CN101838199B - 截短侧耳素的溶剂提取工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物来源化合物的提取工艺,特别涉及截短侧耳素的溶剂提取工艺,包括以下步骤:从截短侧耳素产生菌全发酵液中分离出菌丝体,干燥,粉碎过筛,烘焙至菌体总含水量低于5%,得烘焙菌丝体,备用;将所得烘焙菌丝体与醋酸丁酯混合,振摇浸提,提取液滤过,滤液经水洗、脱水干燥、活性炭脱色后,回收溶剂至有结晶析出,静置析晶,即得截短侧耳素;该工艺具有稳定易行,操作简便,溶剂毒性小、安全性好,溶剂消耗量小,提取时间短,产物易于纯化,成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物来源化合物的提取工艺,特别涉及截短侧耳素的溶剂提取工艺。
背景技术
截短侧耳素(pleuromutilin)是一种三环二萜类广谱抗生素,1951年首先由学者Kavanagh等从担子菌Pleurotus mutilis及P.passeckerianus中分离得到,已发现担子菌纲斜盖菇(Clitopilus)属中11个真菌能产生此类抗生素。截短侧耳素作为中间体,先后被用于半合成新型兽用抗生素泰妙菌素(Tiamulin)、沃尼妙林(Valnemulin)及新型人用抗生素瑞他莫林(Retapamulin)。其中2007年上市的瑞他莫林是近二十年以来世界范围内第一个全新的局部抗菌药,其标志着妙林类化合物的开发实现了从兽用抗生素到人用抗生素的飞跃。截短侧耳素类抗生素主要作用于细菌50S核糖体亚基,通过抑制肽基转移酶的活性阻断细菌蛋白合成,其独特的抗菌机制使其展示出对耐药菌的良好抗菌活性,同时还具有不易与其他药物发生交叉耐药的优越性,因此,近年来对该类抗生素口服衍生物的人用化开发备受关注。目前,日本住友制药Hirokawa等人所开发的一系列水溶性更好,代谢更稳定的新化合物以及Nabriva和GSK制药公司的口服妙林类新衍生物等相继进入临床,皆预示着妙林类化合物良好的应用开发前景。同时,妙林类化合物的相继开发直接刺激了作为原料药的截短侧耳素的产量需求。针对目前截短侧耳素与半合成系列抗生素紧迫的供需矛盾,提高截短侧耳素原料药的发酵单位、优化提取工艺、降低生产成本无疑将是最有效的解决办法。
目前关于截短侧耳素的提取工艺方面的研究报道较少。针对二萜类化合物的提取仍多采取冷浸、渗漉、回流等传统方法,也可利用新技术如超声提取、微波提取、超临界CO2萃取等达到高效、节能、环保提取的目的,但新型技术多数尚未在生产中应用。目前国内截短侧耳素的生产厂家采用的提取工艺主要是用板框压滤法从全发酵液中分离出菌丝体,再用甲醇进行浸提,该工艺在实际工业应用过程中存在以下问题:浸提时间长;溶剂消耗量大;甲醇闪点低、易燃易爆、易挥发、毒性和刺激性较大,危害生产环境和操作人员健康;甲醇与水的相溶性好,提取物中含有较多水溶性杂质,而这些杂质在后期纯化过程中难以去除。国外近年也有专利报道采用甲基异丁基甲酮一步法对全发酵液进行提取、纯化,但该工艺虽然简化了操作,但溶剂消耗量较大,成本偏高。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种截短侧耳素的溶剂提取工艺,具有稳定易行,操作简便,溶剂毒性小、安全性好,溶剂消耗量小,提取时间短,产物易于纯化,成本低等优点。
为达到上述目的,本发明的截短侧耳素的溶剂提取工艺,包括以下步骤:
a、菌丝体的预处理:从截短侧耳素产生菌全发酵液中分离出菌丝体,干燥,粉碎过筛,烘焙至含水量低于5%,得烘焙菌丝体,备用;
b、截短侧耳素的提取:将步骤a所得烘焙菌丝体与醋酸丁酯混合,振摇浸提,提取液滤过,滤液经水洗、脱水干燥、活性炭脱色后,回收溶剂至有结晶析出,静置析晶,即得截短侧耳素。
进一步,所述步骤b中每克烘焙菌丝体与4~6毫升醋酸丁酯混合,振摇转速为70~210转/分钟,提取次数为2~4次,每次提取时间为5~30分钟;
进一步,所述步骤b中每克烘焙菌丝体与4毫升醋酸丁酯混合,振摇转速为140转/分钟,提取次数为3次,每次提取时间为10分钟。
本发明的有益效果在于:本课题组在前期对截短侧耳素的发酵工艺和检测方法的优化研究中发现,截短侧耳素主要存在于菌丝体内部,胞内产物达90%以上。因此,本发明首先改进了提取前菌丝体的预处理方式:将菌丝体经粉碎预处理,利于溶剂在菌丝体中的传质,利于溶剂将与菌丝体蛋白紧密结合的微生物次生代谢产物溶出;粉碎后的菌丝体经烘焙预处理,利于减少提取过程中由于水分的存在对有机溶剂提取的干扰,且能够节约提取过程中的有机溶剂使用量;其次,本发明对截短侧耳素的提取溶剂进行了比较分析,发现醋酸丁酯是提取截短侧耳素的优良溶剂,其具有毒性较小、闪点较高、安全性好;水溶性小,提取物中水溶性杂质少;对截短侧耳素具有良好的结晶性能等优点;再次,在确定了最佳提取溶剂之后,本发明在单因素实验的基础上通过正交实验对影响截短侧耳素提取率的主要因素如提取时间、液料比、振摇转速、提取次数等进行了优化,所得优化工艺具有稳定易行,操作简便,溶剂消耗量小,提取时间短,产物易于纯化、成本低等优点,工业应用前景好。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述,其中:
图1为提取溶剂对截短侧耳素提取率的影响;
图2为提取时间对截短侧耳素提取率的影响;
图3为液料比对截短侧耳素提取率的影响;
图4为振摇转速对截短侧耳素提取率的影响;
图5为提取次数对截短侧耳素提取率的影响。
具体实施方式
以下将参照附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。
一、实验材料与仪器
截短侧耳素全发酵液是按照文献方法(Hu C,et al.Effect of soybean oil on theproduction of mycelial biomass and pleuromutilin in the shake-flask culture ofPleurotus mutilis.World J Microb Biot,2009,25(10):1705-1711)通过产生菌Pleurotus mutilis-04发酵制得。
醋酸丁酯、甲醇、冰醋酸、丙酮、正己烷、无水乙醇、甲基异丁基甲酮、醋酸乙酯、二氯甲烷及氯仿等溶剂均为国产分析纯,色谱级甲醇购于美国FisherScientific公司。
FUS-50L型发酵罐(上海国强生化工程装备有限公司),JA2003A电子天平(上海精天电子仪器有限公司),ZN-200A高速药材粉碎机(长沙中南制药机械厂),HZQ-C空气浴震荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司),LC-20AT型高效液相色谱仪(日本岛津公司)。
一、菌丝体的预处理
采用板框过滤法从截短侧耳素全发酵液中分离出菌丝体,自然风干,粉碎过16目筛,45℃烘焙8~10小时至总含水量<5%,得烘焙菌丝体,备用。按照文献方法(邹祥.高效液相色谱法测定发酵液中截短侧耳素的含量.食品与发酵工业,2006,32(03):83-85)测得烘焙菌丝体中截短侧耳素含量为15.80%(w/w)。
二、提取溶剂对截短侧耳素提取率的影响考察
方法:准确称取烘焙菌丝体11份,每份1.0g,分别加入溶剂冰醋酸、丙酮、正己烷、无水乙醇、甲醇、水、甲基异丁基甲酮、醋酸丁酯、醋酸乙酯、二氯甲烷和氯仿各5.0mL,振摇提取1小时,提取液滤过,滤液回收溶剂至干,残余物用甲醇溶解后采用高效液相色谱法测定截短侧耳素含量,计算提取率,每种溶剂重复试验3次。
结果:提取溶剂对截短侧耳素提取率的影响如图1所示,在相同的提取条件下,冰醋酸、正己烷和水对截短侧耳素的提取效率低下;无水乙醇、甲基异丁基甲酮、二氯甲烷和氯仿对截短侧耳素的提取效果较好;丙酮、甲醇、醋酸丁酯和醋酸乙酯对截短侧耳素的提取效果好。其中,甲醇、丙酮能与水混溶,在后期纯化过程中存在难以去除水溶性杂质的问题;氯仿毒性较强,不利于安全生产;醋酸丁酯和醋酸乙酯的毒性和水溶性均较小,但醋酸丁酯与醋酸乙酯相比,闪点较高,具备更好的安全性。此外,研究过程中还发现,醋酸丁酯对截短侧耳素具有良好的结晶性能,提取液回收溶剂即可析出截短侧耳素结晶,省去了应用甲醇等水溶性溶剂提取时,提取液回收溶剂后残余物需要用其它溶剂复溶再浓缩结晶等步骤,在简化工艺的同时大大降低了能耗。因此,本发明优选醋酸丁酯作为提取溶剂。
三、其它提取条件对截短侧耳素提取率的影响考察
影响截短侧耳素提取效果的因素较多,在确定提取溶剂之后,本发明分别对液料比、提取时间、振摇转速、提取次数等影响截短侧耳素提取效果的关键因素进行了考察。
1、提取时间对截短侧耳素提取率的影响
方法:将烘焙菌丝体与醋酸丁酯按液料比为5∶1(mL/g)混合,在温度25℃、转速200rpm条件下振摇提取5~30分钟,提取液滤过,滤液回收溶剂至干,残余物用甲醇溶解后采用高效液相色谱法测定截短侧耳素含量,计算提取率。
结果:提取时间对截短侧耳素提取率的影响如图2所示,当提取时间少于10分钟时,截短侧耳素提取率随提取时间延长而增加;当提取时间超过10分钟后,截短侧耳素提取率的变化趋于平缓;说明提取10分钟,烘焙菌丝体中的截短侧耳素已基本提取完全。
2、液料比对截短侧耳素提取率的影响
方法:将烘焙菌丝体与醋酸丁酯分别按液料比为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1(mL/g)混合,在温度25℃、转速200rpm条件下振摇提取10分钟,提取液滤过,滤液回收溶剂至干,残余物用甲醇溶解后采用高效液相色谱法测定截短侧耳素含量,计算提取率。
结果:液料比对截短侧耳素提取率的影响如图3所示,当液料比在4∶1以下时,截短侧耳素的提取率随液料比增加而急剧增加,当液料比大于4∶1时,截短侧耳素提取率的增加趋势变缓。推测其原因在于,溶剂用量的增大会降低烘焙菌丝体外液中截短侧耳素的浓度,增大烘焙菌丝体内外截短侧耳素的浓度差,从而利于截短侧耳素被提取出来;但当溶剂用量增大到一定程度后,烘焙菌丝体内的大部分截短侧耳素已溶入溶剂中且达到一定浓度,此时再增加溶剂用量,提取率增加缓慢。
3、振摇转速对截短侧耳素提取率的影响
方法:将烘焙菌丝体与醋酸丁酯按液料比为4∶1(mL/g)混合,在温度25℃、转速分别为0、70、140、210rpm条件下振摇提取10分钟,提取液滤过,滤液回收溶剂至干,残余物用甲醇溶解后采用高效液相色谱法测定截短侧耳素含量,计算提取率。
结果:振摇转速对截短侧耳素提取率的影响如图4所示,当转速为0即在提取过程中不加以振摇时,截短侧耳素的提取率仅为51.66%,而随着转速增大,截短侧耳素的提取率不断增大,当转速达到140rpm后,转速的增大对截短侧耳素提取率的影响变小,当转速达到210rpm时,提取液的色泽明显变深,说明振摇能提高溶质在溶液中的传质速率,提高溶剂对截短侧耳素的溶解效率,但振摇强度过大,反而使提取液中色素等杂质大幅增加,给后续纯化工作带来困难。
4、提取次数对截短侧耳素提取率的影响
方法:将烘焙菌丝体与醋酸丁酯按液料比为4∶1(mL/g)混合,在温度25℃、转速为140rpm条件下振摇提取1~4次,每次10分钟,提取液滤过,滤液回收溶剂至干,残余物用甲醇溶解后采用高效液相色谱法测定截短侧耳素含量,计算提取率。
结果:提取次数对截短侧耳素提取率的影响如图5所示,随着提取次数的增加,截短侧耳素的提取率增大,当提取次数超过2次时,提取率的增加趋势变缓。
四、正交实验优化截短侧耳素的溶剂提取工艺
综合单因素实验结果,以醋酸丁酯为提取溶剂,选取提取时间、液料比、振摇转速和提取次数共4个考察因素,每个因素各取3个水平,采用L9(34)正交表设计正交实验,以截短侧耳素提取率为考察指标,优化截短侧耳素的溶剂提取工艺。正交实验方案及结果见表1。
表1正交实验方案及结果
由表1可知,各因素对截短侧耳素提取率的影响大小为D>C>B>A,提取次数对截短侧耳素提取率的影响最为显著,提取时间对提取率的影响较小。从工艺的整体性价比和后期产物纯化难易程度考虑,确定截短侧耳素的最佳提取工艺为A2B3C3D3,即醋酸丁酯与烘焙菌丝体的液料比为5∶1(mL/g),提取时间为10分钟,振摇转速为210rpm,提取次数为3次。但是,当液料比从4∶1提高到5∶1时,溶剂的消耗量增加了25%,而截短侧耳素的提取率仅提高了约1.81%,因此,从投入产出比以及后期醋酸丁酯回收能耗等方面考虑,将最佳提取工艺的液料比调整为4∶1(mL/g)。同时,从振摇转速对截短侧耳素提取率的影响单因素实验结果可知,当振摇转速从140rpm提高至210rpm时,提取液的色泽明显变深,说明振摇强度的增大造成色素等杂质的提取大幅增加,不利于后期产物的纯化,而且当振摇转速从140rpm提高至210rpm时,截短侧耳素的提取率仅提高约0.64%,因此,将最佳提取工艺的振摇转速调整为140rpm。最终,确定本发明的最佳提取工艺为A2B2C2D3,即醋酸丁酯与烘焙菌丝体的液料比为4∶1(mL/g),提取时间为10分钟,振摇转速为140rpm,提取次数为3次。
五、截短侧耳素优化溶剂提取工艺的实验验证
方法:将烘焙菌丝体与醋酸丁酯按液料比为4∶1(mL/g)混合,在温度25℃、转速为140rpm条件下振摇提取3次,每次10分钟,合并提取液,滤过;取少量滤液回收溶剂至干,残余物用甲醇溶解后采用高效液相色谱法测定截短侧耳素含量,计算提取率;剩余滤液经水洗,无水硫酸钠脱水干燥,活性炭脱色后,回收醋酸丁酯至有少许结晶出现,温度4℃静置12小时析晶,即得截短侧耳素。实验重复3次。
结果:3次实验的截短侧耳素提取率分别为94.47%、94.03%及95.18%,平均提取率为94.56%,所得截短侧耳素的纯度经高效液相色谱法分析为78.60%;经水洗去除水溶性杂质、脱水干燥、活性炭脱色后浓缩析晶,所得截短侧耳素的纯度经高效液相色谱法分析达到94%。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (1)
1.截短侧耳素的溶剂提取工艺,其特征在于:包括以下步骤:
a、菌丝体的预处理:从截短侧耳素产生菌全发酵液中分离出菌丝体,干燥,粉碎过筛,烘焙至菌体总含水量低于5%,得烘焙菌丝体,备用;
b、截短侧耳素的提取:将每克步骤a所得烘焙菌丝体与4毫升醋酸丁酯混合,振摇浸提,振摇转速为140转/分钟,提取次数为3次,每次提取时间为10分钟,提取液滤过,滤液经水洗、脱水干燥、活性炭脱色后,回收溶剂至有结晶析出,静置析晶,即得截短侧耳素。
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