CN107991408A - 四味珍层冰硼滴眼液中指标成分含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了四味珍层冰硼滴眼液中特征性成分寡肽L‑酪氨酰甘氨酸和L‑色氨酸的含量测定方法。其特征在于，对四味珍层冰硼滴眼液进行分离纯化和结构鉴定，确定寡肽L‑酪氨酰甘氨酸和L‑色氨酸在内的7个单体化合物为四味珍层冰硼滴眼液的特征性成份，通过采用HPLC法测定四味珍层冰硼滴眼液中寡肽L‑酪氨酰甘氨酸和L‑色氨酸的含量，控制特征性成份寡肽L‑酪氨酰甘氨酸和L‑色氨酸的含量，能确保四味珍层冰硼滴眼液质量稳定均一，从而提高该产品的质量可控性。本发明方法简便快速，专属性强，能够准确、稳定、快捷地测定四味珍层冰硼滴眼液中寡肽L‑酪氨酰甘氨酸和L‑色氨酸的含量，该方法的应用可更好地控制该产品的质量。

Description

四味珍层冰硼滴眼液中指标成分含量测定方法

技术领域

本发明属于中药分析领域，具体涉及四味珍层冰硼滴眼液中特征性成分的含量测定方法。

背景技术

中药治疗疾病有着悠久的历史，然而中药成份的复杂性给中药质量控制带来了难题，阻碍了中药走上世界市场，要想全面的控制中药的质量，必须做好各成分的含量的精确控制。

本发明所述四味珍层冰硼滴眼液，其主要成份为珍珠层粉；珍珠层粉是由蚌科动物三角帆蚌Hyriopsis cumingii(Lea)、褶纹冠蚌Cristaria plicata(Leach)或珍珠贝科动物马氏珍珠贝Pteria martensii(Dunker)的贝壳的珍珠层经加工磨制成的粉末，是传统中药，收载于《中国药典》2015版一部，具有平肝潜阳，退翳等功效。珍珠层粉经过提取后，获得珍珠层粉提取液，从而使珍珠层粉中的有效成分更好地发挥作用。据国内有关珍珠层粉化学成分的报道，珍珠层粉的主要成分是碳酸钙，含有少量的微量元素和氨基酸等，对其化学成分研究并不深入，。经过对珍珠层粉提取液和四味珍层冰硼滴眼液进行分离纯化和结构鉴定，第一次分离得到并确定寡肽L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸在内的7个单体化合物为珍珠层粉提取液和珍视明滴眼液的特征性成份，为提高四味珍层冰硼滴眼液质量控制打下了基础。

《中国药典》2015年版一部收录了四味珍层冰硼滴眼液的鉴别和含量测定方法，然而含量测定中关于主要成分珍珠层粉的项目仅有总氮量测定，总氮量测定对该产品成分没有针对性和专属性，而且定氮法的消化、蒸馏、滴定等操作复杂，对检测人员操作熟练程度要求高，检测耗时长，污染大，准确度差，难以科学的评价和控制珍珠层粉的品质质量。只有进一步的测定了珍珠层粉提取液和四味珍层冰硼滴眼液中特征性成分及其含量，才能从根本上保证四味珍层冰硼滴眼液的药效。本发明，采用HPLC法测定四味珍层冰硼滴眼液中寡肽L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸的含量，通过控制特征性成份寡肽L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸的含量，能确保四味珍层冰硼滴眼液质量稳定均一，从而提高该产品的质量可控性。

发明内容

本发明的目的是提供四味珍层冰硼滴眼液中指标成分含量测定方法。

本发明技术方案：

一种四味珍层冰硼滴眼液中特征性成分含量测定方法，对珍视明滴眼液进行分离纯化和结构鉴定，确定包括寡肽L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸在内的单体化合物为珍视明滴眼液的特征性成份，通过控制特征性成份寡肽L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸的含量，能确保四味珍层冰硼滴眼液质量稳定均一，从而提高药物的安全性和质量可控性。

进一步，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备：称取L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸适量，置于100mL容量瓶中，加水溶解稀释，摇匀，定容，作为混合对照品储备液；

(2)供试品溶液的制备：吸取四味珍层冰硼滴眼液，离心，取上清液，得供试品溶液；

(3)测定方法：采用高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照品溶液进行定量检测。

进一步，步骤(2)中还包括以下特征中的任意一项或多项：

(1)吸取四味珍层冰硼滴眼液的用量为1.0～20.0mL；

(2)所述离心的速度是10,000～15,000r/min；

(3)所述离心温度为2～30℃。

进一步，步骤(3)中，选择美国安捷伦公司出品的Eclipse XDB-C₁₈(3.0×150mm，3.5μm)色谱柱对珍视明滴眼液的分离。

进一步，步骤(3)中，使用二极管阵列检测器对样品进行全波长扫描，并对各波长下的色谱图进行分析比较，确定了在220nm下检测到的特征峰及峰形，获取色谱组分信息以反应体系组成的全貌。

进一步，步骤(3)中，分别采用不同流动相***不同梯度进行试验，以0.085％TFA+70％乙腈水溶液-0.1％TFA水线性梯度分离。

进一步，步骤(3)中，所述定量检测方法步骤包括：采用HPLC在相同色谱条件下分别测定供试品溶液和对照品溶液，将供试品溶液的色谱图与对照品溶液的色谱图比较，根据相对保留时间和特征峰，确认供试品溶液中L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸的特征峰。

进一步，步骤(3)中，所述定量检测方法包括步骤：采用HPLC在相同色谱条件下分别测定供试品溶液和对照品溶液，按外标法以峰面积计算供试品溶液中的L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸成分的含量。

进一步，包括以下步骤：

(1)精密称取L-酪氨酰甘氨酸6.16mg和L-色氨酸3.06mg置于100mL容量瓶中，加水溶解稀释，摇匀，定容，作为混合对照品储备液；

(2)上述对照品储备液按照检测需要可进一步稀释；

(3)吸取四味珍层冰硼滴眼液10mL，12,000r/min离心15min，取上清备用。

(4)HPLC所用色谱柱为：Agilent，Eclipse XDB-C18(3.0×150mm，3.5μm)；

(5)流动相，A相为0.1％三氟乙酸(TFA)-水，B相为0.085％三氟乙酸(TFA)+70％乙腈水溶液；

(6)采用梯度洗脱：

(7)流速：0.1～1.0mL/min；

(8)检测波长：200～300nm；

(9)进样量：5～50μL；

(10)柱温：20～40℃；

(11)理论塔板数按L-酪氨酰甘氨酸计算不低于3000。

(12)本品每ml含珍珠层粉以以L-酪氨酰甘氨酸(C₁₁H₁₄N₂O₄)计，不得少于0.99μg，以L-色氨酸(C₁₁H₁₂N₂O₂)计，不得少于0.46μg。

更进一步，包括以下步骤：

(1)精密称取L-酪氨酰甘氨酸6.16mg和L-色氨酸3.06mg置于100mL容量瓶中，加水溶解稀释，摇匀，定容，作为混合对照品储备液；

(2)精密量取对照品储备液适量，加水稀释成每1ml含L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸1.150—1.300μg，0.550—0.660μg的溶液，即得。

(3)吸取四味珍层冰硼滴眼液10mL，12,000r/min离心15min，取上清备用。

(4)HPLC所用色谱柱为：Agilent，Eclipse XDB-C18(3.0×150mm，3.5μm)；

(5)流动相，A相为0.1％三氟乙酸(TFA)-水，B相为0.085％三氟乙酸(TFA)+70％乙腈水溶液；

(6)采用梯度洗脱：

梯度洗脱程序表

(7)流速：0.4mL/min；

(8)检测波长：220nm；

(9)进样量：20μL；

(10)柱温：30℃；

(11)理论塔板数按L-酪氨酰甘氨酸计算不低于3000。

(12)本品每ml含珍珠层粉以以L-酪氨酰甘氨酸(C₁₁H₁₄N₂O₄)计，不得少于0.99μg，以L-色氨酸(C₁₁H₁₂N₂O₂)计，不得少于0.46μg。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明方法采用HPLC法测定四味珍层冰硼滴眼液中寡肽L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸的含量，该方法简便快速，专属性强，能够准确、稳定、快捷地测定四味珍层冰硼滴眼液中寡肽L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸的含量。该方法不仅有助于四味珍层冰硼滴眼液的质量控制，提高该产品的质量可控性。

本发明创造性分析：

珍视明滴眼液的主要成份珍珠层粉是由蚌科动物三角帆蚌Hyriopsis cumingii(Lea)、褶纹冠蚌Cristaria plicata(Leach)等贝壳的珍珠层经加工磨制成的粉末，是传统中药，收载于《中国药典》2015版一部，具有平肝潜阳，退翳等功效。珍珠层粉经过水解后，获得珍珠层粉水解液，从而使珍珠层粉中的有效成分更好地发挥作用。因此，为了能够更好的应用珍珠层动物药资源，阐明其药效的化学依据，有必要对其化学成分进行***的研究。本实验经过研究，基本确定了珍珠层中含有寡肽类等化学成份。

发明人对珍视明滴眼液进行分离纯化和结构鉴定，获得包括寡肽L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸在内的7个单体化合物，为珍视明滴眼液的特征性成份，为更好地控制珍视明滴眼液的质量，建立了珍视明滴眼液中特征性成份含量测定方法。

①液相色谱柱的选择是液相色谱分析的核心部分。本实验在色谱条件已经确定的条件下，对不同的色谱柱做了比较，结果表明：美国安捷伦公司出品的Eclipse XDB-C₁₈(3.0×150mm，3.5μm)色谱柱对珍视明滴眼液的分离效果较好。

②使用二极管阵列检测器对样品进行全波长扫描，并对各波长下的色谱图进行分析比较，确定了在220nm下检测到的峰的数目较多，各峰分离良好，特征峰明显且峰形较好，从图谱中可以尽可能的获取色谱组分信息以反应体系组成的全貌。

③分别采用不同流动相***不同梯度进行试验，结果表明以0.085％TFA+70％乙腈水溶液-0.1％TFA水线性梯度分离效果最好，基线最平稳。

附图说明

图1为L-酪氨酰甘氨酸对照品色谱图。

图2为L-色氨酸对照品色谱图。

图3为L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸对照品色谱图。

图4为四味珍层冰硼滴眼液含量测定色谱图。

图5为L-酪氨酰甘氨酸最低检测限色谱图。

图6为L-色氨酸最低检测限色谱图。

图7为L-酪氨酰甘氨酸最低定量限色谱图。

图8为L-色氨酸最低定量限色谱图。

具体实施方式

实施例1

四味珍层冰硼滴眼液中寡肽L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸的含量测定，该四味珍层冰硼滴眼液由以下成分制成：珍珠层粉提取液，天然冰片，硼酸、硼砂调pH值至7.4，氯化钠调渗透压至0.29Osmol/kg，乙醇，苯氧乙醇及注射用水。

1.实验仪器和试剂

高效液相色谱仪(1260，美国安捷伦)；YC-800层析实验冷柜(XMT608，北京亚星仪科科技发展有限公司)；微量台式冷冻离心机(FRESCO 17，赛默飞世尔科技公司)；超声仪(KQ-300E，昆山市超声仪器有限公司)；乙腈(色谱纯，美国天地有限公司)；甲醇(色谱纯，上海星可高纯溶剂有限公司)；三氟乙酸(TFA)(色谱纯，阿拉丁)；注射用水(申请人)；色谱柱(Eclipse XDB-C18，美国安捷伦)；保护柱(Utimate XB-C18，上海月旭公司)；移液枪(200μL、1000μL，美国艾本德公司)。

2.色谱条件

色谱柱为Agilent，Eclipse XDB-C18(3.0×150mm，3.5μm)。流动相为A相(0.1％TFA-水)，B相(0.085％TFA+70％乙腈水溶液)，采用梯度洗脱程序如下表2所示，流速：0.4mL/min，进样量：20μL，柱温：30℃，检测波长：220nm。

表2 四味珍层冰硼滴眼液梯度洗脱程序表

3.对照品溶液制备

精密称取L-酪氨酰甘氨酸6.16mg和L-色氨酸3.06mg置于100mL容量瓶中，加水溶解稀释，摇匀后，定容，其质量浓度分别为61.6μg/mL，30.6μg/mL，作为混合对照品储备液。

精密量取对照品储备液适量，加水稀释成每1ml含L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸1.232μg，0.612μg的溶液，即得。

4.供试品溶液制备

分别吸取各批次上述处方制备的四味珍层冰硼滴眼液10mL，12,000r/min离心15min，取上清备用。

5.专属性实验

5.1空白辅料影响实验

按处方称取本品空白辅料(硼砂、硼酸等)，置一定体积容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，吸取20μL注入液相色谱仪；结果空白辅料在此色谱条件下于主峰出峰时间内未见有峰出现，表明本品辅料对含量测定没有干扰。

5.2流动相影响实验

取20μL流动相注入液相色谱仪，记录色谱图，结果在主峰出峰时间未见有峰出现，表明流动相对含量测定无干扰。

6.检测限与定量限

精密称取对照品，加水溶解并等倍稀释制成一系列由高到低的梯度浓度溶液，分别进样。取信噪比为3(S/N＝3)时的进样浓度为最低检测浓度，由进样量20μL得出最低检测限(见图5和图6)。结果L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸的最低检测限分别为：0.091μg/mL，0.1052μg/mL。

取S/N＝10时的进样浓度为最低定量限(见图7和图8)。结果L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸的最低定量限分别为：0.1365μg/mL，0.1925μg/mL。

7.线性关系

分别精密吸取混合对照品储备液1.0mL，1.5mL，2.0mL，2.5mL，3.0mL置100mL容量瓶中，加水溶解稀释，摇匀后，定容，制成系列标准品溶液，其浓度分别为L-酪氨酰甘氨酸：0.616μg/mL，0.924μg/mL，1.232μg/mL，1.540μg/mL，1.848μg/mL；L-色氨酸：0.306μg/mL，0.459μg/mL，0.612μg/mL，0.765μg/mL，0.918μg/mL。按2.项下色谱条件进行实验，记录色谱图。

以峰面积Y为纵坐标，以L-酪氨酰甘氨酸或L-色氨酸进样浓度(μg/mL)为横坐标，得回归方程，L-酪氨酰甘氨酸：Y₁＝63.866X₂+0.8193，r²＝0.9998；L-色氨酸：Y₂＝450.39X₃-1.68，r²＝0.9997。

结果表明：L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸质量浓度分别在0.616～1.840μg/mL，0.306～0.918μg/mL有良好的线性关系。

8.精密度试验

取同一批次6份供试品溶液，按上述2.项下色谱条件，连续进样6次，记录L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸的峰面积，计算其峰面积的RSD，结果：L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸的RSD分别为0.64％，1.33％，表明仪器精密度良好。

9.重复性试验

取同一批次6份供试品溶液，按上述2.项下色谱条件进样测定，记录峰面积，测定待测成分的含量，结果L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸6次含量测定值的RSD在0.80％～0.93％，重复性良好。

10.稳定性试验

取同一批次6份供试品溶液，按上述2.项下色谱条件，分别于0h，2h，4h，8h，12h，24h进样，测定L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸的峰面积，计算其峰面积RSD值，结果RSD在1.10％～1.37％，表明供试品溶液在24h小时内稳定。

11.加样回收率试验

精密量取已知L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸含量(实际含量为L-酪氨酰甘氨酸：1.320μg/mL，L-色氨酸：0.630μg/mL)的同一批四味珍层冰硼滴眼液6份，每份5mL，分别精密加入上述7.项下混合对照品溶液(L-酪氨酰甘氨酸：1.232μg/mL，L-色氨酸：0.612μg/mL)5mL，以样品测定法测定，计算回收率：回收率(％)＝(测得量-本底量)/加入量×100％。结果，加样回收率测定项符合药典要求。

表3 L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸加样回收率试验

12.样品测定

分别取3批本实施例处方制备的四味珍层冰硼滴眼液各2mL，按上述2.项下色谱条件进样测定，每批样品平行测定2次，3批样品测定结果见下表4。

表4 实施例1四味珍层冰硼滴眼液样品测定结果

实施例2

四味珍层冰硼滴眼液中寡肽L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸的含量测定，该四味珍层冰硼滴眼液由以下成分制成：珍珠层粉提取液，天然冰片，硼酸、硼砂调pH值至7.3，氯化钠调渗透压至0.29Osmol/kg，乙醇，苯氧乙醇及注射用水。

1.实验仪器和试剂、色谱条件、对照品溶液制备同实施例1

2.供试品溶液制备

分别吸取各批次上述处方制备的四味珍层冰硼滴眼液10mL，12,000r/min离心15min，取上清备用。

3.专属性实验

3.1空白辅料影响实验

按处方称取本品空白辅料(硼砂、硼酸等)，置一定体积容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，吸取20μL注入液相色谱仪；结果空白辅料在此色谱条件下于主峰出峰时间内未见有峰出现，表明本品辅料对含量测定没有干扰。

取20μL流动相注入液相色谱仪，记录色谱图，结果在主峰出峰时间未见有峰出现，表明流动相对含量测定无干扰。

4.检测限与定量限、线性关系同实施例1

5.精密度试验

取同一批次6份供试品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，记录L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸的峰面积，计算其峰面积的RSD，结果：L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸的RSD分别为1.66％，1.73％，表明仪器精密度良好。

6.重复性试验

取同一批次6份供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，记录峰面积，测定待测成分的含量，结果L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸6次峰面积测定值的RSD在0.73％～1.02％，重复性良好。

7.稳定性试验

取同一批次6份供试品溶液，按上述2.项下色谱条件，分别于0h，2h，4h，8h，12h，24h进样，测定L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸的峰面积，计算其峰面积RSD值，结果RSD在0.097％～1.16％，表明供试品溶液在24h小时内稳定。

8.加样回收率试验

精密量取已知L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸含量(实际含量为L-酪氨酰甘氨酸：1.295μg/mL，L-色氨酸：0.600μg/mL)的同一批四味珍层冰硼滴眼液6份，每份5mL，分别精密加入实施例1中7.项下混合对照品溶液(L-酪氨酰甘氨酸：1.232μg/mL，L-色氨酸：0.612μg/mL)5mL，以样品测定法测定，计算回收率：回收率(％)＝(测得量-本底量)/加入量×100％。结果，加样回收率测定项符合药典要求。

表5 L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸加样回收率试验

9.样品测定

分别取3批本实施例处方制备的四味珍层冰硼滴眼液各2mL，按上述色谱条件进样测定，每批样品平行测定2次，3批样品测定结果见下表6。

表6 实施例2四味珍层冰硼滴眼液样品测定结果

此外，L-酪氨酰甘氨酸对照品色谱图如图1所示。L-色氨酸对照品色谱图如图2所示。L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸混合物对照品色谱图如图3所示。四味珍层冰硼滴眼液含量测定色谱图如图4所示。

需要说明的是，以上所述只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种四味珍层冰硼滴眼液中特征性成分含量测定方法，其特征在于，对四味珍层冰硼滴眼液进行分离纯化和结构鉴定，确定寡肽L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸在内的单体化合物为珍视明滴眼液的特征性成份，采用HPLC法测定四味珍层冰硼滴眼液中寡肽L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸的含量，通过控制特征性成份寡肽L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸的含量，能确保四味珍层冰硼滴眼液质量稳定均一，从而提高该产品的质量可控性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备：称取L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸适量，置于100mL容量瓶中，加水溶解稀释，摇匀，定容，作为混合对照品储备液；

(2)供试品溶液的制备：吸取四味珍层冰硼滴眼液，离心，取上清液，得供试品溶液；

(3)测定方法：采用高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照品溶液进行定量检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中还包括以下特征中的任意一项或多项：

(1)吸取四味珍层冰硼滴眼液的量为1.0～20.0mL；

(2)所述离心的速度是10,000～15,000r/min；

(3)所述离心温度为2～30℃。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，选择美国安捷伦公司出品的Eclipse XDB-C₁₈(3.0×150mm，3.5μm)色谱柱对四味珍层冰硼滴眼液的分离。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，使用二极管阵列检测器对样品进行全波长扫描，并对各波长下的色谱图进行分析比较，确定了在220nm下检测到的特征峰及峰形，获取色谱组分信息以反应体系组成的全貌。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，分别采用不同流动相***不同梯度进行试验，以0.085％TFA+70％乙腈水溶液-0.1％TFA水线性梯度分离。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述定量检测方法步骤包括：采用HPLC在相同色谱条件下分别测定供试品溶液和对照品溶液，将供试品溶液的色谱图与对照品溶液的色谱图比较，根据相对保留时间和特征峰，确认供试品溶液中L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸的特征峰。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述定量检测方法包括步骤：采用HPLC在相同色谱条件下分别测定供试品溶液和对照品溶液，按外标法以峰面积计算供试品溶液中的L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸成分的含量。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

(1)精密称取L-酪氨酰甘氨酸6.16mg和L-色氨酸3.06mg置于100mL容量瓶中，加水溶解稀释，摇匀，定容，作为混合对照品储备液；

(2)上述对照品储备液按照检测需要可进一步稀释；

(3)吸取四味珍层冰硼滴眼液10mL，12,000r/min离心15min，取上清备用。

(4)HPLC所用色谱柱为：Agilent，Eclipse XDB-C18(3.0×150mm，3.5μm)；

(5)流动相，A相为0.1％三氟乙酸(TFA)-水，B相为0.085％三氟乙酸(TFA)+70％乙腈水溶液；

(6)采用梯度洗脱：

(7)流速：0.1～1.0mL/min；

(8)检测波长：200～300nm；

(9)进样量：5～50μL；

(10)柱温：20～40℃；

(11)理论塔板数按L-酪氨酰甘氨酸计算不低于3000。

(12)本品每ml含珍珠层粉以以L-酪氨酰甘氨酸(C₁₁H₁₄N₂O₄)计，不得少于0.99μg，以L-色氨酸(C₁₁H₁₂N₂O₂)计，不得少于0.46μg。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于:

(1)精密称取L-酪氨酰甘氨酸6.16mg和L-色氨酸3.06mg置于100mL容量瓶中，加水溶解稀释，摇匀，定容，作为混合对照品储备液；

(2)精密量取对照品储备液适量，加水稀释成每1ml含L-酪氨酰甘氨酸和L-色氨酸1.150—1.300μg，0.550—0.660μg的溶液，即得。

(3)吸取四味珍层冰硼滴眼液10mL，12,000r/min离心15min，取上清备用。

(4)HPLC所用色谱柱为：Agilent，Eclipse XDB-C18(3.0×150mm，3.5μm)；

(5)流动相，A相为0.1％三氟乙酸(TFA)-水，B相为0.085％三氟乙酸(TFA)+70％乙腈水溶液；

(6)采用梯度洗脱：

梯度洗脱程序表

(7)流速：0.4mL/min；

(8)检测波长：220nm；

(9)进样量：20μL；

(10)柱温：30℃；

(11)理论塔板数按L-酪氨酰甘氨酸计算不低于3000。

(12)本品每ml含珍珠层粉以以L-酪氨酰甘氨酸(C₁₁H₁₄N₂O₄)计，不得少于0.99μg，以L-色氨酸(C₁₁H₁₂N₂O₂)计，不得少于0.46μg。