CN101792719A - 一株酿酒酵母及其在酿造葡萄酒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株酿酒酵母及其在酿造葡萄酒中的应用。酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NJZCC17 CGMCC №.3284。该酿酒酵母NJZCC17用于酿造葡萄酒。与广泛使用的对照商业化酿酒酵母菌株相比，该酿酒酵母发酵得到的葡萄酒中糖含量为1～4％，酒精含量为9～14％，甘油产量4～11g/L，硫化氢、乙醛、乙酸和尿素等对葡萄酒风味或品质不利的代谢产物产量较低，苹果酸利用率较高，挥发性香气成分平衡，总酯类物质产量更高而总高级醇产量适中，口感更具复杂性，酿造时间缩短，对国产干红葡萄酒品质的稳定和提高，以及发挥河北昌黎产区赤霞珠等红葡萄酿造潜力均可发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及一株酿酒酵母及其在葡萄酒酿造中的应用，特别涉及一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及其在酿造干红葡萄酒中的应用。
背景技术
葡萄酒酿造是一个复杂的微生物学过程，其中酵母菌是占主导地位的微生物。葡萄酒的酿造主要是在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的作用下，采用自然发酵或者纯种发酵，将葡萄原料中的各种潜在品质和优势在酒中充分表现出来。因此，酿酒酵母性能的优劣不仅对葡萄酒的口感和风味影响很大，而且还直接影响到所酿葡萄酒的产量、质量、经济性和发酵生产管理，对葡萄酒特色和风格的形成至关重要。采用具有多种特定优良性能的酿酒酵母菌株不但能提高葡萄酒的品质，还能缩短发酵周期和降低生产成本，进而提高企业的竞争优势和获利能力。对葡萄酒酵母的这些要求直接推动了优良酿酒酵母选育工作的开展。
利用本土优良酿酒酵母菌株酿造具有当地特色的优质葡萄酒，在酿酒历史悠久的欧洲某些地区，尤其是名酒产地广为流行。目前，法国、美国、意大利、西班牙和澳大利亚等国均十分重视对本国本地优良酿酒酵母的酿酒特性研究，并广泛将优良菌株制成活性干酵母并将其引入商业化葡萄酒生产。从国外引入这些优良葡萄酒酿造用活性干酵母虽然是一条生产捷径，但由于葡萄品种、栽培环境及工艺条件等差异，引入菌种并不能完全表现出其良好品质。在多年种植葡萄的园区有多种天然酵母与其相伴而生，经长期的自然选择和进化演变，逐渐形成了一批适应当地气候、环境和葡萄品种的优势野生酿酒酵母。因此，我国必须重视选育具有优良酿造特性的本土酿酒酵母菌株。
我国的葡萄酒生产企业和葡萄酒产区缺乏适合自己原料和产品的酵母菌种，我国葡萄酒工业需要的微生物制剂几乎全部依赖进口。而国外广适性葡萄酒微生物制剂的广泛使用，会导致产品同质化加剧，缺乏产地特色，而且外来微生物菌种的大量引入，会影响本土资源的丰富性和多样性，影响葡萄酒厂进行自然酵母菌选育的有效性。选育具有优良品质的葡萄酒酵母，对葡萄酒色泽、香气、感官质量和风格的改善具有重要意义。而我国葡萄酿酒微生物菌种的选育还处于起步阶段。迄今为止，尚未有我国自行筛选和选育的微生物菌株应用到葡萄酒工业生产之中。
我国葡萄种植面积广，河北、山东、甘肃和新疆等地都是重要的葡萄产区。不同产区以及不同品种葡萄中野生酿酒酵母分布具有一定规律性。筛选具有优良酿造特性的酿酒酵母菌株，对于开发具有优质特色的本地(尤其是原产地)葡萄酒具有重要意义。
发明内容
本发明的目的，旨在解决国产干红葡萄酒品质由于广泛使用国外进口的活性干酵母发酵剂而趋于“同质化”的问题，提供一株酿酒酵母及其在干红葡萄酒生产中的应用。
本发明所提供的酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NJZCC17CGMCC№.3284。
所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NJZCC 17CGMCC№.3284经过48h固体YEDP培养基上生长的菌落为圆形、乳白色、有光泽，其边缘整齐，菌体粘稠，易挑起；在WL营养琼脂培养基上菌落特征为奶油色带绿色，菌落球形突起，表面光滑、不透明，奶油状(如图1所示)；在McClary醋酸盐琼脂培养基上28℃培养1-4周后，有2-4个子囊孢子形成，孢子壁光滑(如图2所示)。
所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NJZCC17，已于2009年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC№.3284。
本发明从我国昌黎产区酿酒葡萄表面筛选、鉴定得到的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)NJZCC17。利用本发明的酿酒酵母NJZCC17生产出的干红葡萄酒优点在于：在河北省葡萄产区干红葡萄酒生产过程中，与对照商业化酿酒酵母菌株相比，其发酵得到的葡萄酒中糖含量为1～4g/L，酒精含量为9～14％，甘油产量4～11g/L，硫化氢、乙醛、乙酸和尿素等对葡萄酒风味或品质不利的代谢产物产量较低，苹果酸利用率更高，挥发性香气成分平衡，总酯类物质产量更高而总高级醇产量适中，可以提高葡萄酒中多酚和白藜芦醇的含量，口感更具复杂性，酿造时间适中，对本土干红葡萄酒品质的稳定和提高，以及发挥昌黎产区赤霞珠等红葡萄酿造潜力均发挥重要作用。本发明的酿酒酵母NJZCC17尤其能够最大限度发挥赤霞珠葡萄的酿造特点和优点，具有生产优质产区赤霞珠干红葡萄酒的作用。
附图说明
图1为酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)NZJCC17在WL营养琼脂上的菌落形态。
图2为酿酒酵母菌株NJZCC17在McClary醋酸盐琼脂培养基上28℃培养1-4周后，在显微镜中的形态观察。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的模拟葡萄汁培养基配方如下：
葡萄糖，200g/1000mL；柠檬酸，6g/1000mL；苹果酸6g/1000mL，尿嘧啶20mg/1000mL；磷酸二氢钾，750mg/1000mL；硫酸钾，500mg/1000mL；七水硫酸镁，250mg/1000mL；氯化钠200mg/1000mL；二水氯化钙，155mg/1000mL；一水硫酸锰，4mg/1000mL；硫酸锌，4mg/1000mL；碘化钾，1mg/1000mL；五水硫酸铜，1mg/1000mL；硼酸，1mg/1000mL；二水钼酸钠，1mg/1000mL；六水氯化钴，0.4mg/1000mL；肌醇，20mg/1000mL；烟酸，2mg/1000mL；泛酸钙1.5mg/1000mL；盐酸硫胺素0.25mg/1000mL；盐酸吡哆辛(VB6)0.25mg/1000mL；生物素(biotin)，0.003mg/1000mL；脯氨酸(proline)，61.5mg/1000mL；谷氨酰胺(glutamine)，50.7mg/1000mL；精氨酸(arginine)，37.5mg/1000mL；色氨酸(tryptophan)，18mg/1000mL；丙氨酸(alanine)，14.7mg/1000mL；谷氨酸(glutamic acid)，12mg/1000mL；丝氨酸(serine)，7.8mg/1000mL；苏氨酸(threonine)，7.8mg/1000mL；亮氨酸(leucine)，4.8mg/1000mL；天冬氨酸(aspartic acd)4.5mg/1000mL；缬氨酸(valine)，4.5mg/1000mL；苯丙氨酸(phenylalanine)3.9mg/1000mL；异亮氨酸(isoleucine)，3.3mg/1000mL；组氨酸(histidine)，3.3mg/1000mL；甲硫氨酸(methionine)，3.3mg/1000mL；酪氨酸(tyrosine)，1.8mg/1000mL；甘氨酸(glycine)，1.8mg/1000mL；赖氨酸(lysine)，1.8mg/1000mL；半胱氨酸(cysteine)，1.2mg/1000mL；氯化铵，55.8mg/1000mL；麦角甾醇，15mg/1000mL；油酸钠，5mg/1000mL；吐温-80，0.5ml/1000mL。pH＝3.3±0.1。
下述实施例中YEPD培养基配方如下：
葡萄糖，20g/1000mL；蛋白胨，20g/1000mL；酵母抽提物，10g/1000mL；自然pH值，121℃，灭菌15min。固体培养基加入20g/1000mL琼脂，微波炉加热完全融化后灭菌。
下述实施例中WL营养琼脂培养基配方如下：
酵母抽提物，4g/1000mL；胰蛋白胨，1g/1000mL；葡萄糖，50g/1000mL；KH2PO4，0.550g/1000mL；KCl，0.425g/1000mL；CaCl2，0.125g/1000mL；MgSO4，0.125g/1000mL；FeCl3，0.0025g/1000mL；MnSO4，0.0025g/1000mL；溴甲酚绿，0.022g/1000mL；pH＝6.5。
下述实施例中McClary培养基培养基配方如下：
葡萄糖，1g/1000mL；KCl，1.8g/1000mL；无水乙酸钠，8.2g/1000mL；酵母膏，2.5g/1000mL；琼脂，20g/1000mL。
实施例1、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NJZCC17CGMCC№.3284的分离、纯化及其鉴定
对昌黎葡萄产区不同葡萄品种表面所分离的200多株野生酵母菌株进行分离、鉴定和筛选。其分离方法采用平板稀释涂布法挑取单菌落并连续两次纯化。鉴定方法采用传统形态学鉴定和生理生化鉴定结合ATB ID 32C酵母自动鉴定***(生物梅里埃公司，法国)，并辅以5.8S-ITS rDNA PCR-RFLP和5.8S-ITS rDNA序列分析两种分子生物学方法对菌株进行鉴定；经鉴定为酿酒酵母的菌株均以法国LAFFORT公司生产商业化活性干酵母(Active Dry Yeast，ADY)Zymaflora F15(以下均简写作F15)为对照菌株进行试管发酵初筛、摇瓶发酵复筛、小型酿酒优选菌株筛选实验和优筛菌株中试规模酿酒实验，对菌株进行筛选。经过近四年的***研究和反复筛选，得到数株具有优良酿造特性的酿酒酵母菌株。依据国际上常用的葡萄酒酿造用酿酒酵母菌株筛选指标(Efstratios Nikolaou，Evangelos H.Soufleros，ElizabethBouloumpasi，Nikolaos Tzanetakis.Selection of indigenous Saccharomyces cerevisiaestrains according to their oenological characteristics and vinification results.FoodMicrobiol.2006，23：205-211)对数株优筛菌株各种酿造特性进行***研究，所有优筛菌株分别在模拟葡萄汁培养基中以1×106CFU/mL的接种量接种，25℃模拟发酵静置培养20～30d，然后经过4L葡萄汁发酵小试和500L发酵中试，所有指标测定采用标准分析方法，并对中试生产干红葡萄酒进行专家感官评定。指标包括：发酵活力、发酵速率、絮凝能力、产泡沫能力、挥发酸产量、降酸能力、甘油产量、乙醛产量、H2S产量、尿素产量、SO2抗性、酒精抗性、温度抗性、挥发性香气物质(酯类和高级醇)产量等，具体检测方法如实施例2所述。
经过反复筛选、验证和酿造研究，从河北省昌黎县葡萄产区生长的赤霞珠葡萄表面分离得到的(Saccharomyces cerevisiae)NJZCC17CGMCC№.3284(以下简称NZJCC17)具有发酵活力旺盛、发酵启动迅速、泡沫产量低、发酵结束絮凝能力强、发酵残糖低而酒精度高、甘油产量高、利用苹果酸能力较强，乙醛、H2S和尿素等对葡萄酒品质具有不良影响的物质产量低，对SO2、酒精和高糖度所造成的高渗透压等逆境生存条件具有良好抗性，经NJZCC17酿造的葡萄酒具有良好的香气结构和组成，主要二次挥发香气物质(酯类、高级醇、羰基化合物、小分子有机酸等)产量较对照菌株高或近似，而种类较商业对照菌株酿酒酵母F15多。经过专家评定一致认为用昌黎赤霞珠葡萄上分离得到的优选酿酒酵母菌株NJZCC17发酵昌黎产区所产赤霞珠葡萄，酿造所得的干红葡萄酒无论从颜色、气味和口味上均优于对照用活性干酵母(法国)以相同条件生产的干红葡萄酒。
该菌株经过形态学观察、生理生化鉴定、ATB ID 32C酵母菌快速鉴定***和5.8S-ITS rDNA基因扩增及PCR产物的RFLP分析后对所有鉴定结果综合分析后，鉴定NJZCC17为酿酒酵母的新株。具体鉴定结果如下：
形态学观察方法和结果：经过48h培养，NJZCC17在YEDP固体培养基上生长的菌落为乳白色，圆形，有光泽，边缘整齐，粘稠，易挑起，显微镜下观察为细胞成圆形或卵圆形，多边芽殖，无假菌丝；在WL营养琼脂培养基上菌落特征为奶油色带绿色，菌落球形突起，表面光滑、不透明，奶油状(如图1所示)在McClary琼脂培养基上28℃培养1-2周后，在显微镜下观察有2-4个子囊孢子形成，孢子壁光滑，NJJCC17的孢子特征(如图2所示)。
生理生化鉴定方法和结果：根据酵母属的分类检索表，本研究选取对于酿酒酵母属种内区分比较重要的测试项目为葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的发酵能力、纤维二糖和肌醇的同化能力、硝酸盐和L-赖氨酸的同化能力和抗放线菌酮能力这四项生理生化测试。经过生理生化实验后发现，NJZCC17的碳源同化、氮源同化和放线菌酮生长实验的结果均与对照菌株CICC1450(标准商业对照菌株，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，以下均写作CICC1450)测试结果相同，具体结果见下表。
表1对照菌株和代表菌株的生理生化实验结果
[注]：“+”表示菌体生长，试验结果阳性；“-”表示菌体不生长，试验结果阴性。
ID 32C酵母菌鉴定***鉴定的方法和结果：利用ID 32C酵母菌鉴定***(梅里埃公司，法国)和ATB全自动鉴定及药敏测试仪(梅里埃公司，法国)对纯化好的酵母菌进行鉴定。
ID 32C是由32个标准化、微量化的同化试验与相应的数据库组成的适于酵母菌的鉴定***。这32个小孔中含有不同的脱水碳水化合物。一种化学纯的半固体培养基与菌悬液一起被接种到小孔中。培养24～48h后由ATB阅读器观察孔中酵母菌的生长情况，然后***自动根据API LAB ID 32软件得到鉴定结果。
对本实验中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NJZCC17与标准对照菌株CICC1450的鉴定相似率(id％)达到99.9，为极好的鉴定结果。
5.8S-ITS rDNA PCR-RFLP和5.8S-ITS rDNA序列分析鉴定方法和结果：
酵母的核糖体5.8S rDNA及两侧的转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)具有显著的种间差异性，可作为鉴别酵母菌种的分类依据。在对待测酵母菌株进行常规表型鉴定和自动化鉴定的同时，还采用5.8S-ITS rDNA PCR-RFLP和5.8S-ITSrDNA序列分析两种分子生物学方法对菌株进行鉴定，对几种分类鉴定方法的试验结果的统一性和可靠性作验证。具体方法如下：
①酵母菌基因组DNA的提取：首先采用酵母菌基因组DNA提取试剂盒(明日百傲公司，北京)提取酵母菌的基因组DNA。
②酵母菌株5.8S-ITS rDNA的PCR扩增：PCR扩增所用引物为ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，由上海生物工程技术服务有限公司合成；PCR扩增条件为95℃×5min；94℃×1min，55.5℃×2min，72℃×2min，35个循环；72℃×10min；PCR扩增体系(50μL)的组成为：模板DNA 3-5μL，10×PCR反应缓冲液5.0μL，10μM引物0.5μL，10mM dNTPs1μL，Taq DNA聚合酶1U，ddH2O补充体系至50μl，混匀。随后对PCR扩增产物进行检测：取5μLPCR扩增产物点样于1.4％琼脂糖凝胶上，电泳缓冲液为1×TAE，100V电压下，电泳40min，溴化乙锭(EB)染色后，由凝胶成像***对电泳图谱拍照并进行分析，采用100-bp DNA Marker判断PCR扩增产物的大小。
③酵母菌株5.8S-ITS rDNA的RFLP分析：5.8S-ITS rDNA的PCR扩增产物分别用CfoI、HaeIII和Hinf I(Fermentas，American)三种限制性内切酶37℃酶切16h；20μL的酶切体系内含10μLPCR产物，2μL10×Buffer和10U内切酶；酶切后取10μL酶切产物于3％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液中，100V电压下电泳1h，EB染色后，凝胶照相，最后与标准酶切图谱对照，在种的水平上鉴定待测酵母菌株。
④酵母菌株5.8S-ITS rDNA的序列分析：5.8S-ITS rDNA PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶回收试剂盒(明日百傲公司，北京)纯化后，由上海生物工程技术服务有限公司进行测序，测序引物同PCR引物ITS1或ITS4；根据测序结果，利用BLAST软件从GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索，比较供试菌株与已知酵母菌株相应序列的相似程度。
使用引物ITS 1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)对分离的代表性菌株的5.8S-ITS rDNA区扩增，所得的产物大多为450-880bp之间。使用CfoI、HaeIII和HinfI进行酶切，所得酶切图谱共有20个类型，将酶切图谱与Guillamon和Esteve-Zarzoao等人建立的标准酶切图谱进行对照鉴定。对酵母菌株NJZCC17和CICC1450的5.8S-ITSrDNA-RFLP方法鉴定的酵母菌株的酶切数据如表2所示。通过试验证明NJZCC17和CICC1450的5.8S-ITS rDNA-RFLP的酶切图谱，证明NJZCC17为酿酒酵母新株。
表2酵母菌株5.8S-ITS rDNA PCR扩增产物大小及限制性内切酶酶切图谱
本土酵母的5.8S-ITS rDNA序列分析结果如表3所示。
表3葡萄酒相关酵母菌株5.8S-ITS rDNA测序结果
| RFLP酶切类型(菌株编号) | 参考菌株基因库接受号 | 同源性(％) | 鉴定结果 |
| CICC1450 | AM900396 | 100 | S.cerevisiae |
| NJZCC17 | AM900396 | 100 | S.cerevisiae |
根据目前酵母菌分子***学研究领域所流行的观点，即具有相同或相似ITS序列(序列同源性≥99％)的菌株属于同一物种，根据序列分析发现标准菌株CICC1450和测试菌株NJZCC17与基因库参考菌株5.8S-ITS rDNA的序列同源性为100％，因此可以确认鉴定结果，即NJZCC17为酿酒酵母新株。
采用四种分类鉴定方法对NJZCC17进行鉴定，其鉴定结果与标准对照菌株完全相同，故可将NJZCC17鉴定为酿酒酵母新株。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NZJCC17，已于2009年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC№.3284。
实施例2、酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)NZJCC17的酿酒效果实验
优良葡萄酒酿酒酵母菌株NJZCC17和对照菌株CICC1450在模拟发酵葡萄汁中的酿造特性比较，具体方法如下所述：
将保存于-80℃的酿酒酵母NJZCC17和酿酒酵母CICC1450分别在YEPD固体和液体培养基上传代两次，按106CFU/mL接种于1.8L模拟葡萄汁培养液中，25℃培养。
挑取培养过夜的酿酒酵母NJZCC17或酿酒酵母CICC1450对照菌株接入含10mL液体YEPD培养基的试管中，28℃静置培养12h后分别吸取1mL转接于含100mL YEPD液体培养基的三角瓶中，28℃静置培养12h。然后按照106CFU/mL的接种量接种于模拟葡萄汁中，25℃培养至残糖量＜4g/L，酿造得到模拟葡萄酒。
按照下述方法检测模拟发酵葡萄汁中酿造特性：
CO2失重：称量法(M.S.Pérez-Coello1，A.I.Briones Pérez，J.F.Ubeda Iranzo andP.J.Martin Alvarez.Characteristics of wines fermented with different Saccharomycescerevisiae strains isolated from the LaMancha region.Food Microbio.1999，16(6)：563-573)；
残糖含量：菲林试剂法(GB/T 15038-2006)；
酒精含量：比重瓶法(GB/T 15038-2006)；
总酸度：滴定法(GB/T 15038-2006)；
乙醛产量：试剂盒法，乙醛测定试剂盒(Acetaldehyde Assay Kit，Megazyme公司，爱尔兰)；
甘油产量：试剂盒法，甘油测定试剂盒(Glycerol Assay Kit，Megazyme公司，爱尔兰)；
尿素产量：试剂盒法，尿素测定试剂盒(Urea Assay Kit，Megazyme公司，爱尔兰)；
苹果酸含量：液相色谱法(GB/T 15038-2006)；
酯类、高级醇、有机酸等挥发性香气物质含量：用Agilent 6890气相色谱(GC)和Agilent 5975质谱(MS)联用仪(Agilent，美国)检测上述获得的酿造葡萄酒中各种挥发性香气物质种类和含量。具体条件为：毛细管柱HP-INNOWAX PolyethyleneGlycol 60m×0.25mm×0.25μm(J&W scientific，美国)载气为高纯氦气，流速1mL/min；顶空固相微萃取手动进样，采用不分流模式，***气相色谱的进样口，进样口温度250℃，热解析25min。柱温箱的升温程序是：40℃保持5min，然后以3℃/min的速度升温至200℃，保持2min。质谱借口温度为280℃，离子源温度为230℃，电离方式EI，离子能量70ev，质量扫描范围20-450amu(张明霞.葡萄酒香气变化规律研究——着重于关键酿造工艺对葡萄酒香气的影响[D].中国农业大学博士学位论文.2007)；
最大耐乙醇含量：按文献(J.A.Regodón，F.Peréz，M.E.Valdés，C.De Miguel andM.Ramírez.A simple and effective procedure for selection of wine yeast strains.FoodMicrobio.1997，14(3)：247-254)描述的方法进行；
最大耐SO2含量：按文献(J.A.Regodón，F.Peréz，M.E.Valdés，C.De Miguel andM.Ramírez.A simple and effective procedure for selection of wine yeast strains.FoodMicrobio.1997，14(3)：247-254)描述的方法进行；
产H2S能力：将各测试菌株点种在商业化生产的BIGGY琼脂上，30℃培养4～7d，持续观察菌落颜色变化，根据颜色深浅考察各测试菌株产硫化氢能力。1＝white(白色)，2＝cream(奶油色)，3＝light brown(浅棕色)，4＝brown(棕色)，5＝dark brown(深棕色)，6＝black(黑色)。数值越高则H2S产生能力越强(Giudici，P.，Kunkee，R.E.The effect of nitrogen deficiency and sulfur-containing amino acids on the reduction ofsulfate to hydrogen sulfide by wines yeasts.Am.J.Enol.Vitic.1994，45：107-112)；
2，3-丁二醇：利用核磁共振检测(Hong-Seok Son，Geum-Sook Hwang，Ki MyongKim，Eun-Young Kim，Frans van den Berg，Won-Mok Park，Cherl-Ho Lee，andYoung-Shick Hong.1H NMR-Based Metabolomic Approach for Understanding theFermentation Behaviors of Wine Yeast Strains.Anal Chem.2009，81：1137-1145)。
酿酒酵母NJZCC17和CICC1450在模拟发酵葡萄汁中酿造特性比较结果见表4。
表4酿酒酵母NJZCC17和CICC1450在模拟发酵葡萄汁中酿造特性比较
| 菌株 | CO2失重(g/100mL) | 残糖含量(g/L) | 酒精含量(％，v/v) | 总酸度(g/L) | 乙醛产量(mg/L) |
| NZJCC17 | 11.3±0.1 | 1.06±0.02 | 10.58±0.02 | 11.2±0.017 | 0.818±0.023 |
| CICC1450 | 10.5±0.1 | 1.19±0.03 | 10.29±0.02 | 10.6±0.051 | 2.142±0.091 |
表4(续1)酿酒酵母NJZCC17和CICC1450在模拟发酵葡萄汁中酿造特性比较
| 菌株 | 甘油产量(g/L) | 尿素产量(mg/L) | 苹果酸残留量(g/L) | 乙酸含量(mg/L) | 苯乙醇(mg/L) |
| NZJCC17 | 4.33±0.012 | 0.57±0.21 | 4.51±0.067 | 1.161±0.012 | 15.80±2.42 |
| CICC1450 | 4.16±0.035 | 3.62±0.10 | 5.43±0.043 | 1.365±0.016 | 12.01±0.64 |
表4(续2)酿酒酵母NJZCC17和CICC1450在模拟发酵葡萄汁中酿造特性比较
| 菌株 | 乙酸乙酯(mg/L) | 己酸乙酯(mg/L) | 乙酸己酯(mg/L) | 己酸苯乙酯(mg/L) | 总酯(mg/L) |
| NZJCC17 | 6.76±0.54 | 6.32±1.12 | 0.13±0.02 | 0.094±0.016 | 60.31±1.34 |
| CICC1450 | 6.37±0.54 | 4.29±0.26 | 0.096±0.034 | 0 | 51.88±0.98 |
表4(续3)酿酒酵母NJZCC17和CICC1450在模拟发酵葡萄汁中酿造特性比较
| 菌株 | 挥发性香气物质种类 | 最大耐乙醇含量(％，v/v) | 最大耐SO2含量(mg/L) | 产H2S能力 | 2，3-丁二醇(mg/L) |
| NZJCC17 | 34 | 17％ | 600 | 低(浅棕色) | 0.456±0.021 |
| CICC1450 | 28 | 16％ | 600 | 高(深棕色) | 0.346±0.017 |
在模拟葡萄汁中对酿酒酵母菌株进行酿造特性研究可以在与天然葡萄汁非常相似的营养组成条件下完全排除野生杂酵母对发酵特性的影响。由表4的实验结果可以看出，与商业标准对照菌株CICC1450相比，NJZCC17的发酵力更强，其CO2和酒精产量更高，而残糖量更低；对葡萄酒品质和风味具有不利影响的产物，如乙醛、乙酸、H2S和尿素产量，NJZCC17的产量均更低；而对葡萄酒风味和口感具有积极影响的物质，如甘油、乙酸乙酯、乙酸己酯、己酸乙酯、苯乙醇、2，3-丁二醇和总酯，NJZCC17的产量均高于对照菌株；从挥发性香气成分构成上看，NJZCC17可以产生34种挥发性香气成分，而CICC1450仅能产生30种。在产酯类物质能力上，NJZCC17强于对照菌株F15，属于优良酿造特性。而且，NJZCC17可以产生CICC 1450无法产生的酯类乙酸苯乙酯(0.094±0.016mg/L)、己酸-3-甲基丁酯(0.17±0.021mg/L)、3-辛烯酸乙酯(0.1±0.001mg/L)和2-甲基-丙酸(0.054±0.002mg/L)；从对逆境抗性的比较研究看，NJZCC17的抗酒精能力略高于CICC1450，而对SO2抗性相同。葡萄酒中苹果酸含量低可以缩短乳酸菌苹乳发酵的时间，缩短酿造周期。虽然酿酒酵母菌株不具备从膜外运输苹果酸的膜***，但不同菌株对苹果酸的利用率是不同的，与CICC1450相比，NJZCC17的苹果酸利用率更高(NJZCC17为24.83％，CICC1450为9.5％)
实施例3、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NZJCC17和商业菌株F15在赤霞珠葡萄汁中的小型酿酒比较实验
将本发明的酿酒酵母菌株NJZCC17和对照菌株活性干酵母ADY F15，以4L赤霞珠葡萄汁为酿造体系，比较酿造特性。下述以2007年昌黎产赤霞珠葡萄除梗、除杂，然后破碎、榨汁得到的葡萄汁为原料，进行酿造实验。下述2007年昌黎产赤霞珠葡萄主要理化指标为：还原糖(以葡萄糖计)含量，210.99±1.20g/L；总酸量(以酒石酸计)，5.06±0.46g/L；pH＝3.83±0.04。
将保存于-80℃的酿酒酵母NZJCC17在YEPD固体和液体培养基上传代两次，将7℃的商业菌株活性干酵母F15(对照菌株，商业化活性干酵母Zymaflora F15，购自法国LAFFORT公司)按厂家建议方法复水活化。分别取活化好的酿酒酵母NJZCC17或对照菌株F15分别接种到装有4L 2007年河北省昌黎产赤霞珠葡萄汁的5L玻璃容器中，添加亚硫酸，至游离硫含量达到60mg/L，接种量是106CFU/mL，室温发酵，每天监测发酵液的温度和比重，当比重不再下降时视为发酵结束，得到干红葡萄酒。
按照实施例2所述的方法测定上述得到的干红葡萄酒的CO2失重、残糖量、酒精含量、甘油产量、挥发酸、高级醇、酯类含量和产尿素能力。
测定所得的葡萄酒用酿酒酵母菌株在赤霞珠葡萄汁中的产泡沫能力，该实验在16mm×160mm试管中加入10mL过滤除菌的赤霞珠葡萄汁进行，以106CFU/mL接种，25℃培养5d，实验期间每天观察泡沫的高度变化。泡沫高度h＜2mm表示测试菌株产泡沫能力低，2mm≤h≤4mm表示测试菌株产泡沫能力中等，h＞4mm表示测试菌株产泡沫能力强(J.A.Regodón，F.Peréz，M.E.Valdés，C.De Miguel and M.Ramírez.A simple and effective procedure for selection of wine yeast strains.FoodMicrobio.1997，14(3)：247-254)。
具体结果见表5。由表5可以看出利用赤霞珠葡萄酒精发酵结束后，NJZCC17发酵得到的干红葡萄酒的CO2失重高于商业对照菌株，其残糖含量小于对照菌株，而酒精产量高于对照菌株，这说明其发酵力强于对照菌株，在同等条件下其利用可发酵碳水化合物能力和乙醇产生能力更强。此外其他几个主要酿造特性指标，如甘油产量、挥发酸产量、乙酸乙酯产量、泡沫产量、尿素产量，NJZCC17均好于商业对照菌株F15。总酯产量上，NJZCC17明显高于F15，属于优良酿造特性；而在总高级醇产量上，F15高于NJZCC17。国际上认为葡萄酒中的高级醇含量不宜高于300mg/L，否则对葡萄酒风味会产生负面影响(D.，Tominac，V.P.，
V.On higher alcohols in wine.Periodicum Biologorum.2007，109(2)：205-217)。
表5赤霞珠葡萄小试酿酒实验中测试菌株发酵液的理化指标
| 菌株 | CO2失重(g/100mL) | 残糖含量(g/L) | 酒精含量(％，v/v) | 甘油产量(g/L) | 挥发酸(g/L) |
| NJZCC17 | 13.7±0.1 | 3.10±0.06 | 10.01±0.09 | 10.83 | 0.15±0.01 |
| F15** | 12.8±0.1 | 3.88±0.03 | 9.89±0.14 | 9.46 | 0.22±0.03 |
表5(续)赤霞珠葡萄小试酿酒实验中测试菌株发酵液的理化指标
| 菌株 | 乙酸乙酯(mg/L) | 产泡沫能力(mm) | 尿素产量(mg/L) | 总高级醇(mg/L) | 总酯(mg/L) |
| NJZCC17 | 16.15 | h*＜2 | 4.23±0.08 | 275.68±5.89 | 76.13±12.7 |
| F15** | 12.78 | 2＜h＜4 | 9.78±0.05 | 309.94±8.67 | 68.91±8.83 |
h*：表示泡沫高度。F15**：表示商业化活性干酵母S.cerevisiae Zymaflora F15，购自法国LAFFORT公司。
实施例4、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NZJCC17和商业菌株F15在希拉葡萄汁中的小型酿酒比较实验
将本发明的酿酒酵母菌株NJZCC17和对照菌株活性干酵母F15，以4L希拉葡萄汁为酿造体系，比较酿造特性。下述以2007年昌黎产希拉葡萄除梗、除杂，然后破碎、榨汁得到的葡萄汁为原料，进行酿造实验。下述2007年昌黎产希拉葡萄主要理化指标为：还原糖(以葡萄糖计)含量，188.81±1.27g/L；总酸量(以酒石酸计)，7.20±0.40g/L；pH＝3.56±0.02。
将保存于-80℃的酿酒酵母NJZCC17在YEPD固体和液体培养基上传代两次，将7℃的商业菌株活性干酵母F15(对照菌株，商业化活性干酵母S.cerevisiaeZymaflora F15，购自法国LAFFORT公司)按厂家建议方法复水活化，分别取活化好的NJZCC17和商业对照菌株F15接种到装有4L 2007年昌黎产希拉葡萄汁的5L玻璃容器中，添加亚硫酸，至游离硫含量达到60mg/L，接种量是106CFU/mL，室温发酵，每天监测发酵液的温度和比重，当比重不再下降时视为发酵结束，得到干红葡萄酒。
按照实施例2所述的方法测定上述获得的干红葡萄酒的CO2失重、残糖量、酒精含量、甘油产量、挥发酸、高级醇、酯类含量和产尿素能力。
按照实施例3所示的方法测定待测菌株在希拉葡萄汁中的产泡沫能力。
具体结果见表6。由表6可以看出，利用希拉葡萄酒精发酵结束后，NJZCC17发酵得到的干红葡萄酒的CO2失重高于商业对照菌株，其残糖含量小于对照菌株，而酒精产量高于对照菌株，这说明其发酵力强于对照菌株，在同等条件下其利用可发酵碳水化合物能力和乙醇产生能力更强。此外其他几个主要酿造特性指标，如甘油产量、挥发酸产量、乙酸乙酯产量、泡沫产量、H2S产量，NJZCC17均好于商业对照菌株F15。总酯产量上，NJZCC17明显高于F15，属于优良酿造特性；而在总高级醇产量上，F15高于NJZCC17。国际上认为葡萄酒中的高级醇含量不宜高于300mg/L，否则对葡萄酒风味会产生负面影响(
D.，Tominac，V.P.，
V.On higher alcohols in wine.Periodicum Biologorum.2007，109(2)：205-217)。
表6希拉葡萄小试酿酒实验中测试菌株发酵液的理化指标
| 菌株 | CO2失重(g/100mL) | 残糖含量(g/L) | 酒精含量(％，v/v) | 甘油产量(g/L) | 挥发酸(g/L) |
| NJZCC17 | 12.9±0.1 | 2.26±0.08 | 9.55±0.36 | 9.08 | 0.21±0.02 |
| F15* | 12.1±0.1 | 2.67±0.04 | 9.35±0.35 | 8.31 | 0.37±0.04 |
表6(续)希拉葡萄小试酿酒实验中测试菌株发酵液的理化指标
| 菌株 | 乙酸乙酯(mg/L) | 产泡沫能力(mm) | 尿素产量(mg/L) | 总高级醇(mg/L) | 总酯(mg/L) |
| NJZCC17 | 17.89 | h*＜2 | 4.06±0.13 | 296.23±7.89 | 96.13±9.94 |
| F15** | 14.42 | 2＜h＜4 | 10.11±0.04 | 382.88±10.12 | 78.91±2.88 |
h*：表示泡沫高度。F15**：表示商业化活性干酵母S.cerevisiae ZymafloraF15，购自法国LAFFORT公司。
实施例5、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NZJCC17和商业菌株F15在美乐葡萄汁中的小型酿酒比较实验
将本发明的酿酒酵母菌株NJZCC17和对照菌株活性干酵母F15，以4L美乐葡萄汁为酿造体系，比较酿造特性。下述以2007年昌黎产美乐葡萄除梗、除杂，然后破碎、榨汁得到的葡萄汁为原料，进行酿造实验。下述2007年昌黎产美乐葡萄主要理化指标为：还原糖(以葡萄糖计)含量，199.14±1.05g/L；总酸量(以酒石酸计)，4.87±0.20g/L；pH＝3.99±0.01。
将保存于-80℃的NJZCC17在YEPD固体和液体培养基上传代两次，将7℃的商业菌株活性干酵母F15(对照菌株，商业化活性干酵母S.cerevisiae Zymaflora F15，购自法国LAFFORT公司)按厂家建议方法复水活化，分别取活化好的NJZCC17和对照菌株F15接种到装有4L 2007年昌黎产美乐葡萄汁的5L玻璃容器中，添加亚硫酸，至游离硫含量达到60mg/L，接种量是106CFU/mL，室温发酵，每天监测发酵液的温度和比重，当比重不再下降时视为发酵结束，得到干红葡萄酒。
按照实施例2所述的方法发酵结束后测定葡萄酒的CO2失重、残糖量、酒精含量、甘油产量、挥发酸、高级醇、酯类含量和尿素产量。
按照实施例3所示的方法测定待测菌株在美乐葡萄汁中的产泡沫能力。
具体结果见表7。由表7可以看出，利用美乐葡萄酒精发酵结束后，NJZCC17发酵得到的干红葡萄酒的CO2失重高于商业对照菌株，其残糖含量小于对照菌株，而酒精产量高于对照菌株，这说明其发酵力强于对照菌株，在同等条件下其利用可发酵碳水化合物能力和乙醇产生能力更强。此外其他几个主要酿造特性指标，如甘油产量、挥发酸产量、乙酸乙酯产量、泡沫产量、尿素产量，NJZCC17均好于商业对照菌株F15。总酯产量上，NJZCC17明显高于F15，属于优良酿造特性；而在总高级醇产量上，F15高于NJZCC17。国际上认为葡萄酒中的高级醇含量不宜高于300mg/L，否则对葡萄酒风味会产生负面影响(
D.，Tominac，V.P.，
V.On higher alcohols in wine.Periodicum Biologorum.2007，109(2)：205-217)。
表7美乐葡萄小试酿酒实验中测试菌株发酵液的理化指标
| 菌株 | CO2失重(g/100mL) | 残糖含量(g/L) | 酒精含量(％，v/v) | 甘油产量(g/L) | 挥发酸(g/L) |
| NJZCC17 | 13.1±0.1 | 3.14±0.08 | 10.04±0.08 | 8.11 | 0.36±0.01 |
| F15** | 12.8±0.1 | 3.25±0.04 | 10.01±0.15 | 7.31 | 0.39±0.08 |
表7(续)美乐葡萄小试酿酒实验中测试菌株发酵液的理化指标
| 菌株 | 乙酸乙酯(mg/L) | 产泡沫能力(cm) | 尿素产量(mg/L) | 总高级醇(mg/L) | 总酯(mg/L) |
| NJZCC17 | 11.34 | h*＜2 | 5.21±0.02 | 249±8.01 | 79.43±7.86 |
| F15** | 9.52 | 2＜h＜4 | 12.62±0.03 | 324.11±3.16 | 63.65±4.03 |
h*：表示泡沫高度。F15**：表示商业化活性干酵母S.cerevisiae Zymaflora F15，购自法国LAFFORT公司。
实施例6、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NZJCC17和商业菌株F15在400L赤霞珠葡萄汁中的中试酿酒比较实验
下述2008年昌黎产新鲜赤霞珠葡萄主要理化指标为：还原糖(以葡萄糖计)含量，229.12±1.02g/L；总酸量(以酒石酸计)，6.14±0.42g/L；pH＝3.39±0.03。
将保存于-80℃的NJZCC17在YEPD固体和液体培养基上传代两次，将7℃的商业菌株活性干酵母F15复水活化。
将2吨2008年昌黎产新鲜赤霞珠酿酒葡萄除梗、除杂，然后破碎、榨汁得到赤霞珠葡萄汁，以每罐400L的量分装至不锈钢罐中，分3次逐量添加亚硫酸，至游离硫含量达到60mg/L，并添加20mg/L果胶酶，打循环混匀后，测定葡萄汁的总酸、总糖量、游离硫、比重和品温。每株菌发酵两罐作为平行对照试验。实验场地为中国农业大学葡萄酒中心中试基地。
与此同时，采用新鲜调硫至游离硫含量达到60mg/L的上述赤霞珠葡萄汁进行菌株活化，具体方法是将待测NJZCC17菌株传代培养后以3％接种量加入到12L上述赤霞珠葡萄汁中。静置24h后，回温至22℃后得到活化后的NJZCC17菌株。
将活化好的待测菌株NJZCC17以3％的接种量加入到上述发酵罐中，每个待测菌株设2个平行实验罐，对照罐以20mg/L接种量添加活化好的F15。用泵打循环3min使原料液与酵母充分混合均匀。每日分早、中、晚三次打循环，并在循环后取样监控发酵液的温度和比重。分别于酒精发酵后、皮汁分离前和苹乳发酵后取样，根据检测需要测定酒样的理化指标，指标主要包括挥发酸、残糖、酒精度、总酚等，并利用SPME-GC-MS测定主要香气成分及构成，组织专家评审团对葡萄酒进行感官评定。并对NJZCC17各检测结果与对照菌株F15进行对比分析，具体结果如下所述：
(1)菌株发酵曲线和理化指标的比较
酵母NJZCC17起酵时间略早于F15，在接种后的第24-30h后达到最高峰，对照商业菌株F15在接种后第30-42h达到最高峰，对照F15在4.5d结束发酵；NJZCC17发酵时间略长，在第5d结束。酵母菌起酵速度快，可以抑制其他杂菌的生长繁殖，最大限度地保证葡萄酒的成分和质量。同时发酵周期要适当，过短不能充分完成发酵，完全发挥葡萄汁中的风味表现力；过长则可能增加污染的机会，产生不期望的副产物。
酒精发酵后葡萄酒样的理化指标见表8所示。
表8中，乙醇含量的检测方法为比重瓶法，具体步骤按GB/T 15038-2006所规定程序操作；
残糖的检测方法为菲林试剂法，具体步骤按GB/T 15038-2006所规定程序操作；
甘油含量的检测方法为试剂盒法(甘油测定试剂盒，Glycerol Assay Kit，Megazyme公司，爱尔兰)，具体步骤按公司推荐程序操作；
挥发酸含量检测方法为滴定法，具体步骤按GB/T 15038-2006所规定程序操作；
优选酿酒酵母NJZCC17发酵酒样的酒度高于商业对照菌株F15，表明优筛菌株的产酒精能力要优于F15。但是F15发酵较完全，发酵液中的残糖量较低，但是在允许范围内(≤4.0g/L)。通过对所有酒样挥发酸的检测，发现挥发酸均小于0.6g/L，表明发酵无异常情况，酒质良好，检测数据可用于分析。由此综合评价，菌株NJZCC17的发酵活力较高。甘油产量NJZCC17略高于对照菌株。
表8测试菌株酒精发酵后葡萄酒样的理化指标
| 菌株 | 乙醇(％，V/V) | 残糖(以葡萄糖计，g/L) | 甘油(g/L) | 挥发酸(以乙酸计，g/L) |
| NJZCC17 | 13.57±0.01 | 2.23±0.05 | 5.766 | 0.15±0.01 |
| F15* | 13.32±0.02 | 2.77±0.03 | 5.124 | 0.18±0.01 |
F15*：商业化活性干酵母S.cerevisiae Zymaflora F15，购自法国LAFFORT公司。
(2)菌株主要挥发性香气成分种类和含量的比较
葡萄酒发酵过程中产生的香气物质也被称为“二次香气”，主要包括高级醇、短链脂肪酸酯类、短链脂肪酸和芳香族酸和羰基类化合物。
表9显示了利用SPME-GC-MS(张明霞.葡萄酒香气变化规律研究——着重于关键酿造工艺对葡萄酒香气的影响[D].中国农业大学博士学位论文.2007)技术对优选菌株NJZCC17和对照工业用菌株F15在苹乳发酵后发酵香气物质(主要是酯、醇和酸三类物质，除此三类物质外其他类物质，如醛、酮等，由于种类较少，含量低而未列出)的种类。从表9看出酯和醇的种类占发酵香气成分的绝大部分。NJZCC17和F15发酵酒样中酯类物质分别为13种和12种；醇类物质分别为21种和17种；挥发性香气物质总种类分别为44种和35种。与F15相比，在发酵香气的复杂性方面，优选菌株NJZCC17无论是香气物质总种类，还是酯类物质和醇类物质种类均多于F15。复杂的香气成分必将赋予葡萄酒复杂的口感和味感，从而赋予葡萄酒更多的个性和特质。NJZCC17总酯类物质的平均产量为109.76±6.78mg/L，明显高于F15的91.57±7.08mg/L；NJZCC 17总高级醇类物质的平均产量为169.34±6.99mg/L，而F15为211.37±5.71mg/L。
由以上分析可以看出，NJZCC17优选菌株均可产生比较复杂的香气成分，充分发挥了昌黎产区赤霞珠葡萄的酿造潜力。
表9菌株NJZCC17和对照工业用菌株F15在苹乳发酵后发酵香气物质检测
F15*：商业化活性干酵母S.cerevisiae Zymaflora F15，购自法国LAFFORT公司。
(3)菌株酒精发酵后多酚物质含量的比较
葡萄酒是主要的含多酚类物质的酒精饮料。多酚类物质存在于葡萄皮、葡萄浆果、葡萄籽和果梗中，通过酿造过程被提取到葡萄酒中，它们构成了葡萄酒色、香、味的主体，赋予葡萄酒绚丽的色彩、浓郁的香气和醇厚的结构。葡萄酒对人体特有的益处也源于这些多酚类物质，它们具有明显的扩张血管、增强血管通透性的作用。因此说酚类物质的种类、结构以及含量与葡萄酒的颜色、口感、香气和营养价值等密切相关，它们是葡萄酒质量和典型性的决定因素之一。
近年的研究结果表明，葡萄酒中酚类物质含量的差异与不同酵母菌酿造特性有很大关系。利用LC-UV-MS/MS技术(孙建平.葡萄与葡萄酒中酚类物质LC-UV-MS/MS谱库构建及应用[D].中国农业大学博士学位论文.2006)对优选菌株NJZCC17和商业对照菌株F15发酵酒样中多酚研究结果表明：优选酿酒酵母菌株发酵的葡萄酒中花色苷类物质和黄烷-3-醇类物质明显高于活性干酵母发酵的酒样；二苯乙烯类和黄酮醇含量也高于对照酒样；此外，优选菌株发酵酒样中的羟基苯甲酸和羟基肉桂酸类和对照酒样无显著差异。
表10测试菌株发酵葡萄酒样的多酚类物质含量
| 多酚类物质(mg/L) | NJZCC17 | F15* |
| 花色苷类 | 340.1±2.02 | 319.8±1.49 |
| 二苯乙烯类 | 0.81±0.04 | 0.66±0.02 |
| 羟基苯甲酸 | 45.17±0.71 | 45.93±0.57 |
| 黄酮醇 | 15.63±0.22 | 15.21±0.13 |
| 黄烷-3-醇类 | 3357.83±12.26 | 2994.64±6.73 |
| 羟基肉桂酸类 | 16.43±1.02 | 22.41±0.44 |
F15*：商业化活性干酵母S.cerevisiae Zymaflora F15，购自法国LAFFORT公司。
由此可见，采用优选本土酵母菌株NJZCC17发酵的葡萄酒样的营养价值要显著好于进***性干酵母发酵的葡萄酒，四类多酚物质生成量多于对照，另两类物质生成量与对照无显著差异。
(4)专家对中试规模酿造葡萄酒的感官评定
课题组组织对中试发酵酒样的专家感官品评，十名专家有来自企业的高级工程师(两位)，来自高校多年从事葡萄酒研究的教授、副教授(四位，教授两位)，葡萄酒专业研究生(四位，博士生两位)。专家评审组兼顾企业、教学和科研人员，具有较高的权威性和合理性。评审专家组给出的评分结果见表8所示。
表11发酵中试葡萄酒感官评定结果(专家盲评)
F15*：商业化活性干酵母S.cerevisiae ZymafloraF15，购自法国LAFFORT公司
由专家感官评定结果可见，绝大多数专家(8位)对酵母菌株NJZCC17发酵酒样的评价比较高，与对照F15发酵酒样感官品质更优(7位)或相当(1位)。酵母菌株NJZCC17来自于2006年昌黎产赤霞珠的自然发酵液中，而此次中试采用的葡萄汁是2008年昌黎产赤霞珠的压榨汁，由此可见，来源于用同一产区的野生酵母菌株发酵生产的本地葡萄酒具有更好的品质，其酿造特性得到了更完美的展现和发挥。
实施例7、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NZJCC17和商业菌株F15在1000L赤霞珠葡萄汁中的中试酿酒比较实验
下述2009年昌黎产新鲜赤霞珠葡萄主要理化指标为：还原糖(以葡萄糖计)含量，240.06±2.00g/L；总酸量(以酒石酸计)，6.94±0.62g/L；pH＝3.49±0.01。
将保存于-80℃的NJZCC17在分别YEPD固体和液体培养基上传代两次，将7℃的商业菌株活性干酵母F15复水活化。
将2.5吨2009年昌黎产新鲜赤霞珠酿酒葡萄除梗、除杂，然后破碎、榨汁得到葡萄汁，以每罐1000L的量分装至1500L不锈钢罐中，分3次逐量添加亚硫酸，至游离硫含量达到60mg/L，并添加20mg/L果胶酶，打循环混匀后，测定葡萄汁的总酸、总糖量、游离硫、比重和品温。实验场地为中粮华夏长城葡萄酒有限公司。
与此同时，采用新鲜调硫至游离硫含量达到60mg/L的上述赤霞珠葡萄汁进行菌株活化，具体方法是将待测NJZCC17菌株传代培养后以3％接种量加入到30L上述赤霞珠葡萄汁中。静置24h后，回温至22℃后得到活化后的NJZCC17菌株。
将活化好的待测菌株NJZCC17以3％的接种量加入到上述发酵罐中，对照罐以20mg/L接种量添加活化好的F15，具体方式按照生产厂家推荐规程进行。用泵打循环3min使原料液与酵母充分混合均匀。每日分早、中、晚三次打循环，并在循环后取样监控发酵液的温度和比重。于酒精发酵后取样，根据检测需要测定酒样的理化指标，指标主要包括挥发酸、残糖、酒精度、总酚等，并利用SPME-GC-MS测定主要香气成分及构成，LC-MS测定花色苷和多酚。在苹乳发酵后组织专家评审团对葡萄酒进行感官评定。对NJZCC17各检测结果与对照菌株F15进行对比分析，具体结果如下所述：
(1)菌株发酵曲线和理化指标的比较
酵母NJZCC17起酵时间略早于F15，在接种后的第24-30h后达到最高峰，对照商业菌株F15在接种后第30-42h达到最高峰，对照F15在5d结束发酵；NJZCC17发酵时间略长，在第5.5d结束。酵母菌起酵速度快，可以抑制其他杂菌的生长繁殖，最大限度地保证葡萄酒的成分和质量。同时发酵周期要适当，过短不能充分完成发酵，完全发挥葡萄汁中的风味表现力；过长则可能增加污染的机会，产生不期望的副产物。
酒精发酵后葡萄酒样的理化指标见表12所示。
表12中，乙醇含量的检测方法为比重瓶法，具体步骤按GB/T 15038-2006所规定程序操作；
残糖量的检测方法为菲林试剂法，具体步骤为按GB/T 15038-2006所规定程序操作；
甘油含量的检测方法为试剂盒法(甘油测定试剂盒，Glycerol Assay Kit，Megazyme公司，爱尔兰)，具体步骤按公司推荐程序操作；
挥发酸量的检测方法为滴定法，具体步骤按GB/T 15038-2006所规定程序操作；
pH值测定为pH计法，具体步骤为按GB/T 15038-2006所规定程序操作；
总酸含量的检测为电位滴定法，具体步骤为按GB/T 15038-2006所规定程序操作；
游离SO2量的检测为直接碘量法，具体步骤为按GB/T 15038-2006所规定程序操作；
乙醛产量的检测方法为试剂盒法(乙醛测定试剂盒，Aldehyde Assay Kit，Megazyme公司，爱尔兰)，具体步骤按公司推荐程序操作；
尿素产量的检测方法为试剂盒法(尿素测定试剂盒，Urea Assay Kit，Megazyme公司，爱尔兰)，具体步骤按公司推荐程序操作；
苹果酸的检测为HPLC法，具体步骤为按GB/T 15038-2006所规定程序操作；
白藜芦醇的检测为HPLC法，具体步骤为按GB/T 15038-2006所规定程序操作；
2，3丁二醇的检测为核磁共振法(Hong-Seok Son，Geum-Sook Hwang，Ki MyongKim，Eun-Young Kim，Frans van den Berg，Won-Mok Park，Cherl-Ho Lee，andYoung-Shick Hong.1H NMR-Based Metabolomic Approach for Understanding theFermentation Behaviors of Wine Yeast Strains.Anal Chem.2009，81：1137-1145)。
优选酿酒酵母NJZCC17发酵酒样的酒度略高于商业对照菌株F15，表明优筛菌株的产酒精能力要优于F15。但是F15发酵较完全，发酵液中的残糖量较低，但是二者残糖含量均在允许范围内(≤4.0g/L)。通过对酒样挥发酸的检测，发现二者挥发酸均小于0.3g/L(NJZCC17挥发酸量较低)，表明发酵无异常情况。由此综合评价，菌株NJZCC17的发酵启动较快、活力较高，而发酵性能更平稳。甘油、白藜芦醇、2，3-丁二醇等对葡萄酒品质起积极作用的物质产量，NJZCC17均高于对照菌株，其中白藜芦醇的含量是对照菌株的2倍多。白藜芦醇具有良好的生物活性，是一种天然的抗氧化剂，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝结和血管舒张，保持血液畅通，可预防癌症的发生及发展，具有抗动脉粥样硬化和冠心病，缺血性心脏病，高血脂的防治作用。其还具有抑制肿瘤和类***的作用，可用于治疗乳腺癌等疾病。NJZCC17的游离SO2、乙醛、尿素等对葡萄酒品质具有潜在不利影响的物质产量均较对照菌株F15低。
表12测试菌株酒精发酵后葡萄酒样的理化指标
| 菌株 | 乙醇(％，V/V) | 残糖(以葡萄糖计，g/L) | 甘油(g/L) | 挥发酸(以乙酸计，g/L) |
| NJZCC17 | 14.02±0.01 | 3.56±0.08 | 6.198 | 0.193±0.06 |
| ADY* | 13.91±0.02 | 3.52±0.24 | 5.679 | 0.225±0.31 |
表12(续1)测试菌株酒精发酵后葡萄酒样的理化指标
| 菌株 | pH | 总酸(以酒石酸计，g/L) | 游离SO2(mg/L) | 乙醛(mg/L) |
| NJZCC17 | 3.40±0.01 | 8.12±0.07 | 11.03±0.21 | 0.498±0.13 |
| ADY* | 3.46±0.01 | 7.34±0.11 | 13.35±0.17 | 0.519±0.22 |
表12(续2)测试菌株酒精发酵后葡萄酒样的理化指标
| 菌株 | 尿素(mg/L) | 苹果酸(g/L) | 白藜芦醇(mg/L) | 2，3-丁二醇(mg/L) |
| NJZCC17 | 1.89±0.44 | 3.04±0.10 | 4.987±0.058 | 1.225±0.64 |
| ADY* | 6.92±0.18 | 3.52±0.33 | 2.174±0.067 | 1.293±0.31 |
*ADY：商业化活性干酵母S.cerevisiae Zymaflora F15，购自法国LAFFORT公司。
从表12还可以看出，经过酒精发酵后，NZJCC17和F15两株菌均可使葡萄酒中的pH值降低而是总酸升高，这证明两株菌在发酵过程中生成了其他酸性物质。而其中NJZCC17所酿葡萄酒的变化尤为明显。这说明NJZCC17在昌黎产赤霞珠葡萄中的代谢途径更为复杂。然而，在酒精发酵结束后NJZCC17所酿葡萄酒中苹果酸含量更低，这可以减少后期苹乳发酵的时间，具有缩短发酵周期的作用。
(2)菌株主要挥发性香气成分种类和含量的比较
葡萄酒发酵过程中产生的香气物质也被称为“二次香气”，主要包括高级醇、短链脂肪酸酯类、短链脂肪酸和芳香族酸和羰基类化合物。
表13显示了利用SPME-GC-MS(张明霞.葡萄酒香气变化规律研究——着重于关键酿造工艺对葡萄酒香气的影响[D].中国农业大学博士学位论文.2007)技术对优选菌株NJZCC17和对照工业用菌株F15在酒精发酵结束后发酵香气物质(主要是酯、醇和酸三类物质，除此三类物质外其他类物质，如醛、酮等，由于种类较少，含量低而未列出)的种类。从表13看出酯和醇的种类占发酵香气成分的绝大部分。NJZCC17和F15发酵酒样中酯类物质分别为20种和18种。总酯类物质含量NJZCC17远高于F15，其中乙酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸-3-甲基丁酯、丁二酸二乙酯、月桂酸乙酯、十四碳酸乙酯和棕榈酸乙酯等对葡萄酒香气骨架较为重要的酯类物质含量，NJZCC17均高于F15，且NJZCC17可以产生F15无法产生的庚酸乙酯和己酸苯乙酯。高级醇也叫杂油醇或杂醇油，是酵母菌产生的一大类挥发性香气物质。但近年的研究表明饮用过多的高级醇类物质可以增加肝脏的代谢负担，可能使肝组织产生与慢性酒精中毒性肝炎相似的病变；高级醇对神经***也会产生不同程度的毒害作用，其产生的中毒和麻醉作用均比乙醇强，使饮用者产生头痛、晕眩等所谓的饮酒“上头”现象。杂醇油的毒性作用随着分子量的增大而加剧(Dirk W.Lachenmeier，Simone Haupt，Katja Schulz.Defining maximum levels ofhigher alcohols in alcoholic beverages and surrogate alcohol products.RegulatoryToxicology and Pharmacology.2008，50：313-321)。而且由于过高含量的高级醇反而会对葡萄酒的风味和口感产生负面作用，使葡萄酒产生所谓的“杂醇味”和“油漆味”，所以一般认为葡萄酒中的高级醇不应高于300mg/L(
D.，Tominac，V.P.，V.On higher alcohols in wine.Periodicum Biologorum.2007，109(2)：205-217)。因此，目前在国际葡萄酒界筛选酿酒酵母菌株时有这样一种趋势，就是在不影响葡萄酒品质和风味复杂性的前提下，筛选酯类产量较高，而高级醇类产量较低酿酒酵母菌株。虽然NJZCC17的高级醇总产量低于F15，但其产生高级醇的种类多于F15(NJZCC17和F15产生的高级醇类物质分别为21种和17种)。这表明NJZCC17相较于F15具有更为复杂的代谢规律。NJZCC17和F15产生挥发性有机酸类物质均为5种，且种类相同，但NJZCC17产生的挥发酸总量低于F15，其中NJZCC17乙酸的产量也低于F15。这些均是葡萄酒用酿酒酵母需要的优良酿造特征。挥发性香气物质总种类分别为49种和43种。与F15相比，在发酵香气的复杂性方面，优选菌株NJZCC17无论是香气物质总种类，还是酯类物质和醇类物质种类均多于F15。复杂的香气成分必将赋予葡萄酒复杂的口感和味感，从而赋予葡萄酒更多的个性和特质。
由以上分析可以看出，NJZCC17优选菌株均可产生比较复杂的香气成分，酯类物质产量较高，高级醇和挥发性有机酸的含量较低，充分发挥了昌黎产区赤霞珠葡萄的酿造潜力。
表13菌株NJZCC17和对照工业用菌株F15在苹乳发酵后发酵香气物质检测
(3)菌株酒精发酵后多酚物质含量的比较
利用LC-UV-MS/MS技术(孙建平.葡萄与葡萄酒中酚类物质LC-UV-MS/MS谱库构建及应用[D].中国农业大学博士学位论文.2006)对优选菌株NJZCC17和商业对照菌株F15发酵酒样中多酚研究结果表明：优选酿酒酵母菌株发酵的葡萄酒中花色苷类物质和黄烷-3-醇类物质明显高于活性干酵母F15发酵的酒样；二苯乙烯类和黄酮醇含量也高于对照酒样；此外，优选菌株NJZCC17发酵酒样中的羟基苯甲酸和羟基肉桂酸类和对照酒样无显著差异。
表14测试菌株发酵葡萄酒样的多酚类物质含量
| 多酚类物质(mg/L) | NJZCC17 | F15* |
| 花色苷类 | 436.5±1.38 | 389.2±2.29 |
| 二苯乙烯类 | 1.07±0.06 | 0.84±0.03 |
| 羟基苯甲酸 | 39.65±0.41 | 37.97±0.39 |
| 黄酮醇 | 21.03±0.42 | 23.11±0.18 |
| 黄烷-3-醇类 | 3561.41±17.08 | 3197.34±10.03 |
| 羟基肉桂酸类 | 12.19±0.82 | 14.49±0.39 |
F15*：商业化活性干酵母S.cerevisiae Zymaflora F15，购自法国LAFFORT公司。
由此可见，采用优选本土酵母菌株NJZCC17发酵的葡萄酒样的营养价值要显著好于进***性干酵母发酵的葡萄酒，四类多酚物质生成量多于对照，另两类物质生成量与对照无显著差异。
(4)专家对中试规模酿造葡萄酒的感官评定
课题组组织对中试发酵酒样的专家感官品评，十四名专家有来自企业的高级工程师(一位)，助理工程师(一位)，国家级葡萄酒品酒师(一位)，来自国内高校多年从事葡萄酒研究的教授、副教授(四位，教授两位)，外籍酿酒酵母研究专家一人(教授，荷兰瓦格宁根大学)，葡萄酒专业研究生(六位，博士生四位)。专家评审组兼顾企业、教学、专业品评和科研人员，具有较高的权威性和合理性。评审专家组给出的评分结果见表15所示。
由专家感官评定结果可见，绝大多数专家(12位)对酵母菌株NJZCC17发酵酒样的评价比较高，认为比对照F15发酵酒样感官品质更优(11位)或相当(1位)。酵母菌株NJZCC17来自于2006年昌黎产赤霞珠的自然发酵液中，而此次中试采用的葡萄汁是2009年昌黎产赤霞珠的压榨汁，由此可见，来源于用同一产区同一品种的野生酵母菌株发酵生产的本地葡萄酒具有更好的品质，其酿造特性得到了更全面的展现和发挥。
表15发酵中试葡萄酒感官评定结果(专家盲评)
F15*：商业化活性干酵母S.cerevisiae ZymafloraF15，购自法国LAFFORT公司。
Claims (5)
1.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NJZCC17 CGMCC №.3284。
2.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NJZCC17 CGMCC №.3284在酿造葡萄酒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述葡萄酒为干红葡萄酒。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述酿造葡萄酒的葡萄原料的品种为赤霞珠葡萄、希拉葡萄或美乐葡萄。
5.根据权利要求2-4中任意一项所述的应用，其特征在于：所述酿造葡萄酒的葡萄原料为河北昌黎产区产的赤霞珠葡萄、希拉葡萄或美乐葡萄。
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Granted publication date: 20110914 Termination date: 20141116 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |