检测结果可知，该HSCCC谱图中峰A产物结构正确，为松萝酸，纯度为99％，得率为41％。

Claims

1.一种制备松萝酸的方法，步骤如下：

1)称取粉碎后的目数为80目的长松萝100g，加入***，回流提取3h，抽滤；提取2次，***用量为1000mL/次，合并滤液，35℃真空浓缩所述滤液至10ml，室温下静置过夜，得到松萝酸粗提物；

2)以体积比为8∶7∶5∶0.8的由正己烷、乙腈、乙酸乙酯和水组成的混合液作为两相溶剂体系，采用高速逆流色谱仪，将步骤1)得到的松萝酸粗提物溶于该两相溶剂体系中进行分离纯化，步骤为：将该两相溶剂体系充分混合后，静置分相，两相依次在100KHz超声波条件下脱气30min；取上相为固定相，下相为流动相；将所述固定相以6ml/min的流速泵入分离柱总体积为325ml的高速逆流色谱分离柱中，启动高速逆流色谱主机，调节分离柱转速为500rpm，将所述流动相以4ml/min的流速由首端向尾端泵入；分离柱温度调至20℃；将10mg所述松萝酸粗提物溶于5ml所述上相和5ml所述下相组成的溶剂中得到该松萝酸粗提物的溶液；待高速逆流色谱分离柱达到平衡，将该松萝酸粗提物的溶液注入进样环中，检测波长为254nm，使用分步收集器收集流出组分，根据色谱工作站谱图收集含有松萝酸的目标组分，将含有该目标组分的收集液合并，氮气吹干，得到松萝酸；所述松萝酸纯度为99.5％。