CN101808642B - 肥大细胞稳定剂治疗肥胖症 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过给予稳定肥大细胞的化合物来治疗或预防肥胖症发展的方法，此外，所述方法包括具有肥大细胞稳定剂和关于所述稳定剂用于治疗或预防肥胖症的说明书的药物组合物。

Description

肥大细胞稳定剂治疗肥胖症
相关申请交叉参考
本申请要求2007年9月28日在美国申请的申请号为60/960,408的美国专利的优先权和相关利益。
政府资助声明
美国政府无偿许可本发明并有权在有限范围内要求本专利拥有人以合理的条件，依据由卫生和人类服务部颁发的NIH授权HL60942的条款，许可他人。
发明领域
本发明涉及用于治疗和预防肥胖症的组合物和方法。
发明的背景
肥胖症是非常常见和有害的代谢性疾病，严重威胁美国以致全世界的公共卫生健康。自二十世纪八十年代中期这种疾病的流行开始显著上升。在美国，50％的成年人超重并且30％肥胖。更为严重的是，儿童的肥胖症的流行和相关的糖尿病也快速增加。尤其是在卫生保健资源的费用和利用方面，肥胖症对个人、家庭、社会的影响是很严重的。因此，控制体重不仅仅是科学课题，而是不断发展的社会所关切的问题。
肥大细胞(MCs)通过释放细胞质颗粒(其成分通过被IgE或补体因子致敏而促进过敏性炎症)帮助诱导过敏反应(Schwartz，et al.，Prog.Allergy 34：271-321(1984)；Mekori，et al.，J.Allergy Clin.Immunol.104：517-523(1999))。最近生物化学和组织学观察结果提示MCs可能参与血液来源的白细胞聚集(Mekori，et al.，J.Allergy Clin.Immunol.104：517-523(1999))，平滑肌细胞(SMC)/内皮细胞(EC)增生(Toda，N.，Circ.Res.61：280-286(1987)；Inoue，et al.，Am.J.Pathol.149：2037-2054(1996)；Mueller，et al.，Circ.Res.77：54-63(1995))，凋亡(Latti，et al.，J.Cell.Physiol.195：130-138(2003)；Leskinen，et al.，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.23：238-2343(2003)；Leskinen，et al.，Biochem.Pharmacol.66：1493-1498(2003))，T淋巴细胞迁移和活化(Mekori，et al.，J.Allergy Clin.Immunol.104：517-23(1999))，血管发生(Zudaire et al.，Am.J.Pathol.168：280-291(2006))，和基质重塑(Daugherty，et al.，Curr.Atheroscler.Rep.4：222-227(2002))。迄今为止，肥大细胞对肥胖症的作用尚不明确。
现在，肥大细胞缺陷型小鼠的发现(Duttlinger，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：3754-3758(1995)；Wolters，et al.，Clin.Exp Allergy 35：82-88(2005))和肥胖症模型(基因和饮食引起的肥胖症小鼠)的获得使我们可以评价肥大细胞在肥胖症及其并发症中的作用。此外，重要的的肥大细胞介质或白色脂肪组织(WAT)趋化因子受体的基因敲除小鼠的获得使我们可以鉴定肥大细胞中对肥胖症重要的介质和WAT中肥大细胞归巢所需要的趋化因子。
发明概述
本发明以实验研究结果为基础，结果提示肥大细胞在肥胖症的发展中起重要作用，可能是由于促炎细胞因子和其他介质的产生和释放。缺乏肥大细胞的小鼠在给予西方膳食后，与正常对应体相比，体重增加显著较少。然而，如果给予正常小鼠肥大细胞稳定剂，也显著避免了体重增加。
第一方面，本发明涉及通过给予有效量的使肥大细胞稳定的药物来治疗或预防动物或人中的肥胖症的一种方法。术语“有效量”是指药物达到治疗目的的充足的量。在本发明中，这是指当作为用于肥胖症的疗法时，必需给予以促进体重减轻的肥大细胞稳定剂的足够的量，或者当被给予以预防肥胖症发展时，必需给予以预防体重增加的肥大细胞稳定剂的足够的量。如果经鼻给药，通常剂量为5-100mg/天，口服剂量会高一些，通常为50-1500mg/天。出于本发明的目的，如果人或动物超过理想体重20％、体重指数(BMI)在30或更高和/或身体脂肪超过30％的，则被视为肥胖。
在上述方法中给予的肥大细胞稳定性药物，优选在24小时期间分为两次或者更多次平均给予。首选的药物是色甘酸、奈多罗米、酮替芬和洛度沙胺。这些药物可以任何药物学可接受的形式，包括药物学可接受的盐类如钠盐、二钠盐、钾盐或锂盐。应该理解为，除非另外说明，涉及这些药物的一种就包括所有药物学可接受的形式。一些优选的形式为：奈多罗米钠(尤其是经鼻5-50mg/天或口服50-500mg/天)；富马酸酮替芬(尤其是口服1-200mg/天)和洛度沙胺氨丁三醇(尤其是口服1-200mg/天)。最优选的药物是色甘酸钠或二钠，以200-1,000mg/天的剂量口服给药。在此提及的所有剂量是就人的药物给予而言的。如果将所述药物给予动物，可以人的剂量为参考再根据体重差异调整。例如，体重约为50lbs的动物应接受人剂量的三分之一。
上述方法可用于促进肥胖个体的体重下降或者预防个体的体重增加，尤其是由于遗传或环境因素而容易增加体重的个体。当给予人或动物治疗肥胖症时，需要持续每天给药直到个体体重下降至少原来体重的10％，优选15或20％。在特别优选的实施方式中，给予肥胖个体色甘酸，特别是色甘酸钠或二钠，在此期间，以约200-1,000mg/天的剂量给予。被治疗的患者在治疗期间可有除肥胖症以外的其他症状，或者它们可以没有症状，如过敏，心血管疾病或糖尿病。
另一方面，本发明涉及具有肥大细胞稳定剂和将该稳定剂给予患者以预防和治疗肥胖症的说明书的治疗组合物。所述稳定剂应该是单位剂型的药物组合物的一部分，并被包装在成品药物容器中。单位剂型是指单个药物给予实体如片剂，胶囊或溶液量。成品药物容器中是指任何个用于药物包装的不同类型，如瓶、小玻璃瓶、泡罩包装等。出于本发明的目的，成品药物容器中包括设计用于经鼻给药的包装，即，瓶或小玻璃瓶，其包含或可用于递送鼻腔喷雾的溶液或者粉末。类似地，单位剂型包括药物在其中以提供治疗效果的浓度溶解的溶液，当以固定的量经鼻或口服给予患者时。
包含在治疗组合物中的最优选的肥大细胞稳定剂是色甘酸、奈多罗米、酮替芬和洛度沙胺。当这些药物以片剂或胶囊形式口服给予时，单位剂量通常为5-1,000mg，并且更通常用地为10-500mg。以口服溶液给予的单位剂量是等量的。如果经鼻给药，溶液应该通常包含充足的药物浓度，以便患者每喷一下可以接受0.1-10mg。
形成治疗组合物的一部分的说明书可以出现在包含肥大细胞稳定剂的包装上，在成品药物容器上或作为单独的包装说明书。所述说明书包括应给与患者的肥大细胞稳定剂的剂量，例如用于治疗或预防肥胖症。主治的患者典型地是肥胖患者，以前肥胖，有肥胖症家族史，或者是会由于体重增长带来严重的健康风险的患者，如罹患心血管疾病的患者。
本发明也包括通过检测化合物稳定肥大细胞的能力来确定具体的化合物是否对肥胖症的治疗或预防有用。活性有抑制作用本领域公知的任何一种稳定作用检测方法，特别是那些已开发的用以筛选在过敏性治疗中无用的药物的，均可用于该目的。
发明详述
本发明基于以下表明肥大细胞稳定剂可以用来控制肥胖症的实施例部分总结的实验。这些药物可以用于帮助肥胖症患者减轻体重或者预防人们变胖。
A.肥大细胞稳定剂
稳定肥大细胞的药物在治疗过敏方面已经被广泛研究，并且这些药物的数种已经是商购可得的。最优选的肥大细胞稳定剂是色甘酸、奈多罗米、酮替芬和洛度沙胺，并且可以购得，或者可以使用本领域已知的方法合成。此外，本领域中描述的其他任何药物学可接受的肥大细胞抑制剂也可用于本发明。这些包括在以下的美国专利中公开的化合物：6,207,684；4,634,699；6,207,684；4,871,865；4,923,892；6,225,327和7,060,827。在每一项美国专利中提供了制备所述化合物的方法，伴随如何纯化的所述化合物以及其以何种方式使用的信息。这些化合物可以任何任何何药物学可接受的形式给与患者，包括任何任何何药物学可接受的盐类，最优选的药物是色甘酸钠或色甘酸二钠。
B.制备制药组合物
肥大细胞稳定性药物可以依据本领域的标准方法掺入药物组合物中(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.，(1990))。配制剂可以设计为通过本领域常规使用的任何任何途径递送，优选制剂设计为口服或经鼻递送。对于口服组合物，例如片剂或胶囊，肥大细胞稳定性药物应典型地以1和500mg的剂量提供。对于经鼻递送的组合物，稳定剂应典型地以0.5mg/ml-50mg/ml的剂量提供并更优选以1mg/ml-20mg/ml。类似的浓度范围可以用于口服溶液。尽管不是优选的，但是其他的给药途径也可以采用。
肥大细胞稳定剂可以与任何药物制剂中常规使用的任何赋形剂和辅料结合使用，包括水，盐溶液，醇类，***树胶，植物油，苯并醇(benzo-alcohol)，聚乙二醇，明胶，碳水化合物如乳糖、淀粉酶(amylase)或淀粉，硬脂酸镁，滑石粉，水杨酸，石蜡，脂肪酸酯，聚合物等。药物制剂可以被灭菌，如果需要的话，与以下佐剂混合如：分散剂，润滑剂，防腐剂，稳定剂，润湿剂，乳化剂，影响渗透压的盐类，缓冲剂，着色剂，调味剂和/或芳香物质。
溶液，尤其是注射用溶液，可以用水或生理上相容的有机溶剂如乙醇，1，2-丙二醇，聚乙二醇，二甲基亚砜，脂肪醇类，甘油三酯类，甘油偏酯等制备。可以采用常规技术所述制剂，并且可包括灭菌的等渗盐水，水，1，3-丁二醇，乙醇，1，2-丙二醇，聚乙二醇与水混合，Ringer溶液等。
C.剂型和给药途径
本发明适合任何给药途径，包括口服，经口服，内服，直肠，经鼻，舌下，经皮，***，静脉内，动脉内，肌内，腹膜内，皮内和皮下途径。可以采用的剂型包括片剂，胶囊，粉剂，气雾剂，栓剂，皮肤贴剂，非口服剂，缓释制剂和口服液，包括混悬液溶液和乳液。最优选的给药途径是口服和经鼻。如果需要的话，将组合物，尤其是用于注射的组合物可以冻干并将冻干物给药前重构。剂型可以包括肥大细胞稳定剂作为唯一的活性成分，或者可以同时包含其他的活性剂。所有剂型可以采用本领域常规方法并在参考文献如Remington′s Pharmaceutical Sciences(Osol，A，ed.，Mack Publishing Co. (1990))中教导的方法制备。
D.治疗方法
在此描述的方法的治疗目的是减轻患者体重或预防体重进一步增加。当用于预防体重增加时，最佳剂量是基于动物研究的结果的，例如本文所述的那些，以及使用本领城众所周知的方法进行的临床研究。稳定肥大细胞的药物已经可获得用于其他症状的治疗，特别是过敏反应，并且目前的剂量可以用作评价在预防和治疗肥胖症中有效剂量的起点。在现有知识的基础上，预计，使用口服递送的方法，患者典型地接受口服剂量50和1500mg/天的肥大细胞稳定剂，优选分为相等的两剂。当经鼻给药时，预计给予5和100mg/天量的稳定剂，同样将该量分为相等的几剂。
E.关于糖尿病的注释
尽管在此描述的实验主要针对肥胖症，某些方面提示同样的方法也可以用来治疗或预防1型糖尿病。治疗糖尿病的治疗目的是减轻或消除胰岛素依赖。优选的药物和剂量与用于肥胖症的相同。
F.治疗组合物的包装
正如之前描述的，包含肥大细胞稳定剂的药物组合物应置于成品药物容器中，并与针对医生的关于该组合物的使用说明书一同销售。在经鼻递送的制剂的情况下，药物组合物典型地为溶液或粉末，其包装在设计为将组合物作为喷雾递送的装置中。本领域已知的任何以此方式递送药物的装置均适用于本发明。取决于意欲的递送途径，其他容器可以包括瓶，小玻璃瓶，安瓿瓶，泡罩包装等等。
关于药物组合物的使用的说明书可以与药物组合物一起包含在容器上或作为包装说明书。可替代地，说明书也可以包含其中销售有药物组合物的盒子或其他包装上。在所有情况下，说明书都应该标明给予药物组合物以用来促进体重减轻或预防体重增加的目的。活性成分的描述也与关于剂量和如何给予药物组合物的信息一起包括在内。
G.检测方法
本发明也包括基于化合物使肥大细胞稳定的能力来评价其在治疗和预防肥胖症中的潜在用途的方法。这些检测方法是本领域众所周知的并且曾经用于在治疗过敏性反应中有用的药剂的鉴别。
可以使用的一个适合的检测方法的实例在美国6,225,327中描述。简言之，肥大细胞(约5,000/测定管)在37℃与试验化合物孵育约15分钟，然后暴露于抗人IgE(约10μg/ml)中。再孵育15分钟后，通过离心终止反应。然后收集上清液，并分析组胺含量，例如通过放射免疫法。然后将该样品(试验样品)中存在的组胺量与通过在不存在试验化合物的情况下孵育肥大细胞和抗人IgE而获得的对照制剂中的量进行比较。与对照相比，试验样品中组胺含量的减少是试验化合物起稳定肥大细胞的作用的指示。稳定剂的效力可以通过达到给定抑制水平所需的浓度来反应，例如，组胺释放减少50％。
实施例
本研究证实肥大细胞对饮食引起的肥胖症和糖尿病起重要作用。来自肥胖的人和小鼠的白脂肪组织(WAT)比来自他们的瘦对应体的WAT包含较多的肥大细胞。小鼠中遗传决定的肥大细胞缺陷和肥大细胞的药物稳定减少了体重增加和血清和/或WAT中炎性细胞因子、趋化因子和蛋白酶的水平，并且与改善的葡萄糖内稳态和能量消耗相呼应。机制研究揭示肥大细胞提高WAT和肌肉的血管发生和相关的脂肪生成有关的组织蛋白酶活性。与减少体重增加和改善葡萄糖耐量一致，肥大细胞缺陷和稳定提高肌肉和WAT中抗脂肪生成的基质纤维连接蛋白、葡萄糖运载体Glut4和胰岛素受体的水平。细胞因子缺陷型肥大细胞的使用确立了这些细胞体外诱导小鼠脂肪细胞的脂质沉积和组织蛋白酶的表达，并且体内通过产生IL6和IFN-γ促进饮食引起的肥胖症和葡萄糖代谢。临床使用肥大细胞稳定剂减轻了小鼠肥胖症和糖尿病，提示对这些常见人类代谢性疾病的新疗法。
I.方法
小鼠
野生型(C57BL/6)、I16-/-型(C57BL/6，N11)和Ifng-/-型(C57BL/6，N10)小鼠购自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)。同基因型的Tnf-/-型(C56BL/6，N10)和肥大细胞缺陷型KitW-sh/W-sh(C57BL/6，N＞10)小鼠通过与C57BL/6背景如所述地回交(Sun，et al.Nat.Med.13：719-724(2007)；Wolters，et al.，Clin Exp Allergy 35：82-88(2005))而产生。哈佛大学医学院常务委员会批准了所有动物研究草案，所有小鼠都饲养在无病原体的设施内。为诱导肥胖症，给6周龄小鼠(雌性和雄性)饲以西方膳食(Research Diet，New Brunswick，NJ)12-20周。每周监测小鼠体重。直至西方膳食的消耗的各个过程结束为止，如先前所报道地进行葡萄糖耐量和能量消耗检测(Yang，etal.，Nat.Cell Biol.9：970-977(2007))。采集小鼠血样用于血清脂肪因子测量。独立采集皮下脂肪、内脏脂肪和棕脂肪以及骨骼肌用于蛋白提取和石蜡切片的制备。组织蛋白提取物用于进行酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹分析和半胱氨酸组织蛋白酶活性中心标记。对于免疫印迹分析，30μg蛋白在8％SDS-PAGE上分离以检测220kDa的纤维连接蛋白(小鼠单克隆，1∶100，NeoMarkers，Fremont，CA)和200kDa的胰岛素受体(小鼠单克隆，1∶100，Calbiochem，SanDiego，CA)，或者在12％SDS-PAGE上分离以测定Glut4(小鼠单克隆，1∶200，R&D Systems，Minneapolis，MN)、解偶联蛋白UCP1(兔多克隆，1∶3000，Abcam，Cambridge，MA)、肌动蛋白(小鼠单克隆，1∶500，Abcam)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH，兔多克隆，1∶1000，Santa Cruz Biotechnolog，Santa Cruz，CA)。对于组织蛋白酶活性中心标记，将30μg蛋白与1μl的600mM的二硫苏糖醇、1μl的[125I]-JPM在pH5.5的缓冲液中如在先所述地一起孵育。在37℃孵育反应混合物1小时后，于12％SDS-PAGE上分离经标记的蛋白。凝胶用考马斯蓝染色、脱色、干燥并暴露于x射线胶片。采集肝脏和胃肠道用于组织学分析。
患者选择
本研究入选在2003-2007年
Figure GPA00001070737800091
-Dieu医院营养科(ReferenceCenter for the Medical and Surgical Care of Obesity，Paris，France)预征募的80位肥胖受试者(平均年龄37.5岁，在20-66岁之间；平均BMI为48.5kg/m2，范围是32-85；女性/男性比69/11)。在Assistance Publique-
Figure GPA00001070737800101
de Paris支持的临床研究计划中，受试者是饮食干预或者胃手术的候选人。排除了有炎症或传染性疾病、癌症、酒精滥用或肾脏疾病迹象的那些。在胃手术时，在肥胖受试者小组(N＝6，BMI＝51.71±1.40kg/m2，血糖：5.38±0.13mmol/l，胰岛素：13.32±1.06μU/ml)中，我们获得了脐周区的皮下脂肪组织。在同一地理区域生活的健康不肥胖的年龄匹配的(P＝0.2)个体(N＝32，平均年龄41.4岁，范围20-62；平均BMI 22.8kg/m2，范围19.9-28.4；女性/男性比22/10)征募为对照组。在10位瘦对照(BMI＝23.67±0.48kg/m2，葡萄糖：4.82±0.45mmol/l，胰岛素：7.20±1.56μU/ml)中我们通过穿刺活检获取了脐周区的皮下脂肪组织。参与代谢研究的志愿者在干预前3个月是体重稳定的。在禁食后的早上得到的血液样本和血清，于-80℃冷冻直至使用。将组织标本进行***固定和石蜡包埋。
Figure GPA00001070737800102
-Dieu医院伦理委员会批准该临床研究，并且所有受试者都签署了书面知情同意书。
免疫组织学
将人和小鼠的WAT和肌肉组织用10％***固定过夜并包埋在石蜡中，由此制备厚度5μm的切片。抗人肥大细胞类胰蛋白酶(小鼠单克隆，1∶100，Dako，TRAPPES CBDEX，France)，抗小鼠肥大细胞CD117(兔多克隆，1∶10，eBiosciences，Inc.，San Diego，CA)，和抗小鼠CD31(兔单克隆，1∶400，Pharmingen，San Diego，CA)对WAT，肌肉和肝切片上的肥大细胞和微血管进行免疫染色。对组织来源不知情的研究者计数人的类胰蛋白酶阳性和CD117阳性的肥大细胞，并且数据提供为每mm2的细胞数。在WAT和肌肉组织中的CD31阳性区如所述地使用Image-Pro Plus软件来测定，并且数据提供为CD31阳性区的百分比(Wang，et al.，J.Biol.Chem.281：6020-6029(2006)；Wild，Microvasc Res.59：368-376(2000))。苏木精和伊红染色有助于胃肠道的组织学评价。
ELISA
将经冷冻的小鼠WAT粉化并溶解在包含组织蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Calbiochem，San Diego，CA)的RIPA缓冲液(Pierce，Rockford，IL)中。WAT和血清样本都根据生产商的说明书经针对IL6(BDBiosciences)，TNF-α(PeproTech，Rocky Hill，NJ)，IFN-γ(PeproTech)，MCP-1(PeproTech)，脂连蛋白(R&D Systems)，MMP-9(R&D Systems)，CatS(R&D Systems)和CatL(Bender MedSystems Inc，Burlingame，CA)的ELISA检测。
为测量人血清中类胰蛋白酶水平，将96孔板用兔的抗人的类胰蛋白酶多克隆抗体(1∶1000，Calbiochem)预涂覆。将经稀释的人血清样本(1∶2)与重组的人的类胰蛋白酶一起作为标准添加到抗体涂覆孔板中。室温孵育2小时后，洗涤板，并与抗人的类胰蛋白酶单克隆抗体(1∶2000，AbD Serotec，Raleigh，NC)孵育1小时。过氧化物酶(HRP)缀合的抗鼠1gG(1∶1000，Thermo scientific，Waltham，MA)用作检测用抗体。
3T3-L1细胞培养和分化
将小鼠前脂肪细胞3T3-L1(The American Type CultureCollection，Manassas，VA)在胰岛素、***和异丁甲基黄嘌呤中在6孔板或24孔板上如所述地培养并分化为脂肪细胞(Yang，et al.，Nat.Cell Biol.9：970-977(2007))。为评价肥大细胞在3T3-L1分化中的作用，我们在100％融合的3T 3-L1细胞中加入活肥大细胞(对于6孔板加入2×106个细胞/孔，或对于24孔板加入5×105个细胞/孔)或者肥大细胞脱粒蛋白提取物(等于活细胞数)。将共同培养物保持7-9天，每2天更换具有活肥大细胞或肥大细胞脱粒蛋白提取物的培养基。油红O染色定量脂质沉积，并且数据提供为OD510nm读数。通过如所述地将细胞溶解在pH5.5的缓冲液中，分化的3T3-L1细胞还用于组织蛋白酶活性中心标记(Shi，et al.，J.Biol.Chem.267：7258-7262(1992))。
骨髓来源肥大细胞(BMMC)的培养和重建
由WT，I16-/-，Tnf-/-，and Ifng-/-小鼠的骨髓制备BMMC，如在先报道(Sun，et al.Nat.Med.13：719-724(2007)；Sun，et al.，J.Clin.Invest.117：3359-3368(2007))。在重组小鼠IL3(PeproTech)和干细胞因子(PeproTech)分化5周后(Sun，et al.Nat.Med.13：719-724(2007))，分别用CD117介导的荧光活化细胞分选***(FACS)分析和甲苯胺蓝染色鉴定细胞纯度和形态。为检测肥大细胞在小鼠肥胖症中的作用，将来自每种小鼠的BMMC(1×107/小鼠)注入6周龄雄性KitW-sh/W-sh小鼠的尾静脉。BMMC重建2周后，小鼠消耗西方膳食以诱导肥胖症和糖尿病。每周记录小鼠体重，在收集WAT制备蛋白提取物之前进行葡萄糖耐量分析。
统计
来自所有小鼠的数据以平均值±标准差表示，并且由于我们的数据大小小和数据分布是非正态的因此采用非参数秩和检验(Mann-Whitney test)来确定统计显著性。人血清糜蛋白酶和类胰蛋白酶数据表示为平均值±标准差。Shapiro-Wilcoxon检验估计所有临床和生物学参数的高斯分布。统计分析前，将偏态变量(糜蛋白酶和类胰蛋白酶)经对数转换并验证以使它们的分布正态化。不连续数值的Student′s t检验，方差分析(ANOVA)和X2检验被用于组间比较。用JMP统计软件(SAS Institute Inc.，Cary，NC)进行统计分析。P＜0.05被认为是显著的。
II.结果
除脂肪细胞外，肥胖受试者中的WAT还包含巨噬细胞和淋巴细胞(Weisberg，et al.，J.Clin.Invest.112：1796-1808(2003)；Wu，et al.，Circulation 115：1029-1038(2007))。这些炎性细胞提供WAT中的细胞因子、生长因子、趋化因子和蛋白酶(Wu，et al.，Circulation 115：1029-1038(2007)；Fantuzzi，J.Allergy Clin.Immunol.115：911-919(2005))。但是这些细胞在肥胖症和相关的代谢并发症糖尿病的发病机制中的作用仍不清楚。其他未明确的细胞也可能起重要作用。人脂肪组织切片用肥大细胞特异性类胰蛋白酶单克隆抗体的免疫染色显示，与瘦削供体相比，来自肥胖受试者的WAT中肥大细胞数量增加。伴随着较高的肥大细胞含量，肥胖供体的血清中肥大细胞蛋白酶水平增高。使用ELISA，测得，与瘦削的受试者(BMI＜30kg/mm2)相比，肥胖供体(人体质量指数：BMI≥30kg/mm2)在性别差异校正之前(P＜0.01)和之后的(P＜0.01，多变量分析)具有显著较高的类胰蛋白酶水平。这些观察结果提示了肥大细胞在肥胖症中的作用。
为评价肥大细胞直接参与肥胖症，我们研究了饮食诱导的肥胖症的肥大细胞缺陷型KitW-sh/W-sh小鼠。尽管由于c-Kit启动子区域的倒位突变而使得KitW-sh/W-sh小鼠缺乏成熟的肥大细胞(Duttlinger，et al.，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 92：3754-3758(1995))，但是血液中其他淋巴细胞的数量和活性是正常的，所以允许体内探测肥大细胞的功能。饲以西方膳食12周，与野生型(WT)同基因型的对照相比，6周龄雄性KitW-sh/W-sh小鼠增加显著较少的体重。类似地，接受每日腹膜内(i.p.)注射肥大细胞稳定剂色甘酸二钠(DSCG)(Eigen，et al.，J.Allergy Clin.Immunol.80：612-621(1987))的WT小鼠也具有减少的体重增加。DSCG治疗并不进一步影响KitW-sh/W-sh小鼠的体重，提示是通过肥大细胞起作用的。与减轻体重一致，雄性KitW-sh/W-sh小鼠或者接受DSCG的那些，与未治疗的野生型WT对照相比，具有显著较少的皮下和内脏脂肪。雌性KitW-sh/W-sh小鼠或DSCG治疗的WT小鼠表现出相似的体重增加和皮下及内脏脂肪的减少。和人的脂肪组织一样，来自饮食导致肥胖的小鼠的WAT包含大量的c-Kit(CD117)阳性的肥大细胞，而来自饲料喂饲(chow diet-fed)的瘦削小鼠的WAT具有少得多的肥大细胞。有趣的是，在相同的饮食条件下，DSCG治疗小鼠的WAT中肥大细胞数量与未治疗小鼠的WAT中肥大细胞数量相近，尽管在体重增加方面这些小鼠与KitW-sh/W-sh小鼠反应类似，提示与未治疗的WT小鼠相比，DSCG治疗WT小鼠具有较少的活性肥大细胞。与雄性和雌性KitW-sh/W-sh小鼠或接受DSCG的那些的体重减轻一致，这些小鼠还具有比WT对照显著较低水平的血清瘦素水平。KitW-sh/W-sh和经DSCG治疗的小鼠不仅较瘦，而且还证实它们对葡萄糖负荷的敏感性较高。葡萄糖耐量检测表明无肥大细胞(KitW-sh/W-sh)的小鼠或具有被稳定的肥大细胞(用DSCG治疗的WT)的小鼠中显著改善的葡萄糖耐量。为理解肥大细胞缺陷或失活的这些有益效果的机制，我们进行了能量消耗检测并测量了棕色脂肪非偶联蛋白-1(UCP1)。通过测量食物/水的摄入，粪便/尿液的产生和O2消耗及CO2的产生，发现KitW-sh/W-sh小鼠和经DSCG治疗的WT小鼠的静息代谢率增加，这通过与未治疗WT小鼠相比显著更多的O2消耗及的CO2产生而阐明。相比WT对照小鼠，KitW-sh/W-sh小鼠和接受DSCG的那些具有明显较高的棕脂肪UCP1(能量消耗的标志)表达。重要的是，既不是食物/水的摄入减少，也不是DSCG的毒性作用引起经DSCG治疗的WT小鼠的体重减轻和葡萄糖耐量改善。组织学分析表明，与饲料喂饲的WT小鼠相比，经DSCG治疗的西方膳食饮食喂饲的小鼠的肝脏和胃肠道(GI)病理上没有差异。在西方膳食喂饲的WT小鼠的脂肪肝里出现大量肥大细胞和脂肪细胞，而在饲料喂饲的WT小鼠或经DSCG治疗的西方膳食饮食喂饲的WT小鼠的肝脏中没有检测到肥大细胞或负载脂质的脂肪细胞。类似地，胰脏、胃、结肠和小肠组织学检查显示饲料喂饲的WT小鼠和经DSCG治疗的西方膳食喂饲的WT小鼠之间没有明显区别。为进一步观察，我们对WT小鼠饲以西方膳食12周以引发肥胖症和糖尿病，并将这些肥胖和糖尿病小鼠分为4个治疗组：I，持续用西方膳食喂饲，II，转为饲料；III，持续用西方膳食喂饲连同每日腹膜内注射DSCG；IV，转为饲料并且用DSCG治疗。尽管饮食的改变(组II)也会引起预计到的体重减轻(8％)和葡萄糖耐量改善，然而饮食改变与给予DSCG(组IV)联合产生体重和葡萄糖耐量的最大改善。DSCG治疗8周后，组III的小鼠体重下降了12％，但是组IV的小鼠下降了19％，并且稳定在约40-41克。重要的是，在这4四组中组的IV小鼠也显示了最高的葡萄糖耐量，提示通过稳定肥大细胞来控制人的肥胖症和糖尿病的可能性。
III.讨论
肥胖症的发展包括脂肪生成、血管发生和基质重塑。血管发生在肥胖症中尤为重要。微血管除了给WAT提供营养，还为白细胞侵润及随之的脂肪因子释放提供通道。血管发生的抑制阻断小鼠脂肪组织的发育(Rupnick，et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA 99：10730-10735(2002))。肥胖WT小鼠的WAT和肌肉组织显示了内皮细胞标记物CD31明显的免疫染色。相反，西方膳食喂饲的KitW-sh/W-sh小鼠或接受DSCG的那些具有与饲料喂饲的瘦小鼠相似的CD31阳性区域。减少的血管发生可能影响白细胞侵润，因此减少WAT炎症介质的产生(Skoura，etal.，J.Clin.Invest.117：2506-2516(2007))。与此观点一致，KitW-sh/W-sh小鼠或接受DSCG的那些具有较低的血清和/或WAT中IL6，TNF-α，IFN-γ，MCP-1，基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和组织蛋白酶S(CatS)，尽管某些脂肪因子(如脂连蛋白和CatL)没有明显变化。基质蛋白酶解可能通过释放促血管生成的肽而有助于血管发生(Xu，etal.，J.Cell Biol.154：1069-1079(2001))。我们以前已经揭示了CatS通过降解抗血管生成的肽和产生促血管生成的核纤层蛋白-5的片段γ2而在血管发生中发挥重要作用(Wang，et al.，J.Biol.Chem.281：6020-6029(2006))。在KitW-sh/W-sh小鼠或DSCG治疗小鼠中血管发生减少，伴有WAT和血清中的低CatS水平。将WAT蛋白提取物与选择性标记活性组织蛋白酶的[125I]-JPM孵育后，在KitW-sh/W-sh小鼠WAT中我们发现活性受损的组织蛋白酶，包括CatS，CatK和CatB。有趣的是，经DSCG治疗的小鼠的WAT中仍具有与WT对照相似的活性CatS和CatK水平，与在这些组织中观察到大量肥大细胞一致。CatSELISA使我们能够测定不同小鼠中局部和全身的水平。与JPM标记实验的观察结果相似，雄性和雌性的KitW-sh/W-sh小鼠都显示低于WT对照的血清和WAT中CatS水平。相反，DSCG治疗组显著降低在血清中而不是在WAT中的CatS水平，提示该抗***反应药剂有效地使肥大细胞失活。
我们以前的研究提示半胱氨酰组织蛋白酶不仅促进血管发生，而且通过降解抗脂肪生成的基质构成纤维连接蛋白、葡萄糖运载体Glut4和胰岛素受体(IR)参与脂肪生成(Wang，et al.，J Biol Chem.281：6020-6029(2006)；Yang，et al.，Nat.Cell Biol.9：970-977(2007)；Taleb，et al.，Endocrinology 147：4950-4959(2006))。肥大细胞缺陷和失活由于组织蛋白酶活性降低可能间接影响这些蛋白。与该假说一致的是，KitW-sh/W-sh小鼠的WAT和肌肉组织中所有这三种分子都增加。有趣的是，在经DSCG治疗小鼠的WAT和肌肉组织中我们检测到比KitW-sh/W-sh小鼠更多的纤维连接蛋白、Glut4和IR分子，提示DSCG比肥大细胞影响更大。但是，DSCG的这种附加效应并未进一步改变KitW-sh/W-sh小鼠的体重增加和葡萄糖耐量或者改变WT小鼠的肝脏及胃肠道组织学。
为进一步理解肥大细胞控制小鼠肥胖症和糖尿病的分子机制，我们制备了缺乏三种常见肥大细胞分泌的细胞因子(IL6，TNF-α，和IFN-γ)之一的小鼠的骨髓来源的肥大细胞(BMMC)，并检查了任何细胞因子的缺乏是否损害肥大细胞体外诱导前脂肪细胞分化及体内对饮食引起的肥胖症和糖尿病中的活性。来自WT、Tnf-/-，和Ifng-/-小鼠的BMMC即使在无分化诱导鸡尾酒(胰岛素，***，异丁基甲基黄嘌呤)的条件下也诱导3T3-L1细胞的血管发生和相关的组织蛋白酶表达，尽管根本机制仍未知。相反，I16-/-的BMMC对这两个变量具有低得多的效力。为体内验证这些肥大细胞的细胞因子在肥胖症中发挥作用，我们将这些BMMC细胞过继转染到雄性KitW-sh/W-sh小鼠。给予西方膳食13周后，与没有进行BMMC重建小鼠相比，WT和Tnf-/-BMMC重建但非I16-/-和Ifng-/-BMMC的小鼠显著增加更多的体重尽管它们都比WT对照瘦。与体重差异一致，和未重建的小鼠或接受I16-/-和Ifng-/-BMMC的那些相比，接受WT和Tnf-/-BMMC的那些具有显著更高的血清胰岛素和葡萄糖水平。相比WT对照，接受I16-/-和Ifng-/-BMMC但非WT或Tnf-/-BMMC的KitW-sh/W-sh小鼠也显示了改善的葡萄糖耐量，提示肥大细胞来源的IL6和IFN-γ促成了这些代谢紊乱。为支持该结论，相比WT小鼠或者接受WT或Tnf-/-BMMC的那些，我们在I16-/-和Ifng-/-BMMC重建的KiW-sh/W-sh小鼠WAT提取物中检测到更高量的基质纤维连接蛋白、Glut4和IR。WAT中这些分子的差异可能是由于蛋白酶解的改变或脂肪细胞大小不同造成的。尽管我们发现KitW-sh/W-sh小鼠比WT对照的WAT脂肪细胞小，但是WAT脂肪细胞的大小在不同BMMC重建小鼠之间并没有显著变化。相反，不同重建的接受者在半胱氨酰组织蛋白酶的表达上具有明显不同。不知道为什么Ifng-/-BMMC与WT BMMC相同地诱导3T3-L1脂肪生成和组织蛋白酶活性，但是不能恢复体重和葡萄糖敏感性。肥大细胞来源的IFN-γ除了影响脂肪细胞分化外，还可能影响其他过程如通过旁分泌效应影响邻近细胞的血管发生或蛋白酶表达。在Ifng-/-BMMC重建KitW-sh/W-sh小鼠WAT中观察到低组织蛋白酶活性支持了这一观点。因此，肥大细胞介质体外如何调节WAT的生长及何种附加的肥大细胞因子参与还值得进一步研究。
本研究确立了肥大细胞在鼠类肥胖症和糖尿病中的新作用并提示了临床常规应用的抗过敏反应药物用于这些常见人类代谢性疾病的潜在新疗法。
本文引用的所有参考文献通过参考完全并入。现在完整地描述了本发明，本领域的技术人员了解本发明可以在宽的和相当范围的条件、参数范围等下实施，而不影响发明及其任何实施方式的精髓或范围。

Claims (9)

1.肥大细胞稳定剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防人或动物对象的肥胖症，所述肥大细胞稳定剂选自色甘酸、奈多罗米、酮替芬和洛度沙胺。
2.权利要求1的用途，其中所述人或动物对象在开始治疗时没有过敏反应、心脏病和糖尿病。
3.权利要求1或2的用途，其中所述药物是以50-1500mg/天的剂量口服给予的形式存在。
4.权利要求1或2的用途，其中所述药物是以5-100mg/天的剂量经鼻给予的形式存在。
5.权利要求1或2的用途，其中所述药物是以200-1000mg/天的剂量口服给予的形式存在，且所述肥大细胞稳定剂是色甘酸钠或色甘酸二钠。
6.权利要求1或2的用途，其中所述药物是以5-50mg/天的剂量经鼻给予的形式存在，且所述肥大细胞稳定剂是奈多罗米钠。
7.权利要求1或2的用途，其中所述药物是以50-500mg/天的剂量口服给予的形式存在，且所述肥大细胞稳定剂是奈多罗米钠。
8.权利要求1或2的用途，其中所述药物是以1-200mg/天的剂量口服给予的形式存在，且所述肥大细胞稳定剂是富马酸酮替芬。
9.权利要求1或2的方法，其中所述药物是以1-200mg/天的剂量口服给予的形式存在，且所述肥大细胞稳定剂是洛度沙胺氨丁三醇。
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