CN101848923A - 通过双链rna特异性抑制基因表达的方法和组合物 - Google Patents

通过双链rna特异性抑制基因表达的方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及选择性降低细胞中希望的靶基因的基因产物表达以及治疗由所述基因表达引起的疾病的组合物和方法。本发明更特别涉及含有双链RNA(dsRNA)的组合物，以及其制备方法，所述组合物能降低真核细胞中靶基因的表达。所述dsRNA具有长度为大25至大约30个核苷酸的第一个寡核苷酸序列，以及与第一个序列在生物学条件下退火的第二个寡核苷酸序列。此外dsRNA序列之一的长度为至少19个核苷酸的序列的区域与靶基因产生的RNA的核苷酸序列充分互补，以通过RNAi机制触发靶RNA的破坏。

Description

通过双链RNA特异性抑制基因表达的方法和组合物
联邦资助研发声明
本发明部分利用国立卫生研究院的资金号AI29329和HL074704的政府资助完成。政府可在此发明中有一定权利。
发明领域
本发明中的公开出版物和其他材料用于说明本发明的背景，具体是提供关于实施的另外的细节，其均包含在本发明中作为参考，并且为了方便而将作者和日期在下文中按照作者姓名的字母排序列出。
本发明涉及通过双链核糖核酸(dsRNA)效应分子而基因特异性抑制基因表达的组合物和方法。所述组合物和方法可用于在多种应用中调节基因表达，包括治疗、诊断、靶标确认和基因组发现。
发明背景
双链RNA(dsRNA)对基因表达的抑制已经在多个***中证实，包括在植物(转录后基因抑制)(Napoli et ah，1990)、真菌(抑制(quelling))(Romanoand Marcino，1992)和线虫(RNA干扰)(Fire et al.，1998)中。双链RNA(dsRNA)显然比单链RNA(ssRNA)更稳定。这种差异在细胞内环境中很明显(Raemdonck et al.，2006)。然而，未修饰的siRNA在血清中迅速降解，血清是核酸酶相当丰富的环境。化学修饰在体外和体内可显著稳定siRNA及改善效力。在过去的20年已经从事了大量医药化学应用研究，其中合成的核酸用于实验性或治疗性体内应用，如在反义和核酶领域，并且已经检测了几百种化合物以探究改善核酸酶稳定性、增加结合亲和性以及有时也改善合成的核酸的药效学性质的修饰(Matteucci，1997；Manoharan，2002；Kurreck，2003)。已经检测了许多这些修饰，且发现可作为修饰剂用于传统的21mersiRNA中。一些综述提供了近来使用21mer siRNA和化学修饰的经验总结(Zhang et al.，2006；Nawrot and Sipa，2006；Rana，2007)。对于用于较长的RNA如Dicer-底物siRNA(DsiRNA)中，还未检测或者优化修饰模式。
使用长dsRNA在哺乳动物***中抑制基因表达的早期尝试的失败是由于在低等生物体中不存在的干扰素途径的激活所致。干扰素应答由dsRNA触发(Stark et al.，1998)。特别地，蛋白质激酶PKR由长度超过30bp的dsRNA激活(Manche et al.，1992)，并且导致翻译起始因子eIF2α磷酸化，使得蛋白质合成和2’5’-寡腺苷酸合成酶(2’-5’-OAS)活化受阻，导致RNA降解(Minkset al.，1979)。
在果蝇细胞和细胞提取物中，发现长度为150bp或更长的dsRNA诱导RNA干扰，而较短的dsRNA无效(Tuschl et al.，1999)。然而，长双链RNA不是活性效应分子；长dsRNA被称作Dicer(Bernstein et al.，2001)的RNase III型酶降解为非常短的21-23bp具有2个碱基的3’突出端的双链体(Zamore etal.，2000)。这些称作siRNA的短RNA双链体指导体内RNAi应答，而且这种设计的短的化学合成的siRNA双链体转染使得可以使用RNAi方法抑制哺乳动物细胞中基因表达，而不触发不希望的干扰素应答(Elbashir et al.，2001a)。siRNA双链体的反义链作为序列特异性向导，指导RNA诱导的沉默复合物(RISC)降解靶mRNA中的核糖核酸内切酶功能活性(Martinez et al.，2002)。
在RNAi在体外果蝇胚胎提取物中的大小限制的研究中，使用长度为36、30和29bp的外源提供的双链RNA和双链体，针对RNA干扰的活化确定了大约38bp双链RNA的下限(Elbashir et al.，2001b)。较短的30个碱基的RNA不被裂解为有活性的21-23个碱基的siRNA，并因此认为在用于RNAi中是无活性的(Elbashir et al.，2001b)。在果蝇胚胎提取物***中继续研究，同一研究小组随后仔细确定了较短的化学合成的RNA双链体作为siRNA在RNAi途径中起作用所需的结构特征。长度为21bp的具有2个碱基的3’突出端的RNA双链体最有效，长度为20、22和23bp的双链体的效力略微降低，但是不导致RNAi介导的mRNA降解，长度为24和25bp的双链体无活性(Elbashir et al.，2001c)。
这些先前研究的一些结论可能特异于所应用的果蝇***。其它研究人员确定较长的siRNA可以在人体细胞中起作用。然而，21-23bp范围的双链体已经示出更具活性且成为公认的设计(Caplen et al.，2001)。确定模拟得自较长双链体RNA的Dicer降解的天然产物的化学合成的双链体RNA是用于RNAi中的优选化合物。从相反方向解决这个问题，研究人员在秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)中研究RNAi的大小限制，发现尽管经显微注射的26bp RNA双链体可以发挥抑制基因表达的作用，但是与81bp双链体相比需要浓度增加250倍(Parrish et al.，2000)。
尽管最近对RNAi的研究的关注，但是这个领域仍处于早期发展阶段。不是所有的siRNA分子均能靶向破坏细胞中的其互补RNA。结果，已经开发了复杂规则用于设计有效的RNAi分子。本领域技术人员期望检测多个siRNA分子以发现功能性组合物(Ji et al.，2003)。一些技术人员将一些siRNA制备物集合在一起以在一项研究中增加获得沉默的机会(Ji et al.，2003)。尽管事实是siRNA分子可以在1nM或更低的浓度起作用(Holen et al.，2002)，但是这种集合典型含有20nM或更多的siRNA寡核苷酸双链体混合物(Ji etal.，2003)。这种技术可导致siRNA序列与其它细胞RNA相互作用(“脱靶效应(off target effects)”)产生的假象(Scherer et al.，2003)。当RNAi寡核苷酸与非目标靶具有同源性时或者当RISC复合物掺入RNAi双链体的非目标链时可以发生脱靶效应(Scherer et al.，2003)。通常地，当使用更高浓度RNAi双链体时，这些效应更显著(Scherer et al.，2003)。
此外，有效的RNAi治疗作用的持续时间限于大约4天(Holen et al.，2002)。因此，研究人员必须在用siRNA双链体转染2-3天内进行siRNA实验或者使用质粒或病毒表达载体工作以获得更长期的沉默。
抑制siRNA作用的一个主要因素是siRNA由核酸酶降解。3’-核酸外切酶是血清中存在的主要核酸酶活性，在反义DNA寡核苷酸的3’末端进行修饰对于防止降解是关键的(Eder et al.，1991)。已经鉴别了一种RNase-T家族核酸酶，称作ERI-I，其具有3’→5’核酸外切酶活性，参与siRNA的调节和降解(Kennedy et al.，2004；Hong et al.，2005)。这个基因在小鼠中也被称作Thex1(NM_02067)，或者在人体中被称作THEX1(NM_153332)，且其参与组蛋白mRNA降解；其也介导siRNA中3’-突出端降解，但是不降解双链RNA(Yang et al.，2006)。因此，有理由期望siRNA的3’-末端稳定化将改善稳定性。
XRN1(NM_019001)是5’→3’核酸外切酶，位于细胞质加工小体中且参与miRNA靶向的mRNA降解(Rehwinkel et al.，2005)，且也负责由siRNA指导的内部裂解起始的完全降解。XRN2(NM 012255)是一种独特的5’→3’核酸外切酶，参与核RNA加工。尽管非普遍地参与siRNA和miRNA的降解或加工，但已知这二者均是能降解RNA的核酸酶，且也认为是重要的核酸酶。
RNase A在哺乳动物中是降解RNA的主要核酸内切酶。其特异于ssRNA且在嘧啶碱基的3’-末端进行裂解。与RNase A裂解一致的siRNA降解产物可以在血清中保温后通过质谱分析检测(Tumer et al.，2007)。3’-突出端增强siRNA对于RNase降解的易感性。血清中RNase A的损耗降低siRNA降解；这个降解示出一些序列优选性，且对于末端具有poly A/U序列的序列更不利(Haupenthal et al.，2006)。这提示双链体低稳定性区域可“breathe”且为RNase A降解提供可用的瞬时单链种类(species)的可能性。可以将RNase A抑制剂加入血清中，改善siRNA寿命和效力(Haupenthal etal.，2007)。
在21mer中，硫代磷酸酯或者boranophosphate修饰直接稳定核苷间磷酸酯连键。Boranophosphate修饰的RNA是核酸酶高抗性的强沉默剂，且是相对无毒性的。Boranophosphate修饰的RNA不能通过使用标准化学合成方法产生，而是通过在体外转录(IVT)产生(Hall et al.，2004 and Hall et al.，2006)。硫代磷酸酯(PS)修饰可易于置于RNA双链体中任何希望的位置，且可以使用标准化学合成方法产生。PS修饰示出剂量依赖性毒性，因此大多数研究人员建议限制性掺入siRNA中，有利地在抗核酸酶保护作用是最重要的3’末端掺入(Harborth et al.，2003；Chiu and Rana，2003；Braasch et al.，2003；Amarzguioui et al.，2003)。更广泛的PS修饰可以与强RNAi活性相容；然而优选使用糖修饰(如T-O-甲基RNA)(Choung et al.，2006)。
可以在核糖的2’-位置进行各种取代，其通常增加双链体稳定性(Tm)且可以明显改善核酸酶抗性。2’-O-甲基RNA是在哺乳动物核糖体RNA和转移RNA中发现的天然发生的修饰。已知siRNA中的2’-O-甲基修饰，但是双链体内修饰的碱基的精确位置对于保留效力是重要的，且2’-O-甲基RNA完全取代RNA将使siRNA失活。例如，采用交替2’-O-甲基碱基的模式可具有与未修饰的RNA等价的效力且在血清中非常稳定(Choung et al.，2006；Czaudema et al.，2003)。
2’-氟代(2’-F)修饰也与siRNA功能相容，其最常置于嘧啶位置(由于试剂成本和可用性所致)，且可以组合在嘌呤位置的2’-O-甲基修饰；可以获得且也可以使用2’-F嘌呤。这种重度修饰的双链体可以在体外强力触发RNAi(Allerson et al.，2005；Prakash et al.，2005；Kraynack and Baker，2006)，且可以改善性能以及当在体内使用时延长作用时间(Morrissey et al.，2005a；Morrissey et al.，2005b)。Allerson教导了高效的核酸酶稳定的含有交替2’-F和2’-O-Me碱基的平端19mer双链体。在这种设计中，交替的2’-O-Me残基以与Czauderna所用相同模式放置，然而剩余的RNA残基转变为2’-F修饰的碱基。Morrissey采用的高效核酸酶抗性siRNA采用体内高效核酸酶抗性siRNA。除了2’-O-Me RNA和2’-F RNA之外，这个双链体还包含DNA、RNA、反向无碱基残基(abasic residues)以及3’-末端PS核苷酸间连键。虽然广泛的修饰具有一定益处，但是所述双链体更有限的修饰也可以改善在体内的效力，且简便以及生产成本较低。Soutschek et al.(2004)在采用体内双链体，主要是具有2个2’-O-Me RNA碱基以及有限的3’-末端PS核苷酸间连键的RNA。
锁核酸(LNA)是不同类别的2’-修饰，可用于稳定siRNA。LNA的保留效力的掺入模式比2’-O-甲基或2’-F碱基更受限，因此优选有限的修饰(Braasch et al.，2003；Grunweller et al.，2003；Elmen et al.，2005)。即使具有有限的修饰，但是LNA修饰的使用可改善在体内的siRNA效力，且也可以改变或改善脱靶效应模式(Mook et al.，2007)。
导入细胞或者活的生物体中的合成核酸可以被识别为“外来的”且触发免疫应答。免疫刺激是脱靶效应的一个主要类别，其可以显著改变实验结果，甚至导致细胞死亡。先天免疫***包括受体分子的集合，所述受体分子与介导这些应答的DNA和RNA特异性相互作用，其中一些位于细胞质中，一些位于内涵体中(Marques and Williams，2005；Schlee et al.，2006)。通过阳离子脂质或脂质体输送siRNA将所述siRNA暴露于细胞质和内涵体间隔，使得在体外和体内触发I型干扰素(IFN)应答的风险最大化(Morrisseyet al.，2005b；Sioud and Sorensen，2003；Sioud，2005；Ma et al.，2005)。在细胞内转录的RNA的免疫原性较低(Robbins et al.，2006)，当使用基于脂质的方法输送的免疫原性合成RNA通过机械方式导入细胞中时可逃避免疫刺激，甚至在体内也如此(Heidel et al.，2004)。然而，基于脂质的输送方法是便利的、有效的且广泛使用的。在存在所有细胞类型且产生免疫应答的风险最大的情况中，需要一些防止免疫应答的一般策略，尤其是在体内应用时。化学修饰的RNA的使用可解决大多数或者甚至所有这些问题。
尽管某些序列基序显然比其他序列更具免疫原性，但是看起来先天免疫***的受体通常可识别在哺乳动物RNA中比在原核细胞RNA中更常见的某些碱基修饰的存在与否。例如，假尿苷、N6-甲基-A和2’-O-甲基修饰的碱基被识别为“自身碱基”，且合成的RNA中包含这些残基可帮助逃避免疫检测(Kariko et al.，2005)。对作为未修饰的RNA具有强免疫刺激性的序列进行的广泛2’-修饰当静脉内给予小鼠时可阻断免疫应答(Morrissey et al.，2005b)。然而，广泛的修饰不是逃避免疫检测所必须的，在siRNA双链体的一个链的少如2个2’-O-甲基碱基的取代可足以在体外和体内阻断I型IFN应答；修饰的U和G碱基是最有效的(Judge et al.，2006)。额外的益处是，选择性掺入2’-O-甲基碱基可降低脱靶效应的量级(Jackson et al.，2006)。因此认为对于预期在体内应用的所有siRNA而言，使用2’-O-甲基碱基可以阻断免疫应答，且具有改善核酸酶稳定性以及降低脱靶效应可能性的额外益处。
尽管细胞死亡可产生自免疫刺激，但是评估细胞存活力不是监测IFN应答的诱导的适当方法。IFN应答可以存在而无细胞死亡，且细胞死亡可以在不存在IFN触发的条件下产生自靶击倒(target knockdown)(例如如果靶基因是细胞存活所必需的)。相关的细胞因子可以在培养基中直接测量，有许多商业试剂盒可常规进行这种测定。虽然可测量大量不同的免疫效应分子，但是在转染后4小时和24小时检测IFN-α、TNF-α和IL-6的水平通常足以进行筛选。重要的是包含“转染试剂对照”，因为阳离子脂质可以在某些细胞中在无任何核酸的条件下触发免疫应答。IFN途径诱导包含的对照物应被认为是针对所有细胞培养。每当在体内给予核酸时，在触发IFN应答的风险最高的情况中，必须检测免疫刺激。
因此需要提供增强dsRNA、特别是DsiRNA的效力的化学修饰模式。所述修饰：1)应不降低效力；2)应不干扰Dicer加工；3)应改善在生物学液体中的稳定性(降低核酸酶敏感性)；4)应阻碍或逃避先天免疫***检测；5)应是无毒性的；6)应不增加成本或者不影响生产便利性。
本发明提供了可用于RNAi中的组合物以抑制基因表达，本发明也提供了这种组合物的使用方法。此外，本发明提供了设计为最大潜力地增强加工、改善稳定性同时规避免疫***且无毒性的RNAi组合物和方法。此外，本发明的各个实施方案适于高产量、小规模合成以符合研究需要，以及大规模生产用以治疗性应用。本发明的这些及其它优势以及额外的发明特征从本文提供的发明描述将显而易见。
发明简述
本发明涉及含有双链RNA(dsRNA)的组合物及制备其的方法，其、所述组合物能降低真核细胞中靶基因的表达。本发明更特别涉及功能改善的具有修饰的Dicer底物RNA。
因此，第一方面，本发明提供了RNA干扰(RNAi)的新组合物。所述组合物包含前体分子dsRNA，即本发明的dsRNA在体内被加工产生活性siRNA。所述dsRNA被Dicer加工为活性siRNA，其被掺入RISC复合物中进行靶基因的RNA干扰。所述前体分子在本文也被称作前体RNAi分子。
在一个实施方案中，所述dsRNA，即所述前体RNAi分子，具有足以被Dicer加工产生siRNA的长度。根据这个实施方案，所述dsRNA包含长度为26至大约30个核苷酸的第一个寡核苷酸链(也称作有义链)，以及包含在生物学条件下与第一个序列退火的第二个寡核苷酸序列(也称作反义链)，所述条件如在细胞质中的条件。此外，所述dsRNA的序列之一、特别是反义链的一个区域具有至少19个核苷酸的序列长度，例如大约19至大约23个核苷酸，如21个核苷酸，这些核苷酸足以与从靶基因中产生的RNA的核苷酸序列充分互补以触发RNAi应答。
在第二个实施方案中，所述dsRNA，即前体RNAi分子，具有增强其被Dicer加工的一些性质。根据这个实施方案，所述dsRNA具有被Dicer加工产生siRNA的足够长度，且具有至少一种如下性质：(i)所述dsRNA是不对称的，例如在反义链上具有3’突出端；(ii)所述dsRNA在其有义链上具有修饰的3’末端，以指导Dicer与dsRNA结合并将其加工为活性siRNA的方向。根据这个实施方案，所述有义链包含22-28个核苷酸，所述反义链包含24-30个核苷酸。在一个实施方案中，所述dsRNA在反义链的3’末端具有突出端。在另一个实施方案中，通过位于有义链3’末端的合适修饰剂针对Dicer结合和加工而修饰所述有义链。合适的修饰剂包含核苷酸如脱氧核糖核苷酸、无环核苷酸等，以及位阻分子如荧光分子等。当使用核苷酸修饰剂，其置换dsRNA中的核糖核苷酸，由此dsRNA的长度不改变。在另一个实施方案中，所述dsRNA在反义链的3’末端具有突出端，有义链针对Dicer加工被修饰。在另一个实施方案中，有义链的5’末端具有磷酸酯。在另一个实施方案中，反义链的5’末端具有磷酸酯。在另一个实施方案中，反义链或有义链或者这两个链具有一或多个2’-O-甲基修饰的核苷酸。在另一个实施方案中，反义链含有2’-O-甲基修饰的核苷酸。在另一个实施方案中，反义链含有由2’-O-甲基修饰的核苷酸组成的3’突出端。反义链也可包含额外的2’-O-甲基修饰的核苷酸。有义链和反义链在生物学条件下退火，所述条件如在细胞的细胞质中的条件。此外，dsRNA的序列之一、尤其是反义链的一个区域具有至少19个核苷酸的序列长度，其中这些核苷酸在与反义链的3’末端相邻的21个核苷酸区域中，且与从靶基因中产生的RNA的核苷酸序列充分互补。根据这个实施方案，所述dsRNA，即前体RNAi分子，也可以具有一或多种如下额外的性质：(a)所述反义链与典型21mer相比右移(即当与典型21mer对比时，所述反义链包含在分子右侧的核苷酸)；(b)所述链可以非完全互补，即所述链可含有简单的错配碱基对；(c)在有义链的5’末端可包含碱基修饰，如锁核酸。
在第三个实施方案中，有义链包含25-28个核苷酸，其中在有义链的3’末端上的2个核苷酸是脱氧核糖核苷酸。有义链在5’末端含有磷酸酯。反义链包含26-30个核苷酸，且含有1-4个核苷酸的3’突出端。包含3’突出端的核苷酸被用2’-O-甲基RNA修饰。反义链含有交替2’-O-甲基修饰的核苷酸，从反义链的与3’突出端相邻的第一个单体开始并从与3’突出端相邻的第一个单体延伸15-19个核苷酸。例如，对于27个核苷酸的反义链且将在反义链5’末端的第一个碱基计数为位置1的情况中，2’OMe修饰位于碱基9、11、13、15、17、19、21、23、25、26和27。在一个实施方案中，所述DsiRNA包含：
5’pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD
3’YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp
其中X＝RNA，p＝磷酸酯集团，X＝2’-O-甲基RNA，Y是由1-4个RNA单体(任选是2’-O-甲基RNA单体)组成的突出端结构域，D＝DNA。上一个链是有义链，下一个链是反义链。
在第四个实施方案中，所述dsRNA，即前体RNAi分子，具有增强其被Dicer加工的一些性质。根据这个实施方案，所述dsRNA具有足以被Dicer加工产生siRNA的长度，且具有至少一种如下性质：(i)所述dsRNA是不对称的，例如在有义链上具有3’突出端；(ii)所述dsRNA在反义链具有修饰的3’末端，以指导Dicer结合dsRNA并将其加工为活性siRNA的方向。根据这个实施方案，有义链包含24-30个核苷酸，反义链包含22-28个核苷酸。在一个实施方案中，所述dsRNA在有义链的3’末端具有突出端。在另一个实施方案中，反义链由位于反义链3’末端的合适修饰剂针对Dicer结合和加工而被修饰。合适的修饰剂包含核苷酸如脱氧核糖核苷酸、无环核苷酸等，以及位阻分子如荧光分子等。当使用核苷酸修饰剂时，其置换dsRNA中的核糖核苷酸，由此所述dsRNA的长度不变。在另一个实施方案中，所述dsRNA在有义链的3’末端上具有突出端，且反义链针对Dicer加工被修饰。在一个实施方案中，反义链具有5’磷酸酯。所述有义链和反义链在生物学条件下退火，所述条件如在细胞的细胞质中的条件。此外，dsRNA的序列之一、尤其是反义链的一个区域具有至少19个核苷酸的序列长度，其中这些核苷酸在与反义链的3’末端相邻的21个核苷酸区域中，且与从靶基因中产生的RNA的核苷酸序列充分互补。根据这个实施方案，所述dsRNA，即前体RNAi分子，也可以具有一或多种如下额外的性质：(a)所述反义链与典型21mer相比左移(即当与典型21mer对比时，所述反义链包含在分子左侧的核苷酸)；(b)所述链可以非完全互补，即所述链可含有简单的错配碱基对。
第二方面，本发明提供了产生具有增强的Dicer加工的dsRNA、即前体RNAi分子的方法。根据这个方法，针对指定的靶基因使用常规技术和算法选择长度为至少19个核苷酸的反义链siRNA。在一个实施方案中，反义siRNA被修饰为在5’末端包含5-11核糖核苷酸以获得24-30个核苷酸长度。当反义链长度为21个核苷酸时，则在5’末端加入3-9个核苷酸或者4-7个核苷酸或者6个核苷酸。尽管加入的核糖核苷酸可以与靶基因序列互补，但是不要求靶序列与反义siRNA之间的完全互补性。也就是说，所得反义siRNA与靶序列充分互补。然后产生具有22-28个核苷酸的有义链。所述有义链与反义链基本互补，以在生物学条件下与所述反义链退火。在一个实施方案中，有义链被合成为含有修饰的3’末端以指导反义链的Dicer加工。在另一个实施方案中，dsRNA的反义链具有3’突出端。在另一个实施方案中，有义链针对Dicer结合和加工而被合成为含有修饰的3’末端，且所述dsRNA的反义链具有3’突出端。
在这个方法的第二个实施方案中，反义siRNA被修饰为在5’末端包含1-9个核糖核苷酸以获得22-28个核苷酸长度。当反义链长度为21个核苷酸时，则在3’末端上加入1-7个核糖核苷酸或者2-5个核糖核苷酸或者4个核糖核苷酸。加入的核糖核苷酸可具有任何序列。尽管加入的核糖核苷酸可以与靶基因序列互补，但是不要求靶序列与反义siRNA之间的完全互补性。也就是说，所得反义siRNA与靶序列充分互补。然后产生具有24-30个核苷酸的有义链。有义链与反义链基本互补，以在生物学条件下与所述反义链退火。在一个实施方案中，反义链被合成为含有修饰的3’末端以指导Dicer加工。在另一个实施方案中，dsRNA的有义链具有3’突出端。在另一个实施方案中，反义链被合成为含有针对Dicer结合和加工的修饰的3’末端，且dsRNA的有义链具有3’突出端。
第三方面，本发明提供了含有本发明揭示的dsRNA组合物的药物组合物。
第四方面，本发明提供了选择性降低希望的靶基因的基因产物在细胞中表达的方法，以及治疗由于该基因的表达引起的疾病的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在细胞环境中导入一定量的本发明dsRNA，由此足够的dsRNA可进入细胞的细胞质中，导致靶基因表达降低。
所述组合物和方法具有未曾预料水平的RNAi效应。尽管本发明不受理论限制，但是认为这个效力水平和作用持续时间是由于dsRNA作为Dicer底物引起的，其看起来促进dsRNA的一个序列掺入直接负责来自靶基因的RNA的破坏的RISC复合物中。
附图简述
图1A-1F示出27mer dsRNA与21+2siRNA相比是更强力的RNAi效应物。在用固定量的EGFP表达质粒和不同浓度dsRNA共转染HEK293细胞之后确定EGFP表达水平。图1A-1C：使用(图1A)50nM、(图1B)200pM和(图1C)50pM指定dsRNA进行转染。图1D：较长的dsRNA的剂量应答检测。用指定浓度dsRNA进行转染。图1E：描述了在体外Dicer与同一较长RNA的反应。浓度和条件如实施例所述。图1F：转染进稳定表达EGFP的NIH3T3细胞中的dsRNA的剂量应答曲线。每个点均代表三个独立测量的平均值(±标准偏差)。
图2A-2E示出与RNAi活性相关的Dicer加工。图2A：重组Dicer对dsRNA的裂解。将每个RNA双链体在有或无重组人Dicer的条件下保温24小时，使用非变性PAGE分离并观测(见实施例)。图2B：用于这个检测中的RNA双链体。如图中圆形所示，在5’末端、3’末端或者这两端将寡核苷酸与6FAM缀合。上面和下面的线表示双链体构型中的有义链和反义链，有义链是5’-至3’方向(左至右)，反义链是3’-至5’方向(左至右)。图2C：6FAM末端修饰影响体外Dicer活性。将RNA双链体与0.5单位的重组人Dicer保温8小时，并将产物在7.5％非变性聚丙烯酰胺凝胶上分辨。通过溴化乙锭染色观测RNA。图2D：6FAM修饰影响RNAi活性。如述将200pM的RNA双链体与EGFP表达质粒共转染，并且在24小时测定EGFP荧光性。报道的EGFP表达数值代表两个独立实验的平均值。根据荧光素酶标准化荧光水平。图2E：27mer双链体RNA在体内被加工为21mer。从用10nM双链体3和双链体5转染的细胞中制备总RNA。将RNA与21mer32P寡核苷酸探针杂交。杂交的样品通过非变性PAGE分离，并且通过放射自显影术观测。大小标记是32P末端标记的21mer和27mer RNA双链体。
图3A-3B示出各种21+2siRNA的RNAi活性。图3A：在HEK293细胞中在与EGFP报道构建体的共转染测定中单独或者集合检测从切割(Dicing)27mer dsRNA中预测的7个可能的21+2siRNA。每个图描述的是一式两份实验的平均值。图3B：对于RNAi，体外切割的(Diced)27mer dsRNA与完整27mer dsRNA的对比。如图4A所示，各个RNA以指定浓度dsRNA共转染。对于切割的产物，将1μM 27mer dsRNA在无(柱3)或有(柱4)Dicer的反应缓冲液中在37℃保温12小时。将该混合物在水中稀释，并直接用于与EGFP报道基因共转染。为了控制稀释的混合物中剩余Dicer的可能的伪像，将柱4中的样品经苯酚提取及乙醇沉淀，之后用于转染(柱5)。
图4A和4B示出在与Dicer保温之前(图4A)和之后(图4B)，27mer双链体EGFPS1 27+0的ESI质谱。将双链体分离成单链，标示每条链测量的质量。在存在高盐条件下进行Dicer消化，一些“隐蔽(shadow)”的峰代表+1或+2Na种类。
图5A-5D示出RNAi中27mer dsRNA的特征。图5A：27mer dsRNA延长RNAi的持续时间。在5nM的21+2siRNA或27mer dsRNA转染进稳定表达EGFP的NIH3T3细胞中之后确定EGFP水平。对比21+2siRNA与27mer dsRNA介导的EGFP沉默。在指定日期取一式两份样品，通过荧光计确定EGFP表达。图5B：靶向耐(refractory to)21mer siRNA位点的27merdsRNA可激发RNAi。与EGFP报道构建体一起转染dsRNA，确定EGFP表达(方法)。柱1，模拟；柱2，靶向EGFPS2的21+2siRNA；柱3，靶向EGFPS2的27mer dsRNA；柱4，靶向EGFPS3的21+2siRNA；柱5，靶向EGFPS3的27mer dsRNA。图5C和5D：21mer siRNA和27mer dsRNA负调节内源转录物对比。设计21+2 siRNA和27+0 dsRNA的RNA以靶向hnRNP H mRNA(图5C)或La mRNA(图5D)中的位点。通过western印迹测定HnRNP H降低(knockdown)，通过northern印迹分析测定La降低。使用指定浓度的dsRNA。β-肌动蛋白在这两个实验中用作内部特异性和上样标准。
图6示出Dicer底物27mer dsRNA的序列特异性。将指定浓度的各种27mer dsRNA与EGFP表达载体共转染进HEK93细胞中，并针对EGFP荧光进行测定。
图7A-7D示出siRNA和Dicer底物dsRNA不诱导干扰素或激活PKR或者产生特异性“脱靶效应”。图7A和7B：干扰素α(图7A)和干扰素β(图7B)测定：柱1，用于IFN诱导的阳性对照(Kim et al.，2004)；柱2，无RNA；柱3，化学合成的21+2siRNA；柱4，化学合成的27+0dsRNA。图7C：PKR活化测定。先前已经描述了用于PKR活化(Kim et al.，2004)和体外PKR活化测定(Manche et al，1992)的lond dsRNA。如述转染RNA。图7D：微阵列分析概述。
图8A-8B示出在与Dicer保温之前(图8A)和之后(图8B)，27mer双链体EGFPS1 27+0 L的ESI质谱。双链体分离为单链，标示每条链的测量的质量。
图8C-8D示出在与Dicer保温之前(图8CA)和之后(图8D)，27mer双链体EGFPS127/25 L的ESI质谱。双链体分离为单链，标示每条链的测量的质量。
图9A-9B示出在与Dicer保温之前(图9A)和之后(图9B)，27mer双链体EGFPS1 27+0 R的ESI质谱。双链体分离为单链，标示每条链的测量的质量。
图9C-9D示出在与Dicer保温之前(图9C)和之后(图9B)，27mer双链体EGFPS1 25/27 R的ESI质谱。双链体分离为单链，标示每条链的测量的质量。
图10A-10B示出了设计为增强Dicer加工能力的双链体是RNAi的强力效应物。在用固定量EGFP表达质粒和不同浓度dsRNA共转染HEK293细胞之后确定EGFP表达水平。图10A：对比双链体EGFPS2-21+2、EGFPS2-27+0、EGFPS2-27/25L和EGFPS2-25/27 R的效力。图10B：对比双链体EGFPS 1-27/25 L与EGFPS 1-25/27 R的效力。
图11是示出关于靶序列以及靶序列与每个实施方案之间关系的本发明两个实施方案的示意图。
图12示出掺入21mer双链体中的各种修饰对该双链体作为RNAi触发剂的效力的作用。该图列出了在以1nM浓度转染进HeLa细胞中后24小时，通过qRT-PCR评估的相对于未修饰的对照双链体的％mRNA水平。
图13示出25/27mer dsRNA底物内精确裂解位点，其中预期发生Dicer加工。该图示出在预期的裂解位点右侧的修饰在裂解后的终产物中不存在。
图14示出在25/27mer DsiRNA双链体中掺入各种修饰对该双链体作为RNAi触发剂的效力的作用。图中列出了在以1nM浓度转染进HeLa细胞中后24小时，通过qRT-PCR评估的相对于仅在有义链的3’末端上用2个DNA碱基修饰的对照双链体的％mRNA水平。
图15证实一些修饰模式对于DsiRNA靶向EGFP基因序列的相对效力。结果表明所有单链修饰的变体在降低EGFP表达中均同样起作用。
图16示出一些DsiRNA修饰针对人HPRT基因的相对效力。检测了三个剂量(10nM、1nM和0.1nM)。该图证实不仅修饰的DsiRNA与未修饰的DsiRNA同样或者近于同样起作用，而且25/27mer也可以需Dicer裂解而潜在地加于RISC中无。
图17A示出在用未修饰的及ASm修饰的DsiRNA转染之前与之后，T98G细胞中各种免疫途径基因的表达水平的相对改变。2’-O-甲基修饰的DsiRNA导致基因表达水平最小变化，而未修饰的DsiRNA导致某些基因表达增加200倍。在转染后24小时，通过qRT-PCR测定相对mRNA水平。图17B和17C提供了对照基因测定结果的详细描述。在17B中，未修饰的HPRT-特异性DsiRNA导致HPRT mRNA水平降低，以及对照的非靶向管家基因RPLPO的mRNA水平降低，这是I型IFN应答的特征。在图17C中，ASm修饰的HPRT-特异性DsiRNA导致HPRT mRNA水平降低，而对照RPLPO基因的表达无变化。
图18证实当将25/27mer DsiRNA导入组织培养的T98G细胞中时，分泌的细胞因子水平的变化。测定上清中各种细胞因子的水平，所述上清得自在实施例20及图17针对基因表达水平报道的***细胞培养物。未修饰的HPRT DsiRNA的转染导致IL-8和IL-6细胞因子水平明显增加，表明免疫信号途径的强刺激。以ASm模式用2’-O-甲基RNA修饰的同一序列的转染未示出任何细胞因子的显著增加。
图19证实修饰的27mer DsiRNA设计与未修饰DsiRNA和21mer siRNA的双链体相比的改善的稳定性。将RNA双链体在50％胎牛血清中在37℃保温指定时间长度，提取，并在聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离。未修饰的27merDsiRNA双链体与未修饰的21mer双链体相比示出改善的稳定性，最佳稳定性见于2’-O-甲基ASm+5’P修饰模式。
发明详述
本发明涉及含有双链RNA(dsRNA)的组合物以及其制备方法，所述组合物能降低真核细胞中靶基因表达。所述dsRNA的一个链含有长度为大约19至大约30个核苷酸的一个核苷酸序列区域，其可以指导从靶基因中转录的RNA的破坏。
第一方面，本发明提供了RNA干扰(RNAi)的新组合物。所述组合物包含是前体分子的dsRNA，即本发明的dsRNA在体内被加工产生活性siRNA。所述dsRNA被Dicer加工为掺入RISC复合物中的siRNA。所述前体分子在本文也被称作前体RNAi分子。如本文所用，术语活性siRNA是指双链核酸，其中每个链均包含RNA、RNA类似物或者RNA与DNA。所述siRNA包含19-23个核苷酸或者包含21个核苷酸。所述活性siRNA在每个链的3’末端具有2bp突出端，由此siRNA中的双链体区域包含17-21个核苷酸，或者19个核苷酸。典型地，siRNA的反义链与靶基因的靶序列充分互补。
短语“双链体区域”是指两个互补或者基本互补的寡核苷酸中彼此形成碱基对的区域，通过Watson-Crick碱基配对或者任何其它方式配对以使得互补或者基本互补的寡核苷酸链之间形成双链体。例如，具有21个核苷酸单位的寡核苷酸链可以与另一个具有21个核苷酸单位的寡核苷酸碱基配对，每个链上仅19个碱基互补或基本互补，由此“双链体区域”由19个碱基对组成。剩余的碱基可例如存在于5’和3’突出端。再者，在双链体区域内，不要求100％互补性；双链体区域内允许基本互补性。基本互补性是指链之间的互补性，由此其在生物学条件下能退火。根据经验确定两个链是否能在生物学条件下退火的技术为本领域熟知。或者，可以合成两个链并且在生物学条件下加在一起，以确定其是否彼此退火。
如本文所用，具有与靶mRNA序列“充分互补”的序列的siRNA是指所述siRNA具有足以触发通过RNAi机构(例如RISC复合物)或过程破坏靶mRNA的序列。可以设计siRNA分子，由此反义链的每一残基均与靶分子中的残基互补。或者，可以在分子内产生取代，以增加所述分子的稳定性和/或增强加工活性。取代可以在链内产生或者可以对在链末端的残基进行取代。
在本发明第一方面的一个实施方案中，dsRNA，即所述前体RNAi分子，具有足够长度由此被Dicer加工产生siRNA。根据这个实施方案，合适的dsRNA含有一个寡核苷酸序列，即第一个序列，其长度为至少25个核苷酸且不长于大约30个核苷酸。这个RNA序列的长度可以是大约26至29个核苷酸。这个序列的长度可以是大约27或者28个核苷酸，或者27个核苷酸。dsRNA的第二个序列可以是与第一个序列在生物学条件下退火的任何序列，所述条件如在真核细胞的细胞质中的条件。通常地，所述第二个序列具有至少19个与第一个寡核苷酸序列互补的碱基对，更典型地所述第二个寡核苷酸序列具有大约21或更多个与第一个寡核苷酸序列互补的碱基对，或者大约25或更多个与第一个寡核苷酸序列互补的碱基对。在一个实施方案中，所述第二个序列与第一个序列长度相同，且所述dsRNA是平端的。在另一个实施方案中，所述dsRNA的末端具有突出端。
在这第一个实施方案的某些方面中，所述dsRNA的第一个和第二个寡核苷酸序列存在于单独的寡核苷酸链上，其可以且典型是化学合成的。在一些实施方案中，这两个链的长度均为26-30个核苷酸。在其它实施方案中，这两个链的长度均为25-30个核苷酸。在一个实施方案中，这两个链的长度均为27个核苷酸，且是完全互补的以及具有平端。所述dsRNA可以来自一个RNA寡核苷酸，经历分子内退火，或者更典型地，所述第一个和第二个序列存在于单独的RNA寡核苷酸上。在一个实施方案中，一或这两个寡核苷酸链均能作为Dicer的底物。在其它实施方案中，存在至少一个修饰，以促进Dicer以使得双链RNA结构在抑制基因表达中的效力最大化的方向结合双链RNA结构。所述dsRNA可含有一或多个脱氧核糖核苷酸(DNA)碱基取代。
含有两个单独的寡核苷酸的合适dsRNA组合物可以通过化学连接基团在其退火区外部化学连接。本领域已知且可以使用许多合适的化学连接基团。合适的基团不阻断Dicer对于dsRNA的活性，且不干扰从靶基因中转录的RNA的定向破坏。或者，两个单独的寡核苷酸可以通过第三个寡核苷酸连接，由此在构成dsRNA组合物的这两个寡核苷酸退火时产生发夹结构。所述发夹结构不阻断Dicer对于dsRNA的活性，且不干扰从靶基因中转录的RNA的定向破坏。
所述第一个和第二个寡核苷酸不需要完全互补。事实上，在一个实施方案中，有义链的3’末端含有一或多个错配。一方面，在有义链的3’末端掺入大约两个错配。在另一个实施方案中，本发明的dsRNA是含有两个RNA寡核苷酸的双链RNA分子，每个链的长度均为27个核苷酸，且当彼此退火时在有义链的3’末端(反义链的5’末端)具有平端以及具有两个核苷酸错配。已经提议使用错配或者降低的热力学稳定性(特别在有义链3’末端/反义链5’末端位置)促进或者便于反义链进入RISC中(Schwarz et al.，2003；Khvorova et al.，2003)，推测是通过影响在siRNA进入RISC中时发生的一些限速解旋步骤所致。因此，末端碱基成分包含在选择活性21mer siRNA双链体的设计规则中(Ui-Tei et al.，2004；Reynolds et al.，2004)。随着这个实施方案中Dicer对dsRNA的裂解，含有错配的小末端终末序列与反义链不成对(成为3’突出端的一部分)，或者完全裂解除去最终的21-mer siRNA。因此，这些“错配”在RISC的最终RNA成分中不再是错配。令人惊奇地发现在Dicer底物有义链的3’末端的一段序列的碱基错配或不稳定改善合成的双链体在RNAi中的效力，推测是由于促进Dicer加工所致。
根据经验发现这些长度为25至大约30个核苷酸的dsRNA在作用效力和作用时间方面提供未曾预料的有效结果。不受理论的限制，认为较长的dsRNA在细胞的细胞质中作为Dicer酶的底物。除了将本发明的dsRNA裂解为较短的节段之外，还认为Dicer促进衍生自裂解的dsRNA的单链裂解产物掺入RISC复合物中，引起衍生自靶基因的细胞质RNA的破坏。本文描述的研究示出Dicer对dsRNA的可裂解性与所述dsRNA的作用效力增强和作用时间延长一致。
在本发明第一方面的第二个实施方案中，所述dsRNA，即前体RNAi分子，具有增强其被Dicer加工的一些性质。根据这个实施方案，所述dsRNA具有足够长度，由此被Dicer加工产生活性siRNA，且具有至少一种如下性质：(i)所述dsRNA是不对称的，例如反义链具有3’突出端；(ii)所述dsRNA在有义链上具有修饰的3’末端，以指导Dicer结合dsRNA并将其加工为活性siRNA的方向。根据这个实施方案，所述dsRNA中最长链包含24-30个核苷酸。在一个实施方案中，所述dsRNA是不对称的，由此有义链包含22-28个核苷酸，反义链包含24-30个核苷酸。因此，所得dsRNA在反义链的3’末端具有突出端。所述突出端的长度为1-3个核苷酸，例如2个核苷酸。所述有义链也可具有5’磷酸酯。
在另一个实施方案中，所述有义链针对Dicer加工由位于有义链3’末端的合适修饰剂修饰，即所述dsRNA被设计为指导Dicer结合和加工的方向。合适的修饰剂包括核苷酸如脱氧核糖核苷酸、二脱氧核糖核苷酸、无环核苷酸等，以及位阻分子如荧光分子等。无环核苷酸是2-羟基乙氧基甲基基团取代dNMP中正常存在的2’-脱氧呋喃核糖基糖(deoxyribofuranosylsugar)。其它核苷酸修饰剂可包括3’-脱氧腺苷(虫草菌素)、3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷(AZT)、2’，3’-二脱氧肌苷(ddI)、2’，3’-二脱氧-3’-硫代胞苷(3TC)、2’，3’-二脱氢-2’，3’-二脱氧胸苷(d4T)以及3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷(AZT)、2’，3’-二脱氧-3’-硫代胞苷(3TC)和2’，3’-二脱氢-2’，3’-二脱氧胸苷(d4T)的一磷酸核苷酸。在一个实施方案中，脱氧核苷酸用作修饰剂。当利用核苷酸修饰剂时，有义链3’末端上的核糖核苷酸由1-3个核苷酸修饰剂或者2个核苷酸修饰剂取代。当利用位阻分子时，其附着于反义链3’末端的核糖核苷酸。因此，掺入修饰剂不改变链的长度。在另一个实施方案中，本发明预期取代dsRNA中的两个DNA碱基，以指导反义链的Dicer加工方向。在本发明的另一个实施方案中，两个末端DNA碱基取代有义链3’末端上两个核糖核苷酸，形成有义链3’末端和反义链5’末端上双链体的平端，两个核苷酸的RNA突出端位于反义链的3’末端上。这是不对称的组合物，在平端具有DNA，在突出端具有RNA碱基。
有义链和反义链在生物学条件下退火，所述条件如在细胞的细胞质中的条件。此外，dsRNA的序列之一、特别是反义链的一个区域具有至少19个核苷酸长度的序列，其中这些核苷酸在与反义链3’末端相邻的21个核苷酸区域中，且与从靶基因中产生的RNA的核苷酸序列充分互补。
进一步根据这个实施方案，所述dsRNA，即前体RNAi分子，也可以具有一或多种如下额外性质：(a)反义链与典型21mer相比右移，(b)所述链可以不完全互补，即所述链可含有简单的错配对，(c)有义链的5’末端可包含碱基修饰，如锁核酸。使用常规技术设计“典型的”21mer siRNA。在一种技术中，通常平行检测或者在含有一些特异于相同靶位的不同siRNA双链体的集合中检测多个位点，希望一种试剂是有效的(Ji et al.，2003)。其它技术使用增加获得活性RNAi效应分子的可能性的规则和算法(Schwarz etal.，2003；Khvorova et al.，2003；Ui-Tei et al.，2004；Reynolds et al.，2004；Krol et al.，2004；Yuan et al.，2004；Boese et al.，2005)。也开发了siRNA的高效选择法(美国公布的专利申请No.2005/0042641 A1，在此并入作参考)。也可以通过二级结构预测分析潜在靶位点(Heale et al.，2005)。然后使用这个21mer设计右移，以在21mer的5’末端包含3-9个额外的核苷酸。这些额外的核苷酸序列可以具有任何序列。在一个实施方案中，加入的核糖核苷酸基于靶基因的序列。仍然是在这个实施方案中，不要求靶序列与反义siRNA的完全互补。
第一个和第二个寡核苷酸不要求完全互补。仅要求它们充分互补以在生物学条件下退火，以及提供产生于靶序列充分互补的siRNA的Dicer底物。锁核酸或者LNA为本领域技术人员熟知(Elman et al.，2005；Kurreck etal.，2002；Crinelli et al.，2002；Braasch and Corey，2001；Bondensgaard et al.，2000；Wahlestedt et al.，2000)。在一个实施方案中，LNA掺入在有义链的5’末端。在另一个实施方案中，LNA掺入在双链体有义链的5’末端，所述双链体被设计为在反义链包含3’突出端。
在一个实施方案中，所述dsRNA具有不对称结构，有义链长度为25个碱基对，反义链长度为27个碱基对且具有2个碱基的3’突出端。在另一个实施方案中，这个具有不对称结构的dsRNA在有义链的3’末端进一步含有2个脱氧核苷酸代替2个核糖核苷酸。
含有两个单独的寡核苷酸的合适dsRNA组合物可以通过第三个结构连接。所述第三个结构不阻断Dicer对于dsRNA的活性，且不干扰转录自靶基因的RNA的定向破坏。在一个实施方案中，所述第三个结构可以是化学连键基团。本领域已知且可以使用许多合适的化学连键基团。或者，所述第三个结构可以是寡核苷酸，其以一定的方式连接dsRNA的两个寡核苷酸，由此在构成所述dsRNA组合物的两个寡核苷酸退火时产生发夹结构。所述发夹结构不阻断Dicer对于dsRNA的活性，且不干扰转录自靶基因的RNA的定向破坏。
在本发明第一方面的第三个实施方案中，所述dsRNA，即前体RNAi分子，具有增强其被Dicer加工的一些性质。根据这个实施方案，所述dsRNA具有足够长度，由此其被Dicer加工产生siRNA，且其具有至少一种如下性质：(i)所述dsRNA是不对称的，例如有义链具有3’突出端，(ii)所述dsRNA在反义链上具有修饰的3’末端，以指导Dicer结合dsRNA并将其加工为活性siRNA的方向。根据这个实施方案，dsRNA中最长链包含24-30个核苷酸。在一个实施方案中，有义链包含24-30个核苷酸，反义链包含22-28个核苷酸。因此，所得dsRNA在有义链3’末端具有突出端。所述突出端长度为1-3个核苷酸，如2个核苷酸。所述反义链也可以具有5’磷酸酯。
在另一个实施方案中，所述反义链由位于反义链3’末端的合适修饰剂针对Dicer加工而修饰，即所述dsRNA被设计为指导Dicer结合和加工的方向。合适的修饰剂包括核苷酸如脱氧核糖核苷酸、二脱氧核糖核苷酸、无环核苷酸等，以及位阻分子如荧光分子等。无环核苷酸是2-羟基乙氧基甲基基团取代dNMP中正常存在的2’-脱氧呋喃核糖基糖。其它核苷酸修饰剂可包括3’-脱氧腺苷(虫草菌素)、3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷(AZT)、2’，3’-二脱氧肌苷(ddI)、2’，3’-二脱氧-3’-硫代胞苷(3TC)、2’，3’-二脱氢-2’，3’-二脱氧胸苷(d4T)以及3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷(AZT)、2’，3’-二脱氧-3’-硫代胞苷(3TC)和2’，3’-二脱氢-2’，3’-二脱氧胸苷(d4T)的一磷酸核苷酸。在一个实施方案中，脱氧核苷酸用作修饰剂。当利用核苷酸修饰剂时，反义链3’末端上的核糖核苷酸由1-3个核苷酸修饰剂或者2个核苷酸修饰剂取代。当利用位阻分子时，其附着于反义链3’末端的核糖核苷酸。因此，掺入修饰剂不改变链的长度。在另一个实施方案中，本发明预期取代dsRNA中的两个DNA碱基，以指导反义链的Dicer加工方向。在本发明的另一个实施方案中，两个末端DNA碱基位于反义链的3’末端以取代两个核糖核苷酸，形成有义链5’末端和反义链3’末端上双链体的平端，两个核苷酸的RNA突出端位于有义链的3’末端上。这是不对称的组合物，在平端具有DNA，在突出端具有RNA碱基。
有义链和反义链在生物学条件下退火，所述条件如在细胞的细胞质中的条件。此外，dsRNA的序列之一、特别是反义链的一个区域具有至少19个核苷酸长度的序列，其中这些核苷酸在与反义链3’末端相邻，且与从靶基因中产生的RNA的核苷酸序列充分互补。
进一步根据这个实施方案，所述dsRNA，即前体RNAi分子，也可以具有一或多种如下额外性质：(a)反义链与典型21mer相比右移，(b)所述链可以不完全互补，即所述链可含有简单的错配对。使用常规技术设计“典型的”21mer siRNA，如上所述。然后使用这个21mer设计右移，以在21mer的5’末端包含1-7个额外的核苷酸。这些额外的核苷酸序列可以具有任何序列。尽管加入的核糖核苷酸可以与靶基因序列互补，但是不要求靶序列与反义siRNA之间完全互补。也就是说，所得反义siRNA与靶序列充分互补。第一个和第二个寡核苷酸不需要完全互补。仅要求其基本互补以在生物学条件下退火，且提供产生与靶序列充分互补的siRNA的Dicer底物。
在一个实施方案中，所述dsRNA具有不对称结构，反义链长度为25个碱基对，有义链长度为27个碱基对且具有1-4个碱基的3’-突出端。在另一个实施方案中，具有不对称结构的这个dsRNA进一步含有在反义链3’末端的2个脱氧核糖核苷酸。
含有两个单独的寡核苷酸的合适dsRNA组合物可以通过第三个结构连接。所述第三个结构不阻断Dicer对于dsRNA的活性，且不干扰转录自靶基因的RNA的定向破坏。在一个实施方案中，所述第三个结构可以是化学连键基团。本领域已知且可以使用许多合适的化学连键基团。或者，所述第三个结构可以是寡核苷酸，其以一定的方式连接dsRNA的两个寡核苷酸，由此在构成所述dsRNA组合物的两个寡核苷酸退火时产生发夹结构。所述发夹结构不阻断Dicer对于dsRNA的活性，且不干扰转录自靶基因的RNA的定向破坏。
本发明的dsRNA组合物的一个特征是其可以作为Dicer底物。典型地，本发明的dsRNA组合物不用Dicer、其它RNase或者含有其的提取物处理。在当前发明中，这种类型的预处理可以防止Dicer退火。已知且可以使用一些方法确定dsRNA组合物是否作为Dicer底物。例如，Dicer活性可以在体外使用重组Dicer酶试剂盒(GTS，San Diego，CA)根据厂商指导测量。Dicer活性可以在体内通过用dsRNA处理细胞并且将其在收获和分离其RNA之前保持24小时进行测量。RNA可以通过使用标准方法分离，如使用RNeasyTM试剂盒(Qiagen)根据厂商指导进行。分离的RNA可以在10％PAGE凝胶上分辨，用以制备标准RNA印迹，其可以用适当标记的脱氧寡核苷酸如用
Figure G2008800213852D00211
Oligo标记***(Integrated DNA Technologies，Inc.，Coralville，IA)标记的寡核苷酸探查。
dsRNA对于细胞的作用可依赖于细胞自身。在一些情况中，dsRNA可以在一种类型细胞中诱导细胞凋亡或者基因沉默，而在另一种类型细胞中不诱导。因此，dsRNA可能适用于一种细胞而不适用于另一种细胞。为了被认为是“适合的”，dsRNA组合物不需要在可使用其的所有可能的情况中均适合，其仅需要在特定情况中是适合的即可。
可以在本发明的dsRNA、即前体RNAi分子中包含修饰，只要所述修饰不阻止所述dsRNA组合物作为Dicer底物即可。在一个实施方案中，产生一或多种修饰以增强Dicer对dsRNA的加工。在第二个实施方案中，产生一或多种修饰以导致更有效的RNAi产生。在第三个实施方案中，产生一或多种修饰以支持更强的RNAi效应。在第四个实施方案中，产生一或多种修饰以获得输送给细胞的每个dsRNA分子的更高效力。修饰可以掺入3’末端区域、5’末端区域以及这两个区域中，或者在一些情况中掺入序列内的不同位置。需要注意的是可以在dsRNA中掺入任何数目的修饰和修饰组合。在存在多个修饰的情况中，这些修饰可以相同或不同。预期对碱基、糖部分、磷酸酯主链及这些组合进行修饰。或者，5’末端可以被磷酸化。
预期对磷酸酯主链进行的修饰的例子包括膦酸酯，包括甲基膦酸、硫代磷酸酯，以及磷酸三酯修饰如烷基磷酸三酯等。预期对糖部分进行的修饰的例子包括2’-烷基嘧啶，如2’-O-甲基、2’-氟代、氨基以及脱氧修饰等(见例如Amarzguioui et al.，2003)。预期对碱基基团进行的修饰的例子包括脱碱基糖、2-O-烷基修饰的嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶和5-(3-氨基烯丙基)-尿嘧啶等。也可以掺入锁核酸或者LNA。已知且可以使用许多其它修饰，只要符合上述标准即可。修饰的例子也见于美国专利No.5,684,143、5,858,988和6,291,438以及美国公开的专利申请No.2004/0203145 A1所揭示，所述专利在此并入本文作参考。其它修饰在Herdewijn(2000)、Eckstein(2000)、Rusckowski et al.(2000)、Stein et al.(2001)、Vorobjev et al.(2001)中揭示。
预期的一或多个修饰可以掺入每个链中。DsiRNA中修饰的位置可显著影响DsiRNA的特性，包括赋予更大的潜力和稳定性、降低毒性、增强Dicer加工能力以及使免疫应答最小化。在一个实施方案中，反义链或有义链或者这两个链均具有一或多个2’-O-甲基修饰的核苷酸。在另一个实施方案中，反义链含有2’-O-甲基修饰的核苷酸。在另一个实施方案中，反义链含有由2’-O-甲基修饰的核苷酸组成的3’突出端。反义链也可以包含额外的2’-O-甲基修饰的核苷酸。
此外，dsRNA结构可以被优化为保证通过Dicer裂解产生的寡核苷酸节段是在抑制基因表达中最有效的寡核苷酸的一部分。例如，在本发明的一个实施方案中，合成27-bp的dsRNA寡核苷酸结构，其中预期抑制基因表达的21-22-bp节段位于反义链的3’末端上。位于反义链的5’末端上的剩余的碱基被Dicer裂解并弃去。这个裂解的部分可以是同源(即基于靶序列的序列)或非同源的，并且被加入以延伸核酸链。
在一个实施方案中，有义链包含24-26个核苷酸，其中位于有义链3’末端的2个核苷酸是脱氧核糖核苷酸。有义链在5’末端含有磷酸酯。反义链包含26-29个核苷酸，且含有1-4个核苷酸的3’突出端。包含3’突出端的核苷酸用2’-O-甲基修饰。反义链含有交替的2’-O-甲基修饰的核苷酸，从与3’突出端相邻的反义链的第一个单体开始并从与3’突出端相邻的反义链的第一个单体延伸15-19个核苷酸，从而Dicer裂解后剩余的21-22个碱基对反义链含有修饰的核苷酸。例如，对于27个核苷酸反义链且将反义链5’末端的第一个碱基计数为位置1，2’OMe修饰置于碱基9、11、13、15、17、19、21、23、25、26和27。在一个实施方案中，所述DsiRNA包含：
5’pXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXDD
3’YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXp
其中X＝RNA，p＝磷酸酯基团，X＝2’-O-甲基修饰的RNA，Y是由1-4个任选是2’-O-甲基RNA的单体RNA单体组成的突出端结构域，D＝DNA。上面的链是有义链，下面的链是反义链。
RNA可以通过酶产生或者通过部分/全部有机合成产生，且修饰的核糖核苷酸可以通过在体外酶或有机合成方式导入。在一个实施方案中，每个链均是化学制备的。本领域已知合成RNA分子的方法，特别是Verma andEckstein(1998)所述或者本文所述化学合成方法。
正如所已知的，RNAi方法可用于多种生物体的多种基因，且本发明揭示的组合物和方法可用于这些情况的每一种中。可以由本发明揭示的组合物和方法靶向的基因的例子包括内源基因，其是细胞中天然的基因或者细胞中通常不天然存在的基因。非限制性地这些基因包括致癌基因、细胞因子基因、独特型(Id)蛋白质基因、朊蛋白基因、表达诱导血管发生的分子的基因、粘附分子基因、细胞表面受体、参与转移的蛋白质、蛋白酶、细胞凋亡基因、细胞周期控制基因、表达EGF和EGF受体的基因、多药抗药性基因如MDR1基因。
更特别地，本发明的靶mRNA限定细胞蛋白质的氨基酸序列(例如核蛋白、细胞质蛋白、跨膜蛋白或者膜结合蛋白)。在另一个实施方案中，本发明的靶mRNA限定细胞外蛋白质的氨基酸序列(例如细胞外基质蛋白或者分泌的蛋白质)。如本文所用，短语“限定蛋白质的氨基酸序列”是指所述mRNA序列根据遗传密码规则被翻译为氨基酸序列。如下举例列举了一些类别蛋白质：发育蛋白质(例如粘附分子，细胞周期蛋白激酶抑制剂，Wnt家族膜蛋白，Pax家族膜蛋白，Winged螺旋家族膜蛋白，Hox家族膜蛋白，细胞因子/淋巴因子及其受体，生长因子/分化因子及其受体，神经递质及其受体)；致癌基因编码的蛋白质(例如ABLI、BCLI、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETSI、ETSI、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCLI、MYCN、NRAS、PIM I、PML、RET、SRC、TALI、TCL3和YES)；肿瘤阻抑物蛋白(例如APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF I、NF2、RB I、TP53和WTI)；以及酶(例如ACC合酶和氧化酶、ACP去饱和酶和羟化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸酶(pyrophorylases)、ATPases、醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、查耳酮合酶、壳多糖酶、环加氧酶、脱羧酶、dextriinases、DNA和RNA聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、颗粒结合的淀粉合酶、GTPases、解旋酶、hernicellulases、整合酶、菊粉酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂加氧酶、溶菌酶、烟碱合酶、章鱼碱合酶、果胶甲酯酶、过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、植酸酶、植物生长调节剂合酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶和肽酶、pullanases、重组酶、逆转录酶、RUBISCOs、拓扑异构酶和木聚糖酶)。
一方面，本发明的靶mRNA指定与病理学病症相关的蛋白质的氨基酸序列。例如，所述蛋白质可以是病原体相关的蛋白质(例如参与宿主免疫抑制、病原体复制、病原体传播或者感染维持的病毒蛋白质)，或者是宿主蛋白质，其促进病原体进入宿主、病原体或宿主对药物的代谢、病原体基因组的复制或整合、宿主中感染的建立与传播，或者病原体下一世代的装配。病原体RNA病毒，如黄病毒、小RNA病毒、杆状病毒、丝状病毒，逆转录病毒，包括慢病毒，或者DNA病毒如腺病毒、痘病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、hepadnaviruses等。其它病原体包括细菌、真菌、蠕虫、血吸虫和锥体虫。其它类型的病原体可包括哺乳动物可转座元件。或者，所述蛋白质可以是肿瘤相关的蛋白质或者自身免疫疾病相关蛋白质。
所述靶基因可衍生自或者包含于任何生物体中。所述生物体可以是植物、动物、原生动物、细菌、病毒或者真菌。见例如美国专利No.6,506,559所述，所述专利并入本文作参考。
另一方面，本发明提供了包含本发明的dsRNA的药物组合物。可以适当地配制所述dsRNA样品并通过任何方式将其导入细胞环境中，使得足够部分的样品进入细胞中诱导基因沉默(如果发生)。本领域已知且可以使用dsRNA的许多配制物，只要dsRNA得以进入其可以作用的靶细胞中。见例如美国公开的专利申请No.2004/0203145 A1和2005/0054598 A1所述，所述专利并入本文作参考。例如，dsRNA可以在缓冲溶液中配制，所述缓冲液如磷酸盐缓冲盐水溶液、脂质体、微团结构以及壳体。dsRNA与阳离子脂质的配制物可用于促进dsRNA转染进细胞中。例如，可以使用阳离子液体，如lipofectin(美国专利No.5,705,188，所述专利并入作参考)，阳离子甘油衍生物，以及聚阳离子分子，如聚赖氨酸(公开的PCT国际申请WO97/30731，在此并入作参考)。合适的液体包括Oligofectamine、Lipofectamine(Life Technologies)、NC388(Ribozyme Pharmaceuticals，Inc.，Boulder，CO)或者FuGene 6(Roche)，所有这些液体均可根据厂商指导使用。
本领域可意识到将dsRNA导入细胞环境中的方法依赖于细胞类型及其环境的组成。例如，当细胞在液体中时，优选配制物是液体配制物如在lipofectamine中，且所述dsRNA可以直接加入细胞的液体环境中。液体配制物也可以通过如静脉内、肌内或者腹膜内注射或者口服或者通过吸入或者本领域已知的其它方法给予动物。当所述配制物适于给予动物如哺乳动物及更特别给予人时，所述配制物也是药物学可接受的。本领域已知且可以使用给予寡核苷酸的药物学可接受的配制。在一些情况中，可优选在缓冲液或盐水溶液中配制dsRNA，并将配制的dsRNA直接注射进细胞中，如使用***进行的研究。也可以直接注射dsRNA双链体。导入dsRNA的合适方法见美国公开的专利申请No.2004/0203145 A1所述，所述专利并入本文作参考。
必须导入适量的dsRNA，且这些量可以通过使用标准方法根据经验确定。典型地，细胞环境中各个dsRNA的有效浓度为大约50纳摩尔或低于10纳摩尔或更低，或者可以使用大约1纳摩尔或更低浓度的组合物。在其它实施方案中，在许多情况中可以使用利用大约200微微摩尔或更低、甚至大约50微微摩尔或更低浓度的方法。
所述方法可以通过将dsRNA组合物加入任何细胞外基质中而进行，在所述基质中细胞可以存活，条件是配制所述dsRNA组合物，由此足量的dsRNA可以进行细胞已发挥其作用。例如，所述方法应适用于在液体如液体培养物或者细胞生长培养基、或者在全生物体包括动物如哺乳动物、特别是人中存在的细胞。
靶基因的表达可以通过本领域已知的或者随后开发的任何合适方法确定。本领域意识到用于测量靶基因表达的方法依赖于靶基因的性质。例如，当靶基因编码蛋白质时，术语“表达”可以是指蛋白质或者转录物衍生自该基因。在这种情况中，靶基因的表达可以通过测量相应于靶基因的mRNA的量或者通过测量蛋白质的量而确定。可以在蛋白质测定中通过染色或者免疫沉淀方法测量蛋白质，或者如果蛋白质催化可被测量的反应，则通过测量反应速度测量蛋白质。本领域已知且可使用所有这些方法。在基因产物是RNA的情况中，可以通过确定相应于基因产物的RNA的量测量表达。一些检测基因表达的特殊方法在实施例1中描述。测量可以针对细胞、细胞提取物、组织、组织提取物或者任何其它合适的原材料进行。
确定靶基因表达是否降低可以通过能可靠地检测基因表达中的变化的任何合适方法进行。典型地，通过将未消化的dsRNA导入细胞环境中，由此至少一部分dsRNA进入细胞质中，然后测量靶基因的表达而加以确定。对相同的未处理的细胞进行相同测量，对比得自每个测量的结果。
所述dsRNA可以配制为药物组合物，其包含药物学有效量的dsRNA和药物学可接受的载体。药物学有效量或者治疗有效量是指有效产生指定药物学、治疗或者预防结果的dsRNA的量。短语“药物学有效量”和“治疗有效量”是指有效产生指定药物学、治疗或者预防结果的RNA的量。例如，如果认为当与疾病或病症相关的可测量参数降低至少20％的指定临床治疗是有效治疗时，则药物治疗该疾病或病症的治疗有效量是实现该参数降低至少20％所需要的。
短语“药物可接受的载体”是指给予治疗剂的载体。举例的载体包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及这些载体的组合。对于口服给予药物，药物可接受的载体包括但不限于药物可接受的赋形剂如惰性稀释剂、崩解剂、结合剂、润滑剂、甜味剂、香味剂、色素和防腐剂。合适的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙，以及乳糖，玉米淀粉和藻酸是合适的崩解剂。结合剂可包括淀粉和凝胶；如果存在润滑剂，则其通常是硬脂酸镁、硬脂酸或者滑石。如果需要，片剂可以用如甘油一硬脂酸酯、甘油二硬脂酸酯等材料涂层，以延缓在胃肠道中吸收。本发明揭示的dsRNA的药物可接受的载体可以是微团结构，如脂质体、壳体(capsids)、capsoids、聚合的纳米胶囊或者聚合的微囊。
聚合的纳米胶囊或者微囊便于胶囊化的或结合的dsRNA转运进细胞中和释放。其包括聚合材料和单体材料(monomelic material)，特别包括聚氰基丙烯酸正丁酯(polybutylcyanoacrylate)。关于材料和制作方法的概述已经公开(见Kreuter，1991)。本领域已知在聚合/纳米颗粒产生步骤中从单体和/或寡聚前体中形成的聚合材料，聚合材料的分子量和分子量分布可以由生产纳米颗粒领域的技术人员根据常规技术适当选择。
本发明的适当配制的药物组合物可以通过本领域已知的任何方式给予，例如通过肠道外途径给予，包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、经皮、经呼吸道(气雾剂)、经直肠、经***和局部(包括口腔和舌下)给予。在一些实施方案中，所述药物组合物通过静脉内或者intraparenteral灌注或注射方式给予。
通常地，dsRNA的合适剂量范围是0.001-0.25mg/kg受者体重/天，或者0.01-20μg/kg受者体重/天，或者0.01-10μg/kg受者体重/天，或者0.10-5μg/kg受者体重/天，或者0.1-2.5μg/kg受者体重/天。包含dsRNA的药物组合物可以一天给予一次。然而，所述治疗剂也可以是每天以适当间隔给予2、3、4、5、6或更多次的亚剂量(sub-dose)的剂量单位给予。在这种情况中，每个亚剂量中含有的dsRNA必须相应较少，以达到全天的剂量单位。所述剂量单位也可以是几天给予一次的剂量，例如使用常规缓释配制物，在几天的时间内持续且一致释放dsRNA。缓释配制物为本领域熟知。在这个实施方案中，剂量单位含有相应的多倍每日剂量。无论配制物如何，所述药物组合物必须含有足够数量的dsRNA，以抑制靶基因在治疗的动物或人体中的表达。所述组合物可以这样的方式配制，由此多个单位的dsRNA加一起含有足够剂量。
数据可得自细胞培养测定和动物研究，用以配制适于人的合适剂量范围。本发明组合物的剂量在包括ED50(通过已知方法确定)很低或无毒性的循环浓度范围内。根据应用的剂型和给药途径，剂量可以在此范围内变化。对于用于本发明方法中的任何化合物，治疗有效量可以从细胞培养测定中初步估计。可以在动物模型中确定剂量，以达到所述化合物的循环血浆浓度范围，包括在细胞培养中测定的IC5O(即测试化合物达到半数最大抑制症状的浓度)。这个信息可用于更精确地确定在人体内的可用剂量。血浆中dsRNA的水平可以通过标准方法测量，例如通过高效液相层析法测量。
另一方面，本发明涉及治疗患有或者处于发生由靶基因表达引起的疾病风险中的对象的方法。在这个实施方案中，所述dsRNA可作为新的治疗剂控制一或多种细胞增殖和/或分化性疾病，与骨代谢相关的疾病，免疫疾病，造血***疾病，心血管疾病，肝脏疾病，病毒性疾病，或者代谢性疾病。所述方法包括给予患者(例如人)本发明药物组合物，由此所述靶基因的表达被沉默。由于其高特异性，因此本发明的dsRNA特异性靶向患病细胞和组织的靶基因的靶mRNA。
在预防疾病中，靶基因可以是起始或维持疾病所需的或者已经鉴别为与染上疾病的高危状况相关的基因。在治疗疾病中，可以将dsRNA与呈现疾病的细胞或组织接触。例如，可以将dsRNA与癌细胞或rumor基因接触或者导入其中，所述dsRNA与癌症相关的突变基因的全部或一部分基本相同，或者在肿瘤细胞中高水平表达，例如aurora激酶。
细胞增殖和/或分化病症的例子包括癌症，例如癌瘤、肉瘤、转移瘤或者造血***癌症例如白血病。转移瘤可以起因于多种类型原发肿瘤，包括但不限于源于***癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌和肝癌。如本文所用，术语“癌症”、“过度增殖”和“肿瘤”是指具有自治生长能力的细胞，即特征在于迅速增殖性细胞生长的病症。这些术语是指包括所有类型癌性生长或致癌过程，转移组织或恶性转化的细胞、组织或器官，无论侵润的组织病理学类型或阶段如何。增殖性疾病也包括造血***癌症，包括造血起源的增生性/癌性细胞，例如源于骨髓、淋巴或者红细胞系，或者这些细胞的前体细胞。
本发明也可用于治疗多种免疫失调，特别是与基因的过表达或者突变基因表达相关的那些免疫失调。造血失调或疾病的例子包括但不限于自身免疫疾病(包括例如糖尿病、关节炎(包括类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎)，多发性硬化，脑脊髓炎，重症肌无力，***性红斑狼疮，自身免疫性甲状腺炎，皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)，银屑病，Sjogren′s综合症，Crohn′s病，鹅口疮，虹膜炎，结膜炎，角膜结膜炎，溃疡性结肠炎，哮喘，变应性哮喘，皮肤红斑狼疮，硬皮病，***炎，直肠炎，药疹，麻风逆向反应，麻风结节性红斑，自身免疫性葡萄膜炎，***反应性脑脊髓炎，急性坏死性出血性脑病，自发双侧进展性感觉神经听觉丧失(idiopathic bilateral progressive sensorineural hearing loss)，再生障碍性贫血，纯红细胞贫血，特发性血小板减少，多软骨炎，Wegener′s肉芽肿病，慢性肝炎，急性肝炎，Stevens-Johnson综合征，特发性脂肪泻，扁平苔藓，Graves′病，结节病，原发性胆汁性肝硬化，后葡萄膜炎，以及肺间质纤维变性)，移植物抗宿主疾病，移植，以及***反应。
在另一个实施方案中，本发明涉及治疗病毒性疾病的方法，包括但不限于人***状瘤病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、HIV-AIDS、脊髓灰质炎病毒和天花病毒。本发明的dsRNA如本文所述制备以靶向表达的病毒序列，因此改良病毒活性和复制。所述分子可用于治疗和/或诊断病毒感染的动物和植物的组织。同样，这种分子可用于治疗病毒相关的癌症，如肝细胞癌。
本发明的dsRNA也可用于抑制多药抗药性1(MDR1)基因的表达。“多药抗药性”(MDR)泛指具有不相关的化学结构和不同作用机制的多种化学治疗药物的抗性模式。尽管MDR的病因学多种多样，但是在实验室模型中P-糖蛋白(Pgp)的过表达保持最常见的改变潜在的MDR，Pgp是介导MDR药物转运的膜蛋白(Childs and Ling，1994)。此外，在人体癌症中，Pgp的表达与MDR的发生相关，特别是在白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤以及软组织肉瘤中(Fan et al.)。近来的研究表明表达MDR相关蛋白(MRP)(Cole et al.，1992)、肺抗性蛋白(LRP)(Scheffer et al.，1995)和DNA拓扑异构酶II(Beck，1989)突变的肿瘤细胞也可导致MDR。
除非特别指出，则实施本发明时应用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的常规技术，这些技术为本领域所已知。见例如Maniatis et al.，1982，MolecularCloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork)；Sambrook et al，1989，Molecular Cloning，2nd Ed.(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)；Sambrook and Russell，2001，Molecular Cloning，3rd Ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York)；Ausubel et al.，1992)，Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley & Sons，including periodic updates)；Glover，1985，DNA Cloning(IRL Press，Oxford)；Anand，1992；Guthrie and Fink，1991；Harlow and Lane，1988，Antibodies，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，New York)；Jakoby and Pastan，1979；Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription AndTranslation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRLPress，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；thetreatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene TransferVectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，ColdSpring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，VoIs.154 and 155(Wu etal.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer andWalker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of ExperimentalImmunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Riott，Essential Immunology，6th Edition，Blackwell Scientific Publications，Oxford，1988；Hogan et al.，Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)；Westerfield，M.，Thezebrafish boo k.A guide for the laboratory use of zebrafish(Danio rerio)，(4thEd.，Univ.of Oregon Press，Eugene，2000)所述。
实施例
参考如下实施例描述本发明，所述实施例只是例证本发明，无任何限制本发明之意。本发明实施例利用本领域熟知的标准技术或者下文特别描述的技术。
实施例1：双链RNA寡核苷酸的制备
寡核苷酸合成与纯化
RNA寡核苷酸通过使用固相亚磷酰胺化学方法合成，使用标准技术(Damha and Olgivie，1993；Wincott et al.，1995)在NAP-5柱(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上去保护和脱盐。通过离子交换高效液相层析技术(IE-HPLC)在Amersham Source 15Q柱(1.0cm×25cm)(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上纯化寡聚物，使用15分钟线性梯度(step-linear gradient)。所述梯度变化为从90∶10缓冲液A∶B至52∶48缓冲液A∶B，其中缓冲液A是100mM Tris pH 8.5，缓冲液B是100mM Tris pH 8.5，1M NaCl。在260nm监测样品，收集并集合相应于全长寡核苷酸的峰，在NAP-5柱上脱盐并冻干。
每个寡聚物的纯度通过在Beckman PACE 5000(Beckman Coulter，Inc.，Fullerton，CA)上进行毛细管电泳(CE)确定。所述CE毛细管内径为100μm，且含有ssDNA 100R凝胶(Beckman-Coulter)。典型地，将大约0.6nmole寡核苷酸注射进毛细管中，以444V/cm电场电泳，并且在260nm通过UV吸光度检测。变性Tris-硼酸盐-7M-尿素运行缓冲液购自Beckman-Coulter。通过CE评定的至少90％纯的寡核糖核苷酸用于下述实验中。化合物本质是根据厂商推荐的方案，在Voyager DETM Biospectometry Work Station(AppliedBiosystems，Foster City，CA)上通过基质辅助激光解析电喷射飞行时间(MALDI-TOF)质谱核实。所有寡聚物的相对分子质量均在期望分子质量的0.2％偏差之内。
双链体的制备
将单链RNA(ssRNA)寡聚物以100μM浓度重悬于由100mM乙酸钾、30mM HEPES、pH 7.5组成的双链体缓冲液中。将互补的有义链和反义链等摩尔量混合，获得50μM双链体的最终溶液。将样品加热至95℃持续5分钟，在使用之前使其冷却至室温。将双链RNA(dsRNA)寡聚物在-20℃贮存。单链RNA冻干贮存或者在-80℃在无核酸酶水中贮存。
命名法
为了保持一致，在本说明书和实施例中使用如下命名法。双链体的名称指出寡聚物的长度及突出端的存在与否。“21+2”双链体含有两个RNA链，每个链长度均为21个核苷酸，也称作21mer siRNA双链体，且具有2个碱基的3’突出端。“21-2”是具有2个碱基的5’突出端的21mer siRNA双链体。“21-0”是无突出端(平端)的21mer siRNA双链体。“21+2UU”是具有2个碱基的3’突出端的21mer双链体，且在3’末端的最后2个碱基均是U残基(其可导致与靶序列的错配)。“25/27”是不对称双链体，有义链具有25个碱基，反义链具有27个碱基以及具有2个碱基的3’突出端。“27/25”是不对称双链体，有义链具有27个碱基，反义链具有25个碱基。
实施例2：增强的25mer效力
这个实施例证实链长度为25个核苷酸或更长的dsRNA在哺乳动物***中与已知的21mer至23mer siRNA相比具有令人惊奇的增强的效力。
在研究通过噬菌体T7在体外转录产生的dsRNA的不同5’和3’末端结构期间(Kim et al.，2004)，我们观测到与合成的21mer siRNA相比对于相同靶位点具有更强效力的一些dsRNA，这个性质似乎与长度相关。为了进一步探究这个现象，我们***地研究了不同长度和设计的化学合成的双链体的沉默性质。
细胞培养、转染和EGFP测定
在转染前一天，将HEK 293细胞在24孔平板DMEM培养基中***至60％铺满。在加入等份每种RNA之后，加入含有报道载体的50μl的OptiMedia。接下来混合含有1.5μl的Lipofectamine 2000(Invitrogen)的50μl的Opti Media，保温15分钟。然后将细胞加入0.4ml的DMEM培养基中。为了标准化转染效率，每个测定均包括靶和/或双链体RNA与萤火虫萤光素酶或者红色荧光蛋白(RFP)报道质粒(所有其它测定)的共转染。对于萤光素酶测定，根据厂商指导使用Steady GIo Luciferase测定试剂盒(Promega)。对于RFP共转染，将指定量的EGFP报道质粒(pLEGFP-C1载体，Clontech)与20ng的RFP报道质粒(pDsRed2-C1，BD Sciences)转染。24小时后，通过荧光显微镜监测RFP表达。仅评估其中转染效率＞90％(通过RFP表达评估)的实验。24小时后测量EGFP表达水平。通过FACS(活细胞)或者通过荧光计读数(细胞提取物)确定EGFP-荧光细胞的平均数，从而确定EGFP表达。
对于使用稳定表达EGFP的NIH3T3细胞进行的EGFP测定，使用VersaFluor荧光计(Bio-Rad)及使用激发滤光片D490和发射滤光片D520进行测量。在转染之前，将细胞种植于24孔平板中，密度为大约30％铺满。在第0天，如上述转染细胞，在转染后第1天更换培养基。在第3天进行第一次EGFP测定。为了制备提取物，取1×105个细胞，将1×104个细胞进一步增殖以用于第6天的EGFP测定。在第6天和第9天重复相同程序。
如下所述获得EGFP提取物测量结果：将1×105个细胞悬浮于300μlPBS中，超声处理10秒钟，随后进行2分钟微量离心。上清用于荧光测量。确定相对于从未处理的NIH3T3细胞中制备的提取物的EGFP表达百分比。
核酸试剂
所述报道***应用EGFP作为转染质粒载体pEGFP-C1(Clontech，PaloAlto，CA)，或者作为在NIH 3T3细胞系中的稳定转化体。EGFP的编码序列示于表1，Genbank登记号#U55763。ATG起始密码子和TAA终止密码子以粗体字体标示，下划线处示出本实施例和其它实施例中的siRNA试剂的靶向位点。
表1：EGFP的核苷酸序列
atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccg gcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa(SEQ ID NO：1)
本实施例中用于EGFP中siRNA靶向的位点1是：
位点1：
5’GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCGGCAAGC 3’(SEQ ID NO：2).
如实施例1所述合成和制备RNA双链体。靶向EGFP位点1的RNA双链体在表2中示出。一些序列在有义链的3’末端具有二核苷酸序列“UU”(Elbashir et al.，2001c；Hohjoh，2002)。得自包括3’末端“UU”的错配或者其中错配是有意放置的错配以粗体字体和下划线标示。
表2：寡核苷酸试剂、EGFP位点-1概述
Figure G2008800213852D00331
结果
在靶向EGFP“位点1”的模型***中检测不同长度的含有3’突出端、5’突出端或者平端的一扩大系列的合成RNA双链体的相对效力(Kim et al.，2003)。使用50nM的各种RNA双链体进行最初的转染(图1A)。只有当在亚纳摩尔(subnanomolar)浓度进行转染时才示出较长双链体的真实效力。使用200pM(图1B)和50pM(图1C)浓度的双链体RNA，观测到效力随着长度而增加。平端、5’-末端和3’-末端具有相似效力。甚至在稳定表达EGFP的NIH3T3细胞中观测到较长双链体RNA的效力增加(图1F)。合成长于27个核苷酸的双链体并检测RNAi效力(图1D)。在长度为27bp的双链体观测到最大抑制活性(图1D)。较长的双链体示出功能性RNAi活性进行性丧失，且长度为40-45bp的双链体在检测浓度完全无活性，这与这些双链体在体外的Dicer裂解不佳也相关(图1E)。
实施例3：Dicer底物
本实施例证实确定dsRNA是否作为Dicer底物的方法。
体外Dicer裂解测定
将RNA双链体(100pmol)在具有1单位重组人Dicer(Stratagene)的20μl的20mM Tris pH 8.0、200mM NaCl、2.5mM MgCl2中保温24小时。将3μ等份每个反应物(15pmol RNA)在15％非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，用GelStar(Ambrex)染色，以及使用UV激发进行观测。
结果
21-bp至27-bp RNA双链体与重组人Dicer保温导致23mer、25mer和27mer双链体裂解，而21mer双链体不裂解(图2A)。由于这个反应的缓慢动力学，在厂商推荐的体外条件下不可能确定Dicer裂解的相对效率。除了长于30bp的dsRNA可能需要被Drosha(一种micro RNA加工酶)预处理为Dicer的良好底物的可能性之外，我们未能解释为什么这些较长的dsRNA是Dicer的不良底物和RNAi的不良触发剂。
实施例4：末端修饰对于Dicer活性的影响
使用实施例3所述体外Dicer裂解测定检测dsRNA的末端修饰的作用。
对于27mer双链体，检测荧光素末端修饰对于Dicer活性及触发RNAi沉默的能力的影响。针对EGFPS1位点合成RNA寡核苷酸，6-羧基荧光素(6FAM)附着于有义(S)链的5’末端、S-链的3’末端、反义(AS)链的5’末端以及AS链的3’末端。成对组合用于产生双链体RNA(图2B)。双链体3是未修饰的野生型EGFPS1 27+0双链体。6FAM修饰的双链体的结构示于表2。将RNA双链体与重组人Dicer保温24小时，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离，染色及通过UV激发观测(图2C)。与先前的实验(其中在24小时保温期间RNA双链体被充***解)不同(图2A)，所有修饰的双链体均示出一定程度的Dicer裂解抗性。仅未修饰的野生型序列(双链体3)在体外Dicer反应中被充***解。在S链具有3’-6FAM以及在AS链具有3’-6FAM的双链体(双链体5)在这些条件下是完全裂解抗性的。在EGFP共转染测定中对比这5个双链体的功能效力(图2D)，使用200pM RNA浓度。与在体外Dicer裂解中观测到的模式类似，具有6FAM-修饰的末端的所有27mer双链体与未修饰的双链体相比在降低EGFP表达中的效力较低。示出被重组Dicer部***解的双链体1、2和4的RNAi活性降低1、2和4倍。示出不被重组Dicer裂解的双链体5具有较低的RNAi活性，由此确定体外Dicer裂解的相对效率与细胞培养中RNAi之间的直接相关性。
实施例5：体内Dicer加工
本实施例证实27mer dsRNA在体内被Dicer加工。
测定27mer RNA的细胞内加工
如上述将10nM的RNA双链体转染进6孔平板中的HEK293细胞中。14小时后，如下所述制备总RNA。首先，将20μg总RNA在75℃加热10分钟，与32P 5’末端标记的寡核苷酸探针(5’-ACCCTGAAGTTCATCTGCACC-3’；SEQ ID NO：73)混合，并且在24℃在150mM NaCl、50mM Tris-HCl、pH.7.4、1mM EDTA中杂交。将样品加样于7.5％非变性聚丙烯酰胺凝胶中，在4℃在200V分离3小时，将该凝胶暴露于X-射线胶片。32p-末端标记的27mer和21mer双链体RNA寡聚物用作大小标准。
结果
为了证实所述27mer dsRNA在体内被Dicer加工，用10nM双链体3(未修饰)或者双链体5(两个3’末端均用6FAM修饰)转染HEK293细胞。14小时后，分离总RNA，并且与32P末端标记的21mer探针寡聚物(S链)杂交。通过非变性PAGE分离RNA，通过放射自显影术观测(图2E)。与在体外Dicer裂解中观测到的结果相似，在从用双链体3(未修饰的27mer)转染的细胞中制备的RNA中，观测到随着21mer双链体标记迁移的较小种类，与Dicer裂解产物一致。这个21mer种类在得自用双链体5(3’末端修饰的27mer)转染的细胞的RNA中未检测到。
实施例6：dsRNA的效力
本实施例检验了27mer的Dicer潜在裂解产物的效力。
根据裂解发生的部位，27mer由Dicer的裂解可以获得多种不同的21mer；一种21mer或这些可能的21mer的混合物显然比用作对比标准的特定21mer更有效是可能的。为了检测这种可能性，合成7个不同的21mer，其可以衍生自EGFPS1 27+0双链体，使用传统的21+2设计，沿反义链单碱基步移。在HEK293细胞共转染测定中单独或者集合检测这7个双链体的RNAi活性(图3A)。在50或200pM浓度，单独的21mer双链体或者集合的7个21mer双链体均未示出与27mer双链体相当的活性。转染之前的27mer的体外Dicer裂解未明显增强活性(图3B)。作为额外对照，转染突变的EGFP 27mer双链体(表2)，即具有四个连续的置于中心的错配碱基的EGFPS 1-27+0/mut)。所述错配实际上消除任何RNAi活性(图3B)。
实施例7：Dicer裂解产物的分析
本实施例通过质谱分析体外Dicer裂解产物。
电喷射液相层析质谱分析
使用Oligo HTCS***(Novatia)，对用Dicer处理之前和之后的双链体RNA进行电喷射液相层析-质谱分析(ESI-LCMS)，所述***由ThermoFinnigan TSQ7000、Xcalibur数据***、ProMass数据处理软件和Paradigm MS4 HPLC(Michrom BioResources)组成。在注射进质谱分析仪(LC-MS)之前使用的液相层析步骤除去与核酸复合的大多数阳离子；一些钠离子可以保持与RNA结合，且作为较小+22或+44种类被观测到，反映用钠取代氢获得的净质量增加。
结果
使用电喷射质谱分析(ESI MS)鉴别通过EGFPS1 27+0双链体与重组Dicer在体外保温而实际产生的物种(图4A和4B)。对可得自体外Dicer裂解的每个可能的消化产物计算的质量示于表3。对体外裂解产物的ESI MS分析与这个酶的已知活性一致。
表3：通过Dicer加工而衍生自27mer双链体的可能的21mer双链体的分子量
Figure G2008800213852D00371
*27mer的分子量是具有羟基末端的最初的化学合成的双链体的分子量。计算的21mer的分子量假定在Dicer加工后每个链上具有5’磷酸酯。
**表示与在图4B中观测到的峰一致的质量。
实施例8：27mer dsRNA的抑制性质的进一步鉴定
为了进一步鉴定27mer dsRNA在稳定表达EGFP靶的细胞中的抑制性质，将表达EGFP的稳定转染的NIH3T3细胞用21+2和27+0dsRNA双链体(均为5nM)转染。为了获得基因抑制期间的定量估算，进行时程实验，观测在转染后2、4、6、8和10天的EGFP表达。制备细胞提取物，并使用荧光计测量EGFP荧光(图5A)。使用21+2 siRNA，EGFP抑制持续大约4天，与先前的观测结果(Persengiev et al.，2004)一致，而使用27+0 dsRNA获得的抑制作用持续直至10天。已经报道一类“超功能性”21+2 siRNA，其示出相似的沉默期间延长(Reynolds et al.，2004)；然而，这些序列很罕见且难以发现或预测。使用27mer dsRNA可以使得在更多靶位点达到更长更有效的RNAi。
实施例9：27mer dsRNA对位点选择的作用
使用RNAi作为***性抑制任意基因表达的工具的常见问题是不是所有的靶位点对于siRNA的抑制作用是同样易感的(Sherer and Rossi，2004)，需要复杂算法以预测有效位点(Reynolds et al.，2004；Ui-Tei et al.，2004；Amarzguioui and Prydz，2004)。因此我们询问了27mer dsRNA的增强的效力是否使得可以有效靶向使用传统21mer siRNA时无活性的位点。制备双链体RNA，其具有针对EGFP中两个位点(EGFP-S2和EGFP-S3)的21+2和27+0设计，这两个位点先前已知是使用标准siRNA时耐RNAi的位点(Kimeand Rossi，2003)。
核酸试剂
报道***使用上述SEQ ID NO：1所示EGFP。EGFP中位点-2(也称作坏位点1)和位点-3(也称作坏位点2)被靶向。如实施例1所述合成及制备RNA双链体。在本实施例中EGFP用于siRNA靶向的位点-2和位点-3是：
位点-2：
5’UGAAGCAGCACGACUUCUUCAAGUCCGCCAUG 3’(SEQ ID NO：74)
位点-3：
5’UGAAGUUCGAGGGCGACACCCUGGUGAACCGCAU  3’(SEQ IDNO：75)。
靶向EGFP位点-2和EGFP位点-3的RNA双链体概括示于表4。
表4
寡核苷酸试剂概述，EGFP位点-2
Figure G2008800213852D00391
结果
使用共转染测定形式(图5B)将1nM和10nM双链体转染进HEK293细胞中。在这些剂量，标准21+2siRNA在两个位点均无效，而27mer dsRNA在EGFP-S2使EGFP表达降低80-90％，在EGFP-S3使EGFP表达降低50％(1nM)和80％(10nM)。尽管Dicer底物dsRNA效力增强，但是根据经验进行的检测仍可用于发现最敏感的RNAi靶位。在这点上，重要的是一些27mer的Dicer产物产生不良的功能性siRNA。通过更好地了解Dicer底物优选性，应该可以设计产生希望的21mer的底物RNA。我们观测到仅在27mer一个末端上的2个碱基的3’突出端优先指导Dicer裂解该2个碱基的3’突出端上游的21-23个核苷酸。
本实施例证实本发明的dsRNA可有效地靶向EGFP基因内的通过先前已知的方法认为是不良靶位的位点。因此使用本发明的方法将简化RNAi的位点选择和设计标准。本实施例还示出在有义链3’末端有意放置错配可增强27mer双链体的效力。
实施例10：27mer dsRNA对其它基因的作用
为了保证27mer dsRNA增强的效力不是靶向报道构建体的人工结果(artifact)，使其靶向两个内源转录物：人hnRNP H mRNA(Markovtsov et al.，2000)和编码La蛋白的mRNA(Wolin and Cedervall，2002)。
针对hnRNP H和La的RNAi测定
将HEK293细胞铺板于6孔平板中，至30％铺满。第二天，用指定量的dsRNA转染细胞，接下来一天更换培养基。转染后72小时将细胞收获在300μl PBS中。如上文针对EGFP测定所述制备提取物。对于western印迹，将2μl细胞提取物加样于10％SDS-PAGE凝胶中，使用兔多克隆抗-hnRNP H抗体(Markovtsov et al.，2000)和与碱性磷酸酶(Sigma)缀合的抗兔抗体检测内源hnRNP H。使用小鼠衍生的抗肌动蛋白抗体(Sigma)和与碱性磷酸酶(Sigma)缀合的抗小鼠抗体检测β-肌动蛋白。对于northern印迹分析，将收获的细胞与RNA STAT-60(Tel-Test B)混合，根据厂商指导提取总RNA。将RNA在6％变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，转移至尼龙膜并用32P末端标记的寡聚物(La，5，-CCAAAGGTACCCAGCCTTCATCCAGTT-3’(SEQ ID NO：84)；β-肌动蛋白，5’-GTGAGGATGCCTCTCTTGCTCTGGGCCTCG-3’(SEQ ID NO：85))探查。在10ml杂交溶液(1ml 50×Denhardt′s，3ml 20×SSPE，0.5ml10％SDS)中在37℃杂交3小时。在杂交后，用2×SSPE在37℃洗涤印迹3次。
核酸试剂
人(Homo sapiens)异源核内核糖核蛋白质H(hnRPH)mRNA(Genbankaccession No.NM 005520)的编码序列示于表5。ATG起始密码子和TAA终止密码子以粗体字体标示，以下划线处标示出siRNA靶向位点。
表5
HNRPH的核苷酸序列
ttttttttttcgtcttagccacgcagaagtcgcgtgtctagtttgtttcgacgccggaccgcgtaagagacgatgatgttgggcacggaaggtggagagggattcgtggtgaaggtccggggcttgccctggtcttgctcggccgatgaagtgcagaggtttttttctgactgcaaaattcaaaatggggctcaaggtattcgtttcatctacaccagagaaggcagaccaagtggcgaggcttttgttgaacttgaatcagaagatgaagtcaaattggccctgaaaaaagacagagaaactatgggacacagatatgttgaagtattcaagtcaaacaacgttgaaatggattgggtgttgaagcatactggtccaaatagtcctgacacggccaatgatggctttgtacggcttagaggacttccctttggatgtagcaaggaagaaattgttcagttcttctcagggttggaaatcgtgccaaatgggataacattgccggtggacttccaggggaggagtacgggggaggccttcgtgcagtttgcttcacaggaaatagctgaaaaggctctaaagaaacacaaggaaagaatagggcacaggtatattgaaatctttaagagcagtagagctgaagttagaactcattatgatccaccacgaaagcttatggccatgcagcggccaggtccttatgacagacctggggctggtagagggtataacagcattggcagaggagctggctttgagaggatgaggcgtggtgcttatggtggaggctatggaggctatgatgattacaatggctataatgatggctatggatttgggtcagatagatttggaagagacctcaattactgtttttcaggaatgtctgatcacagatacggggatggtggctctactttccagagcacaacaggacactgtgtacacatgcggggattaccttacagagctactgagaatgacatttataattttttttcaccgctcaaccctgtgagagtacacattgaaattggtcctgatggcagagtaactggtgaagcagatgtcgagttcgcaactcatgaagatgctgtggcagctatgtcaaaagacaaagcaaatatgcaacacagatatgtagaactcttcttgaattctacagcaggagcaagcggtggtgcttacgaacacagatatgtagaactcttcttgaattctacagcaggagcaagcggtggtgcttatggtagccaaatgatgggaggcatgggcttgtcaaaccagtccagctacgggggcccagccagccagcagctgagtgggggttacggaggcggctacggtggccagagcagcatgagtggatacgaccaagttttacaggaaaactccagtgattttcaatcaaacattgcataggtaaccaaggagcagtgaacagcagctactacagtagtggaagccgtgcatctatgggcgtgaacggaatgggagggttgtctagcatgtccagtatgagtggtggatggggaatgtaattgatcgatcctgatcactgactcttggtcaacctttttttttttttttttttctttaagaaaacttcagtttaacagtttctgcaatacaagcttgtgatttatgcttactctaagtggaaatcaggattgttatgaagacttaaggcccagtatttttgaatacaatactcatctaggatgtaacagtgaagctgagtaaactataactgttaaacttaagttccagcttttctcaagttagttataggatgtacttaagcagtaagcgtatttaggtaaaagcagttgaattatgttaaatgttgccctttgccacgttaaattgaacactgttttggatgcatgttgaaagacatgcttttattttttttgtaaaacaatataggagctgtgtctactattaaaagtgaaacattttggcatgtttgttaattctagtttcatttaataacctgtaaggcacgtaagtttaagctttttttttttttaagttaatgggaaaaatttgagacgcaataccaatacttaggattttggtcttggtgtttgtatgaaattctgaggccttgatttaaatctttcattgtattgtgatttccttttaggtatattgcgctaagtgaaacttgtcaaataaatcctccttttaaaaactgc(SEQ ID NO：86)
La蛋白质mRNA(Genbank登记号No.NM005520)的编码序列示于表6。ATG起始密码子和TAA终止密码子以粗体字体标示，以下划线标示出siRNA试剂靶向位点。
表6
La蛋白质的核苷酸序列
ccggcggcgctgggaggtggagtcgttgctgttgctgtttgtgagcctgtggcgcggcttctgtgggccggaaccttaaagatagccgtaatggctgaaaatggtgataatgaaaagatggctgccctggaggccaaaatctgtcatcaaattgagtattattttggcgacttcaatttgccacgggacaagtttctaaaggaacagataaaactggatgaaggctgggta cctttggagataatgataaaattcaacaggttgaaccgtctaacaacagactttaatgtaattgtggaagcattgagcaaatccaaggcagaactcatggaaatcagtgaagataaaactaaaatcagaaggtctccaagcaaacccctacctgaagtgactgatgagtataaaaatgatgtaaaaaacagatctgtttatattaaaggcttcccaactgatgcaactcttgatgacataaaagaatggttagaagataaaggtcaagtactaaatattcagatgagaagaacattgcataaagcatttaagggatcaatttttgttgtgtttgatagcattgaatctgctaagaaatttgtagagacccctggccagaagtacaaagaaacagacctgctaatacttttcaaggacgattactttgccaaaaaaaatgaagaaagaaaacaaaataaagtggaagctaaattaagagctaaacaggagcaagaagcaaaacaaaagttagaagaagatgctgaaatgaaatctctagaagaaaagattggatgcttgctgaaattttcgggtgatttagatgatcagacctgtagagaagatttacacatacttttctcaaatcatggtgaaataaaatggatagacttcgtcagaggagcaaaagaggggataattctatttaaagaaaaagccaaggaagcattgggtaaagccaaagatgcaaataatggtaacctacaattaaggaacaaagaagtgacttgggaagtactagaaggagaggtggaaaaagaagcactgaagaaaataatagaagaccaacaagaatccctaaacaaatggaagtcaaaaggtcgtagatttaaaggaaaaggaaagggtaataaagctgcccagcctgggtctggtaaaggaaaagtacagtttcagggcaagaaaacgaaatttgctagtgatgatgaacatgatgaacatgatgaaaatggtgcaactggacctgtgaaaagagcaagagaagaaacagacaaagaagaacctgcatccaaacaacagaaaacagaaaatggtgctggagaccagtagtttagtaaaccaattttttattcattttaaataggttttaaacgacttttgtttgcggggcttttaaaaggaaaaccgaattaggtccacttcaatgtccacctgtgagaaaggaaaaatttttttgttgtttaacttgtctttttgttatgcaaatgagatttctttgaatgtattgttctgtttgtgttatttcagatgattcaaatatcaaaaggaagattcttccattaaattgcctttgtaatatgagaatgtattagtacaaactaactaataaaatatatactatatgaaaagagc(SEQ ID NO：87)
如实施例1所述合成及制备RNA双链体。靶向HNRPH1的RNA双链体在表7中概括示出。
表7：寡核苷酸试剂的概述
Figure G2008800213852D00411
结果
合成RNA双链体，其靶向人hnRNP H mRNA(通过western印迹分析)和编码La蛋白质的mRNA(通过northern印迹分析)中随机选择的位点(图5C和5D)。对于这两个靶位，27mer双链体比21mer siRNA在靶向这些信息方面更有效。
实施例11：27mer的序列特异性
为了检测27mer dsRNA的序列特异性，合成与EGFP靶mRNA具有1、2或3个错配的一系列27+0dsRNA，并且在0nM、1nM和200pM浓度在共转染测定中检测(图6)。突变的27+0dsRNA的序列在表2中示出。在200pM浓度，每个错配的序列均比野生型27mer dsRNA的效力低；具有3个错配的27mer dsRNA在所有检测浓度在触发RNAi中完全无效。使用靶向EGFP的“位点2”的27mer dsRNA获得相似结果。
实施例12：干扰素应答的缺乏
本实施例证实本发明的dsRNA双链体不激活干扰素应答。
干扰素和PKR测定
在用20nM前述每种RNA转染293细胞后，24小时后收集培养基，并如先前所述用于干扰素α和β的ELISA测定(Kim et al.，2004)。如先前所述进行PKR活化测定(Gunnery and Mathews，1998)。溶胞产物中的PKR首先通过与指定RNA共保温激活，并且通过其自身激酶反应放射性标记。然后将放射标记的PKR免疫沉淀以进行分析。为了确定未预先激活的细胞溶胞产物中PKR的活性，省略dsRNA。将该反应物在30℃保温20分钟。使用多克隆抗体免疫沉淀来自该反应的PKR。将多克隆抗体加入该反应物中，然后将其置于冰上1小时，随后加入50μl的在IPP500(10mM Tris，pH8，500mM NaCl，0.1％ Nonidet P-40)中的10％蛋白质A-琼脂糖凝胶(Sepharose)。将这个混合物在4℃摇动30分钟。用1ml IPP100缓冲液(10mMTris，pH 8，100mM NaCl，0.1％Nonidet P-40)洗涤蛋白质A-琼脂糖凝胶珠5次。在最后一次洗涤后，将该珠在蛋白质样品缓冲液中煮沸，并加样于SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，随后进行放射自显影术。
结果
使用较长的dsRNA的一个潜在问题是PKR的活化以及干扰素的诱导(Manche et al.，1992)。因此我们评估了转染的27mer dsRNA是否激活干扰素-α(图7A)或者干扰素-β(图7B)。作为干扰素诱导的阳性对照，如先前所报道的那样，转染潜在激活干扰素-α或者干扰素-β的含有三磷酸的单链RNA(Kim et al.，2004)。当使用21+2siRNA或27+0dsRNA时，两个细胞因子均检测不到。我们将这个观测结果扩展为特异于EGFP-S2和EGFP-S3位点的两个其它27mer序列。也如先前所述测定细胞溶胞产物中PKR活化情况(Gunnery and Mathews，1998)。将溶胞产物用指定RNA处理，随后进行免疫沉淀。阳性对照长dsRNA激发PKR活化，但是较短的RNA无一激活PKR(图7C)。
实施例13：不对称的27mer双链体设计和碱基修饰可影响切割(Dicing)模式且可以智能设计27mer
本实施例证实通过Dicer作用于27mer产生的多个物种以及设计27mer和/或修饰碱基可用于指导这些降解模式、限制异质性，以及预测终产物。
在实施例6、图3A和3B中证实可以通过Dicer作用于EGFPS1 27mer双链体而产生的所有单独的21mer在抑制EGFP中均比27mer双链体效力低。然而，产生哪个21mer可影响最终效力。使用电喷射质谱测定确定哪个21mer是得自Dicer对27mer底物RNA的酶消化的实际产物。一种以上的21mer可得自Dicer消化27mer。可以控制切割模式，使得可以进行智能设计。
体外切割反应的电喷射质谱测定
将RNA双链体(100pmole)与1单位重组人Dicer(Stratagene，La Jolla，CA)在20μl的20mM Tris pH 8.0，200mM NaCl，2.5mM MgCl2中保温12-24小时。使用Oligo HTCS***(Novatia，Princeton，NJ)对用Dicer处理前和处理后的双链体RNA进行电喷射离子化液相层析质谱分析(ESI-LCMS)，该***由ThermoFinnigan TSQ7000、Xcalibur数据***、ProMass数据处理软件和Paradigm MS4TM HPLC组成(Michrom BioResources，Auburn，CA)。在注射进质谱分析仪(LC-MS)之前使用的液相层析步骤除去与核酸复合的大多数阳离子；一些钠离子可以保持与RNA结合，且被观测为较小的+22或+44种类，且是用钠取代氢可见的净质量增加。这个测定的精确性是这个大小的寡核苷酸+/-2道尔顿左右。
结果
用Dicer消化EGFPS 1-27+0双链体，获得消化前(图8A)和消化后(图8B)的质谱。通常地，Dicer使27mer双链体裂解为具有5’磷酸酯的21mer长度片段。通常也产生较少量的22mer。有时也可观测到少量20mer和23mer。通过与起始序列对比观测到的质量，可以推断在这个切割反应中产生具有2个碱基的3’突出端和5’磷酸酯的4个双链体。这些种类代表两个主要的裂解产物，这两个产物均导致21mer和22mer双链体。小写字母p表示磷酸酯基团。对可得自体外Dicer裂解的每个可能的消化产物计算的质量示于表8。
表8
通过Dicer加工衍生自27mer双链体的可能的双链体的分子量
Figure G2008800213852D00441
在实施例2和图1A-1C中证实片平端双链体或者具有5’突出端的双链体可示出与具有3’突出端的双链体相似或更好的效力。在这些研究中，双链体的两端均是对称的(即两端是平端，两端是3’突出端，或者两端是5’突出端)。在相似的研究中，发现在一端具有2个碱基错配的平端27mer双链体比检测的对称的平端、3’突出端或者5’突出端物种具有更高效力。在一端具有2个碱基错配的平端双链体可模拟在一端具有2个碱基的3’突出端及在另一端具有平端的不对称双链体的行为。检测这种不对称的27mer双链体，发现其具有增强的效力和较少的切割产物(较低异质性)，并导致更可预测的模式。
许多酶的双链RNA结合结构域通常特异性识别RNA和非DNA或者一些修饰的RNA。本发明研究了在平端27mer双链体的末端***DNA残基。在一个链的3’末端具有DNA残基的不对称设计导致较少的切割(较低异质性)，且通常产生可预测的模式，这与不对称的3’突出端设计的结果相反。
将EGFPS1-27+0双链体修饰为在一侧具有不对称的3’突出端及在另一侧3’末端具有2个DNA碱基。在3’突出端将5’-磷酸酯置于凹进去的链上以模拟切割加工。这种设计的最终双链体示出在下面与原始平端27mer对齐。小写字母t表示DNA dT碱基，小写字母p表示磷酸酯基团。计算的质量示于表9。
表9：
双链体的分子量
Figure G2008800213852D00451
获得消化前(图8C)和消化后(图8D)的质谱。分析从修饰的不对称双链体中产生的切割产物比分析对称双链体简便(对比图8B与8D)。观测到单裂解产物，其主要是21mer双链体，具有少量可检测的22mer。小写字母t表示DNA dT碱基，小写字母p表示磷酸酯基团。计算的质量示于表10。
表10：
通过Dicer加工衍生自27mer/25mer双链体的可能的双链体的分子量
Figure G2008800213852D00452
使用具有一个2个碱基的3’突出端和选择性掺入DNA残基的不对称设计简化了切割反应，产生单一的主要裂解产物。这个设计另外使得可以预测切割模式以及可以智能设计27mer，由此可以通过切割产生希望的21mer。正如所证实的，研究重叠EGFPS1-27-L序列的另一种27mer双链体EGFPS1-27-R。计算的质量示于表11。
表11：双链体的分子量
获得消化前(图9A)和消化后(图9B)的质谱。分析从EGFPS 1-27+0R双链体中产生的切割产物示出与EGFPS 1-27+0L双链体相似的复合模式。观测到两种主要的裂解产物，21mer和22mer均存在。也观测到极少量的20mer种类。小写字母p表示磷酸酯基团。对可得自体外Dicer裂解的每种可能的消化产物计算的质量示于表12。
表12
通过Dicer加工衍生自27mer双链体的可能的双链体的分子量
Figure G2008800213852D00462
下文示出了将EGFPS 1-27+0-R双链体转变为DNA-修饰的不对称25/27mer双链体，在体外切割测定中研究这个双链体。小写字母eg表示DNA dCdG碱基，小写字母p表示磷酸酯基团。计算的治疗示于表13。
表13：双链体的分子量
Figure G2008800213852D00463
获得消化前(图9C)和消化后(图9D)的质谱。所述DNA修饰的不对称EGFPS 1-25/25R双链体示出纯净的单一切割的21mer，如表14所概述。小写字母p表示磷酸酯基团。
表14
通过Dicer加工衍生自25mer/27mer双链体的可能的双链体的分子量
如果对比图8D与9D的结果，可以看出两种不同的不对称双链体EGFPS 1-27/25 L和EGFPS 1-25/27R的消化导致相同21mer种类EGFPS1-21(3)的形成。小写字母t或者eg表示DNA碱基，小写字母p表示磷酸酯基团。计算的质量示于表15。
表15：双链体的分子量
Figure G2008800213852D00472
因此，使用本发明的教导的DNA修饰的不对称双链体降低了27merRNA种类切割反应的复杂性，并且使得可以智能设计用于RNAi的27mer，由此其可以特异性靶向希望的位置。Dicer对底物27mer的裂解导致独特的可预测的21mer，其中所述21mer的一端与底物27mer的3’突出端末端一致。
实施例14：具有碱基修饰的不对称27mer双链体设计可改善效力超过平端27mer
本实施例证实本发明教导的新的不对称RNA双链体可改善效力超过平端27mer双链体，所述新双链体在一侧具有2个碱基的3’突出端，在另一侧具有3个碱基3’DNA修饰的平端。
在实施例13和图8A-8D及9A-9D中证实，使用不对称双链体可指导切割并且获得单一的主要21mer裂解产物。进一步地，27/25 L和25/27 R不对称双链体在切割后均获得相同的21mer双链体。由于所述相同的21mer双链体从两个不对称27mer中各自产生，因此本领域技术人员预期这些化合物应功能性具有相似效力。本实施例示出情况不是这样，且25/27R设计未曾预料地具有相对于27/25L双链体和平端27+0双链体增强的效力。
将靶向EGFPS2的RNA双链体与EGFP表达质粒共转染进HEK293细胞中，根据上述方法在保温24小时后测定EGFP活性。转染的双链体在表16中示出。小写字母p表示磷酸酯基团，小写字母cc和gt表示DNA碱基，大写字母碱基表示RNA。
表16：转染的双链体
Figure G2008800213852D00481
先前在实施例9中使用EGFPS2-21+2和EGFPS2-27+0 RNA双链体。EGFPS2-27/25 L和EGFPS2-25/27 R双链体是根据本发明设计的新的不对称dsRNA，靶向EGFP的相同位点-位点II。在如实施例13所述体外切割电喷射质谱测定中，EGFPS2-27/25 L和EGFPS2-25/27 R双链体在经Dicer消化后均产生相同21mer产物，与EGFPS2-21+2双链体相似。
转染结果在图10A中示出。如先前所示出，EGFPS2-21+2双链体在抑制EGFP表达中具有最小活性，而27+0双链体示出显著抑制作用。27/25 L双链体比27+0双链体效力略低，25/27 R双链体效力最强。基于现有技术的教导，这个发现是未曾预料的，因为这两种不对称双链体在切割后产生相同的21mer种类。
使用EGFPS1双链体27/25 L和25/27 R进行相似转染。这些双链体在经切割后产生相同21mer产物EGFPS1-21(3)双链体(实施例13)。转染的双链体在表17中示出。小写字母p表示磷酸酯基团，小写字母tt表示DNA碱基，而大写字母碱基表示RNA。
表17：转染的双链体
Figure G2008800213852D00482
转染后EGFP表达在图10B中示出。如前所述，25/27 R双链体与27/25L双链体相比在降低EGFP表达方面效力更强。在相似的实验中，将平端27mer与25/27 R双链体和27/25 L双链体对比，发现dsRNA具有如下效力：
25/27 R双链体＞27/25 L双链体＞27mer
27mer双链体RNA与21mer双链体相比在抑制靶基因表达方面可示出显著较高的效力。平端27mer在切割后可产生多种21mer种类，因此平端27mer双链体的精确性能不总是可预测。本发明的新的不对称双链体使得切割以可预测方式发生，由此精确21mer结果，所述新的双链体其中一侧具有2个碱基的3’突出端，另一侧是平端且在3’末端具有碱基修饰如DNA。这些不对称双链体，即27/25 L和25/27 R，均比21mer效力更强。所述不对称25/27R设计是本发明最有效的实施方案。
图11举例对比了本发明的实施方案。靶基因序列如SEQ ID NO：116所示。用作siRNA分子的“典型的”亲本21mer示出与靶基因序列排列一致。与靶基因及亲本21mer序列排列一致的是L 27mer v2.1，其在有义链上含有3’突出端，以及在反义链3’末端含有2个DNA碱基。图中也示出了切割的裂解产物。这个序列对比例证了这些前体RNAi分子设计中的左移。与靶基因和亲本21mer序列排列一致的还有R 27mer v2.1，其在反义链上含有3’突出端，以及在有义链3’末端含有2个DNA碱基。图中也示出了切割的裂解产物。这个序列对比例证了这些前体RNAi分子设计中的右移。
实施例15：有效剂量的确定
本实施例证实确定本发明的dsRNA在哺乳动物中有效剂量的方法。含有编码dsRNA的序列的组合物的治疗有效量(即有效剂量)，是使靶基因产物表达抑制至少10％的量。在某些情况中可希望更高百分比的抑制作用，例如20％、50％、90％、95％、99％。举例的剂量包括mg或μg量的分子/kg对象或样品重量(例如大约1μg/kg至大约5mg/kg，大约100μg/kg至大约0.5mg/kg，或者大约1μg/kg至大约50μg/kg)。所述组合物可以每周给予一或多次，共给予大约1-10周，例如2-8周或者大约3-7周，或者大约4、5或6周，根据主治医生认为需要而给予。用治疗有效量的组合物治疗对象可包括一次治疗或者一系列治疗
特定dsRNA组合物的合适剂量根据所述分子调节表达或活性的效力而确定。一或多种这些分子可以给予动物，特别是哺乳动物，尤其是人，以调节一或多个靶基因的表达或活性。医生可例如首先开出相对较低剂量的处方，随后逐渐增加剂量直至获得适当应答。此外，应理解对于任何特定对象的特定剂量水平依赖于多种其它因素，包括疾病的严重性、先前的治疗方案、存在的其它疾病、活性剂的脱靶效应、体重、一般状况、性别以及患者的饮食、给药时间、给药途径、***速度、任何药物组合，以及被调节的表达程度或活性。
治疗效力可以通过测量靶基因mRNA的量(例如使用实时PCR)或者通过Western印迹分析测量靶基因编码的产物的量进行监测。此外，主治医生可以监测与患者疾病或病症相关的症状，并且与在开始治疗之前记录的那些症状比较。
从最近的研究中获知RNAi的作用不是完全特异性的，不希望的“脱靶”效应可以根据siRNA的浓度大小而出现(Persengiev et al.，2004)。新的Dicer底物dsRNA方法可便于使用较低浓度的双链体RNA而不是需要使用传统的21mer siRNA。从公布的数据中获知“脱靶”效应可以在使用21mer siRNA的细胞系中出现(Persengiev et al.，2004；Jackson et al.，2003)，但是这些脱靶效应可以通过使用在较低至亚纳摩尔范围具有效力的试剂而最小化(Persengiev et al.，2004)。为了检测使用Dicer底物dsRNA的“脱靶”效应的潜力，进行微阵列分析对比均靶向EGFP位点1的siRNA 21mer与27mer。用提供有效靶降低(knockdown)的浓度的siRNA转染稳定表达EGFP的NIH3T3细胞(图2A，图7D)。在转染24小时和48小时后从细胞中制备总RNA，并且通过与图7D所述寡核苷酸微阵列杂交进行分析。在分析的16,282个小鼠基因中，仅一小部分示出高于或低于对照值两倍以上的正调节或负调节(图7D)。所述27mer和21mer在其有效RNAi浓度提供相似结果。当使用25nM较高浓度27mer时，正调节的转录物数目增加，但是与在24小时vs.48小时以及5nM vs.25nM对比受影响的靶时无重叠。这些改变与检测的16282个基因中的统计学散射(statistical scatter)而非特异的“脱靶效应”更一致。使用EGFP-S2 27+0双链体RNA重复相同测定，获得相似结果。
鉴于27mer dsRNA的效力相对于21+2siRNA增强，感兴趣的是先前未报到过这个观测结果。尽管其它人使用直至27bp的dsRNA在哺乳动物细胞中进行过RNAi研究(Bohula et al.，2003；Caplen et al.，2001)，但是据报道与传统的21+2双链体对比效力无差别。先前研究与我们自己的研究中的这种差异可简单地归因于检测的dsRNA的浓度不同所致。21mer siRNA的“好”位点在纳摩尔范围可具有效力(Reynolds et al.，2004)。当在高浓度转染的RNA检测“好”位点时，21mer siRNA与27mer dsRNA之间的差异很可能很小而易于被忽略。在较低纳摩尔或皮摩尔浓度检测示出的效力最明显的差异，这有时在大多数实验室中不常规进行。
迄今为止，所述27mer dsRNA设计示出在每个检测的位点均相对于21+2siRNA具有增强的RNAi效力。然而，在本发明研究的一组27mer内，在相同基因内不同靶位点之间仍可见一系列效力范围(图3B)。我们已经揭示即使在不存在完全优化的设计规则的情况中，使用Dicer底物dsRNA的方法与传统21+2siRNA相比仍可增加RNAi效力。此外，使用27mer dsRNA使得可以靶向指定序列中的一些位点，这些位点对于传统21mer siRNA的抑制耐受。使用Dicer底物dsRNA触发RNAi在低于使用21+2需要的RNA浓度应导致RNAi效力增强及持续时间延长。与我们的联合Dicer裂解增强RNAi效力的结果一致，最近示出是Dicer底物的化学合成的发夹RNA与常规siRNA相比是更有效的RNAi诱导剂，此外，2个碱基的3’突出端指导Dicer裂解(Siolas et al.，2005)。
实施例16：修饰模式的调查
选择已知对于RNAi介导的STAT1基因抑制有效的位点，调查在21mersiRNA和27mer DsiRNA中的多种不同修饰模式，以检测在组织培养物中的相对效力和任何毒性作用。
检测的19-21mer RNA在表18中列出。
表18：具有不同修饰模式的19-21mer双链体
RNA＝AGCU  2’OMe RNA＝AGCU  2’F＝cu  p＝5’-pbos
Figure G2008800213852D00511
Figure G2008800213852D00521
使用Oligofectamine将所述RNA双链体转染进24孔平板中的HeLa细胞中。在10nM和1nM浓度一式三份转染RNA。转染后24小时，从培养物中制备RNA并产生cDNA；一式三份进行qRT-PCR测定，并将数据标准化为RPLPO(酸性核糖体蛋白PO)mRNA水平，使用阴性对照siRNA为100％。结果列于图12中。
一些修饰模式作用良好，而其它模式则否。特别地，与Czaudema et al.(NAR 31：2703 2003)关于交替2’-O-Me RNA模式的结果和发现一致。对于这个序列/位点，完全修饰的双链体是无活性的，或者至少具有非常明显的效力丧失。在10nM浓度进行的转染未示出对于高度修饰的种类可评估的效力改善。在研究的24小时窗口期，无一种类示出在细胞培养物中明显毒性。
接下来的修饰调查扩大至不对称的25/27mer DsiRNA双链体设计。合成修饰的寡核苷酸并退火产生DsiRNA双链体。“切割结构域”未被修饰，以便不阻断核酸内切酶Dicer裂解底物为希望的21mer终产物的能力，如图13示出的示意图所述。修饰的25-27mer RNA列于表19。
表19：具有不同修饰模式的25-27mer双链体
RNA＝AGCU  2’OMe RNA＝AGCU   2’F＝cu   p＝5’-rhos  DNA＝tg
Figure G2008800213852D00541
如19-21mer双链体一样，使用Oligofectamine将25-27mer RNA双链体转染进24孔平板中HeLa细胞中。一式三份以10nM和1nM浓度转染RNA。在转染后24小时，从培养物中制备RNA并产生cDNA；一式三份进行qRT-PCR测定，并将数据标准化为RPLPO(酸性核糖体蛋白PO)mRNA水平，使用阴性对照siRN A作为100％。结果列于图14中。
结果
通常地，更大量修饰的双链体示出效力降低，特别是用2’-O-甲基和2’-F广泛修饰的那些双链体。不完全修饰的双链体示出与未修饰的双链体相似的效力。优选应用有限的2’-O-甲基修饰的模式。
基于实施例16中所述的结果，选择经证实具有高起始效力的模式进行更详细研究。选择在随后的实施例中被称作“ASm”的如下DsiRNA进行进一步检测：
5′pGCACCAGAGCCAAUGGAACUUGAtg(SEQ ID NO：179)
3′UUCGUGGUCUCGGUUACCUUGAACUAC(SEQ ID NO：207)
所述DsiRNA与SEQ ID NO：179和180所示双链体相同，除了在反义链3’突出端包含的碱基用2’-O-甲基修饰之外。所述ASm具有由27个单体组成的反义链，其含有2’-O-甲基修饰的突出端碱基以及2’-O-甲基修饰的交替碱基及任选含有5’磷酸酯，以及由25个单体组成的有义链，其中3’末端的2个单体是DNA且含有5’磷酸酯。
实施例17：在EGFP中2’-O-甲基RNA修饰模式的研究
使用双重-Luc萤光素酶/EGFP融合报道基因进行接下来的一系列实验。设计DsiRNA，其靶向包埋于FLuc基因3’-UTR中的增强的绿色荧光蛋白(EGFP)序列。
将10nM每种DsiRNA与同时编码靶(Renilla)和Normalizer(萤火虫)萤光素酶编码区的单个质粒一起共转染进HCT1 16细胞中(具有靶向Renilla中GFP序列的阻断的27mer的psiCheck-GFP)。在转染后24小时进行双重萤光素酶测定(Promega)，将Renilla活性(靶)根据萤火虫萤光素酶标准化。检测的DsiRNA列于下表20中。
表20：DsiRNA修饰模式
RNA＝AGCU  2’OMe RNA＝AGCU   p＝5’-phos  DNA＝cg
Figure G2008800213852D00551
如图15所示，所有单链修饰的变体作用良好，而双链修饰的变体则不是这样。ASm模式(#3阻断的)性能良好。
实施例18：ASm设计在人HPRT1基因中的效力
在已知有效位点设计靶向人HPRT基因(NM_000194)的ASm和相关交替的2’-O-甲基修饰模式的DsiRNA。所述DsiRNA在表21中列出。
表21：用人HPRT基因检测的DsiRNA
RNA＝AGCU   2’OMe RNA＝AGCU   p＝5’-phos   DNA＝agct
Figure G2008800213852D00561
使用10nM、1nM和0.1nM浓度的Oligofectamine将双链体转染进HeLa细胞中。HeLa细胞在24孔平板中***至35％铺满，并且使用Oligofectamine(Invitrogen，Carlsbad，CA)使用1μL/65μL OptiMEM I及指定浓度RNA双链体在第二天用转染。所有转染一式三份进行。使用SV96 TotalRNA分离试剂盒(Promega，Madison，WI)在转染后24小时收获RNA。使用Bioanalyzer 2100(Agilent，Palo Alto，CA)检测RNA性质，使用500ng总RNA与SuperScript-II逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)根据厂商指导及使用oligo-dT和随机六聚体引物制备cDNA。进行定量qRT-PCR以评估HPRTmRNA的相对降低(knockdown)，使用RPLPO基因作为内部参考标准以及阴性对照DsiRNA为100％参考水平。
如图16所例证，ASm修饰形式与在相同位点未修饰的DsiRNA双链体的效力最相似。“ASm Total”双链体在整个AS链具有交替的2’O-Me修饰，其也有效降低HPRT mRNA水平，但是在较低剂量(0.1nM)比野生型或ASm模式的效力低。得自体外切割测定的数据表明在“ASm Total”双链体中使用的2’-O-甲基修饰模式阻止Dicer的正常加工(见实施例20)。这些数据最简单明了的解释是这个DsiRNA的完整27个核苷酸的AS链可直接加样于RISC中，并且在不存在Dicer裂解为21mer siRNA的情况中触发RNAi。
为了检测这个假说，设计“末端突变”版本的HPRT DsiRNA，其中该序列的最后4个碱基(AS链的5’-末端)被突变(见表21序列表)。如果27mer加样完整，这样将阻断“种子区”的杂交，且因此应阻断或者显著降低这个双链体触发RNAi介导的抑制HPRT mRNA的活性。如果在RISC加样前发生Dicer裂解，则该4个碱基突变的结构域被裂解掉，获得的21mer产物与正常野生型序列相同。
未修饰的末端突变的序列示出与野生型HPRT DsiRNA相似的效力，这是如果Dicer裂解发生的预期结果。然而，“ASm-total”版本的末端突变序列示出显著降低的效力，这是如果突变序列加样于RISC中未Dicer裂解的预期结果。因此看起来如果底物dsRNA是可裂解的(即不具有跨越裂解位点的核酸酶抗性修饰)则进行Dicer加工。如果DsiRNA在切割位点内被修饰且不能被Dicer加工，则dsRNA仍可发挥RNAi触发剂的功能，大概是作为完整27mer通过RISC加样所致，但是效力降低。因此希望但非必须用于DsiRNA的修饰模式使用在预期的Dicer加工位点的可裂解的碱基和核苷酸内连键。
实施例19：ASm修饰的HPRT DsiRNA的Dicer加工
对未修饰的和修饰的双链体进行体外切割测定。将双链体与重组人Dicer一起保温，对反应产物进行ESI-MS(电喷射质谱测分析)。将RNA双链体(100pmol)与或不与1单位重组人Dicer(Stratagene，La Jolla，CA)在20μL的20mM Tris pH 8.0，200mM NaCl，2.5mM MgCl2中在37℃保温24小时。使用Performa SR 96孔平板(Edge Biosystems，Gaithersburg，MD)对样品脱盐。使用Oligo HTCS***(Novatia，Princeton，NJ)对用Dicer处理前和处理后的双链体RNA进行电喷射离子化液相层析质谱分析(ESI-LCMS)，所述***由ThermoFinnigan TSQ7000、Xcalibur数据***、ProMass数据处理软件和Paradigm MS4TM HPLC(Michrom BioResources，Auburn，CA)组成。在注射进质谱分析仪之前使用的液相层析步骤(LC-MS)除去大多数与核酸复合的阳离子；一些钠离子可以保持与RNA结合且作为较少的+22或+44种类观测到，其是用钠取代氢观测到的净质量增加。所有切割实验均进行至少两次。质量数据在表22中概括示出。
表22：Dicer加工后获得的DsiRNA
RNA＝AGCU  2’OMe RNA＝AGCU  p＝5’-phos  DNA＝agct
Figure G2008800213852D00581
未修饰的HPRT DsiRNA被切割为21mer种类。ASm修饰的HPRTDsiRNA被切割为21mer和22mer产物的等量混合物，在预期位置发生裂解。ASm-total修饰的HPRT DsiRNA不经历正常Dicer加工。未修饰的S-链被裂解为22mer，然而2’-O-Me修饰的AS链保持未切割。因此，交替的2’-O-甲基RNA模式是Dicer核酸内切酶裂解抗性的。
实施例20：通过qRT-PCR测定测量干扰素应答
开发特异于人和小鼠基因的一组qRT-PCR测定，其包括由先天免疫***识别核酸。监测这些基因的相对水平是检测免疫途径活化的一种方法。检测的免疫受体、信号分子、干扰素应答基因(IRG)以及对照在表23中列出。
表23：针对IFN活化检测的基因
Figure G2008800213852D00591
研究T98G细胞，因为已知这些细胞在组织培养中强力应答dsRNA。特别地，这些细胞示出具有可识别本发明类型的较长RNA的受体/信号途径(Marques，et al.2006)。使用高剂量(100nM)siLentFect阳离子脂质(Bio-RadLaboratories)转染两个版本的抗-HPRT DsiRNA，即未修饰的和ASm 2’-O-甲基修饰的抗-HPRT DsiRNA(见实施例18的表21)。在转染后24小时在细胞培养物中测定IFN途径基因，使用单独脂质作为0基线。使用高剂量(100nM)siLentFect阳离子脂质(Bio-Rad Laboratories)转染两个版本的抗-HPRTDsiRNA，即未修饰的和ASm 2’-O-甲基修饰的抗-HPRT DsiRNA(见实施例18的表21)。在转染后24小时在细胞培养物中测定IFN途径基因，使用单独脂质作为0基线。
使用估计33ng cDNA/25μL反应及使用Immolase DNA聚合酶(Bioline，Randolph，MA)和200nM引物和探针进行实时PCR反应。使用的循环条件是：50℃2分钟及95℃10分钟，随后是95℃15秒及60℃1分钟的两步PCR的40次循环。PCR和荧光测量使用ABI Prism(TM)7000序列检测仪或者ABI Prism(TM)7900序列检测仪(Applied Biosystems Inc.，Foster City，CA)进行。所有数据点均一式三份进行。表达数据标准化为在单独的孔中平行测量的内部对照人酸性核糖体磷蛋白PO(RPLPO)(NM OO1 002)水平。
结果在图17A中示出。用未修饰DsiRNA的处理T98G细胞导致先天免疫***内的许多IFN应答基因和受体受到有效刺激。使用ASm 2’-O-甲基修饰的RNA导致最低的途径活化。图17B和17C更清楚地示出对照序列。RPLPO(对照)和HPRT(靶)mRNA在用未修饰的DsiRNA处理的细胞中均被降低至极低水平，这是mRNA发生总体降解的迹象(典型为I型IFN应答)；而在ASm处理的细胞中，对照mRNA RPLPO水平正常，靶HPRT水平降低(表示成功RNAi抑制)。
实施例21：使用细胞因子测定测量对DsiRNA的免疫应答
本领域熟知当在体内给予dsRNA(包括21mer siRNA)时处于触发先天免疫应答(I型IFN应答)的风险中，特别是当与基于脂质的输送试剂(最大化暴露于其中存在Toll-样受体(TLR)3、7和8的内涵体区室)复合给予时。在21mer中用2’-O-甲基RNA修饰示出通常阻止IFN活化(Judge et al.，Molecular Therapy 2006)。
使用得自Upstate(Millipore)的试剂进行细胞因子测定。这些测定是使用Luminex荧光微珠平台的多元运转的基于抗体的测定。确定标准曲线以允许绝对量化。根据厂商指导进行测定。
研究T98G细胞在用修饰和未修饰的HPRT DsiRNA转染后细胞因子的释放。使用来自在实施例20中研究基因表达的相同培养物的上清，因此可以在同一实验内直接对比细胞因子分泌和基因表达。使用高剂量(100nM)siLentFect(阳离子脂质)转染RNA。在转染后24小时对培养上清进行细胞因子测定，使用单独的脂质作为0基线。
图18证实当使用未修饰的RNA时，观测到高水平的炎症细胞因子IL-8和IL-6的释放。当用ASm模式的2’-O-甲基RNA转染修饰相同序列时，观测到细胞因子水平无明显升高。
实施例22：DsiRNA的血清稳定性
如下实施例证实赋予有或无修饰的DsiRNA的免于核酸酶降解的相对保护水平。
将RNA在50％胎牛血清中在37℃保温不同时间(直至24小时)。提取血清，在20％非变性PAGE上分离核酸，并使用Gelstar染色观测。标记是指定长度的平端双链体。研究的序列在表24中列出。
表24：在血清中检测DsiRNA稳定性
RNA＝AGCU  2’OMe RNA＝AGCU   p＝5’-phos   DNA＝tt
Figure G2008800213852D00611
如图19所例证，27mer DsiRNA示出甚至在无化学修饰时在血清中改善的稳定性。通过这个测定，在ASm模式中加入2’-O-甲基RNA看起来不改善稳定性。ASm+5’P修饰模式不改善稳定性。21mer siRNA示出快速降解为可能代表平端19mer(降解的第一步是除去ssRNA 3′-突出端)的种类。双链体dsRNA结构域的降解被减慢。
将已经进行血清降解的RNA通过HPLC分离并纯化峰；使用NovatiaESI-MS平台(如先前针对体外切割测定描述的方法)通过LC-MS鉴别实际降解产物。令人感兴趣地，通过PAGE方法看起来是完整的条带(图21)实际上是混合物，包括完全和部分降解的RNA。质量分析表明由5’磷酸酯阻断的5’核酸外切酶活性的存在，因此在两个链上具有5’-磷酸酯基团的双链体(ASm+5’P)比未修饰的或者ASm修饰的双链体更完整。在24小时保温后在血清中存在的完整DsiRNA的相对量是ASm+5’P＞ASm＞野生型未修饰的双链体。5’-磷酸酯存在于天然发生的miRNA和得自Dicer加工的siRNA上。在合成的RNA双链体的所有链加入5’磷酸酯也许是赋予核酸酶活性一些限制程度的成本较低且生理学方法。
在描述本发明时(特别是在下文权利要求书中)，除非特别指出或者与本发明明显相矛盾，则所用术语“一个”和“所述…”及相似所指事物被解释为包括单数和复数。除非特别指出，则术语“包含”、“具有”、“包括”以及“含有”被解释为无限制术语(即是指“包括但不限于”)。除非特别指出，本文描述的数值范围仅是作为简略的表达方法，单独是指在这个范围内的每个单独数值，且只要在本文单独引用，则每个单独数值均并入该描述中。除非特别指出或者与本发明明显相矛盾，本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。本文提供的任何及所有实施例或者举例的语言描述(如“例如”)仅是为了更好地例证本发明，而无限制本发明范围之意。在本说明书中无文字应被解释为表示为实践本发明所需的任何非权利要求的原理。
本文描述了本发明实施方案，包括发明人已知的进行本发明的最佳模式。基于前文描述，本领域技术人员显然可了解这些实施方案的变化。本发明人期望技术人员适当利用这种变化，且本发明人意指可以不同于本文特别描述的方式实施本发明。因此，本发明包括在法律允许范围内对所附权利要求书中描述的对主题进行的所有修改和等价物。此外，除非特别指出或者与发明明显相矛盾，则上述原理的所有可能的变化的任意组合包含在本发明范围内。
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序列表
 
<110>希望之城
综合基因技术公司
 
<120>通过双链RNA特异性抑制基因表达的方法和组合物
 
<130>1954-489.PCT
 
<150>US 11/797,216
<151>2007-05-01
 
<160>234
 
<170>PatentIn version 3.3
 
<210>1
<211>720
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>EGFP from cloning vector pEGFP-C1
 
<400>1
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac     60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac    120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc    180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag    240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc    300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg    360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac    420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac    480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc    540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac    600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc    660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa    720
 
<210>2
<211>39
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>mRNA from EGFP from cloning vector pEGFP-C1
 
<400>2
gcaagcugac ccugaaguuc aucugcacca ccggcaagc                            39
 
<210>3
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>3
gcaagcugac ccugaaguuc a                                        21
 
<210>4
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>4
gaugaacuuc agggucagcu u                                        21
 
<210>5
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>5
aagcugaccc ugaaguucau c                                        21
 
<210>6
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>6
gaugaacuuc agggucagcu u                                        21
 
<210>7
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>7
ccugaaguuc aucugcacca c                                        21
 
<210>8
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
<400>8
ggugcagaug aacuucaggg u                                                       21
 
<210>9
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>9
cccugaaguu caucugcacc a                                                       21
 
<210>10
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>10
gugcagauga acuucagggu c                                                       21
 
<210>11
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>11
acccugaagu ucaucugcac c                                                       21
 
<210>12
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<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
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<400>12
ugcagaugaa cuucaggguc a                                                       21
 
<210>13
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>13
gacccugaag uucaucugca c                                                       21
 
<210>14
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>14
gcagaugaac uucaggguca g                                                21
 
<210>15
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>15
ugacccugaa guucaucugc a                                                21
 
<210>16
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>16
cagaugaacu ucagggucag c                                                21
 
<210>17
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>17
cugacccuga aguucaucug c                                                21
 
<210>18
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>18
agaugaacuu cagggucagc u                                                21
 
<210>19
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>19
gcugacccug aaguucaucu g                                                21
<210>20
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>20
gaugaacuuc agggucagcu u                                                    21
 
<210>21
<211>23
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>21
gcaagcugac ccugaaguuc auu                                                  23
 
<210>22
<211>23
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>22
cagaugaacu ucagggucag cuu                                                  23
 
<210>23
<211>23
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>23
gcugacccug aaguucaucu guu                                                  23
 
<210>24
<211>22
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>24
cagugaacuu cagggucagc uu                                                   22
 
<210>25
<211>24
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>siRNA
 
<400>25
gcaagcugac ccugaaguuc auuu                                                 24
 
<210>26
<211>24
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>26
gcagaugaac uucaggguca gcuu                                                 24
 
<210>27
<211>24
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>27
gcugacccug aaguucaucu gcuu                                                 24
 
<210>28
<211>24
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>28
gcagaugaac uucaggguca gcuu                                                 24
 
<210>29
<211>25
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>29
gcaagcugac ccugaaguuc aucuu                                                25
 
<210>30
<211>25
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>30
ugcagaugaa cuucaggguc agcuu                                                25
<210>31
<211>25
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>31
gcugacccug aaguucaucu gcauu                                                  25
 
<210>32
<211>25
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>32
ugcagaugaa cuucaggguc agcuu                                                  25
 
<210>33
<211>26
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>33
aagcugaccc ugaaguucau cugcac                                                 26
 
<210>34
<211>26
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>34
gugcagauga acuucagggu cagcuu                                                 26
 
<210>35
<211>26
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>35
aagcugaccc ugaaguucau cugcuu                                                 26
 
<210>36
<211>26
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
<400>36
gugcagauga acuucagggu cagcuu                                                 26
 
<210>37
<211>26
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
<400>37
gcaagcugac ccugaaguuc aucuuu                                                 26
 
<210>38
<211>26
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>38
gugcagauga acuucagggu cagcuu                                                 26
 
<210>39
<211>26
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>39
gcugacccug aaguucaucu gcacuu                                                 26
 
<210>40
<211>26
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>40
gugcagauga acuucagggu cagcuu                                                 26
 
<210>41
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>41
aagcugaccc ugaaguucau cugcacc                                                27
 
<210>42
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>42
ggugcagaug aacuucaggg ucagcuu                                                27
 
<210>43
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>conjugated to 6-FAM
 
<400>43
aagcugaccc ugaaguucau cugcacc                                                27
 
<210>44
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>conjugated to 6-FAM
 
<400>44
ggugcagaug aacuucaggg ucagcuu                                                27
 
<210>45
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(27)..(27)
<223>conjugated to 6-FAM
 
<400>45
aagcugaccc ugaaguucau cugcacc                                                27
 
<210>46
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(27)..(27)
<223>conjugated to 6-FAM
 
<400>46
ggugcagaug aacuucaggg ucagcuu                                              27
 
<210>47
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>47
aagcugaccc ugaaguucau cugcauu                                              27
 
<210>48
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>48
ggugcagaug aacuucaggg ucagcuu                                              27
 
<210>49
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>49
gcaagcugac ccugaaguuc aucuguu                                              27
 
<210>50
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>50
ggugcagaug aacuucaggg ucagcuu                                              27
 
<210>51
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>siRNA
 
<400>51
gcugacccug aaguucaucu gcacauu                                              27
 
<210>52
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>52
ggugcagaug aacuucaggg ucagcuu                                              27
 
<210>53
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>53
aagcugaccc ugaagaucau cugcauu                                              27
 
<210>54
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>54
ggugcagaug aucuucaggg ucagcuu                                              27
 
<210>55
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>55
aagcugaccc ugaagaacau cugcauu                                              27
 
<210>56
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>56
ggugcagaug uucuucaggg ucagcuu                                              27
<210>57
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>57
aagcugaccc ugaacaacau cugcauu                                                27
 
<210>58
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>58
ggugcagaug uuguucaggg ucagcuu                                                27
 
<210>59
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>59
aagcugaccc uguucaucau cugcacc                                                27
 
<210>60
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>60
ggugcagaug augaacaggg ucagcuu                                                27
 
<210>61
<211>28
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
<400>61
aagcugaccc ugaaguucau cugcacca                                               28
 
<210>62
<211>28
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>62
uggugcagau gaacuucagg gucagcuu                                              28
 
<210>63
<211>29
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>63
aagcugaccc ugaaguucau cugcaccac                                             29
 
<210>64
<211>29
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>64
guggugcaga ugaacuucag ggucagcuu                                             29
 
<210>65
<211>30
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>65
aagcugaccc ugaaguucau cugcaccacc                                            30
 
<210>66
<211>30
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>66
gguggugcag augaacuuca gggucagcuu                                            30
 
<210>67
<211>35
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>67
aagcugaccc ugaaguucau cugcaccacc ggcaa                                      35
 
<210>68
<211>35
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>68
uugccggugg ugcagaugaa cuucaggguc agcuu                                   35
 
<210>69
<211>40
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>69
aagcugaccc ugaaguucau cugcaccacc ggcaagcugc                              40
 
<210>70
<211>40
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>70
gcagcuugcc gguggugcag augaacuuca gggucagcuu                              40
 
<210>71
<211>45
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>71
aagcugaccc ugaaguucau cugcaccacc ggcaagcugc ccgug                        45
 
<210>72
<211>44
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>72
cacgggcagc uugccguggu gcagaugaac uucaggguca gcuu                         44
 
<210>73
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>probe
<400>73
accctgaagt tcatctgcac c                                                    21
 
<210>74
<211>32
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>mRNA from EGFP from cloning vector pEGFP-C1
 
<400>74
ugaagcagca cgacuucuuc aaguccgcca ug                                        32
 
<210>75
<211>34
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>mRNA from EGFP from cloning vector pEGFP-C1
 
<400>75
ugaaguucga gggcgacacc cuggugaacc gcau                                      34
 
<210>76
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>76
gcagcacgac uucuucaagu u                                                    21
 
<210>77
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>77
cuugaagaag ucgugcugcu u                                                    21
 
<210>78
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>78
aagcagcacg acuucuucaa guccgcc                                              27
 
<210>79
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>79
ggcggacuug aagaagucgu gcugcuu                                              27
 
<210>80
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>80
guucgagggc gacacccugu u                                                    21
 
<210>81
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>81
cagggucucg cccucgaacu u                                                    21
 
<210>82
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>82
guucgagggc gacacccugg ugaacuu                                              27
 
<210>83
<211>29
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>83
cgguucacca gggucucgcc cucgaacuu                                            29
 
<210>84
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>probe
 
<400>84
ccaaaggtac ccagccttca tccagtt                                              27
<210>85
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>probe
 
<400>85
gtgaggatgc ctctcttgct ctgggcctcg                                      30
 
<210>86
<211>2201
<212>DNA
<213>Homo sapiens
 
<400>86
tttttttttt cgtcttagcc acgcagaagt cgcgtgtcta gtttgtttcg acgccggacc     60
gcgtaagaga cgatgatgtt gggcacggaa ggtggagagg gattcgtggt gaaggtccgg    120
ggcttgccct ggtcttgctc ggccgatgaa gtgcagaggt ttttttctga ctgcaaaatt    180
caaaatgggg ctcaaggtat tcgtttcatc tacaccagag aaggcagacc aagtggcgag    240
gcttttgttg aacttgaatc agaagatgaa gtcaaattgg ccctgaaaaa agacagagaa    300
actatgggac acagatatgt tgaagtattc aagtcaaaca acgttgaaat ggattgggtg    360
ttgaagcata ctggtccaaa tagtcctgac acggccaatg atggctttgt acggcttaga    420
ggacttccct ttggatgtag caaggaagaa attgttcagt tcttctcagg gttggaaatc    480
gtgccaaatg ggataacatt gccggtggac ttccagggga ggagtacggg ggaggccttc    540
gtgcagtttg cttcacagga aatagctgaa aaggctctaa agaaacacaa ggaaagaata    600
gggcacaggt atattgaaat ctttaagagc agtagagctg aagttagaac tcattatgat    660
ccaccacgaa agcttatggc catgcagcgg ccaggtcctt atgacagacc tggggctggt    720
agagggtata acagcattgg cagaggagct ggctttgaga ggatgaggcg tggtgcttat    780
ggtggaggct atggaggcta tgatgattac aatggctata atgatggcta tggatttggg    840
tcagatagat ttggaagaga cctcaattac tgtttttcag gaatgtctga tcacagatac    900
ggggatggtg gctctacttt ccagagcaca acaggacact gtgtacacat gcggggatta    960
ccttacagag ctactgagaa tgacatttat aatttttttt caccgctcaa ccctgtgaga   1020
gtacacattg aaattggtcc tgatggcaga gtaactggtg aagcagatgt cgagttcgca   1080
actcatgaag atgctgtggc agctatgtca aaagacaaag caaatatgca acacagatat   1140
gtagaactct tcttgaattc tacagcagga gcaagcggtg gtgcttacga acacagatat   1200
gtagaactct tcttgaattc tacagcagga gcaagcggtg gtgcttatgg tagccaaatg   1260
atgggaggca tgggcttgtc aaaccagtcc agctacgggg gcccagccag ccagcagctg   1320
agtgggggtt acggaggcgg ctacggtggc cagagcagca tgagtggata cgaccaagtt   1380
ttacaggaaa actccagtga ttttcaatca aacattgcat aggtaaccaa ggagcagtga   1440
acagcagcta ctacagtagt ggaagccgtg catctatggg cgtgaacgga atgggagggt   1500
tgtctagcat gtccagtatg agtggtggat ggggaatgta attgatcgat cctgatcact   1560
gactcttggt caaccttttt tttttttttt ttttctttaa gaaaacttca gtttaacagt   1620
ttctgcaata caagcttgtg atttatgctt actctaagtg gaaatcagga ttgttatgaa   1680
gacttaaggc ccagtatttt tgaatacaat actcatctag gatgtaacag tgaagctgag   1740
taaactataa ctgttaaact taagttccag cttttctcaa gttagttata ggatgtactt   1800
aagcagtaag cgtatttagg taaaagcagt tgaattatgt taaatgttgc cctttgccac   1860
gttaaattga acactgtttt ggatgcatgt tgaaagacat gcttttattt tttttgtaaa   1920
acaatatagg agctgtgtct actattaaaa gtgaaacatt ttggcatgtt tgttaattct   1980
agtttcattt aataacctgt aaggcacgta agtttaagct tttttttttt ttaagttaat   2040
gggaaaaatt tgagacgcaa taccaatact taggattttg gtcttggtgt ttgtatgaaa   2100
ttctgaggcc ttgatttaaa tctttcattg tattgtgatt tccttttagg tatattgcgc   2160
taagtgaaac ttgtcaaata aatcctcctt ttaaaaactg c                       2201
 
<210>87
<211>1620
<212>DNA
<213>Homo sapiens
 
<400>87
ccggcggcgc tgggaggtgg agtcgttgct gttgctgttt gtgagcctgt ggcgcggctt     60
ctgtgggccg gaaccttaaa gatagccgta atggctgaaa atggtgataa tgaaaagatg    120
gctgccctgg aggccaaaat ctgtcatcaa attgagtatt attttggcga cttcaatttg    180
ccacgggaca agtttctaaa ggaacagata aaactggatg aaggctgggt acctttggag    240
ataatgataa aattcaacag gttgaaccgt ctaacaacag actttaatgt aattgtggaa    300
gcattgagca aatccaaggc agaactcatg gaaatcagtg aagataaaac taaaatcaga    360
aggtctccaa gcaaacccct acctgaagtg actgatgagt ataaaaatga tgtaaaaaac    420
agatctgttt atattaaagg cttcccaact gatgcaactc ttgatgacat aaaagaatgg    480
ttagaagata aaggtcaagt actaaatatt cagatgagaa gaacattgca taaagcattt    540
aagggatcaa tttttgttgt gtttgatagc attgaatctg ctaagaaatt tgtagagacc    600
cctggccaga agtacaaaga aacagacctg ctaatacttt tcaaggacga ttactttgcc    660
aaaaaaaatg aagaaagaaa acaaaataaa gtggaagcta aattaagagc taaacaggag    720
caagaagcaa aacaaaagtt agaagaagat gctgaaatga aatctctaga agaaaagatt    780
ggatgcttgc tgaaattttc gggtgattta gatgatcaga cctgtagaga agatttacac    840
atacttttct caaatcatgg tgaaataaaa tggatagact tcgtcagagg agcaaaagag    900
gggataattc tatttaaaga aaaagccaag gaagcattgg gtaaagccaa agatgcaaat    960
aatggtaacc tacaattaag gaacaaagaa gtgacttggg aagtactaga aggagaggtg   1020
gaaaaagaag cactgaagaa aataatagaa gaccaacaag aatccctaaa caaatggaag   1080
tcaaaaggtc gtagatttaa aggaaaagga aagggtaata aagctgccca gcctgggtct   1140
ggtaaaggaa aagtacagtt tcagggcaag aaaacgaaat ttgctagtga tgatgaacat   1200
gatgaacatg atgaaaatgg tgcaactgga cctgtgaaaa gagcaagaga agaaacagac   1260
aaagaagaac ctgcatccaa acaacagaaa acagaaaatg gtgctggaga ccagtagttt   1320
agtaaaccaa ttttttattc attttaaata ggttttaaac gacttttgtt tgcggggctt   1380
ttaaaaggaa aaccgaatta ggtccacttc aatgtccacc tgtgagaaag gaaaaatttt   1440
tttgttgttt aacttgtctt tttgttatgc aaatgagatt tctttgaatg tattgttctg   1500
tttgtgttat ttcagatgat tcaaatatca aaaggaagat tcttccatta aattgccttt   1560
gtaatatgag aatgtattag tacaaactaa ctaataaaat atatactata tgaaaagagc   1620
 
<210>88
<211>35
<212>RNA
<213>Homo sapiens
 
<400>88
guugaacuug aaucagaaga ugaagucaaa uuggc                                35
 
<210>89
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>89
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<210>90
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>90
cuucaucuuc ugauucaagu u                                               21
 
<210>91
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>91
aacuugaauc agaagaugaa gucaaau                                         27
<210>92
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>92
auuugacuuc aucuucugau ucaaguu                                              27
 
<210>93
<211>35
<212>RNA
<213>Homo sapiens
 
<400>93
auaaaacugg augaaggcug gguaccuuug gagau                                     35
 
<210>94
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>94
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<210>95
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>95
guacccagcc uucauccagu u                                                    21
 
<210>96
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
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aacuggauga aggcugggua ccuuuuu                                              27
 
<210>97
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<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>97
ccaaagguac ccagccuuca uccaguu                                              27
<210>98
<211>22
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>98
gacccugaag uucaucugca cc                                                   22
 
<210>99
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<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>99
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<210>100
<211>22
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>100
cugacccuga aguucaucug ca                                                   22
 
<210>101
<211>22
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>101
cagaugaacu ucagggucag cu                                                   22
 
<210>102
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<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>DNA bases(remainder RNA bases)
 
<400>102
ugcagaugaa cuucaggguc agctt                                                25
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<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>103
ugacccugaa guucaucugc accaccg                                                27
 
<210>104
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>104
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<210>105
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>105
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<210>106
<211>22
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>106
ccugaaguuc aucugcacca cc                                                     22
 
<210>107
<211>22
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>107
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<210>108
<211>24
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>108
acccugaagu ucaucugcac cacc                                                   24
 
<210>109
<211>24
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>109
uggugcagau gaacuucagg guca                                                   24
 
<210>110
<211>22
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>110
gugcagauga acuucagggu ca                                                     22
 
<210>111
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>DNA bases(remainder are RNA bases)
 
<400>111
acccugaagu ucaucugcac caccg                                                  25
 
<210>112
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>112
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<210>113
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
<400>113
caugaagcag cacgacuucu ucaaguc                                                27
 
<210>114
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>DNA bases(remainder are RNA bases)
 
<400>114
cuugaagaag ucgugcugcu ucatg                                                  25
 
<210>115
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>DNA bases(remainder are RNA bases)
 
<400>115
gcagcacgac uucuucaagu ccgcc                                                  25
 
<210>116
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>EGFP from cloning vector pEGFP-C1
 
<400>116
acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccg                         48
 
<210>117
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>117
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<210>118
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>118
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<210>119
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<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>119
gcaccagagc caauggaac                                                          19
 
<210>120
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>120
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<210>121
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(19)
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<400>121
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<210>122
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
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<400>122
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<210>123
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>123
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<210>124
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<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
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<210>125
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<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
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<210>126
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>126
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<210>127
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
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<223>bases 1，3，5，7，9，11，13，17，19are 2′OMe derivatives
 
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<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>128
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<210>129
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(19)
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<400>129
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<210>130
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
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<210>131
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<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>siRNA
 
<400>131
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<210>132
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
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<210>133
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(19)
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<400>133
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<210>134
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>134
guuccauugg cucuggugc                                                        19
 
<210>135
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
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<210>136
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<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>136
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<210>137
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
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<223>bases 1，3，5，7，9，11，13，17，19are 2′OMe derivatives
 
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gcaccagagc caauggaac                                                          19
 
<210>138
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(19)
<223>bases 1，3，5，7，9，11，13，17，19are 2′OMe derivatives
 
<400>138
guuccauugg cucuggugc                                                          19
 
<210>139
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(19)
<223>bases 2，4，6，8，10，12，14，16and 18are 2′OMe derivatives
<400>139
gcaccagagc caauggaac                                                           19
 
<210>140
<211>19
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(19)
<223>bases 2，4，6，8，10，12，14，16and 18are 2′OMe derivatives
 
<400>140
guuccauugg cucuggugc                                                           19
 
<210>141
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
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<400>141
gcaccagagc caauggaacu u                                                       21
 
<210>142
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 1，6，9，10，15，16and 18are 2′OMe derivatives
 
<400>142
guuccauugg cucuggugcu u                                                       21
 
<210>143
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 1，3，6-9，12，13and 15-18are 2′OMe derivatives
 
<400>143
gcaccagagc caauggaacu u                                                       21
 
<210>144
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>144
guuccauugg cucuggugcu u                                                       21
 
<210>145
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>145
gcaccagagc caauggaacu u                                                       21
 
<210>146
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 1，6，9，10，15，16and 18are 2′OMe derivatives
 
<400>146
guuccauugg cucuggugcu u                                                       21
 
<210>147
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 2，4，5，10，11，14，19and 20are 2′F derivatives
 
<400>147
gcaccagagc caauggaacu u                                                          21
 
<210>148
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 2-5，7，8，11-14，17，19and 20are 2′F derivatives
 
<400>148
guuccauugg cucuggugcu u                                                          21
 
<210>149
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 2，4，5，10，11，14，19and 20are 2′F derivatives
 
<400>149
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<210>150
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>150
guuccauugg cucuggugcu u                                                          21
 
<210>151
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 2，4，5，10，11，14，19and 20are 2′F derivatives
 
<400>151
gcaccagagc caauggaacu u                                                          21
<210>152
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 1，6，9，10，15，16and 18are 2′OMe derivatives
 
<400>152
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<210>153
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>153
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<210>154
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 2-5，7，8，11-14，17，19and 20are 2′F derivatives
 
<400>154
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<210>155
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 1，3，6-9，12，13and 15-18are 2′OMe derivatives
 
<400>155
gcaccagagc caauggaacu u                                                       21
<210>156
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 2-5，7，8，11-14，17，19and 20are 2′F derivatives
 
<400>156
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<210>157
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 1，3，6-9and 15-18are 2′OMe derivatives and bases 2，4，
5，10，11，14，19and 20are 2′F derivatives
 
<400>157
gcaccagagc caauggaacu u                                                       21
 
<210>158
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 1，6，9，10，15，16and 18are 2′OMe derivatives and bases
2-5，7，8，11-14，17，19and 20are 2′F derivatives
 
<400>158
guuccauugg cucuggugcu u                                                       21
 
<210>159
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 1，3，6-9and 15-18are 2′OMe derivatives and bases 2，4，
5，10，11，14，19and 20are 2′F derivatives
 
<400>159
gcaccagagc caauggaacu u                                                       21
 
<210>160
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>160
guuccauugg cucuggugcu u                                                       21
 
<210>161
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 1，3，6-9and 15-18are 2′OMe derivatives and bases 2，4，
5，10，11，14，19and 20are 2′F derivatives
 
<400>161
gcaccagagc caauggaacu u                                                       21
 
<210>162
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 1，6，9，10，15，16and 18are 2′OMe derivatives
 
<400>162
guuccauugg cucuggugcu u                                                       21
 
<210>163
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 1，3，6-9and 15-18are 2′OMe derivatives and bases 2，4，
5，10，11，14，19and 20are 2′F derivatives
 
<400>163
gcaccagagc caauggaacu u                                                       21
 
<210>164
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 2-5，7，8，11-14，17，19and 20are 2′F derivatives
 
<400>164
guuccauugg cucuggugcu u                                                       21
 
<210>165
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>165
gcaccagagc caauggaacu u                                                       21
 
<210>166
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 1，6，9，10，15，16and 18are 2′OMe derivatives and bases
2-5，7，8，11-14，17，19and 20are 2′F derivatives
 
<400>166
guuccauugg cucuggugcu u                                                       21
 
<210>167
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 1，3，6-9，12，13and 15-18are 2′OMe derivatives
 
<400>167
gcaccagagc caauggaacu u                                                     21
 
<210>168
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 1，6，9，10，15，16and 18are 2′OMe derivatives and bases
2-5，7，8，11-14，17，19and 20are 2′F derivatives
 
<400>168
guuccauugg cucuggugcu u                                                     21
 
<210>169
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 2，4，5，10，11，14，19and 20are 2′F derivatives
 
<400>169
gcaccagagc caauggaacu u                                                     21
 
<210>170
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 1，6，9，10，15，16and 18are 2′OMe derivatives and bases
2-5，7，8，11-14，17，19and 20are 2′F derivatives
 
<400>170
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<210>171
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>171
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<210>172
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNa
 
<400>172
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<210>173
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>173
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<210>174
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(26)..(27)
<223>bases 26and 27are 2′OMe derivatives
 
<400>174
caucaaguuc cauuggcucu ggugcuu                                                27
 
<210>175
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(25)
<223>bases 2，4，6，8，10，12，14，16and 18are 2′OMe derivatives
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
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<400>175
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<210>176
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<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
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<210>177
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(25)
<223>bases 2，4，6，8，10，12，14，16and 18are 2′OMe derivatives
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>177
gcaccagagc caauggaacu ugatg                                                  25
 
<210>178
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>siRNA
 
<400>178
caucaaguuc cauuggcucu ggugcuu                                              27
 
<210>179
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>179
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<210>180
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<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
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<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
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<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>181
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<210>182
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
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<400>182
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<210>183
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>183
gcaccagagc caauggaacu ugatg                                                25
 
<210>184
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
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<400>184
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<210>185
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(25)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>185
gcaccagagc caauggaacu ugatg                                                25
 
<210>186
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
<223>bases 12，15，16，21，22and 24are 2′OMe derivatives
 
<400>186
caucaaguuc cauuggcucu ggugcuu                                              27
 
<210>187
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(25)
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<220>
<221>mi sc_feature
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<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>187
gcaccagagc caauggaacu ugatg                                                25
 
<210>188
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>188
caucaaguuc cauuggcucu ggugcuu                                              27
 
<210>189
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>189
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<210>190
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
<223>bases 12，15，16，21，22and 24are 2′OMe derivatives
 
<400>190
caucaaguuc cauuggcucu ggugcuu                                              27
 
<210>191
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(25)
<223>bases 2，4，5，10，11，14，19and 20are 2′F derivatives
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>191
gcaccagagc caauggaacu ugatg                                                25
 
<210>192
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
<223>bases 8-11，13，14，17-20，23，25and 26are 2′F derivatives
 
<400>192
caucaaguuc cauuggcucu ggugcuu                                              27
 
<210>193
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(25)
<223>bases 2，4，5，10，11，14，19and 20are 2′F derivatives
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>193
gcaccagagc caauggaacu ugatg                                                25
 
<210>194
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>194
caucaaguuc cauuggcucu ggugcuu                                              27
 
<210>195
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(25)
<223>bases 2，4，5，10，11，14，19and 20are 2′F derivatives
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>195
gcaccagagc caauggaacu ugatg                                                25
 
<210>196
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
<223>bases 12，15，16，21，22and 24are 2′OMe derivatives
 
<400>196
caucaaguuc cauuggcucu ggugcuu                                              27
 
<210>197
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>197
gcaccagagc caauggaacu ugatg                                                25
 
<210>198
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
<223>bases 8-11，13，14，17-20，23，25and 26are 2′F derivatives
 
<400>198
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<210>199
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(25)
<223>bases 1，3，6-9，12，13and 15-18are 2′OMe derivatives
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>199
gcaccagagc caauggaacu ugatg                                                  25
 
<210>200
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
<223>bases 8-11，13，14，17-20，23，25and 26are 2′F derivatives
 
<400>200
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<210>201
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>201
gcaccagagc caauggaacu ugatg                                                  25
 
<210>202
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
<223>bases 12，15，16，21，22and 24are 2′OMe derivatives and bases
8-11，13，14，17-20，23，25and 26are 2′F derivatives
 
<400>202
caucaaguuc cauuggcucu ggugcuu                                                27
 
<210>203
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(25)
<223>bases 1，3，6-9，12，13and 15-18are 2′OMe derivatives
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>203
gcaccagagc caauggaacu ugatg                                                  25
 
<210>204
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
<223>bases 12，15，16，21，22and 24are 2′OMe derivatives and bases
8-11，13，14，17-20，23，25and 26are 2′F derivatives
 
<400>204
caucaaguuc cauuggcucu ggugcuu                                                27
 
<210>205
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(25)
<223>bases 2，4，5，10，11，14，19and 20are 2′F derivatives
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>205
gcaccagagc caauggaacu ugatg                                                  25
 
<210>206
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
<223>bases 12，15，16，21，22and 24are 2′OMe derivatives and bases
8-11，13，14，17-20，23，25and 26are 2′F derivatives
 
<400>206
caucaaguuc cauuggcucu ggugcuu                                                27
 
<210>207
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
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derivatives
 
<400>207
caucaaguuc cauuggcucu ggugcuu                                                27
 
<210>208
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>208
acccugaagu ucaucugcac caccg                                                  25
 
<210>209
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
<223>bases 2，11，13，15，17，19，21，23and 25-27are 2′OMe
derivatives
 
<400>209
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<210>210
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(25)
<223>bases 2，4，6，8，10，12，14，16and 18are 2′OMe derivatives
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>210
acccugaagu ucaucugcac caccg                                                25
 
<210>211
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
<223>bases 9，11，13，15，17，19，21，23and 25-27are 2′OMe
derivatives
 
<400>211
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<210>212
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
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derivatives
 
<400>212
cgguggugca gaugaacuuc aggguca                                              27
 
<210>213
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>siRNA
 
<400>213
cgguggugca gaugaacuuc aggguca                                              27
 
<210>214
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>214
gccagacuuu cuuggauuug aaatt                                                25
 
<210>215
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>215
aauuucaaau ccaacaaagu cuggcuu                                              27
 
<210>216
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(25)
<223>bases 2，4，6，8，10，12，14，16and 18are 2′OMe derivatives
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>216
gccagacuuu cuuggauuug aaatt                                                25
 
<210>217
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
<223>bases 9，11，13，15，17，19，21，23and 25-27are 2′OMe
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<400>217
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<210>218
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
<223>bases 1，2，9，11，13，15，17，19，21，23and 25-27are 2′OMe
derivatives
 
<400>218
aauuucaaau ccaacaaagu cuggcuu                                                27
 
<210>219
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
<223>bases 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23and 25-27are 2′
OMe derivatives
 
<400>219
aauuucaaau ccaacaaagu cuggcuu                                                27
 
<210>220
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>220
gccagacuuu guuggauuug agccg                                                  25
<210>221
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>221
cggcucaaau ccaacaaagu cuggcuu                                              27
 
<210>222
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
<223>bases 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23and 25-27are 2′
OMe derivatives
 
<400>222
cggcucaaau ccaacaaagu cuggcuu                                              27
 
<210>223
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(25)
<223>bases 24and 25are DNA
 
<400>223
cuuccucucu uucucucccu uguga                                                25
 
<210>224
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>224
ucacaaggga gagaaagaga ggaagga                                              27
 
<210>225
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>siRNA
 
<400>225
gccagacuuu guuggauuug a                                                       21
 
<210>226
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>226
aaauccaaca aagucuggcu u                                                       21
 
<210>227
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>227
gccagacuuu guuggauuug a                                                       21
 
<210>228
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(21)
<223>bases 3，5，7，9，11，13，15，17and 19-21are 2′OMe derivatives
 
<400>228
aaauccaaca aagucuggcu u                                                       21
 
<210>229
<211>22
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>229
gccagacuuu guuggauuug aa                                                      22
 
<210>230
<211>22
<212>RNA
<213>Artificial
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(22)
<223>bases 4，6，8，10，12，14，16，18and 20-22are 2′OMe
derivatives
 
<400>230
caaauccaac aaagucuggc uu                                                      22
 
<210>231
<211>22
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>231
gccagacuuu guuggauuug aa                                                      22
 
<210>232
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>232
gccagacuuu guuggauuug a                                                       21
 
<210>233
<211>21
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<400>233
aaauccaaca aagucuggcu u                                                       21
 
<210>234
<211>27
<212>RNA
<213>Artificial
 
<220>
<223>siRNA
 
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(27)
<223>bases 9，11，13，15，17，19，21，23and 25-27are 2′OMe
derivatives
 
<400>234
aauuucaaau ccaacaaagu cuggcuu                                                27

Claims (96)

1.一种分离的双链核酸，其包含：长度为25-30个核苷酸且具有3’末端和5’末端的第一个寡核苷酸链，其中从所述第一个寡核苷酸链的3’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置1、2和/或3是脱氧核糖核苷酸；以及长度为25-30个核苷酸且具有3’末端和5’末端的第二个寡核苷酸链，其中所述第二个寡核苷酸链具有长度为1-4个核苷酸的3’突出端，其中所述第二个寡核苷酸链从其与所述第一个寡核苷酸链的5’末端核苷酸残基互补的核苷酸残基开始，包含交替修饰和未修饰的核苷酸残基，且其中所述第二个寡核苷酸链与靶RNA沿着所述第二个寡核苷酸链长度的至少19个核苷酸充分互补，用以当所述双链核酸被导入哺乳动物细胞中时降低靶基因表达。
2.权利要求1的分离的双链核酸，其中所述3’突出端的核苷酸包含修饰的核苷酸。
3.权利要求1的分离的双链核酸，其中所述第一个和第二个链的每一个链的长度为至少26个且至多30个核苷酸。
4.权利要求1的分离的双链核酸，其中所述第一个寡核苷酸链的3’末端的位置1是脱氧核糖核苷酸。
5.权利要求3的分离的双链核酸，其中所述第一个寡核苷酸链的3’末端的位置1和2是脱氧核糖核苷酸。
6.权利要求1的分离的双链核酸，其中所述第一个寡核苷酸链的修饰的核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸。
7.权利要求1的分离的双链核酸，其中所述3’突出端的修饰的核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸。
8.权利要求1的分离的双链核酸，其中所述3’突出端的所有核苷酸均是修饰的核苷酸。
9.权利要求1的分离的双链核酸，其中第一个和第二个寡核苷酸链其一或二者均包含5’磷酸酯。
10.权利要求1的分离的双链核酸，其中所述修饰的核苷酸残基选自2’-O-甲基、2’-甲氧基乙氧基、2’-氟代、2’-烯丙基、2’-O-[2-(甲氨基)-2-氧乙基]、4′-硫代、4′-CH2-O-2’-桥、4′-(CH2)2-O-2′-桥、2’-LNA、2’-氨基和2’-O-(N-氨基甲酸甲酯)。
11.权利要求1的分离的双链核酸，其中所述3’突出端长度为1-3个核苷酸。
12.权利要求1的分离的双链核酸，其中所述3’突出端长度为1-2个核苷酸。
13.权利要求1的分离的双链核酸，其中所述3’突出端长度为2个核苷酸，且其中所述3’突出端的修饰的核苷酸是2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸。
14.权利要求1的分离的双链核酸，其中所述第二个寡核苷酸链从其与第一个寡核苷酸链的5’末端核苷酸残基互补的核苷酸残基开始，在从所述第二个寡核苷酸链的位置20至5’末端的所有位置包含未修饰的核苷酸残基。
15.权利要求1的分离的双链核酸，其中所述第一个链和第二个链的核苷酸残基的相对长度选自如下一组：第二个链长度为26-29个核苷酸残基及第一个链长度为25个核苷酸残基，第二个链长度为27-30个核苷酸残基及第一个链长度为26个核苷酸残基，第二个链长度为28-30个核苷酸残基及第一个链长度为27个核苷酸残基，第二个链长度为29-30个核苷酸残基及第一个链长度为28个核苷酸残基，以及第二个链长度为30个核苷酸残基及第一个链长度为29个核苷酸残基.
16.权利要求1的分离的双链核酸，其中所述双链核酸在哺乳动物细胞中被Dicer内源性裂解。
17.权利要求1的分离的双链核酸，其中所述双链核酸在哺乳动物细胞中被内源性裂解以产生降低靶基因表达的长度为19-23个核苷酸的双链核酸。
18.权利要求1的分离的双链核酸，其中所述双链核酸在体外使哺乳动物细胞中靶基因表达降低量(以％表示)选自至少10％、至少50％和至少80-90％。
19.权利要求1的分离的双链核酸，其中所述3’突出端长度为2个核苷酸，且其中所述3’突出端的修饰的核苷酸是2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸。
20.包含权利要求1的分离的双链核酸的配制物，其中所述双链核酸的存在量为当所述双链核酸被导入哺乳动物细胞时在体外使靶基因表达有效降低(以％表示)至少10％、至少50％和至少80-90％，且当以1纳摩尔或更低的细胞环境有效浓度在哺乳动物细胞中在体外测定时，所述双链核酸与指向相同的所述靶RNA的至少19个核苷酸的分离的21mer siRNA相比在降低靶基因表达中更有效。
21.权利要求20的配制物，其中所述有效量选自如下一组：在所述细胞环境中1纳摩尔或更低，200皮摩尔或更低，以及50皮摩尔或更低。
22.包含权利要求1的分离的双链核酸的配制物，其中所述双链核酸的存在量为当所述双链核酸被导入哺乳动物对象的细胞时使靶基因表达有效降低(以％表示)至少10％、至少50％和至少80-90％，且当以1纳摩尔或更低的细胞环境有效浓度在哺乳动物细胞中在体外测定时，所述双链核酸与指向相同的所述靶RNA的至少19个核苷酸的分离的21mer siRNA相比在降低靶基因表达中更有效。
23.权利要求22的配制物，其中所述有效量是选自如下一组的剂量：1μg-5mg/kg对象/天，100μg-0.5mg/kg，0.001-0.25mg/kg，0.01-20μg/kg，0.01-10μg/kg，0.10-5μg/kg，以及0.1-2.5μg/kg。
24.权利要求1的分离的双链核酸，其中第一个链与第二个链通过化学接头连接。
25.权利要求24的分离的双链核酸，其中所述第一个链的3’末端与所述第二个链的5’末端通过化学接头连接。
26.含有权利要求1的分离的双链核酸的哺乳动物细胞。
27.一种药物组合物，其包含权利要求1的分离的双链核酸及药物可接受的载体。
28.一种降低哺乳动物细胞中靶基因表达的方法，所述方法包括将权利要求1的分离的双链核酸以足以降低靶基因在所述哺乳动物细胞中表达的量导入哺乳动物细胞中。
29.权利要求28的方法，其中当以1纳摩尔或更低的细胞环境有效浓度在哺乳动物细胞中在体外测定时，所述分离的双链核酸与指向相同的所述靶RNA的至少19个核苷酸的分离的21mer siRNA相比在降低靶基因表达中更有效。
30.一种降低哺乳动物细胞中靶基因表达的方法，所述方法包括鉴别靶基因用于弱化；针对所述靶基因合成权利要求1的分离的双链核酸；将所述双链核酸以足以降低靶基因在所述哺乳动物细胞中表达的量导入哺乳动物细胞中。
31.一种制备权利要求1的分离的双链核酸的方法，包括选择靶基因RNA的靶序列，其中所述靶序列包含至少19个核苷酸；合成权利要求1或12的第一个寡核苷酸链和第二个寡核苷酸链。
32.权利要求31的方法，其中所述第一个寡核苷酸链包含两个脱氧核苷酸残基，作为所述3’末端的最后和倒数第二个核苷酸。
33.分离的双链核酸，其包含：长度为25-30个核苷酸的具有3’和5’末端的第一个寡核苷酸链，其中从第一个寡核苷酸链的3’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置1、2和/或3是脱氧核糖核苷酸；长度为25-30个核苷酸的具有3’和5’末端的第二个寡核苷酸链，其中所述第二个寡核苷酸链从其与所述第一个寡核苷酸链的5’末端核苷酸残基互补的核苷酸残基开始，包含交替修饰和未修饰的核苷酸残基，且其中所述第二个寡核苷酸链沿着其长度有至少19个核苷酸与所述靶RNA充分互补，当所述双链核酸被导入哺乳动物细胞中时降低靶基因表达。
34.权利要求33的分离的双链核酸，其中第一个链和第二个链的长度均为至少26个核苷酸且至多30个核苷酸。
35.权利要求33的分离的双链核酸，其中所述第二个寡核苷酸链从其与所述第一个寡核苷酸链的5’末端核苷酸残基互补的核苷酸残基开始，位置1、3、5、7、9、11、13、15和17均包含修饰的核苷酸残基。
36.权利要求34的分离的双链核酸，其中所述第二个寡核苷酸链从其与所述第一个寡核苷酸链的5’末端核苷酸残基互补的核苷酸残基开始，从第二个寡核苷酸链的位置18至5’末端的所有位置进一步包含未修饰的核苷酸残基。
37.权利要求33的分离的双链核酸，其中所述第二个寡核苷酸链从其与所述第一个寡核苷酸链的5’末端核苷酸残基互补的核苷酸残基开始，位置1、3、5、7、9、11、13、15、17和19均包含修饰的核苷酸残基。
38.权利要求37的分离的双链核酸，其中所述第二个寡核苷酸链从其与所述第一个寡核苷酸链的5’末端核苷酸残基互补的核苷酸残基开始，从第二个寡核苷酸链的位置20至5’末端的所有位置进一步包含未修饰的核苷酸残基。
39.分离的双链核酸，其包含：长度为25-30个核苷酸的具有3’和5’末端的第一个寡核苷酸链，其中从第一个寡核苷酸链的3’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置1、2和/或3是脱氧核糖核苷酸；长度为25-30个核苷酸的具有3’和5’末端的第二个寡核苷酸链，其中所述第二个寡核苷酸链从其与所述第一个寡核苷酸链的5’末端核苷酸残基互补的核苷酸残基(位置1)开始，位置1-17包含至少6个修饰的核苷酸残基，从位置18至5’末端的所有位置包含未修饰的核苷酸残基，且其中所述第二个寡核苷酸链沿着其长度有至少19个核苷酸与所述靶RNA充分互补，当所述双链核酸被导入哺乳动物细胞中时降低靶基因表达。
40.分离的双链核酸，其包含：长度为25-30个核苷酸的具有3’和5’末端的第一个寡核苷酸链，其中从第一个寡核苷酸链的3’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置1、2和/或3是脱氧核糖核苷酸；长度为25-30个核苷酸的具有3’和5’末端的第二个寡核苷酸链，其中所述第二个寡核苷酸链从其与所述第一个寡核苷酸链的5’末端核苷酸残基互补的核苷酸残基(位置1)开始，位置1-19包含至少6个修饰的核苷酸残基，从位置20至5’末端的所有位置包含未修饰的核苷酸残基，且其中所述第二个寡核苷酸链沿着其长度有至少19个核苷酸与所述靶RNA充分互补，当所述双链核酸被导入哺乳动物细胞中时降低靶基因表达。
41.分离的双链核酸，其包含：长度为25-30个核苷酸的具有3’和5’末端的第一个寡核苷酸链，其中从第一个寡核苷酸链的3’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置1、2和/或3是脱氧核糖核苷酸；长度为27-30个核苷酸的第二个寡核苷酸链，当所述第一个寡核苷酸链与第二个寡核苷酸链形成杂交体时在第二个寡核苷酸链的3’末端包含2-4个核苷酸突出端，且从第二个寡核苷酸链的3’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置1、2、3、5、7、9、11、13、15、17和19均包含修饰的核糖核苷酸，其中所述第二个寡核苷酸链沿着其长度有至少19个核苷酸与所述靶RNA充分互补，当所述双链核酸被导入哺乳动物细胞中时降低靶基因表达。
42.权利要求41的分离的双链核酸，其中所述第二个寡核苷酸链的修饰的核糖核苷酸选自2’-O-甲基、2’-甲氧基乙氧基、2’-氟代、2’-烯丙基、2’-O-[2-(甲氨基)-2-氧乙基]、4′-硫代、4′-CH2-O-2’-桥、4′-(CH2)2-O-2’-桥、2’-LNA、2’-氨基和2’-O-(N-氨基甲酸甲酯)。
43.权利要求41的分离的双链核酸，其中所述第二个寡核苷酸链的修饰的核糖核苷酸包含2’-O-甲基核糖核苷酸。
44.权利要求41的分离的双链核酸，其中第一个和第二个寡核苷酸链其一或二者均包含5’磷酸酯。
45.权利要求41的分离的双链核酸，其中所述第一个和第二个链的长度均为至少26个且至多30个核苷酸。
46.权利要求41的分离的双链核酸，其中第一个寡核苷酸链的3’末端的位置1是脱氧核糖核苷酸。
47.权利要求46的分离的双链核酸，其中所述第一个寡核苷酸链的3’末端的位置1和2是脱氧核糖核苷酸。
48.权利要求41的分离的双链核酸，其中所述第一个寡核苷酸链的修饰的核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸。
49.权利要求41的分离的双链核酸，其中所述3’突出端的修饰的核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸。
50.权利要求41的分离的双链核酸，其中所述3’突出端的所有核苷酸均是修饰的核苷酸。
51.权利要求41的分离的双链核酸，其中所述第一个和第二个寡核苷酸链其一或二者均包含5’磷酸酯。
52.权利要求41的分离的双链核酸，其中所述修饰的核苷酸残基选自：2’-O-甲基、2’-甲氧基乙氧基、2’-氟代、2’-烯丙基、2’-O-[2-(甲氨基)-2-氧乙基]、4′-硫代、4′-CH2-O-2’-桥、4′-(CH2)2-O-2’-桥、2’-LNA、2’-氨基和2’-O-(N-氨基甲酸甲酯)。
53.权利要求41的分离的双链核酸，其中所述3’突出端长度为1-3个核苷酸。
54.权利要求41的分离的双链核酸，其中所述3’突出端长度为1-2个核苷酸。
55.权利要求41的分离的双链核酸，其中所述3’突出端长度为2个核苷酸，且其中所述3’突出端的修饰的核苷酸是2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸。
56.权利要求41的分离的双链核酸，其中所述第一个和第二个链的核苷酸残基的相对长度选自如下一组：第二个链长度为26-29个核苷酸，第一个链长度为25个核苷酸；第二个链长度为27-30个核苷酸，第一个链长度为26个核苷酸；第二个链长度为28-30个核苷酸，第一个链长度为27个核苷酸；第二个链长度为29-30个核苷酸，第一个链长度为28个核苷酸；以及第二个链长度为30个核苷酸，第一链长度为29个核苷酸。
57.权利要求41的分离的双链核酸，其中所述双链核酸在哺乳动物细胞中由Dicer内源裂解。
58.权利要求41的分离的双链核酸，其中所述双链核酸在哺乳动物细胞中被内源裂解，产生长度为19-23个核苷酸的降低靶基因表达的双链核酸。
59.权利要求41的分离的双链核酸，其中所述双链核酸在体外使哺乳动物细胞中靶基因表达降低(以％表示)至少10％、至少50％和至少80-90％。
60.一种降低哺乳动物细胞中靶基因表达的方法，所述方法包括：将权利要求41的分离的双链核酸以足以降低哺乳动物细胞中靶基因表达的量导入哺乳动物细胞中。
61.权利要求60的方法，其中当以1纳摩尔或更低的细胞环境有效浓度在哺乳动物细胞中在体外测定时，所述分离的双链核酸与指向相同的所述靶RNA的至少19个核苷酸的分离的21mer siRNA相比在降低靶基因表达时更有效。
62.一种降低哺乳动物细胞中靶基因表达的方法，所述方法包括鉴别靶基因用于弱化；针对所述靶基因合成权利要求41的分离的双链核酸；将所述双链核酸以足以降低靶基因在所述哺乳动物细胞中表达的量导入哺乳动物细胞中。
63.一种制备权利要求41的分离的双链核酸的方法，包括选择靶基因RNA的靶序列，其中所述靶序列包含至少19个核苷酸；合成权利要求1或12的第一个寡核苷酸链和第二个寡核苷酸链。
64.权利要求77的方法，其中所述第一个寡核苷酸链包含两个脱氧核苷酸残基，作为所述3’末端的最后和倒数第二个核苷酸.
65.包含权利要求41的分离的双链核酸的哺乳动物细胞。
66.权利要求41的分离的双链核酸，与药物可接受的载体组合在一起。
67.分离的双链核酸，其包含：长度为25-30个核苷酸的具有3’和5’末端的第一个寡核苷酸链，其中从第一个寡核苷酸链的3’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置1、2和/或3是脱氧核糖核苷酸；长度为25-30个核苷酸的具有3’和5’末端的第二个寡核苷酸链，其中所述第二个寡核苷酸链从其与所述第一个寡核苷酸链的5’末端核苷酸残基互补的核苷酸残基开始，包含交替修饰和未修饰的核苷酸残基，且其中所述第二个寡核苷酸链沿着其长度有至少19个核苷酸与所述靶RNA充分互补，当所述双链核酸被导入哺乳动物细胞中时降低靶基因表达。
68.权利要求67的分离的双链核酸，其中所述第一链和第二链长度均为至少26个且至多30个核苷酸。
69.权利要求67的分离的双链核酸，其中所述第二个寡核苷酸链从其与第一个寡核苷酸链的5’末端核苷酸残基互补的核苷酸残基开始，位置1、3、5、7、9、11、13、15和17均包含修饰的核苷酸残基。
70.权利要求69的分离的双链核酸，其中所述第二个寡核苷酸链从其与第一个寡核苷酸链的5’末端核苷酸残基互补的核苷酸残基开始，从位置18至5’末端的所有位置进一步包含未修饰的核苷酸残基。
71.权利要求67的分离的双链核酸，其中所述第二个寡核苷酸链从其与第一个寡核苷酸链的5’末端核苷酸残基互补的核苷酸残基开始，位置1、3、5、7、9、11、13、15、17和19均包含修饰的核苷酸残基。
72.权利要求71的分离的双链核酸，其中所述第二个寡核苷酸链从其与第一个寡核苷酸链的5’末端核苷酸残基互补的核苷酸残基开始，从位置20至5’末端的所有位置进一步包含未修饰的核苷酸残基。
73.权利要求67的分离的双链核酸，其中所述第一个寡核苷酸链的3’末端的位置1是脱氧核糖核苷酸。
74.权利要求67的分离的双链核酸，其中所述第一个寡核苷酸链的3’末端的位置1和2是脱氧核糖核苷酸.
75.权利要求67的分离的双链核酸，其中所述第一个寡核苷酸链的修饰的核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸。
76.权利要求67的分离的双链核酸，其中第一个和第二个寡核苷酸链其一或二者均包含5’磷酸酯。
77.权利要求67的分离的双链核酸，其中所述第二个寡核苷酸链的修饰的核苷酸残基选自：2’-O-甲基、2’-甲氧基乙氧基、2’-氟代、2’-烯丙基、2’-O-[2-(甲氨基)-2-氧乙基]、4′-硫代、4′-CH2-O-2’-桥、4′-(CH2)2-O-2’-桥、2’-LNA、2’-氨基和2’-O-(N-氨基甲酸甲酯)。
78.权利要求67的分离的双链核酸，其中所述第二个寡核苷酸链具有长度为1-4个核苷酸的3’突出端，且所述3’突出端的核苷酸包含修饰的核苷酸。
79.权利要求78的分离的双链核酸，其中所述突出端长度为1-2个核苷酸。
80.权利要求78的分离的双链核酸，其中所述突出端长度为2个核苷酸，且其中所述修饰的核苷酸残基是2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸。
81.权利要求67的分离的双链核酸，其中所述第一个链和第二个链的核苷酸残基相对长度选自如下一组：第二个链长度为26-29个核苷酸，第一个链长度为25个核苷酸；第二个链长度为27-30个核苷酸，第一个链长度为26个核苷酸；第二个链长度为28-30个核苷酸，第一个链长度为27个核苷酸；第二个链长度为29-30个核苷酸，第一个链长度为28个核苷酸；以及第二个链长度为30个核苷酸，第一个链长度为29个核苷酸。
82.权利要求67的分离的双链核酸，其中所述双链核酸在哺乳动物细胞中由Dicer内源裂解。
83.权利要求67的分离的双链核酸，其中所述双链核酸在哺乳动物细胞中被内源裂解，产生长度为19-23个核苷酸的降低靶基因表达的双链核酸。
84.权利要求67的分离的双链核酸，其中所述双链核酸在体外使哺乳动物细胞中靶基因表达降低(以％表示)至少10％、至少50％和至少80-90％.
85.分离的双链核酸，其包含：长度为25个核苷酸的具有3’和5’末端的第一个寡核苷酸链，其中从第一个寡核苷酸链的3’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置1、2和/或3是脱氧核糖核苷酸；长度为27个核苷酸的具有3’和5’末端的第二个寡核苷酸链，其中所述第二个寡核苷酸链具有长度为2个核苷酸的3’突出端且包含交替修饰和未修饰的核苷酸残基，从第二个寡核苷酸链5’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置1、2、3、5、7、9、11、13、15、17和19均包含修饰的核糖核苷酸，其中所述第二个寡核苷酸链沿着其长度有至少19个核苷酸与所述靶RNA充分互补，当所述双链核酸被导入哺乳动物细胞中时降低靶基因表达。
86.权利要求85的分离的双链核酸，其中从第二个寡核苷酸链的5’末端第一个核苷酸(位置1)开始，位置4、6、8、10、12、14、16、18、20、21、22、23、24、25、26和27均包含未修饰的核糖核苷酸。
87.分离的双链核酸，其包含：长度为25个核苷酸的具有3’和5’末端的第一个寡核苷酸链，其中从第一个寡核苷酸链的3’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置1、2和/或3是脱氧核糖核苷酸；长度为27个核苷酸的具有3’和5’末端的第二个寡核苷酸链，其中所述第二个寡核苷酸链具有长度为2个核苷酸的3’突出端且包含交替修饰和未修饰的核苷酸残基，从第二个寡核苷酸链5’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置1、2、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21均包含修饰的核糖核苷酸，其中所述第二个寡核苷酸链沿着其长度有至少19个核苷酸与所述靶RNA充分互补，当所述双链核酸被导入哺乳动物细胞中时降低靶基因表达。
88.权利要求87的分离的双链核酸，其中从第二个寡核苷酸链的5’末端第一个核苷酸(位置1)开始，位置4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、23、24、25、26和27均包含未修饰的核糖核苷酸。
89.分离的双链核酸，其包含：长度为25个核苷酸的具有3’和5’末端的第一个寡核苷酸链，其中从第一个寡核苷酸链的3’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置1、2和/或3是脱氧核糖核苷酸；长度为27个核苷酸的具有3’和5’末端的第二个寡核苷酸链，其中所述第二个寡核苷酸链具有长度为2个核苷酸的3’突出端且包含交替修饰和未修饰的核苷酸残基，从第二个寡核苷酸链5’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置1、2、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25和27均包含修饰的核糖核苷酸，其中所述第二个寡核苷酸链沿着其长度有至少19个核苷酸与所述靶RNA充分互补，当所述双链核酸被导入哺乳动物细胞中时降低靶基因表达。
90.权利要求89的分离的双链核酸，其中从第二个寡核苷酸链的5’末端第一个核苷酸(位置1)开始，位置4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24和26均包含未修饰的核糖核苷酸。
91.分离的双链核酸，其包含：长度为25个核苷酸的具有3’和5’末端的第一个寡核苷酸链，其中从第一个寡核苷酸链的3’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置1、2和/或3是脱氧核糖核苷酸；长度为27个核苷酸的具有3’和5’末端的第二个寡核苷酸链，其中所述第二个寡核苷酸链具有长度为2个核苷酸的3’突出端且包含交替修饰和未修饰的核苷酸残基，从第二个寡核苷酸链5’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置1、2、3、5、7、9、11、13、15、17、19、26和27均包含修饰的核糖核苷酸，其中所述第二个寡核苷酸链沿着其长度有至少19个核苷酸与所述靶RNA充分互补，当所述双链核酸被导入哺乳动物细胞中时降低靶基因表达。
92.权利要求91的分离的双链核酸，其中从第二个寡核苷酸链的5’末端第一个核苷酸(位置1)开始，位置4、6、8、10、12、14、16、18、19、20、21、22、23、24和25均包含未修饰的核糖核苷酸。
93.分离的双链核酸，其包含：长度为25个核苷酸的具有3’和5’末端的第一个寡核苷酸链，其中从第一个寡核苷酸链的3’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置1、2和/或3是脱氧核糖核苷酸；长度为27个核苷酸的具有3’和5’末端的第二个寡核苷酸链，其中所述第二个寡核苷酸链具有长度为2个核苷酸的3’突出端且包含交替修饰和未修饰的核苷酸残基，从第二个寡核苷酸链5’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置1、2、3、5、7、9、11、13、15、17和26均包含修饰的核糖核苷酸，其中所述第二个寡核苷酸链沿着其长度有至少19个核苷酸与所述靶RNA充分互补，当所述双链核酸被导入哺乳动物细胞中时降低靶基因表达。
94.权利要求93的分离的双链核酸，其中从第二个寡核苷酸链的5’末端第一个核苷酸(位置1)开始，位置4、6、8、10、12、14、16、18、19、20、21、22、23、24、25和27均包含未修饰的核糖核苷酸。
95.分离的双链核酸，其包含：长度为25个核苷酸的具有3’和5’末端的第一个寡核苷酸链，其中从第一个寡核苷酸链的3’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置1、2和/或3是脱氧核糖核苷酸；长度为27个核苷酸的具有3’和5’末端的第二个寡核苷酸链，其中所述第二个寡核苷酸链具有长度为2个核苷酸的3’突出端且包含交替修饰和未修饰的核苷酸残基，从第二个寡核苷酸链5’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置4、6、7、12、13和16均包含修饰的核糖核苷酸，其中所述第二个寡核苷酸链沿着其长度有至少19个核苷酸与所述靶RNA充分互补，当所述双链核酸被导入哺乳动物细胞中时降低靶基因表达。
96.权利要求95的分离的双链核酸，其中从第二个寡核苷酸链5’末端的第一个核苷酸(位置1)开始，位置1、2、3、5、8、9、10、11、14、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26和27均包含未修饰的核糖核苷酸。
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