CN101891722B - 一种制备松萝酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备松萝酸的方法。该方法包括如下步骤:1)将长松萝粉碎后与有机溶剂混匀,进行回流提取,得到松萝酸粗提物;2)选择两相溶剂体系,采用高速逆流色谱法,将所述步骤1)得到的松萝酸粗提物进行分离,得到所述松萝酸。本发明采用高效逆流色谱进行松萝酸的分离,与以往的试验是制备技术手段相比具有明显的优点:一次进样量大、分离能力强、分离时间短、样品损失小,以及分离和纯化可同步完成。本发明提供的方法适于柱容量325ml的高速逆流色谱仪的高速逆流色谱仪,利用该方法制备所得松萝酸的纯度高达99%,具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及地衣植物中天然抗生素的分离制备方法,特别涉及松萝酸的制备方法。
背景技术
松萝酸是长松萝的主要生物活性成分之一。长松萝(Usnea.longissima)为松萝科松罗属的一种地衣植物,亦称树挂、天蓬草,主要生长于新疆、内蒙古、云南、甘肃、西藏、黑龙江、吉林、辽宁等地,具有清热解毒、止咳化痰、消炎等功效。松萝酸对金黄色葡萄球菌显示出较强的抑制效应,对大肠杆菌、霉菌、酵母菌及病原菌也有一定的抑制作用,可作为天然防腐剂用于食品和饲料中并且具有清热解毒、止咳化痰、抗病毒、消炎、促进伤口愈合等作用。
松萝酸的制备一般采用有机溶剂提取,再经过反复重结晶或硅胶柱层析纯化的方式,获得高纯度的产物。松萝酸一般在长松萝中的含量为1.4%左右。由于多次重结晶以及硅胶柱层析会对目标产物造成较大的损失,使得收率大大降低,同时其过程繁琐冗长,制备量小。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备松萝酸的方法。
本发明提供的制备松萝酸的方法,包括如下步骤:
1)将长松萝粉碎后与有机溶剂混匀,进行回流提取,得到松萝酸粗提物;
2)选择两相溶剂体系,采用高速逆流色谱法,将所述步骤1)得到的松萝酸粗提物进行分离,得到所述松萝酸。
上述方法的步骤1)中,长松萝可由公开商业途径购买得到,所述粉碎后的长松萝的目数为20-80目,优选60目,所述有机溶剂选自***、乙酸乙酯和石油醚中的任意一种,优选石油醚或***,更优选石油醚;所述石油醚为沸程为60℃~90℃的石油醚;所述有机溶剂与所述长松萝的用量比为4-10毫升∶1克,优选5-8毫升∶1克;所述回流提取步骤中,每次回流提取的时间为3-6小时,优选为4-5小时,次数为2-4次。
所述步骤2)中,所述两相溶剂体系是下述两相溶剂体系a-c中的任意一种,所述两相溶剂体系a为由体积比为8-13∶7-11∶5-8∶0.8-1.5的正己烷、乙腈、乙酸乙酯和水组成,所述两相溶剂体系b为由体积比为8-13∶7-11∶5-8∶0.8-1.5的正己烷、乙醇、乙酸乙酯和水组成,所述两相溶剂体系c为由体积比为8-13∶7-11∶5-8∶0.g-1.5的正己烷、甲醇、乙酸乙酯和水组成,优选为体积比为8∶7∶6∶0.9的由正己烷、乙腈、乙酸乙酯和水组成的两相溶剂体系,更优选为体积比为8∶7∶5∶0.8的由正己烷、乙腈、乙酸乙酯和水组成的两相溶剂体系、体积比为8∶7∶5∶0.8的由正己烷、乙醇、乙酸乙酯和水组成的两相溶剂体系或体积比为8∶7∶5∶0.8的由正己烷、甲醇、乙酸乙酯和水组成的两相溶剂体系。所述高速逆流色谱分离柱的转速为500rpm-1000rpm,优选为600rpm-800rpm。所述高速逆流色谱法所用的高速逆流色谱分离柱的总体积为325mL。
所述高速逆流色谱法所用的样品,是将所述步骤1)所得松萝酸粗提物溶于溶样溶剂中形成的溶液;所述溶样溶剂是由所述两相溶剂体系中的5ml上相和5ml下相组成的溶剂;所述松萝酸粗提物与所述溶样溶剂的用量比为10mg-300mg∶10ml,具体可为10mg-50mg∶10ml、10mg-25mg∶10ml、25mg-300mg∶10ml、25mg-50mg∶10ml或50mg-300mg∶10ml。
所述高速逆流色谱法所用高速逆流色谱分离柱中,流动相为所述两相溶剂体系中的下相,所述流动相的流速为0.5-4ml/min,具体为1.5-2ml/min,优选1-3ml/min,流动相的流动方向为由所述高速逆流色谱分离柱的首端泵入;固定相为所述两相溶剂体系中的上相,所述固定相的流速为6ml/min。
所述高速逆流色谱分离柱的分离温度为20℃-30℃。所述高速逆流色谱分离柱的检测波长为254nm。
另外,在所述步骤1)之后,所述步骤2)分离步骤之前,为了避免分离过程中有气泡生成,还可进行超声波脱气,该超声波脱气的条件是在100KHz脱气10分钟。
本发明采用高效逆流色谱(High-speed Counter-current Chromatography,HSCCC)进行松萝酸的分离纯化,与以往的试验是制备技术手段相比具有明显的优点:一次进样量大、分离能力强、分离时间短、样品损失小,以及分离和纯化可同步完成。本发明提供的方法适于柱容量325ml的高速逆流色谱仪的高速逆流色谱仪,利用该方法制备所得松萝酸的纯度高达99%,具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中转速为600转/分钟的HSCCC谱图。
图2为实施例1制备所得HSCCC分离组分峰A(松萝酸)的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中,如无特殊说明,均为常规方法,所述百分含量如无特殊说明,均为质量百分含量。
实施例1
1)称取粉碎后的目数为20目长松萝100g,加入600ml沸程为60℃-90℃的石油醚,回流提取6h,抽滤。重复以上回流提取步骤3次。合并滤液,45℃真空(真空度为0MPa)浓缩至15ml,室温下静置过夜,得到松萝酸粗提物。
2)以体积比为8∶7∶5∶0.8的由正己烷、乙腈、乙酸乙酯和水组成的混合液作为两相溶剂体系,采用高速逆流色谱仪,将步骤1)得到的松萝酸粗提物溶于该两相溶剂体系中进行分离纯化。具体步骤如下:将该两相溶剂体系充分混合后,静置分相,两相依次在100KHz超声波条件下脱气30min。取上相为固定相,下相为流动相。将固定相以6ml/min的流速泵入分离柱总体积为325ml的高速逆流色谱分离柱中,启动高速逆流色谱主机,调节分离柱转速为600rpm,将流动相以1.5ml/min的流速由首端向尾端泵入。分离柱温度调至25℃。将25mg步骤1)得到的松萝酸粗提物溶于5ml上相和5ml下相组成的溶剂中得到该松萝酸粗提物的溶液。待高速逆流色谱分离柱达到平衡,将该松萝酸粗提物的溶液注入进样环中,检测波长为254nm。使用分步收集器收集含有松萝酸的目标流出组分。由连接检测器上的色谱工作站即在线数据采集分析仪上,得到图1所示HSCCC谱图,其中峰A为松萝酸。将含有该目标组分的收集液合并,氮气吹干,得到产物11.2mg,得率为44.8%。
该产物的核磁检测结果如下:
1H-NMR(300MHz,CDCL3):76(3H,s),2.10(3H,s),2.66(3H,s),2.68(3H,s),5.98(1H,s),11.03(1H,s),13.33(1H,s);
13C-NMR(75MHz,CDCL3):197.80(s,C-1),104.98(s,C-2),205.10(s,2-OCCH3),27.58(q,2-OCCH3),191.44(s,C-3),98.06(d,C-4),179.10(s,C-4a),101.27(s,C-6),200.03(s,6-OCCH3),30.97(q,6-OCCH3),154.95(s,C-5a),63.6(s,C-9),103.69(s,C-7),109.07(s,C-8),7.25(q,8-CH3),157.25(s,C-9),103.69(s,C-9a),58.81(s,C-9b),31.84(q,9b-CH3)。
此外,按照下述条件对该峰A产物进行高效液相色谱(HPLC)检测:色谱柱:Agilent反相C18柱(150×4.6mm,id 10μm;流动相:由体积比为60∶40的由乙腈与质量百分浓度为0.1%的乙酸水溶液组成的混合液;流速:1.0ml/min;检测波长:254nm;检测温度:30℃;上样量:10μl。所得结果如图2所示。
由上述核磁共振及HPLC检测结果可知,该HSCCC谱图中峰A产物结构正确,为松萝酸,纯度为99%。
实施例2
1)称取粉碎后的目数为60目的长松萝100g,加入800ml沸程为60-90℃的石油醚,回流提取4h,抽滤。重复以上回流提取步骤3次。合并滤液,45℃真空(真空度为0.01MPa)浓缩至15ml,室温下静置过夜,得到松萝酸粗提物。
2)以体积比为8∶7∶5∶0.8的由正己烷、乙腈、乙酸乙酯和水组成的混合液作为两相溶剂体系,采用高速逆流色谱仪,将步骤1)得到的松萝酸粗提物溶于该两相溶剂体系中进行分离纯化。具体步骤如下:将该两相溶剂体系充分混合后,静置分相,两相依次在100KHz超声波条件下脱气30min。取上相为固定相,下相为流动相。将固定相以6ml/min的流速泵入分离柱总体积为325ml的高速逆流色谱分离柱中,启动高速逆流色谱主机,调节分离柱转速为800rpm,将流动相以2ml/min的流速由首端向尾端泵入。分离柱温度调至30℃。将50mg松萝酸粗提物溶于5ml上相和5ml下相组成的溶剂中得到该松萝酸粗提物的溶液。待高速逆流色谱分离柱达到平衡,将该松萝酸粗提物的溶液注入进样环中,检测波长为254nm。使用分步收集器收集流出组分。根据色谱工作站谱图收集含有松萝酸的目标组分。将含有该目标组分的收集液合并,氮气吹干,得到产物22.8mg,得率为45.4%。
按照与实施例1完全相同的检测条件对峰A产物进行HPLC检测,所得检测结果与实施例1相同。该产物的核磁检测结果亦与实施例1相同。由上述核磁共振及HPLC检测结果可知,该HSCCC谱图中峰A产物结构正确,为松萝酸,纯度为99%。
实施例3
按照与实施例2完全相同的步骤制备松萝酸,仅将步骤1)中的长松萝的目数改为80目,提取溶剂为***,用量1000mL/次,回流提取3小时,提取2次,35℃真空浓缩滤液至10ml;步骤2)中松萝酸粗提物量改为10mg,流动相流速改为4ml/min,分离柱温度20℃,分离柱转速改为500rpm。
按照与实施例1完全相同的检测条件对峰A产物进行HPLC检测,所得检测结果与实施例1相同。该产物的核磁检测结果亦与实施例1相同。由上述核磁共振及HPLC检测结果可知,该HSCCC谱图中峰A产物结构正确,为松萝酸,纯度为99.5%,得率为40.08%。
实施例4
按照与实施例1完全相同的步骤制备松萝酸,仅将步骤1)中的提取溶剂改为乙酸乙酯,用量400mL/次,回流6小时,提取4次,50℃真空浓缩滤液至30ml;步骤中2)中两相溶剂体系改为体积比为8∶7∶5∶0.8的由正己烷、甲醇、乙酸乙酯和水组成的混合液,松萝酸粗提物量改为300mg,分离柱转速改为1000rpm。
按照与实施例1完全相同的检测条件对峰A产物进行HPLC检测,所得检测结果与实施例1相同。该产物的核磁检测结果亦与实施例1相同。由上述核磁共振及HPLC检测结果可知,该HSCCC谱图中峰A产物结构正确,为松萝酸,纯度为99%,得率为43.6%。
实施例5
按照与实施例1完全相同的步骤制备松萝酸,仅将步骤2)中两相溶剂体系改为体积比为8∶7∶5∶0.8的由正己烷、乙醇、乙酸乙酯和水组成的混合液,流动相流速改为0.5ml/min。
按照与实施例1完全相同的检测条件对峰A产物进行HPLC检测,所得检测结果与实施例1相同。该产物的核磁检测结果亦与实施例1相同。由上述核磁共振及HPLC检测结果可知,该HSCCC谱图中峰A产物结构正确,为松萝酸,纯度为99%,得率为41%。
Claims (1)
1.一种制备松萝酸的方法,步骤如下:
1)称取粉碎后的目数为80目的长松萝100g,加入***,回流提取3h,抽滤;提取2次,***用量为1000mL/次,合并滤液,35℃真空浓缩所述滤液至10ml,室温下静置过夜,得到松萝酸粗提物;
2)以体积比为8∶7∶5∶0.8的由正己烷、乙腈、乙酸乙酯和水组成的混合液作为两相溶剂体系,采用高速逆流色谱仪,将步骤1)得到的松萝酸粗提物溶于该两相溶剂体系中进行分离纯化,步骤为:将该两相溶剂体系充分混合后,静置分相,两相依次在100KHz超声波条件下脱气30min;取上相为固定相,下相为流动相;将所述固定相以6ml/min的流速泵入分离柱总体积为325ml的高速逆流色谱分离柱中,启动高速逆流色谱主机,调节分离柱转速为500rpm,将所述流动相以4ml/min的流速由首端向尾端泵入;分离柱温度调至20℃;将10mg所述松萝酸粗提物溶于5ml所述上相和5ml所述下相组成的溶剂中得到该松萝酸粗提物的溶液;待高速逆流色谱分离柱达到平衡,将该松萝酸粗提物的溶液注入进样环中,检测波长为254nm,使用分步收集器收集流出组分,根据色谱工作站谱图收集含有松萝酸的目标组分,将含有该目标组分的收集液合并,氮气吹干,得到松萝酸;所述松萝酸纯度为99.5%。
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迟春艳.高速逆流色谱分离制备无花果叶和长松萝中主要活性成分的研究.《中国农业科学院学位论文》.2008,第26页第3.2.2节-第34页最后1段. * |
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