CN101928270A

CN101928270A - 一种异苯并呋喃酮类化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101928270A
Application number: CN 201010222125
Authority: CN
Inventors: 黄相中; 朱芸; 曾祥慧; 戴云; 郭俊明; 关小丽; 程春梅; 梁辉
Original assignee: Yunnan Minzu University
Current assignee: Yunnan Minzu University
Priority date: 2010-07-09
Filing date: 2010-07-09
Publication date: 2010-12-29
Anticipated expiration: 2030-07-09
Also published as: CN101928270B

Abstract

本发明公开了一种具有新的化学结构通式(I)的异苯并呋喃酮类化合物及其制备方法和应用；其中的1，3，4a，4，5，6，7，7a，8，9分别表示C1，C3，C4a，C4，C5，C6，C7，C7a，C8，C9；系从菌株分类命名为头孢霉属AL031的真菌中分离而得，其菌株的保藏编号为CCTCC№：M2010140。对该化合物进行了抗抗氧化活性和抗肿瘤活性筛选，实验结果显示化合物显示出较强的抗氧化和抗肿瘤活性，具有良好的药物应用前景。

Description

一种异苯并呋喃酮类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种天然药物，更具体地说，涉及一种从头孢霉属AL031真菌次生代谢产物中分离得到的新的异苯并呋喃酮化合物。同时，本发明还涉及该化合物的制备方法和在制药领域中的应用。

背景技术

在自然界中现存的真菌大约有25万种，我国至少有10万余种，已报道8000种左右，其中传统药用及试验具有药效的真菌达400余种。真菌代谢产物具有结构类型繁多，生理活性多样的特点。因而，跟踪活性，对真菌化学成分进行研究，可为寻找新结构的活性天然产物提供一个很好的研究方向。

头孢霉AL031菌株是从云南省哀牢山箭竹上分离筛选到的一种丝状真菌株，经云南大学生物系杨发蓉教授鉴定为丛梗孢科、头孢霉属(Cephalosporium Corde)真菌。据毕韵梅等人对该真菌次生代谢产物的研究报道，从该真菌次生代谢产物中分离到的化合物，发现具有广谱的抗菌活性。因此，对该属真菌次生代谢产物做进一步研究，具有很重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于通过对头孢霉属真菌AL031次生代谢产物的化学成分进行深入研究，从而提供一种新的有药用价值的化合物。

本发明的另一目的是提供一种所述新化合物的制备方法。

本发明进一步的目的是提供所述新化合物在制备抗氧化及抗肿瘤药物方面的用途。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

*除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。

A.本发明从头孢霉属真菌AL031次生代谢产物中分离出了一种新化合物，该化合物用下述结构式表示：

该化合物被命名为4，6-二羟基-5-甲氧基-7-甲基-异苯并呋喃酮。

其中，Me-表示甲基、MeO一表示甲氧基。

B.本发明提供了一种所述的异苯并呋喃酮的制备方法，该法采用下述步骤：

(1)以米饭，玉米粉，甘蔗渣，麦麸为原料，按12∶2∶3∶3(W/W/W/W)比例混合灭菌、冷却；

(2)将菌株分类命名为头孢霉属AL031真菌接种到混合物中，在37℃下发酵，发酵7天；其菌株的保藏编号为CCTCC№：M2010140；

(3)用工业乙酸乙酯避光冷浸提7天，合并提取液、过滤、减压浓缩提取液得乙酸乙酯浸膏，避光保存；

(4)浸膏再次用重蒸乙酸乙酯溶解萃取5次，合并萃取液减压浓缩成浸膏，浸膏用丙酮溶解后用200～300目硅胶拌样；

(5)100～200目的硅胶用湿法装柱进行粗分，先采用用纯氯仿作流动相，然后加甲醇，逐渐加大极性，直到氯仿∶甲醇的体积比例为9∶1；梯度洗脱，收集各个部分的洗脱液；洗脱液的20∶1(体积比)部分反复硅胶、凝胶柱层析进行分离，即得到所需化合物。

C.对该化合物进行了DPPH抗氧化及抗肿瘤活性筛选，化合物显示出较好的抗氧化及抗肿瘤活性。其对DPPH自由基、HL-60细胞、M49肺癌细胞的半数清除浓度IC₅₀测定结果分别为28.7mg/L、12.5mg/L、23mg/L。

本发明的有益效果：

1.头孢霉属AL031真菌保持在实验室中，可以批量发酵，原料来源简单；而且本发明化合物在该真菌次生代谢产物中含量较高，容易得到；

2.采用了避光操作和常规柱层析制备方法，化合物制备操作流程简单，所获得的本发明化合物纯度高，随后的工业化生产很容易实现；

3.所述化合物展现出较强的抗氧化、抗肿瘤活性，可为医药工业提供有药用价值的新化合物或先导化合物，预示着很好的药用前景。

附图说明

图1是本发明化合物高分辨质谱(ESI-MS)；

图2是本发明化合物的核磁共振氢谱(¹H NMR)；

图3是本发明化合物的核磁共振碳谱(¹³C NMR)；

图4是本发明化合物的DEPT谱；

图5是本发明化合物的HMBC相关谱；

图6是本发明化合物的HMBC相关谱。

保藏生物材料的说明

本发明所涉及的真菌菌株，已于2010年6月9日保藏在中国典型培养物保藏中心；该中心地址：中国.武汉.武汉大学。该菌株分类命名为：头孢霉属AL031(Cephalosporium Corda AL031)，保藏编号为CCTCC：M2010140。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

——化合物的制备1

以米饭、玉米粉、甘蔗渣、麦麸为原料，按12∶2∶3∶3(W/W/W/W)比例混合灭菌、冷却。头孢霉属AL031真菌接种到混合物中，在37℃下发酵，发酵7天；用工业乙酸乙酯避光冷浸提7天，提取1次，提取液过滤、减压浓缩，得乙酸乙酯浸膏，避光保存；浸膏再次用重蒸乙酸乙酯溶解萃取，萃取5次，合并萃取液减压浓缩成浸膏，浸膏用丙酮溶解后用200～300目硅胶拌样；100～200目的硅胶用湿法装柱进行粗分，先采用纯氯仿作流动相，然后加甲醇，逐渐加大极性，直到氯仿∶甲醇的体积比例为9∶1；收集各个部分的洗脱液；洗脱液的20∶1(体积比)部分反复硅胶、凝胶柱层析进行分离，即得到所需化合物。

实施例2

——化合物的制备2

重复实施例1的过程，但有以下不同：用工业乙酸乙酯避光冷浸提5天，提取2次，合并提取液、过滤、减压浓缩得乙酸乙酯浸膏避光保存。

实施例3

——化合物的制备3

重复实施例1的过程，但有以下不同：用工业乙酸乙酯避光冷浸提6天，提取2次，合并提取液、过滤、减压浓缩，得乙酸乙酯浸膏避光保存。

实施例4

——化合物的制备4

重复实施例1的过程，但有以下不同：浸膏用重蒸乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液减压浓缩成浸膏，浸膏用丙酮溶解后用200～300目硅胶拌样；100～200目的硅胶用干法装柱进行粗分，用氯仿∶甲醇按一定比例梯度洗脱，收集各个部分的洗脱液；洗脱液的20∶1部分反复硅胶、凝胶柱层析进行分离，即得到所需化合物。

实施例5

——对本发明化合物的结构鉴定

化合物1为无色针晶，mp 253℃；ESI-MS给出准分子离子峰m/z：211.0628[M+H]⁺(计算值211.0562)，结合¹H NMR、¹³C NMR推测分子式为C₁₀H₁₀O₅，不饱和度为6。λmax(MeOH)：217nm、255nm。红外光谱(KBr)中3365，3164cm^-1显示可能有多个羟基存在。1685cm^-1显示分子中可能有羰基存在，1611，1515cm^-1显示分子中可能存在苯环。从¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)中可以看出化合物有2个甲基，1个亚甲基和7个季碳。δ_C172.7(C)等信号确定了酯基的存在，而根据低场中剩下的6个季碳信号可确定有苯环存在。结合该化合物的不饱和度可推测它属于异苯并呋喃类。¹H NMR(CD₃OD，400MHz)中可以看出化合物中存在一个甲基[δ_H＝2.42，(3H，s)]，一个甲氧基[δ_H＝3.87，(3H，s)]。根据以上化合物的分子式以及出现的碳谱数据和氢谱数据，并结合IR可推测分子中还有2个OH存在。从HMBC谱中可以看出H-3与C-1，C-4，C-4a，C-7a相关，H-8与C-6，C-7a相关。根据HMBC谱，甲氧基中的H与5位上的C相关，则推出化合物1中甲氧基连在5位上。通过谱图综合分析，给出化合物的结构，并对其NMR数据进行了归属(见Table1.1)。。

Table 1.1 ¹H NMR，¹³C NMR and HMBC data for compound 1

实施例6

一一化合物抗氧化活性检测

抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示；6.5×10^-5mol·L^-1DPPH溶液用无水乙醇配制，样品用甲醇溶解，以0.1mg/mL为初筛浓度，测定其清除自由基DPPH的活性。在试管中依次加入2.5mL 6.5×10^-5mol·L^-1DPPH溶液和1.5mL甲醇，总体积为4.0mL，混匀20min后，于1cm比色皿中测定A(517nm)，记为A₀；加入2.5mL 6.5×10^-5mol·L^-1的DPPH溶液和1.5mL待测试样溶液，测定值记为As；加入2.5mL甲醇和1.5mL待测试样溶液，测定值记为Ar。样品对自由基DPPH清除率按下式计算：

计算半数清除浓度IC₅₀，IC₅₀测定结果为28.7mg/L，表明本发明的化合物具有较好的抗氧化活性。

实施例7

一一化合物抗肿瘤活性检测

采用改良MTT法评价化合物对肿瘤细胞的增值抑制作用

取备用的肿瘤细胞悬液接种于96孔培养板，90μL/孔，继续培养24h后加入不同浓度的受试样品，10μL/孔，使其终浓度为100、10、1、0.1、0.01μg/mL，每个浓度均设3个复孔。顺铂(DDP)为阳性对照，等体积RPMI1640培养基为阴性对照。同时设化合物100、10μg/mL时相应的DMSO浓度为溶媒对照，以消除DMSO对细胞生长的影响。加药后继续置于37℃，5％CO₂培养箱培养72h，每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，继续培养4h，每孔加入三联液[10％SDS-5％异丁醇-0.012mol/L HCl(W/V/V)]100μL溶解甲臜。用酶标仪在570nm波长下测定各孔的OD值。

按下列公式计算细胞增值抑制率：

抑制率(％)＝(OD值对照孔-OD值给药孔)/OD值对照孔×100％

数据统计分析：采用Microsoft Excel 2003计算抑制率，采用logit法，SPSS11.5软件包计算半数抑制浓度IC₅₀。

计算半数抑制浓度IC₅₀，对HL-60细胞、M49肺癌细胞IC₅₀测定结果为12.5mg/L，23mg/L，表明本发明的化合物具有较好的抗肿瘤活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种具有下述结构式的化合物：

其中，1，3，4a，4，5，6，7，7a，8，9分别表示C1，C3，C4a，C4，C5，C6，C7，C7a，C8，C9。

2.一种权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于：该方法采用以下步骤：

(1)以米饭，玉米粉，甘蔗渣，麦麸为原料，按12∶2∶3∶3的质量比例混合灭菌、冷却；

(2)将菌株分类命名为头孢霉属AL031的真菌接种到混合培养基中，在37℃下发酵，发酵7天；其菌株的保藏编号为CCTCC№：M2010140；

(3)固体发酵产物用工业乙酸乙酯避光冷浸提7天，合并提取液、过滤、减压浓缩提取液得乙酸乙酯浸膏，避光保存；

(4)浸膏再次用重蒸乙酸乙酯溶剂萃取5次，合并萃取液，减压，再次浓缩成浸膏，浸膏用丙酮溶解后用200～300目硅胶拌样；

(5)100～200目的硅胶用湿法装柱进行粗分，先采用纯氯仿作流动相，然后加甲醇，逐渐加大极性，直到氯仿∶甲醇的体积比例为9∶1；梯度洗脱，收集各个部分的洗脱液；洗脱液的20∶1部分反复硅胶、凝胶柱层析进行分离，即得到所需化合物。

3.权利要求1所述的化合物作为抗氧化剂的应用。

4.权利要求1所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。