CN1084858A - 提取绒毛膜***的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以人工流产的血清和绒毛组 织为原料提取绒毛膜***的方法，其特点是采 用逐级层析法提取，首先用排阻层析法选出富含绒毛 膜***段的流出液，再经阳离子层析、阴离子 层析、纯化而制得纯品。

Description

本发明涉及一种绒毛膜***的制备方法，属于生物化学制备方法。

绒毛膜***（简称HCG），它由α-、β-两亚基构成的糖蛋白，等电点PI3.2左右，易溶于水，不溶于有机溶剂，高渗盐和有机物易破坏其空间结构，干品性质稳定。目前制取HCG是从怀孕5个月以内的孕妇尿液中用盐析法制取，其工艺路线是孕尿 (苯甲酸乙醇饱和液)/() 吸附物 (95%乙醇)/() 粗制品 (NaAC缓冲液)/() 提取液 (冷丙铜)/() 沉淀 (NaAc缓冲液)/() 提取液 (95%乙醇)/() 沉淀物 (利凡诺溶液)/() 处理液 (冷丙酮冰Ac)/() 处理物 (NH₄Ac,Na₃PO₄,C_aAC₂)/() 去热源- (NH₄Ac,乙醇 - 醋酸)/() 沉淀 (水、***)/() 水溶液 (NaOH上清95%乙醇)/() 沉淀 (干燥)/() 纯品HCG→HCG注射液，该工艺需使用有机溶剂9次，使用高渗盐5次，每次使用均可造成HCG的三维空间结构发生改变和破坏情况，产品活性小，有的对此工艺做了一些改进，但仍不能摆脱有机-无机沉淀的原则。加之由尿排出的HCG是机体新陈代谢的末尾阶段，HCG稳定性已下降，因此说上述工艺从制取的材料到制取技术都不理想，产品质量差，活性低。

本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处而提供一种人工流产血清和绒毛组织中提取HCG的方法，在提取中不失活，产量高，产品质量好，成本低。

本发明的目的是这样实现的：是以人工流产的血清和绒毛组织为原料，用逐级层析法提取绒毛膜***（HCG）。首先用排阻层析法选出富含HCG段的流出液，经阳离子层析、阴离子层析、纯化而制成HCG纯品。

本发明的目的还可以通过以下措施来达到：排阻层析的分子筛材料用琼脂糖凝胶类或葡聚糖凝胶类树脂。用无菌血清装柱，装柱后柱床体积为柱长30-50厘米，柱径5-10厘米，层析流动相为低浓度氧化钠和纯水交替使用，装柱血清与床体积比为15-25%，此步骤是利用分子筛材料的物理性质，把血清中混合的各类蛋白质按体积大小顺序分离，同时用紫外监测仪收集富含绒毛膜***的流出液，该液体中不含大分子和小分子蛋白的混合液，约除去35-50%的杂蛋白，其主要成分是HCG和与其体积大小相近的一类蛋白质，包括血红素Hb、α-球蛋白、血红蛋白等，为澄清的红色溶液，然后将此液用甲酸缓冲液电至PH为3.3，再通入阳离子层析柱，使等电点PI＞3.3的杂蛋白和阳离子层柱反应，变成红黑色，并把这部分蛋白留在柱内，流出液是富含HCG和等电点PI＞3.3的杂蛋白混合物，为无色透明胶体液，再将胶体液用甲酸缓冲液调至PH2.9-3.0后注入阴离子层析柱，使PI＜3.0的杂蛋白被吸附，流出液是富含HCG和极微量的杂蛋白混合液，即为HCG粗品液。粗品经纯化制成精品，纯化方法是将HCG粗品液用碱性液调PH至7.5-8.5，以扩大HCG与杂蛋白间的静电荷差，再通入阴离子层析柱使其与之反应，置干紫外自动监测仪上，用低盐溶液或纯水洗净非特异吸附的蛋白，待基线平稳后用梯度洗脱液Na₂HPO₄-NaH₂PO₄-H₃PO₄系，PH为7.5-8.5设计梯度洗脱，在紫外监测仪下收集绒毛膜***的峰段即为纯品。

本发明相比背景技术具有以下优点：

1、用人工流产血清和绒毛组织替代了孕尿提取HCG，采用人工流产物，它便于收集贮运，在-20-30℃以下冻存6个月不失活，这就给收集贮运带来方便，且来源广，全国平均人工流产数达1/150，每个县级医院年人工流产平均在1000人次，约有血清100立升，另外血清中含HCG高，每升血清含30-60万国际单位，是同量孕尿的100倍以上，因而经济效益显著，按80%的提取率折算，每立方米血清含3-6亿国际单位的粗品，约含人民币10-30万元，针剂120万元以上。

2、产品活性完整，质量好产量高。由于本发明采用逐级层析法提取HCG，理论上不存在失活因素，排阻层析是纯物理作用，它是按分子体积大小分离蛋白，二级离子交换层析是依照每种蛋白质的自身在一定PH值缓冲液中带电不同来分离，没有造成HCG的三维空间结构破坏，因而产品不失活。

3、无污染，可形成连续性生产。

下面结合（附图）实施例作进一步详述：

附图为本发明的工艺流程图。

图中：无菌处理血清及绒毛浸出液（1）、排阻层析柱（2）、阳离子交换柱（3）、阴离子交换柱（4）、阴离子交换柱（5）、紫外自动监侧（6）。

实施例：

原料的收集与处理：由医务人员将吸宫血清贮存在冰柜内，把收集到的血清冻块融化→离心去沉渣→G₅除菌漏斗去菌及大颗粒悬浮物→无菌血清，沉渣中分拣出的绒毛组织→高速组织捣碎机制成匀浆 (浸泡NaAC→AC缓冲液PH6.0)/() 取上清液，无菌血清血粘滞系数≤2倍层析柱流动相，温度在2-10℃。

提取方法：参见附图，无菌血清及绒毛浸出液（1）→排阻层析柱（2）→阳离子层析柱（3）→阴离子交换柱（4）→阴离子层析柱（5）→紫外自动监侧收集HCG（6）。分子筛为Sepharose-4B，2B或Sephadex-G₇₅，G₁₀₀。装柱后的床体积为柱长40厘米，柱径3厘米，层析流动相为低浓度氧化钠和纯水交替使用，无菌血清加入柱内为床体积的20%，同时用紫外监测仪监侧收集相应峰值（富含HCG）的流出液，该液体为红色透明，在排阻层析柱（2）中进行，然后把排阻后的富含HCG的流出液用甲酸缓冲液调至PH为3.3，再通入阳离子层析柱（3），当柱中的白色柱体变成红黑色时，收集流出的略呈胶体液，该流出液再用甲酸缓冲液调至PH3.0，通入阴离子层析柱（4），使等电点PI＜3.0的杂蛋白被吸附，流出液是富含HCG和极微量的杂蛋白混合液，即为HCG粗品液，粗品经纯化制成HCG纯品，所述的纯化是将HCG粗品液用碱性液调至PH为8，再通入阴离子层析柱（5），用纯水洗柱，置于紫外自动监测仪上，待基线平稳后用梯度洗脱液Na₂HPO₄-NaH₂PO₄-H₃PO₄系PH为7.5-8.5梯度洗脱，在紫外监测仪（6）下收集HCG的峰段即为纯品，全部层析过程控制在2-10℃。将HCG液置于超滤浓缩器中或半透膜透析带中浓缩至10-50mg/ml，降温至-70℃，冻干机冻干呈粉状，即制成纯HCG干品。其制剂同一般针剂处理。

以上依蛋白质分子体积组分蛋白，和依目的蛋白的PI为核心设计除掉杂蛋白的方法及扩大杂蛋白和目的蛋白静电荷差后的递度洗脱方法，除用来纯化HCG外，同样可以纯化其它的目的蛋白，如粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）生长激素（GF）等。

离子柱的选择和再生：阴、阳离子交换材料，以弱阴、阳离子材料为佳，阴、阳离子柱每次处理血清及绒毛侵液后，要进行再生。阳离子柱以0.5MNaOH→水→0.5MHCL→水→0.5MNaOOCH₂。阴离子柱以0.5MHCL→水→0.5MNaOH→水→0.5MNaOO₃CH₂处理。

本发明的层析效果：一升血清与绒毛浸出液含HCG3×10⁵纯水排阻层析柱→3.5升（收率83%，HCG含量7×10⁴IU/升） (甲酸缓冲液)/(PH3.3) 调至3.75升→阳离子交换柱3.8升（收率81%，HCG含量6.5×10⁴IU/升） (甲酸缓冲液)/(PH3.0) 阴离子交换柱3.8升（收率78%，HCG含量6.14×10⁴IU/升） (磷酸缓冲液)/(PH8.5) 阴离子交换柱2.4升（收率75%9.38×10⁴）。如果加强各级柱的清洗可使总体回收到95%，但时间长。

Claims (6)

1、一种提取绒毛膜***的方法，其特征在于：

a、原料为人工流产血清和绒毛组织；

b、逐级层析法提取绒毛膜***，首先用排阻层析法选出富含绒毛膜***段的流出液，再经阳离子层析、阴离子层析、纯化而制得纯品。

2、根据权利要求1所述的提取绒毛膜***的方法，其特征在于排阻层析法其分子筛材料用琼脂糖凝胶类或葡聚糖凝胶类树脂。

3、根据权利要求1或2所述的提取绒毛膜***的方法，其特征在于排阻层析流动相为低浓度氧化钠和纯水交替使用，无菌血清上样与床体积比为15-25%，用紫外监测仪收集富含绒毛膜***的流出液。

4、根据权利要求1所述的提取绒毛膜***的方法，其特征在于阳离子层析是把由排阻后富含绒毛膜***的流出液用甲酸缓冲液调至PH为3.3，再通入阳离子层析柱，使PI＞3.3的杂蛋白和阳离子层柱反应，并把这部分蛋白留在柱内，流出液是富含绒毛膜***及PI＜3.3的杂蛋白混合胶体液。

5、根据权利要求1所述的提取绒毛膜***的方法，其特征在于阴离子层析是将从阳离子层析柱中流出的胶体液用甲酸缓冲液调至PH2.9-3.1，再通入阴离子层析柱使PH＜3.0的杂蛋白被吸附，流出液即为绒毛膜***粗品。

6、根据权利要求1或2所述的提取绒毛膜***的方法，其特征在于纯化是将绒毛膜促性激素粗品液用碱性液调PH至7.5-8.5，扩大绒毛膜***杂与蛋白间的静电荷差，再通入阴离子层析柱使其与之反应，置于紫外自动监测仪上，用低盐溶液或纯水洗净非特异吸附的蛋白，待基线平稳后用梯度洗脱液Na₂HPO₄-NaH₂PO₄-H₃PO₄系，PH为7.5-8.5设计梯度洗脱，在紫外监测仪下收集绒毛膜***的峰段即为纯品。

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