CN101805385A - 从羽芒菊中分离纯化的新黄酮类化合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从羽芒菊中分离纯化的新黄酮类化合物及其制备方法。采用化学分离纯化及色谱分离技术从羽芒菊中分离纯化新黄酮类化合物，包括渗漉提取、大孔吸附树脂、硅胶柱色谱分离等，从羽芒菊中分离得到3个新黄酮化合物：8，3′-二羟基-3，7，4′-三甲氧基6-O-β-D-葡萄糖黄酮苷；8，3′-二羟基-3，7，4′-三甲氧基-6-O-[α-L-鼠李糖基-(1→2)]-β-D-葡萄糖黄酮苷；8，3′-二羟基-3，7，4′-三甲氧基黄酮。该制备方法以野生的羽芒菊为原料，来源特别丰富，制备工艺较简单，经济、安全，得率高；经初步活性研究表明，制得的新黄酮类化合物具有较强的抑菌活性、抗氧化活性。
Description
技术领域
本发明属于黄酮类化合物及其制备方法技术领域，具体为从羽芒菊中分离纯化的新黄酮类化合物及其制备方法。
背景技术
黄酮类化合物是一类广泛存在于植物界的重要生物活性物质，具有抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗肿瘤、抗菌等作用。生物的抗氧化能力与其抗病性、抗逆性及延缓衰老密切相关，因而从天然植物中寻找有效的抗氧化剂应用于医药、食品、保健品、化妆品等中是当前的研究热点之一。
羽芒菊(Tridaxprocumbens.L)为菊科长柄菊属多年生草本植物，甘微，苦寒，羽芒菊叶和花有抗菌消炎的作用，经常用于割伤、擦伤、创伤伤口止血，同时还可以有效阻止脱发。羽芒菊原产于美洲热带地区，后传播于印度、中南半岛及印度尼西亚等国，我国引入广东、台湾及海南等地。关于从羽芒菊中分离纯化的新黄酮类化合物及其制备方法，经文献检索，尚未见研究报道。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种从羽芒菊中分离纯化的新黄酮类化合物及其制备方法的技术方案，其制备工艺简单，得率高，制得的单体化合物具有较强的抑菌活性和抗氧化活性。
所述的从羽芒菊中分离纯化的新黄酮类化合物，化学名称为：8，3′-二羟基-3，7，4′-三甲氧基-6-O-β-D-葡萄糖黄酮苷，具有(I)所示结构式：
所述的从羽芒菊中分离纯化的新黄酮类化合物，化学名称为：8，3′-二羟基-3，7，4′-三甲氧基-6-O-[α-L-鼠李糖基-(1→2)]-β-D-葡萄糖黄酮苷，具有(II)所示结构式：
所述的从羽芒菊中分离纯化的新黄酮类化合物，化学名称为：8，3′-二羟基-3，7，4′-三甲氧基黄酮，具有(III)所示结构式：
所述化合物I、II、III的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取干燥的羽芒菊全草粗粉作原料，用70％乙醇渗漉提取，收集渗漉液；
2)将渗漉液真空薄膜浓缩至无醇味，回收乙醇，得到浸膏；
3)将浸膏加入适量水进行超声分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将所得各部位萃取液减压浓缩得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位；
4a)将步骤3)所得的乙酸乙酯部位超声分散于水中，通过Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱，依次用H2O、10％MeOH、20％MeOH、40％MeOH、60％MeOH、70％Me2CO进行洗脱，得到各洗脱部位；Diaion柱的40％MeOH洗脱部位再通过Sephadex LH-20凝胶吸附树脂柱色谱，然后以H2O、20％MeOH、40％MeOH、60％MeOH、70％Me2CO进行洗脱；
将Sephadex柱的40％MeOH洗脱部位通过硅胶柱色谱，以体积比5-7∶1-3∶1的乙酸乙酯-乙醇-水进行洗脱，洗脱液真空浓缩干燥得化合物I的浅黄色粗品，再经甲醇-水混合溶剂重结晶，得化合物I的浅黄色结晶；
将Sephadex柱的20％MeOH洗脱部位通过硅胶柱色谱，以体积比6-8∶1-3∶1-3的乙酸乙酯-乙醇-水进行洗脱，洗脱液真空浓缩干燥得化合物II的浅黄色无定型粉末；
4b)将石油醚部位通过硅胶柱色谱，以体积比20∶1-1∶10的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，TLC检识，相同流份合并后得8个部分，其中以化合物III为主成分的第4部分再通过硅胶柱色谱，然后再以体积比4-6∶1的石油醚-乙酸乙酯进行洗脱，洗脱液真空浓缩干燥得化合物III的浅黄色结晶。
上述步骤1)中羽芒菊全草粗粉用3倍量的70％乙醇渗漉提取。
上述步骤4a)中Sephadex柱的40％MeOH洗脱部位通过硅胶柱色谱，以体积比6∶2∶1的乙酸乙酯-乙醇-水进行洗脱；
Sephadex柱的20％MeOH洗脱部位通过硅胶柱色谱，以体积比7∶2∶2的乙酸乙酯-乙醇-水进行洗脱。
上述步骤4b)中石油醚-乙酸乙酯的体积比15∶1-1∶5。
上述从羽芒菊中分离纯化的新黄酮类化合物及其制备方法，以野生的羽芒菊为原料，来源特别丰富，制备工艺较简单，经济、安全，得率高；制得的3个新黄酮化合物均具有较强的抑菌活性、抗氧化活性和抗肿瘤作用，具有很好的开发利用价值，为今后的研究开发奠定了基础。
本申请文件中涉及的百分含量，除另有说明外，固体物质为重量比，液体物质为体积比。
具体实施方式
现结合本发明的实施例和药理试验，对本发明作进一步说明。
本发明所述的3个新黄酮化合物I、II、III，其制备方法包括以下步骤：
1)取干燥的羽芒菊全草粗粉10kg，每次用3倍量70％的乙醇渗漉提取3次，滤过，合并滤液；
2)用真空薄膜浓缩装置进行减压浓缩至无醇味，得浓缩后的总浸膏0.8kg；
3)将总浸膏加入适量水进行超声分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将所得各部位萃取液进行减压浓缩得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位；
4a)将所得乙酸乙酯部位取130g超声分散于水中，通过大孔吸附树脂Diaion HP-20柱色谱，依次用H2O、10％MeOH、20％MeOH、40％MeOH、60％MeOH、70％Me2CO洗脱；其中Diaion柱的40％MeOH洗脱部分减压浓缩干燥后，溶于少量水后通过凝胶吸附树脂Sephadex LH-20柱色谱，以H2O、20％MeOH、40％MeOH、60％MeOH、70％Me2CO洗脱，
其中Sephadex LH-20柱的40％MeOH洗脱部位减压浓缩干燥后，溶于少量水后通过160-200目硅胶柱色谱，以体积比6∶2∶1的乙酸乙酯-乙醇-水洗脱，得化合物I的浅黄色粗品，经甲醇-水混合溶剂重结晶，得化合物I的浅黄色结晶1.68g。
其中Sephadex LH-20柱的20％MeOH洗脱部位减压浓缩干燥后，溶于少量水后通过160-200目硅胶柱色谱，以体积比7∶2∶2的乙酸乙酯-乙醇-水洗脱，得化合物II的浅黄色无定型粉末1.03g；
4b)将石油醚部位通过160-200目硅胶柱色谱，以体积比20∶1-1∶10的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，TLC检识，相同流份合并后得8个部分，其中以化合物III为主成分的第4部分再通过硅胶柱色谱，然后再以体积比5∶1的石油醚-乙酸乙酯进行洗脱，洗脱液真空浓缩干燥得化合物III的浅黄色结晶0.58g。
上述步骤中：MeOH表示甲醇、Me2CO表示丙酮。TLC检识是指：薄层板为0.5％CMC-Na-硅胶GF254板，展开剂为乙酸乙酯-乙醇-水(7∶2∶3)，显色剂a：紫外灯(254nm)下观察荧光；或显色剂b：2％FeCl3-2％K3Fe(CN)6喷洒，105℃烘烤2～5分钟。
结构鉴定：主要利用光谱技术，包括红外(IR)、高分辨电喷雾电离质谱(HRESI-MS)、电喷雾电离质谱(ESI-MS)、核磁共振谱(1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC)分析(表1-3)鉴定3个新黄酮化合物I、II、III的结构。
化合物I：分子式为：C24H26O13，浅黄色结晶，255-257℃(MeOH)；遇三氯化铁-铁***试剂显蓝色，与盐酸-镁粉试剂反应显粉红色，Molish反应显阳性。HRESI-MS(m/z)：545.1274[M+Na]+；1HNMR(400MHz)、13CNMR(100MHz)、DEPT、HMBC见表1。
化合物II：分子式为：C30H36O17，浅黄色无定型粉末，300-302℃(MeOH)；遇三氯化铁-铁***试剂显蓝色，与盐酸-镁粉试剂反应显粉红色，Molish反应显阳性。HRESI-MS(m/z)：691.1846[M+Na]+；1HNMR(400MHz)、13CNMR(100MHz)、DEPT、HMBC见表2。
化合物III：分子式为：C18H16O8，浅黄色结晶，236-238℃(MeOH)；遇三氯化铁-铁***试剂显蓝色，与盐酸-镁粉试剂反应显粉红色，与Molish试剂反应阴性。1HNMR(400MHz)、13CNMR(100MHz)、DEPT、HMBC见表3。
表1.化合物I的13C-NMR，1H-NMR光谱数据(MeOH-d4，TMS，δppm，J，Hz)
表2.化合物II的13C-NMR，1H-NMR光谱数据(MeOH-d4，TMS，δppm，J，Hz)
表3.化合物III的13C-NMR，1H-NMR光谱数据(MeOH-d4，TMS，δppm，J，Hz)
上述实施例中的符号说明如下：IR为红外光谱；HRESI-MS为高分辨电喷雾电离质谱；1H-NMR为核磁共振氢谱；13C-NMR为核磁共振碳谱；DEPT为无畸变极化转移增强法；1H-1H COSY为二维氢氢相关谱，HSQC为二维碳氢直接相关谱；HMBC为二维碳氢远程相关谱；δ为化学位移，单位为ppm；J为偶合常数，单位为Hz；TMS为内标物；MeOH-d4为氘代甲醇；Molish试剂为浓硫酸-2％的α-萘酚的乙醇溶液。
为进一步说明本发明在医药领域中的作用，下面通过部分药理试验结果来说明。
1、抑菌活性试验结果：
1)溶液的配制：分别称取5mg分离得到的3个单体化合物I、II、III，加蒸馏水定容至5mL容量瓶中得质量浓度为1.0mg·mL-1的水溶液，依次稀释为800、400、200、100、50、25、12.5μg·mL-1的水溶液，并以消毒蒸馏水做空白对照。
供细菌实验用的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，配方为0.5g牛肉膏，1.0g蛋白胨，0.5g NaCl，2g琼脂，100mL水。真菌实验用培养基为马铃薯葡萄糖培养基。配方为2g葡萄糖、2g琼脂、100mL20％马铃薯浸汁。
2)材料的灭菌及菌种的活化：将实验所需的培养皿及其他器材置160℃干燥箱中干热灭菌2h；培养基及装好蒸馏水的试管置高压蒸汽灭菌锅中，湿热灭菌2h备用。
将所有供试的菌种移接入相应的试管斜面培养基上，每种重复接2支。细菌置37℃恒温培养箱内培养24h，霉菌置28℃培养箱中培养48h。每种菌株取2支供测试用，置0℃～4℃冰箱中冷藏。
3)供试菌株悬浮液的制备：取盛有10mL无菌水的试管依次排在试管架上，将预先进行过活化的3个菌种各挑取2环分别溶解于3支无菌水试管中，制成菌悬液，然后，稀释菌液，使其含菌体为107～108·mL-1，即得供试菌种。
4)抑菌实验：抑菌活性测定采用琼脂扩散平板滤纸片法，根据抑菌环直径大小判断抑菌能力。滤纸片直径6.0mm，灭菌干燥后备用。用无菌移液管吸取0.1mL各种菌悬液加入无菌培养皿中，用镊子夹取浸透3个新黄酮化合物样品溶液的滤纸片，将其对号放在培养基表面。将放好滤纸片的含菌培养皿分别在恒温箱中培养。细菌37℃、24h，霉菌28℃、48h，到时取出，测量并记录抑菌圈的直径。数据采用SPSS 10.0进行分析，组间比较采用t检验。
5)最小抑菌浓度(MIC)测定结果：MIC的测定采用二倍稀释法。将800、400、200、100、50、25、12.5μg·mL-1系列浓度的3个新黄酮化合物样品溶液分别用2mL移液管移入各个平皿内，每个浓度重复3个皿，倒入约10mL已经高温灭菌的培养基中充分混匀，冷却凝固后，每皿加入0.1mL菌悬液，用无菌涂布器涂布均匀进行培养。取出，观察结果，以不长菌的溶液浓度为最小，结果见表4。
表4 3个新黄酮化合物的抑菌效果MIC(μg·mL-1)
| 实验菌种 | 化合物I | 化合物II | 化合物III |
| 金黄色葡萄球菌 | 25 | 12.5 | 25 |
| 大肠杆菌 | 50 | 25 | 50 |
| 黄曲霉菌 | 100 | 100 | 400 |
由表4可知，化合物I、II、III的水溶液对供试菌种都有不同程度的抑制作用，3个新黄酮化合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌具有较强的抑制作用，且随浓度的增加抑菌效果增强。化合物III对黄曲霉菌的抑制效果相对较低(在浓度达到400μg·mL-1时才对黄曲霉菌才有一定的抑制作用)。
该试验结果表明，本发明的3个新黄酮化合物具有较强的抑菌活性。
2、抗氧化活性试验结果：
迄今用于评价植物抗氧化能力的方法虽已有诸如硫氰酸盐(thiocyanate)法、硫代巴比妥酸(TBA)法等。但这些方法或手续相当繁琐费时，或所需试剂或大型仪器的费用昂贵，尚缺乏一种灵敏、简单易行的有效方法。1，1-二苯基苦基苯肼(1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH)是一种稳定的有机自由基，通过检测生物试剂对DPPH自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的强弱。近年来，国外已有人初步利用DPPH溶液的吸光度变化作为清除自由基能力的分光光度测定。本试验采用DPPH分光光度法用以试验评价羽芒菊中的3个新黄酮化合物I、II、III的抗氧化能力。
1)实验条件：测定温度为37℃；震动：30s震动方向水平；DPPH配制浓度：0.2mol·mL-1；Tecan Infinite M200酶标仪(瑞士)；酶标板：96孔板。
2)样品溶液的配制：分别取化合物I、II、III各25mg，用无水乙醇溶解并定容于25mL的量瓶中。然后分别取4mL，3mL，2mL，1mL用无水乙醇定容于5mL量瓶中，配置成0.10mg·mL-1，0.08mg·mL-1，0.06mg·mL-1，0.04mg·mL-1，0.02mg·mL-1。
3)测定结果：用点样用移液枪等体积加入无水乙醇+DPPH，样品+无水乙醇，样品+DPPH分别点样，分别平行点样三次。用Infinite M 200酶标仪测定，测定波长为517nm，测定结果见表5。
表5 3个新黄酮化合物反应20min后的抗氧化结果
在3个新黄酮化合物中，化合物I与化合物II属于黄酮苷，化合物III为黄酮苷元，三者相比，化合物III对DPPH的清除率要高于化合物I与化合物II，即黄酮苷元的抗氧化活性高于黄酮苷，这可能是黄酮苷元与糖结合成苷以后使其抗氧活性降低，另外，3个新黄酮化合物在配制浓度范围内随浓度升高抗氧化能力增强。
试验结果表明，从羽芒菊中分离纯化的3个新黄酮化合物I、II、III具有较强的抗氧化活性。
本发明的优点在于：本发明原料为野生的，来源特别丰富，制备工艺较简单，经济、安全，得率高；制得的3个新黄酮化合物均具有较强的抑菌活性、抗氧化活性和抗肿瘤作用，有很好的开发应用前景。
Claims (10)
1.从羽芒菊中分离纯化的新黄酮类化合物，化学名称为：8，3′-二羟基-3，7，4′-三甲氧基-6-O-β-D-葡萄糖黄酮苷，具有(I)所示结构式：
2.从羽芒菊中分离纯化的新黄酮类化合物，化学名称为：8，3′-二羟基-3，7，4′-三甲氧基-6-O-[α-L-鼠李糖基-(1→2)]-β-D-葡萄糖黄酮苷，具有(II)所示结构式：
3.从羽芒菊中分离纯化的新黄酮类化合物，化学名称为：8，3′-二羟基-3，7，4′-三甲氧基黄酮，具有(III)所示结构式：
4.如权利要求1所述化合物I的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取干燥的羽芒菊全草粗粉作原料，用70％乙醇渗漉提取，收集渗漉液；
2)将渗漉液真空薄膜浓缩至无醇味，回收乙醇，得到浸膏；
3)将浸膏加入适量水进行超声分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将所得各部位萃取液减压浓缩得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位；
4)将步骤3)所得的乙酸乙酯部位超声分散于水中，通过Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱，依次用H2O、10％MeOH、20％MeOH、40％MeOH、60％MeOH、70％Me2CO进行洗脱，得到各洗脱部位；
5)将步骤4)中Diaion柱的40％MeOH洗脱部位再通过Sephadex LH-20凝胶吸附树脂柱色谱，然后以H2O、20％MeOH、40％MeOH、60％MeOH、70％Me2CO进行洗脱，将Sephadex柱的40％MeOH洗脱部位通过硅胶柱色谱，以体积比5-7∶1-3∶1的乙酸乙酯-乙醇-水进行洗脱，洗脱液真空浓缩干燥得化合物I的浅黄色粗品，再经甲醇-水混合溶剂重结晶，得化合物I的浅黄色结晶。
5.如权利要求2所述化合物II的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取干燥的羽芒菊全草粗粉作原料，用70％乙醇渗漉提取，收集渗漉液；
2)将渗漉液真空薄膜浓缩至无醇味，回收乙醇，得到浸膏；
3)将浸膏加入适量水进行超声分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将所得各部位萃取液减压浓缩得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位；
4)将步骤3)所得的乙酸乙酯部位超声分散于水中，通过Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱，依次用H2O、10％MeOH、20％MeOH、40％MeOH、60％MeOH、70％Me2CO进行洗脱，得到各洗脱部位；
5)将步骤4)中Diaion柱的40％MeOH洗脱部位再通过Sephadex LH-20凝胶吸附树脂柱色谱，然后以H2O、20％MeOH、40％MeOH、60％MeOH、70％Me2CO进行洗脱，将Sephadex柱的20％MeOH洗脱部位通过硅胶柱色谱，以体积比6-8∶1-3∶1-3的乙酸乙酯-乙醇-水进行洗脱，洗脱液真空浓缩干燥得化合物II的浅黄色无定型粉末。
6.如权利要求3所述化合物III的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取干燥的羽芒菊全草粗粉作原料，用70％乙醇渗漉提取，收集渗漉液；
2)将渗漉液真空薄膜浓缩至无醇味，回收乙醇，得到浸膏；
3)将浸膏加入适量水进行超声分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将所得各部位萃取液减压浓缩得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位；
4)将石油醚部位通过硅胶柱色谱，以体积比20∶1-1∶10的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，TLC检识，相同流份合并后得8个部分，其中以化合物III为主成分的第4部分再通过硅胶柱色谱，然后再以体积比4-6∶1的石油醚-乙酸乙酯进行洗脱，洗脱液真空浓缩干燥得化合物III的浅黄色结晶。
7.如权利要求4、5或6所述化合物的制备方法，其特征在于步骤1)中羽芒菊全草粗粉用3倍量的70％乙醇渗漉提取。
8.如权利要求4所述化合物的制备方法，其特征在于步骤5)中乙酸乙酯-乙醇-水的体积比6∶2∶1。
9.如权利要求5所述化合物的制备方法，其特征在于步骤5)中乙酸乙酯-乙醇-水的体积比7∶2∶2。
10.如权利要求6所述化合物的制备方法，其特征在于步骤4)中石油醚-乙酸乙酯的体积比15∶1-1∶5。
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