CN108239608A - 一株戴尔凯氏有孢圆酵母菌株及其在葡萄酒酿造中的应用 - Google Patents
一株戴尔凯氏有孢圆酵母菌株及其在葡萄酒酿造中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株戴尔凯氏有孢圆酵母菌株及其在葡萄酒酿造中的应用;其特点是,戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)HC6菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为CGMCC No.15179,保藏日期为2018年1月;该菌株分离自河北省葡萄产区的赤霞珠自然发酵醪,并经过一系列的筛选鉴定以及实验得到的高产酯类香气的戴尔凯氏有孢圆酵母HC6;利用筛选出的戴尔凯氏有孢圆酵母HC6与酿酒酵母联合发酵酿造葡萄酒,符合葡萄酒生产的国家标准,显著提高酯类等香气物质的含量;该菌株可以应用于葡萄酒酿造,提高葡萄酒的品质,增加葡萄酒香气复杂性,提高葡萄酒果香浓郁度都有重要的作用。
Description
技术领域:
本发明涉及葡萄酒酿造技术领域,具体地讲是一株戴尔凯氏有孢圆酵母菌株及其在葡萄酒酿造中的应用。
背景技术:
葡萄酒是酵母发酵葡萄的产物,不同的酵母可以赋予葡萄酒不同的感官风味。在传统的葡萄和葡萄酒产区,天然酵母菌逐渐适应了当地的气候、土壤和葡萄品种,形成了适应当地葡萄酒的优势菌系,因此,著名的葡萄与葡萄酒产区的葡萄原料往往可以酿出有地域特色的葡萄美酒。
非酿酒酵母(产香酵母,non-Saccharomyces)是一类自然存在于葡萄酒发酵中的微生物,其代谢物对葡萄酒的香气和风味等感官特点有着重要的影响。非酿酒酵母也参与葡萄酒的酿造过程,在发酵过程中具有重要作用,主要包括克勒克酵母、假丝酵母、梅氏酵母、有孢汉生酵母、裂殖酵母、汉生酵母、德巴利酵母、接合酵母和酒香酵母等。一些非酿酒酵母产挥发性物质种类多,含量高,香气突出。而且与酿酒酵母混合发酵改善了葡萄酒的风味,葡萄酒香气物质的数量和质量都有大幅增加,从中筛选优良菌株并用于生产优质葡萄酒已成为可能性。葡萄酒中的香气成分有一些来源于发酵过程中香气前体物质的水解,多以糖苷形式存在,发酵过程中酶作用下分解成游离的香气成分。在发酵过程中,非酿酒酵母与酿酒酵母一起消耗营养物质并产生二级代谢物,同时其具有一定的果胶酶、葡萄糖苷酶、脂肪水解酶、蛋白质水解酶和尿酶活性,从而影响葡萄酒的发酵风味。
非酿酒酵母在葡萄酒酿造中的应用研究近年备受重视,如拉曼公司(Lallemand)历经5年的试验,用Torulaspora delbrueckii和Saccharomyces cerevisiae两种酵母,制成了世界上第一个连续接种装置(LEVELTM TD),并投入商业化运作,利用此种混合酵母制成的葡萄酒具有更强烈更平衡的芳香化合物,提高了酒的感官复杂度。丹麦汉森(ChrHansen)推出一款新型冷冻干燥酿酒发酵剂Viniflora FrootZen,冷冻发酵剂采用的是毕赤克鲁维酵母(Pichia kluyveri),适用于新鲜的白葡萄酒与桃红酒,尤其适合酿造长相思、霞多丽和雷司令,能够增加葡萄汁的风味,提升酒液中热带水果的香气,品尝起来口感好,果香余味悠长,该产品已于2010年12月在新西兰上市,现登录美国法国。澳大利亚葡萄酒研究学所通过***筛选非酿酒酵母(non-Saccharomyces),并最终选育出Metschnikowia pulcherrima AWRI1149 酵母用于低酒精度的高品质葡萄酒生产。
在葡萄酒酿造中利用非酿酒酵母菌种的一些优良特性,来提高葡萄酒感官品质。目前,星形假丝酵母(Candida stellata)和戴尔有孢圆酵母(T. delbrueckii)已是公认的对葡萄酒感官特征具有积极影响的菌种。因此,如何根据不同产区葡萄品种的特点,选育适合发挥本土原料优势特性的非酿酒酵母,是从事葡萄酒科研工作者需要面对的问题,例如通过适宜的菌种选育,在中国东部产区推广酿造口感柔和细腻的新鲜果香型葡萄酒或在中国中西部产区推广酿造口感浓郁醇厚的陈酿型葡萄酒是葡萄酒行业未来发展的一个基本方向。
发明内容:
本发明的目的是克服上述已有技术的不足,提供一株戴尔凯氏有孢圆酵母菌株。
本发明的另一目的是提供一株戴尔凯氏有孢圆酵母菌株在葡萄酒酿造中的应用。
本发明主要解决如何根据不同产区葡萄品种的特点选育适合发挥本土原料优势特性的非酿酒酵母的问题。
本发明的技术方案是:一株戴尔凯氏有孢圆酵母菌株(Torulaspora delbrueckii),于2018年1月12日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC No.15179。
本发明的戴尔凯氏有孢圆酵母菌株在葡萄酒酿造中的应用,其特殊之处在于,葡萄酒酿造工艺中以戴尔凯氏有孢圆酵母HC6和酿酒酵母为菌种,对葡萄汁进行发酵,酿造葡萄酒。
进一步的,所述戴尔凯氏有孢圆酵母HC6先于酿酒酵母2~3天接种。
进一步的,所述戴尔凯氏有孢圆酵母HC6接种密度为107 cfu/mL。
进一步的,所述戴尔凯氏有孢圆酵母HC6接种后,葡萄汁发酵温度为8~12℃。
本发明所述的一株戴尔凯氏有孢圆酵母菌株及其在葡萄酒酿造中的应用与已的技术相比具有突出的实质性特点和显著进步,1、利用戴尔凯氏有孢圆酵母HC6酿造的葡萄酒的优点在于,与商业化酿酒酵母CY3079(CY3079,法国拉曼公司生产,常用于干白葡萄酒的酿造)和RC212(RC212,法国拉曼公司生产,常用于干红葡萄酒的酿造)联合发酵,能显著提高酯类等香气物质的含量,从而有效增加葡萄酒中的酯类香气;2、在贵人香干白葡萄酒中,使用戴尔凯氏有孢圆酵母HC6与商业化酿酒酵母CY3079联合发酵产生的酯类物质的含量达到831.3 mg/L,比只使用商业化酵母CY3079发酵产生的香气高179.4 mg/L;3、在蛇龙珠干红葡萄酒中,使用戴尔凯氏有孢圆酵母HC6与商业化酿酒酵母RC212联合发酵产生的酯类物质的含量达到588.25 mg/L,比只使用商业化酵母RC212发酵产生的香气高113.08 mg/L;其中丁二酸二乙酯在两种葡萄酒中明显增加,赋予了葡萄酒更加丰富的果香;4、该菌株可以广泛应用于葡萄酒酿造,对提高葡萄酒的品质,增加葡萄酒香气复杂性,提高葡萄酒果香浓郁度都有重要的作用。
附图说明:
图1为戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)HC6在WL营养琼脂培养基上的菌落形态;
图2为戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)HC6在YEPD培养基上的菌落形态。
具体实施方式:
为了更好地理解与实施,下面结合实施例详细说明本发明;所举实施例仅用于解释本发明,并非用于限制本发明的范围。
下述实施例中的葡萄酒酿造方法,如无特别说明,均为常规方法。
下述实施例中YEPD固体培养基配方如下:
葡萄糖20 g/1000 mL,蛋白胨20 g/1000 mL,酵母提取物10 g/1000 mL,琼脂20 g/1000 mL;自然pH值,115°C,灭菌20 min。
下述实施例中WL营养琼脂培养基配方如下:
酵母抽提物4g/1000 mL,蛋白胨5g/1000 mL,葡萄糖50g/1000L,储液A 40 mL/1000mL,储液B 1 mL/1000 mL,琼脂粉 20 g/1000 mL,加热融化后冷却室温调pH至5.5,将上述培养基组分在115°C下灭菌20 min后,冷却至60°C左右,趁热在超净工作台中加入1 mL/1000 mL储液C;
储液A:磷酸二氢钾 5.5 g,氯化钾 4.25 g,氯化钙 1.25 g,硫酸镁 1.25 g,定容至400 mL,在4°C冰箱保存;
储液B:氯化铁 0.25 g,硫酸锰 0.25 g,定容至100 mL,在4°C冰箱保存;
储液C:溴甲酚绿0.44 g溶于10 mL水和10 mL无水乙醇中,其中10 mL水(带瓶)要提前灭菌。
下列实施案例中,葡萄酒的有机酸、高级醇和酯类等挥发性香气分析方法如下:
非酒精挥发物质:气相色谱法。备有氢火焰离子化检测器,色谱柱:CP-WAX57CB,进样量10 μL,色谱条件:载气流速1 mL/min,分流比30:1,尾吹25 mL/min;氢气流速30 mL/min;空气流速300 mL/min;检测器温度230°C;进样口温度230°C;起始柱温50°C,恒温2 min,以6°C/min 程序升温至190°C,继续恒温10 min。
香气成分分析:气相色谱法。Varian CP3800,柱子cp-wax57CB 50*0.25*0.2Acidic;固相微萃取检测香气成分的色谱条件:载气流速0.8 mL/min,分流比30:1,尾吹25mL/min,氢气流速30 mL/min;空气流速300 mL/min,检测器温度250°C,进样口温度250°C,柱温起始温度50°C,恒温1 min,以4°C /min程序升温至220°C,继续恒温5 min;SPME条件:取样品5 mL置于15 mL萃取瓶中,加入2 g氯化钠,封口,置磁力搅拌器上(40°C)加热搅拌,PDMS萃取头萃取30 min,进样,按色谱条件进行分析。
实施例1,戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)HC6分离、纯化及鉴定:
采摘中国河北地区的成熟赤霞珠葡萄,破碎后分汁分装无菌容器中进行自然发酵3-5d;取1 mL发酵葡萄汁经梯度稀释后涂布WL培养平板上,经28-32°C下培养5 d后,挑取奶油色、深绿或蓝色,略显干燥,表面光滑,不透明的菌株即为所得酵母,经26 S rDNA D1/ D2区方法序列鉴定,确定为戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)HC6,保藏编号为CGMCC No.15179。
上述菌株经过形态学观察和26S rDNA D1/D2区进行扩增测序,后对所有鉴定结果综合分析。具体鉴定结果如下:
形态学观察方法和结果:经过48 h培养,在WL营养琼脂培养基上生长的菌落为奶油色、深绿或蓝色,略显干燥,表面光滑,不透明,奶油状,易挑起(如图1所示);在固体YEPD培养基上生长的菌落为圆形、乳白色、有光泽,边缘整齐,菌体粘稠,易挑起(如图2所示)。
26s rDNA D1/D2区扩增测序分析鉴定方法和结果:由上海生物工程技术服务有限公司进行鉴定和测序;测序结果与NCBI数据库中的已有序列进行比对,确认为戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)。公司测定得到的序列见SEQ NO. 1序列表。
实施例2,戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)HC6与商业化酿酒酵母CY3079联合发酵干白葡萄酒;
将筛选得到的戴尔凯氏有孢圆酵母HC6与商业化酿酒酵母CY3079联合发酵贵人香干白实验,具体方法如下:
将保存于-80°C的自筛野生型戴尔凯氏有孢圆酵母HC6在YPD固体和液体培养基上活化传代;经活化的戴尔凯氏有孢圆酵母HC6接入装有100 mL灭菌的YPD液体培养基中,摇床(30°C,200 rpm)下培养24 h后,在8°C和4000 r/min下离心5 min收集菌体,加无菌水混旋后离心洗涤2次,用无菌水重悬菌体备用作为待接种的活化种子;当酵母生长菌体密度达到107 cfu/mL按照1%接种量,接种于5 L贵人香葡萄汁中,初糖浓度为204 g/L,二氧化硫浓度60 mg/L,8层纱布覆盖,在12°C控温发酵2 d后,回温至15°C后接入商业化酿酒酵母CY3079,并持续至发酵终止;对照实验只接入商业化酿酒酵母CY3079。
戴尔凯氏有孢圆酵母HC6与商业化酿酒酵母CY3079联合发酵贵人香干白葡萄酒与只使用商业化酿酒酵母CY3079的比较结果见表1及表2。
(1)菌株酒精发酵后干白葡萄酒样的理化指标见表1
表1 实验菌株酒精发酵结束后干白葡萄酒样的理化指标
戴尔凯氏有孢圆酵母HC6接种发酵2 d后在接入商业化酿酒酵母CY3079,联合发酵贵人香干白葡萄酒的常规理化指标比较见表1。戴尔凯氏有孢圆酵母HC6与商业化酿酒酵母CY3079联合发酵的理化指标均符合葡萄酒的各项指标要求,综合理化指标分析戴尔凯氏有孢圆酵母HC6的使用对甘油和干浸物的含量具有积极的影响。
(2)菌株酒精发酵后干白葡萄酒样的主要挥发性物质含量见表2
戴尔凯氏有孢圆酵母HC6与商业化酿酒酵母CY3079联合发酵的贵人香干白比只使用商业化酿酒CY3079发酵的贵人香干白的主要挥发性物质含量明显增加。其中酯类物质香气增加明显,使用戴尔凯氏有孢圆酵母HC6与商业化酿酒酵母CY3079联合发酵产生的酯类物质的含量达到831.3 mg/L,比只使用商业化酵母CY3079发酵产生的香气高179.4 mg/L。戴尔凯氏有孢圆酵母HC6与商业化酿酒酵母CY3079联合发酵的贵人香干白中,癸酸乙酯的含量是只使用商业化酿酒酵母CY3079的3.7倍,辛酸乙酯和月桂酸乙酯的含量是只使用商业化酿酒酵母CY3079的2倍,丁二酸二乙酯的含量是只使用商业化酿酒酵母CY3079的1.3倍,说明戴尔凯氏有孢圆酵母HC6的使用,明显增加的发酵贵人香干白葡萄酒中的酯类香气含量。
癸酸乙酯具有水果味,辛酸乙酯具有甜味,果香,奶香并伴有酵母气息,月桂酸乙酯具有琥珀膏香和蜜香,除此之外绝大多数的酯类都具有令人愉快的花香和果香。丰富的酯类物质与适量的高级醇产量与其它挥发性组分相配合使得贵人香干白的香气更加复杂、浓郁。
此外,戴尔凯氏有孢圆酵母HC6与商业化酿酒酵母CY3079联合发酵的贵人香干白的高级醇的含量也高于只使用商业化酿酒酵母CY3079发酵的贵人香干白的,其中正己醇和苯乙醇的含量是只使用商业化酿酒酵母CY3079的1.5倍。
实施例3,戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)HC6与商业化酿酒酵母RC212联合发酵干红葡萄酒;
戴尔凯氏有孢圆酵母HC6的活化种子的准备同实例2戴尔凯氏有孢圆酵母HC6与商业化酿酒酵母CY3079联合发酵贵人香干白实验活化种子的准备。当酵母生长菌体密度达到107cfu/mL按照1%接种量,接种于5 L蛇龙珠葡萄汁中,初糖浓度为215 g/L,二氧化硫浓度60mg/L,8层纱布覆盖,在8°C控温发酵3 d后,接入商业化酿酒酵母RC212,并持续至发酵终止。对照实验只接入商业化酿酒酵母RC212。
戴尔凯氏有孢圆酵母HC6与商业化酿酒酵母RC212联合发酵蛇龙珠干红葡萄酒与只使用商业化酿酒酵母RC212的比较结果见表3及表4。
(1)菌株酒精发酵后干红葡萄酒样的理化指标见表3
戴尔凯氏有孢圆酵母HC6接种发酵3 d后在接入商业化酿酒酵母RC212,联合发酵蛇龙珠干红葡萄酒的常规理化指标比较见表3。戴尔凯氏有孢圆酵母HC6与商业化酿酒酵母RC212联合发酵的理化指标均符合葡萄酒的各项指标要求。
(2)菌株酒精发酵后干红葡萄酒样的主要挥发性物质含量见表4
戴尔凯氏有孢圆酵母HC6与商业化酿酒酵母RC212联合发酵的蛇龙珠干红比只使用商业化酿酒RC212发酵的蛇龙珠干红的主要挥发性物质含量明显增加。其中酯类物质香气增加明显,使用戴尔凯氏有孢圆酵母HC6与商业化酿酒酵RC212联合发酵产生的酯类物质的含量达到588.4 g/L,比只使用商业化酵母RC212高113.2 mg/L。戴尔凯氏有孢圆酵母HC6与商业化酿酒酵母RC212联合发酵的蛇龙珠干红中,月桂酸乙酯的含量是只使用商业化酿酒酵母RC212的2倍,辛酸乙酯是1.5倍,丁二酸二乙酯的含量是只使用商业化酿酒酵母RC212的1.3倍,说明戴尔凯氏有孢圆酵母HC6的使用,明显增加的发酵蛇龙珠干红葡萄酒中的酯类香气含量。
此外,戴尔凯氏有孢圆酵母HC6与商业化酿酒酵母RC212联合发酵的蛇龙珠干红的高级醇的含量也高于只使用商业化酿酒酵母RC212发酵的蛇龙珠干红的,其中苯乙醇的含量是只使用商业化酿酒酵母RC212的1.9倍,正丙醇的含量是只使用商业化酿酒酵母RC212的1.4倍。
序列表
<110> 烟台张裕集团有限公司
<120> 一株戴尔凯氏有孢圆酵母菌株及其在葡萄酒酿造中的应用
<130> 2018
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 596
<212> DNA
<213> 戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)
<400> 1
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ggactgcgac tttacgtcaa ggatgctggc ataatggtta tatgccgccc gtcttg 596
Claims (6)
1. 一株戴尔凯氏有孢圆酵母菌株,现保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”,保藏编号为CGMCC No.15179。
2.权利要求1所述的戴尔凯氏有孢圆酵母菌株在葡萄酒酿造中的应用,其特征在于,葡萄酒酿造工艺中以戴尔凯氏有孢圆酵母HC6和酿酒酵母为菌种,对葡萄汁进行发酵,酿造葡萄酒。
3.根据权利要求2所述的戴尔凯氏有孢圆酵母菌株在葡萄酒酿造中的应用,其特征在于,所述戴尔凯氏有孢圆酵母HC6先于酿酒酵母2~3天接种。
4.根据权利要求2或3所述的戴尔凯氏有孢圆酵母菌株在葡萄酒酿造中的应用,其特征在于,所述戴尔凯氏有孢圆酵母HC6接种密度为107 cfu/mL。
5.根据权利要求2或3所述的戴尔凯氏有孢圆酵母菌株在葡萄酒酿造中的应用,其特征在于,所述戴尔凯氏有孢圆酵母HC6接种后,葡萄汁发酵温度为8~12℃。
6.根据权利要求4所述的戴尔凯氏有孢圆酵母菌株在葡萄酒酿造中的应用,其特征在于,所述戴尔凯氏有孢圆酵母HC6接种后,葡萄汁发酵温度为8~12℃。
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