CN101784564B - B7-dc变体 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于共刺激T细胞(即增强T细胞的抗原特异性增殖、增强T细胞产生细胞因子、刺激T细胞的分化和效应子功能、和/或促进T细胞的存活)的组合物和方法。合适的组合物包含B7-DC多肽、其片段和融合蛋白。B7-DC变体多肽对于抑制性PD-I配体的亲和结合性降低，但基本上保留了共刺激T细胞的能力。本发明提供在需要刺激免疫应答的受试者中使用B7-DC变体多肽以刺激其免疫应答的方法。

Description

B7-DC变体

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2007年7月13日提交的U.S.S.N.60/949,785的权益和优先权。

技术领域

本发明涉及用于调节T细胞活化的组合物和方法，特别地，本发明涉及用于增强T细胞活化的组合物和方法。

政府支持

本发明是在美国国立卫生研究院资助号R01 CA85721的政府支持下完成的。美国政府享有本发明的一定权利。

背景技术

淋巴细胞的抗原特异性活化和增殖受到来自共刺激分子的正信号和负信号的调节。表征的最详尽的T细胞共刺激通路是B7-CD28，其中B7-1(CD80)和B7-2(CD86)可以分别结合刺激性CD28受体和抑制性CTLA-4(CD152)受体。在通过T细胞受体而进行信号传导时，B7-1与CD28的接合能增强T细胞的抗原特异性增殖，增强T细胞产生细胞因子，刺激T细胞的分化和效应子功能、和促进T细胞的存活(Lenshow，et al.，Annu.Rev.Immunol，14：233-258(1996)；Chambers and Allison，Curr.Opin.Immunol，9：396-404(1 997)；和Rathmell and Thompson，Annu.Rev.Immunol，17：78 1-828(1999))。相反，据认为通过CTLA-4的信号传递的却是能抑制T细胞的增殖、抑制IL-2的产生和抑制细胞周期进程的负信号(Krummel and Allison，J.Exp.Med.，183：2533-2540(1996)；和Walunas，et al.，J Exp.Med，183：2541-2550(1996))。B7族的其他成员包括B7-H1(Dong，et al.，Nature Med.，5：1365-1369(1999)；和Freeman，et al.，J Exp.Med.，192：1-9(2000))、B7-DC(Tseng，et al.，J.Exp.Med.，193：839-846(2001)；和Latchman，et al.，Nature Immunol.，2：261-268(2001))、B7-H2(Wang，et al.，Blood，96：2808-2813(2000)；Swallow，et al.，Immunity，11：423-432(1999)；和Yoshinaga，et al.，Nature，402：827-832(1999))、B7-H3(Chapoval，et al.，Nature Immunol.，2：269-274(2001))和B7-H4(Choi，et al.，J.Immunol.，171：4650-4654(2003)；Sica，et al.，Immunity，18：849-861(2003)；Prasad，et al.，Immunity，18：863-873(2003)；和Zang，et al.，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，100：10388-10392(2003))。B7-H1和B7-DC是PD-1的配体，B7-H2是ICOS的配体，目前B7-H3仍为孤儿配体(Dong，et al.，Immunol.Res.，28：39-48(2003))。

B7族分子在细胞表面表达为同型二聚体的形式，并且具有近膜恒定IgC结构域和远膜IgV结构域。这些配体的受体具有共同的胞外IgV样结构域。受体-配体对的相互作用主要通过配体和受体的IgV结构域中的残基来介导(Schwartz，et al.，Nature Immunol.，3：427-434(2002))。通常，IgV结构域被描述为双折叠层结构，每层均含有β链折叠层(Williams and Barclay，Annu.Rev.Immunol.，6：381-405(1998))。CTLA-4的前折叠层和后折叠层分别包含A’GFC’C链和ABEDC”链(Ostrov，et al.，Science，290：816-819(2000))，而B7IgV结构域的前折叠层和后折叠层分别由AGFCC’C”链和BED链构成(Schwartz，et al.，Nature，410：604-608(2001)；Stamper，et al.，Nature，410：608-611(2001)；以及Ikemizu，et al.，Immunity，12：51-60(2000))。晶体学分析表明CTLA-4/B7的结合界面由CTLA-4上的CDR3类似环(其由MYPPPY基序构成)和B7上的主要由G、F、C、C’和C”链形成的表面之间的相互作用来主导(Schwartz，et al.，(2001)，见上文；和Stamper，et al.，(2001)，见上文)。氨基酸同源性、突变和计算机模拟方面的数据提供了对于下列概念的支持：所述基序也是CD28与B7的主结合位点(Bajorath，et al.，J.Mol.Graph.Model.，15：135-139(1997))。尽管MYPPPY基序未存在于ICOS中，但是研究已表明具有序列FDPPPF并且位于类似位点的类似基序是ICOS与B7-H2结合的主要决定因素(Wand，et al.，J.Exp.Med.，195：1033-1041(2002))。

B7-DC(也称为PD-L2)是B7族的较新成员，其具有与B7-H1(也称为PD-L1)的同一性约为34％的氨基酸序列。人和鼠B7-DC同源物具有约70％的氨基酸同一性。虽然在各种组织中发现了B7-H1和B7-DC的转录产物(Dong，et al.(1999)，见上文；Latchman，et al.(2001)，见上文；和Tamura，Blood，97：1809-1816(2001))，但是这些蛋白的表达谱却十分不同。尽管在除了巨噬细胞样细胞之外的正常组织中基本上没有发现B7-H1蛋白的表达，但是B7-H1蛋白的表达能在多种组织和细胞类型中被诱导(Dong，et al.(1999)，见上文；Tamura，et al.(2001)，见上文；和Isbida，et al.，Immunol Lett.，84：57-62(2000))。相反，B7-DC只在树突状细胞和单核细胞中表达(Tseng，etal.(2001)，见上文；和Ishida，et al.(2000)，见上文)。

现已证明B7-H1和B7-DC均与PD-1(程序化细胞死亡-1)结合(Freeman，et al.，J.Exp.Med.，192：1027-1034(2000)；Tseng(2001)，见上文；Latchman(2001)，见上文)，所述PD-1为CD28族的远缘成员，并且在其细胞质结构域中具有免疫受体酪氨酸基抑制性基序(ITIM)(Ishida，et al.，EMBO J.，11：3887-3895(1992))。PD-1在胸腺细胞亚群上表达，并且在活化后对T细胞、B细胞和骨髓细胞进行上调(Agata，et al.，Int.Immunol.，8：765-772(1996))。对PD-1^-/-小鼠的表型分析提供了PD-1在体内是免疫应答的负调节物的直接证据。在缺乏PD-1时，具有C57BL/6背景的小鼠慢慢患上狼疮样肾小球性肾炎和进行性关节炎(Nishimura，et al.，Immunity，11：141-151(1999))。具有BALB/c背景的PD-1^-/-小鼠迅速患上致命的自体免疫性扩张性心肌病(Nishimura，et al.，Science.291：319-322(2001))。然而，大量证据表明B7-DC可以具有共刺激T细胞应答的功能。在次优TCR信号的存在下，B7-DC在体外刺激T细胞增殖和增强细胞因子产生(Tseng，et al.，J Exp.Med.193：839-846(2001))。另一方面，体外研究表明B7-DC在T细胞应答中具有负调节作用(Latchman(2001)，见上文)。对这些看起来矛盾的数据的最好解释是在T细胞上除了PD-1以外还表达有B7-DC的另外的受体的表达。

有利的是提供一种组合物，所述组合物能增强T细胞的抗原特异性增殖，增强T细胞产生细胞因子，刺激分化和效应子功能，和促进T细胞的存活。还有利的是提供B7-DC变体多肽，与野生型B7-DC相比，所述B7-DC变体多肽对于PD-1的亲和结合性降低，并且仍保留共刺激T细胞的能力(即增强T细胞的抗原特异性增殖、增强T细胞产生细胞因子、刺激T细胞的分化和效应子功能、或促进T细胞的存活)。

因此，本发明的目的是提供B7-DC变体多肽，与野生型B7-DC相比，所述B7-DC变体多肽对于PD-1的亲和结合性降低，并且仍保留共刺激T细胞的能力。

本发明的另一个目的是提供编码B7-DC变体多肽的分离的核酸分子。

本发明的另一个目的是提供包含载体的细胞，所述载体表达编码B7-DC变体多肽的核酸分子。

本发明的又一个目的是提供通过使T细胞与B7-DC变体多肽接触来共刺激T细胞的方法。

本发明的又一个目的是提供向需要的哺乳动物施用B7-DC变体多肽、施用编码B7-DC变体多肽的核酸、或施用由编码B7-DC变体多肽的核酸转染或转导的细胞的方法。

本发明的又一个目的是提供通过将B7-DC变体多肽与抗原或疫苗联合施用，来加强对该抗原或疫苗的免疫应答的方法。

发明概述

本发明提供用于共刺激T细胞(即增强T细胞的抗原特异性增殖、增强T细胞产生细胞因子、刺激T细胞的分化和效应子功能、和/或促进T细胞的存活)的组合物和方法。合适的组合物包括B7-DC变体多肽。B7-DC变体多肽对于抑制性PD-I配体的亲和结合性降低，但基本上保留了共刺激T细胞的能力。在某些实施方案中，B7-DC变体多肽可包含(但不限于)在鼠或人B7-DC的A’β链的33位、Bβ-链的39或41位、Cβ-链的56或58位、C’β-链的65或67位、C”β-链的71或72位、Dβ-链的84位、Eβ-链的88位、Fβ-链的101、103或105位、或者Gβ-链的111、113或116位的置换、缺失或***。

本发明还提供B7-DC变体多肽的片段和包含B7-DC变体多肽的融合蛋白。在一些实施方案中，B7-DC变体多肽的片段包括可溶性片段，所述可溶性片段包括胞外域或其片段。其他合适的B7-DC变体多肽的片段包括含有IgV和IgC结构域的片段或仅含有IgV结构域的片段。B7-DC变体多肽及其片段可以与其他多肽连接以形成融合蛋白。本发明提供B7-DC变体融合多肽，其具有包含B7-DC变体多肽的全部或一部分的第一融合伴侣，所述第一融合伴侣(i)与第二多肽直接融合，或者(ii)可任选地，与和第二多肽融合的接头肽序列融合。融合伴侣的存在能够改变B7-DC变体多肽的溶解性、亲和性和/或效价。在某些实施方案中，B7-DC变体多肽与Ig重链恒定区的一个或多个结构域融合，所述恒定区优选具有对应于人免疫球蛋白Cγ1链的铰链区、C_H2区和C_H3区的氨基酸序列。

本发明还提供编码B7-DC变体多肽和B7-DC变体融合蛋白的核酸以及包含存在于载体中的这种核酸的宿主细胞。

本发明还提供包含B7-DC变体多肽和B7-DC变体融合蛋白的免疫原性组合物。免疫原性组合物包含抗原、B7-DC变体多肽源以及可任选的助剂和靶分子。合适的抗原包括病毒、细菌、寄生虫、环境抗原和肿瘤抗原。

本发明还提供使用B7-DC变体多肽和B7-DC变体融合蛋白以共刺激T细胞的方法。可以在体外、离体或体内用B7-DC变体组合物来共刺激T细胞。使用B7-DC变体组合物共刺激T细胞可以在T细胞的抗原特异性活化之前、之中、或之后进行。

本发明提供B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白、和编码它们的核酸的治疗用途。B7-DC变体组合物可用于刺激针对癌症和传染病(包括病毒感染)的免疫应答。B7-DC变体组合物还可用于刺激针对免疫受抑制的受试者的免疫应答。在某些实施方案中，B7-DC变体组合物与疫苗联合施用。

下面结合附图和下文的内容将详细阐述本发明的一个或多个实施方案。从该说明书、附图以及从权利要求书中，本发明的其他特征、目的和优点将显而易见的。

附图简要说明

图1示出人B7-DC(hB7-DC)的全长未成熟的氨基酸序列(SEQID NO：1)。人B7-DC的信号序列包含该全长未成熟的氨基酸序列的最初19个氨基酸。

图2示出小鼠B7-DC(mB7-DC)的全长未成熟的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。小鼠B7-DC的信号序列包含该全长未成熟的氨基酸序列的最初19个氨基酸。

图3示出编码全长未成熟的人B7-DC多肽(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)，其中所述人B7-DC多肽具有图1所示的氨基酸序列。人B7-DC的信号序列由该全长未成熟的核酸序列的最初57个核苷酸编码。

图4示出编码全长未成熟的小鼠B7-DC多肽(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)，其中所述小鼠B7-DC多肽具有图2所示的氨基酸序列。小鼠B7-DC的信号序列由该全长未成熟的核酸序列的最初57个核苷酸编码。

图5示出小鼠和人B7分子的结构取向的序列比对。比对序列包括下列蛋白序列：人CD86(hCD86)(SEQ ID NO：5)、人CD80(hCD80)(SEQ ID NO：6)、人B7-H1(hB7-H1)(SEQ ID NO：7)、小鼠B7-H1(m B7-H1)(SEQ ID NO：8)、人B7-H2(h B7-H2)(SEQ ID NO：9)、人B7-H3(hB7-H3)(SEQ ID NO：10)、人B7-DC(hPD-L2)(SEQ ID NO：11)、小鼠B7-DC(mPD-L2)(SEQ ID NO：12)的N-末端IgV结构域。在CDS0和CD86的X射线结构中观测到的β链被做标记(A′-G)，B7族内最保守的残基位置(例如，较大的疏水性、带电的/极性、或半胱氨酸残基)以阴影标示。用方框框出潜在的N-连结的糖基化位点。CD86中斜体所示的残基在CD80中保守参与结晶性同型二聚体界面的形成，粗斜体所示的残基在与CTLA-4形成的复合体结构中参与和CTLA-4的结合。基于突变研究，用下划线和粗体标出了对于PD-1结合最为重要的mB7-H1和mB7-DC中的残基位置。圆圈示出了当突变时显示出对于PD-1而言增强的亲和力的mB7-H1中的残基。数字表示了mB7-H1(上排数字)和mB7-DC(下排数字)内残基的位置。

图6示出与PD-1结合的B7-DC的表面等离子共振分析结果的曲线图。该图示出野生型B7-DCIg和K113S B7-DCIg变体与固定化的PD-1Ig结合的结果。数据以应答单位(RU)作为以秒为单位的时间的函数的形式记录。

图7是示出野生型和变体型B7-DCIg融合蛋白与表达PD-1的CHO细胞结合情况的一系列图。B7-DCIg融合蛋白与所示野生型或变体型B7-DC融合蛋白一起温育，然后与FITC标记的山羊抗人IgG温育并经FACS分析。培养基本身和人IgG被用作阴性对照，抗人PD-1抗体被用作阳性对照。所示曲线标示细胞数作为发射的荧光水平的函数。曲线右侧和左侧的数字表示分别被认为与所示组合物的结合是阳性结果和阴性结果的细胞的百分率。

图8A和8B是示出野生型和变体型B7-DC分子对T细胞共刺激的效果的图。图8A中数据表示在所示浓度下的包覆到96孔板的孔底上的抗CD3mAb存在下，用所示野生型(-◇-)或变体型(-■-D111；-x-K113)B7-DC Ig融合蛋白刺激后T细胞的增殖情况。以³H-胸腺嘧啶核苷(³H-TdR)(×10³cpm)的掺入量作为抗CD3mAb浓度(μg/ml)的函数来测量T细胞增殖。人Ig(hIg)(-o-)和PBS(-▲-)本身被用作共刺激分子的阴性对照。该数据来自三个实验中的有代表性的一个。图8B中数据表示在所示Ig融合蛋白(■野生型；□D111；□K113)和抗-CD3存在下培养48或72小时，T细胞的IFN-γ分泌情况(ng/ml)。人Ig(□)和PBS(□)被用作阴性对照。该数据来自三个实验中的有代表性的一个。

图9示出在抗CD3mAb存在下与所示野生型(-●-)或变体型(-△-D111；-x-K113)B7-DC Ig融合蛋白温育后，PD-1^-/-T细胞增殖的曲线图。以³H-胸腺嘧啶核苷(³H-TdR)(×10³cpm)的掺入量作为抗CD3mAb浓度(μg/ml)的函数来测量T细胞增殖。人Ig(■)和PBS(-o-)被用作阴性对照。该数据来自三个实验中的有代表性的一个。

图10示出EG7小鼠肿瘤细胞在具有免疫活性的纯系小鼠(C57BL/6)中的生长(肿瘤平均直径(毫米))与时间(天)的函数的线性图，所述肿瘤细胞或者是用空载体转染的(-□-)、或者是用野生型B7-DC转染的(-■-)、或者是用K113S B7-DC(-●-)转染的。

图11示出EG7小鼠肿瘤细胞在免疫缺陷型裸鼠(nu/nu)中的生长(肿瘤平均直径(毫米))与时间(天)的函数的线性图，所述肿瘤细胞或者是用空载体转染的(-□-)、或者是用野生型B7-DC转染的(-■-)、或者是用K113S B7-DC(-●-)转染的。

图12示出小鼠P815巨大细胞瘤肿瘤细胞在具有免疫活性的纯系小鼠(DBA/2)中的生长(肿瘤平均直径(毫米))与时间(天)的函数的线性图，所述肿瘤细胞或者是用空载体转染的(-□-)、或者是用野生型B7-DC转染的(-■-)、或者是用K113S B7-DC(-●-)转染的。

图13示出小鼠P815巨大细胞瘤肿瘤肿瘤细胞在免疫缺陷型裸鼠(nu/nu)中的生长(肿瘤平均直径(毫米))与时间(天)的函数的线性图，所述肿瘤细胞或者是用空载体转染的(-□-)、或者是用野生型B7-DC转染的(-■-)、或者是用K113S B7-DC(-●-)转染的。

图14示出小鼠P815巨大细胞瘤肿瘤细胞在具有免疫活性的纯系小鼠(DBA/2)中的生长(肿瘤平均直径(毫米))与时间(天)的函数的线性图，该图显示了腹腔内注射野生型B7-DCIg的效果。在第3天和第8天给小鼠腹腔内注射0.1mg的对照Ig(-□-)或野生型B7-DC Ig(-■-)。

发明详述

I.定义

本文中使用的术语“分离的”用来描述将目标化合物(例如，多核苷酸或多肽)从其天然环境中分离，使得所述目标化合物处于不同于化合物天然所存在的环境中，例如，将肽浓缩至天然未发现的浓度，而将其从天然环境中分离出来。“分离的”是指包含这样的化合物，其是样品中的目标化合物被基本上富集得到，和/或目标化合物被部分地或基本上纯化而得到。

本文中使用的术语“多肽”指任何长度的氨基酸链，不管该氨基酸链是否被修饰(例如，磷酸化修饰或糖基化修饰)。

本文中使用的“共刺激性多肽”是指这样的多肽，其在与T细胞上的细胞表面分子相互作用时，与不和共刺激性多肽接触的T细胞相比，该多肽增强T细胞应答、增强T细胞的增殖、增强T细胞产生和/或分泌细胞因子、刺激T细胞的分化和效应子功能、或促进T细胞的存活。

与对应的野生型多肽的氨基酸序列相比，本文中使用的“变体”多肽包含至少一个氨基酸序列改变。

本文中使用的“氨基酸序列改变”可以是(例如)一个或多个氨基酸置换、缺失或***。

本文中使用的“载体”是指复制子(例如，质粒、噬菌体或粘粒)，可将另外的DNA片段***该载体中以使该***片段得以复制。此处所述的载体可以是表达载体。

本文中使用的“表达载体”是指包含一个或多个表达控制序列的载体。

本文中使用的“表达控制序列”是指控制和调节另外的DNA序列的转录和/或翻译的DNA序列。

本文中使用的“可操作地连接”是指引入到基因构建体中，使得表达控制序列有效地控制目标编码序列的表达。

本文中使用的多肽“片段”是指多肽的任何亚型，该片段是全长蛋白中较短的多肽。通常，片段具有五个或更多个氨基酸的长度。

本文中使用的“效价”是指每个分子中可用的结合位点的数量。

本文中使用的“保守”氨基酸置换是指具有相似的结构或化学性能的氨基酸的置换。

本文中使用的“非保守”氨基酸置换是指那些被置换的氨基酸的电荷、疏水性或体积显著地改变的置换。

本文中使用的“分离的核酸”是指与哺乳动物基因组中存在(包括在哺乳动物基因组中通常位于该核酸的一侧或两侧)的其他核酸分子(例如编码非B7-DC蛋白的核酸)分离开而得到的核酸。

本文中术语“分离的”在针对核酸使用时，包括任何非天然存在的核酸序列，因为所述非天然存在的核酸序列在天然中找不到并且不具有天然存在的基因组中的直接邻接序列。

本文中使用的术语“宿主细胞”是指可以向其中引入重组表达载体的原核和真核细胞。

本文中使用的“转化”和“转染”包括通过本领域已知的多种技术将核酸(例如，载体)引入细胞。

本文中使用的术语“抗体”是指包括含有抗原结合位点的完整分子及其片段。所述抗体包括Fab和F(ab’)₂片段，它们没有完整抗体中的Fc片段。

本文中使用的术语“个体”、“宿主”“受试者”和“患者”可以相互替换，其是指哺乳动物，包括(但不限于)鼠类、猿猴类、人、哺乳类家畜、哺乳类运动性动物(sport animal)和哺乳类宠物。

本文中使用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或减轻一种或多种待治疗的炎症反应或自身性免疫疾病状态的症状的剂量，或者足以提供所需的药理和/或生理的效果的剂量。精确的剂量随各种因素，例如受试者依赖性变量(例如年龄、免疫***健康状况等)、疾病和所实施的治疗而变化。

II.组合物

A.分离的B7-DC多肽

1.B7-DC变体多肽

本文中公开了分离的B7-DC多肽。B7-DC多肽可以来源自任何物种。在一个实施方案中，B7-DC多肽源自哺乳动物种。在优选的实施方案种，B7-DC多肽源自小鼠或人。图2示出小鼠B7-DC的全长未成熟的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。小鼠B7-DC的信号序列包含全长未成熟的氨基酸序列的最初19个氨基酸。图1示出人B7-DC的全长未成熟的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。人B7-DC的信号序列包含全长未成熟的氨基酸序列的最初19个氨基酸。本文中使用的术语“多肽”是指不管是否被修饰(例如，磷酸化修饰或糖基化修饰)的任何长度的氨基酸链。

在一个实施方案中，B7-DC变体多肽的生物活性和野生型B7-DC的活性相同、基本上相同或者不同。活性基本上相同是指其保留了共刺激T细胞的能力。

本文中公开的多肽包括B7-DC变体多肽。与相应的野生型多肽的氨基酸序列相比，本文中使用的“变体”多肽包含至少一个氨基酸序列改变。氨基酸序列改变可以是(例如)一个或多个氨基酸的置换、缺失或***。

B7-DC变体多肽可以具有氨基酸的置换、缺失或***的任意组合。在一个实施方案中，分离的B7-DC变体多肽具有整数个氨基酸改变，使得其氨基酸序列与野生型B7-DC多肽的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％的一致性。在优选的实施方案中，B7-DC变体多肽与野生型小鼠或野生型人B7-DC多肽的氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％或100％的一致性。

序列一致性百分比可以使用计算机程序或者直接序列比较来计算。确定两个序列的一致性的优选的计算机程序方法包括(但不限于)GCG程序包法、FASTA法、BLASTP法和TBLASTN法(参见，例如，D.W.Mount，2001，B ioinformatics：Sequence and GenomeAnalysis，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。BLASTP和TBLASTN程序可以从NCBI和其他来源公开地获得。熟知的Smith Waterman算法也可以用于确定一致性。

氨基酸序列比较的示例性参数包括：1)Needleman和Wunsch算法(J.Mol Biol.，48：443-453(1970))；2)Hentikoff和Hentikoff的比较矩阵BLOSSUM62(Proc.Natl Acad Sci U.S.A.，89：10915-10919(1992))；3)空位罚分＝12；4)空位长度罚分＝4。具有上述参数的可用程序以“空位”程序的形式可公开地获得(Genetics Compute Group，Madison，Wis.)。上述参数是用于多肽比较的默认参数(对末端空位无罚分)。

或者，多肽序列一致性可以用下面等式计算：一致性％＝(一致残基数)/(氨基酸残基比对长度)×100。对于该计算，比对长度包括内部空位但不包括末端空位。

B7-DC多肽在的氨基酸置换可能是“保守的”或“非保守的”。

本文中使用的“保守的”氨基酸置换是指具有相似的结构或化学性能的氨基酸的置换，“非保守的氨基酸置换是指那些被置换的氨基酸的电荷、疏水性或体积显著地改变的置换。非保守置换在下列方面的效果上具有明显的差别：保持(a)置换区域中的肽链的结构，例如折叠或螺旋构型，保持(b)目标位点的分子的电荷或者疏水性，或保持(c)侧链的体积。

保守氨基酸置换的例子包括在下面五组中的一组内的置换：1)小分子脂肪族、非极性或弱极性残基(丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸)；2)极性、带负电残基和其酰胺(天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷酰胺)；极性、带正电残基(组氨酸、精氨酸、赖氨酸)；大分子脂肪族、非极性残基(蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸)；以及大分子芳族残基(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)。非保守氨基酸残基置换的例子包括1)亲水性残基(例如，丝氨酸残基或苏氨酸残基)置换(或被置换为)疏水性残基(例如，亮氨酸残基、异亮氨酸残基、苯丙氨酸残基、缬氨酸残基或丙氨酸残基)；2)半胱氨酸或脯氨酸置换(或被置换为)任何其他残基；3)具有正电荷的侧链残基(例如，赖氨酸残基、精氨酸残基或组氨酸残基置换(或被置换为)带负电荷的侧链残基(例如，谷氨酸残基或天冬酰胺残基)；或4)具有大分子侧链残基(例如，苯丙氨酸)置换(或被置换为)无侧链残基(例如，甘氨酸)。

B7族分子(包括B7-DC)在细胞表面表达为同型二聚体的形式，并且具有近膜恒定IgC结构域和远膜IgV结构域。这些配体的受体具有共同的胞外IgV样结构域。受体-配体对的相互作用主要通过配体和受体的IgV结构域中的残基来介导。通常，IgV结构域被描述为双折叠层结构，每层均含有β链折叠层。该β-链被称为A’、B、C、C’、C”、D、E、F和G。在一个实施方案中，B7-DC变体多肽在上述β-链的一个或多个中包含任何可能组合的氨基酸改变(即，置换、缺失或***)。在另一个实施方案中，B7-DC变体在A’、B、C、C’、C”、D、E、F或Gβ-链中包含一个或多个氨基酸改变(即，置换、缺失或***)。在优选的实施方案中，B7-DC变体在Gβ-链中包含一个或多个氨基酸改变。

对于小鼠B7-DC或人B7-DC，B7-DC变体多肽可包括(但不限于)在A’β-链的33位、Bβ-链39或41位、Cβ-链的56或58位、C’β-链的65或67位、C”β-链的71或72位、Dβ-链的84位、Eβ-链的88位、Fβ-链的101、103或105位、Gβ-链的111、113或116位的置换、缺失或***。

在一个实施方案中，B7-DC变体多肽包含在33位的置换(例如，丝氨酸置换33位的天冬氨酸)、在39位的置换(例如，酪氨酸置换39位的丝氨酸)、在41位的置换(例如，丝氨酸置换41位的谷氨酸)、在56位的置换(例如，丝氨酸置换56位的精氨酸)、在58位的置换(例如，酪氨酸置换58位的丝氨酸)、在65位的置换(例如，丝氨酸置换65位的天冬氨酸)、在67位的置换(例如，酪氨酸置换67位的丝氨酸)、在71位的置换(例如，丝氨酸置换71位的谷氨酸)、在72位的置换(例如，丝氨酸置换72位的精氨酸)、在84位的置换(例如，丝氨酸置换84位的赖氨酸)、在88位的置换(例如，丙氨酸置换88位的组氨酸)、在101位的置换(例如，丝氨酸置换101位的精氨酸)、在103位的置换(例如，丙氨酸置换103位的亮氨酸)、在105位的置换(例如，丙氨酸置换105位的异亮氨酸)、在111位的置换(例如，丝氨酸置换111位的天冬氨酸)、在113位的置换(例如，丝氨酸置换113位的赖氨酸)、或在116位的置换(例如，酪氨酸置换116位的苏氨酸)。

然而，可以理解，所述氨基酸位置上的置换可以使用任何氨基酸或氨基酸类似物。例如，在所述位置上的置换可以使用任何天然存在的氨基酸(例如，丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸)。

虽然这里所述的置换是针对小鼠和人B7-DC而言的，但是请注意本领域技术人员能够容易地对其他物种(例如，大鼠、仓鼠、豚鼠、沙鼠、野兔、狗、猫、马、猪、羊、牛或非人灵长类)的相应的多肽进行等同的改变。

2.B7-DC变体多肽的性能

本发明公开的分离的B7-DC多肽具有共刺激T细胞的能力。“共刺激性多肽”是指这样的多肽，其在与T细胞上的细胞表面分子相互作用时，与不和共刺激性多肽接触的T细胞相比，该多肽增强T细胞应答、增强T细胞的增殖、增强T细胞产生和/或分泌细胞因子、刺激T细胞的分化和效应子功能、或促进T细胞的存活。源自该相互作用的T细胞应答一般要比不存在共刺激性多肽时的应答更强。不存在共刺激性多肽时的T细胞应答可能是没有应答或者可能是应答比存在共刺激性多肽下的应答显著地降低。T细胞的应答可能是效应子(例如，CTL或产生抗体的B细胞)应答、或者是为一个或多个效应子(例如，CTL或产生抗体的B细胞)应答提供帮助的辅助T细胞应答、或者是抑制性应答。

与相应的野生型B7-DC多肽的亲和结合性相比，本文中公开的B7-DC变体多肽对于PD-1的亲和结合性降低。与相应的野生型B7-DC多肽的亲和结合性相比，变体的亲和结合性通常降低至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、99％、或多于99％。

测量两个分子间的亲和结合性的方法是本领域熟知的。测量B7-DC变体多肽对PD-1的亲和结合性的方法包括(但不限于)荧光活化细胞分拣法(FACS)、表面等离子体共振法、荧光各向异性法、亲和层析法和亲和选择性质谱法。

此外，公开的B7-DC变体多肽对PD-1的亲和结合性降低，但基本上保留了共刺激活性。例如，B7-DC变体多肽可以具有相应的野生型B7-DC多肽所表现出的至少20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、90％、100％、或大于100％的共刺激活性水平。

测量T细胞共刺激的方法是本领域熟知的，其包括测量T细胞的增殖和细胞因子的分泌，所述细胞因子包括(但不限于)II-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13和IFN-γ。T细胞的增殖可以通过许多方法测量，包括(但不限于)细胞计数法、通过摄取标记的核苷酸(例如[³H]TdR和BrdU)测量DNA合成的方法、以及使用四唑鎓盐测量代谢活性的方法。测量细胞因子分泌的方法包括(但不限于)ELISA法。

3.B7-DC变体多肽的片段

本文公开的B7-DC多肽可以是全长多肽，也可以是全长B7-DC多肽的片段。本文中使用的B7-DC片段是指多肽的任何亚群，所述亚群是比全长蛋白短的多肽。

在一个实施方案中，B7-DC变体多肽片段是那些保留了共刺激T细胞的能力的片段。作为全长B7-DC的片段的B7-DC变体多肽通常具有全长B7-DC变体多肽的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、100％、或甚至大于100％的共刺激活性。

人和鼠B7-DC蛋白包含较短的细胞质间结构域、单一一个跨膜结构域和胞外域。胞外域包含两个Ig结构域：近膜IgC结构域和远膜IgV结构域。B7-DC变体多肽的有用片段包括可溶性片段。可溶性B7-DC片段是可从生产细胞流出、分泌或提取出的B7-DC片段。在一个实施方案中，B7-DC变体多肽片段包括B7-DC的整个胞外域。B7-DC胞外域包括来自小鼠或人B7-DC或它们的共刺激性片段的约26位氨基酸至约226位氨基酸。在另一个实施方案中，B7-DC变体多肽片段包含B7-DC的IgC和IgV结构域。在另一个实施方案中，B7-DC变体多肽片段包含B7-DC的IgV结构域。

在一个实施方案中，B7-DC变体多肽片段可包含对PD-1亲和结合性而言重要的多肽区域。这些多肽片段可用于与PD-1竞争结合并防止天然B7-DC与PD-1结合。通过与PD-1竞争结合，这些片段可用于增强免疫应答，因为由于可防止B7-H1和B7-DC与PD-1的抑制性相互作用而产生的免疫应答抑制。可与PD-1竞争结合的小鼠或人B7-DC的多肽片段可以包含(例如)67-71、101-105或111-113位的氨基酸。与在不存在所述片段的情况下B7-DC与PD-1的结合水平相比，所述B7-DC与PD-1的结合通常被抑制至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、或大于95％。

4.修饰的B7-DC变体多肽

B7-DC变体多肽可通过在正常细胞环境的多肽中存在的化学基团所修饰，例如磷酸化、甲基化、酰胺化、硫酸化、酰基化、糖基化、SUMO化(sumoylation)和泛素化(ubiquitylation)。B7-DC变体多肽还可由能够提供可检测的信号的标记物直接地或间接地修饰，所述标记包括(但不限于)放射性同位素和荧光化合物。

B7-DC变体多肽还可由通常不在细胞环境中添加到多肽中的化学基团所修饰。所述修饰可通过使多肽的目标氨基酸残基和能够与所选侧链或末端残基反应的有机衍生试剂反应来引入分子中。另一种修饰是蛋白的环化。

多肽的化学衍生物的例子包括赖氨酰残基和氨基末端残基与由琥珀酸或其他羧酸酸酐反应衍生的物质。与环状羧酸酸酐反应的衍生物具有逆转赖氨酰残基的电荷的作用。其他合适的用于衍生含氨基的残基的试剂包括：亚氨酸酯(例如甲基吡啶亚氨酸甲酯(Methylpicolinimidate))、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯氢硼化物(chloroborohydride)、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2，4-戊二酮、以及与乙醛酸的转氨酶催化反应。羧基侧基(例如天冬氨酰基或谷氨酰基)可通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R’)反应来进行选择性修饰，所述碳二亚胺例如为1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，天冬氨酰残基或谷氨酰残基可通过与氨反应而转化为天冬氨酰胺残基和谷氨酰胺残基。多肽还可包括置换了一个或多个L氨基酸的一个或多个D氨基酸。

5.B7-DC变体融合多肽

本文公开的B7-DC变体多肽可与其他多肽结合以形成融合蛋白。本发明提供B7-DC变体融合多肽，其具有包含B7-DC变体多肽的全部或一部分的第一融合伴侣，所述第一融合伴侣(i)与第二多肽直接融合，或者(ii)可任选地，与和第二多肽融合的接头肽序列融合。融合伴侣的存在能够改变B7-DC变体多肽的溶解性、亲和性和/或效价。本文中使用的“效价”是指每个分子中可用的结合位点的数量。本文公开的B7-DC变体融合蛋白包括氨基酸改变(即，置换、缺失或***)、B7-DC的片段和/或上述修饰的任意组合。在一个实施方案中，B7-DC变体融合蛋白包含B7-DC蛋白或其共刺激性片段的胞外域作为第一结合伴侣。在另一个实施方案中，B7-DC变体融合蛋白包含B7-DC蛋白的IgV和IgC结构域作为第一结合伴侣。在另一个实施方案中，B7-DC变体融合蛋白包含B7-DC蛋白的IgV结构域作为第一结合伴侣。

第二结合伴侣多肽可以是相对于B7-DC变体多肽的N-末端或C-末端。在优选的实施方案中，该第二多肽是B7-DC变体多肽的C-末端。

大量常规用作融合蛋白结合伴侣的多肽序列是本领域熟知的。有用的结合伴侣多肽的例子包括(但不限于)绿色荧光蛋白(GFP)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、聚组氨酸、myc、血球凝集素、Flag^TM标签(Kodak，New Haven，CT)、麦芽糖E结合蛋白以及蛋白A。在一个实施方案中，B7-DC变体融合蛋白与Ig重链恒定区的一个或多个结构域融合，所述结构域优选具有对应于人免疫球蛋白Cγ1链的铰链区、C_H2区和C_H3区的氨基酸序列。

B.分离的核酸分子

本文公开了编码B7-DC变体多肽的分离的核酸序列。本文中使用的“分离的核酸”是指与哺乳动物基因组中存在(包括在哺乳动物基因组中通常位于该核酸的一侧或两侧)的其他核酸分子(例如编码非B7-DC蛋白的核酸)分离开而得到的核酸。本文中在针对核酸使用的术语“分离的”，还包括任何非天然存在的核酸序列，因为所述非天然存在的核酸序列在天然中找不到并且不具有天然存在的基因组中的直接邻接序列。

分离的核酸可以是(例如)DNA分子，只要在天然存在的基因组中直接位于该DNA分子两翼的核酸序列中的一个被移除或不存在即可。因此，分离的核酸包括(但不限于)作为独立于其他序列(例如，化学合成的核酸、或通过PCR或限制性核酸内切酶处理而制备的cDNA片段或者基因组DNA片段)而单独存在的DNA分子、以及被引入载体、自主复制质粒、病毒(例如，逆转录酶病毒、慢病毒、腺病毒或疱疹病毒)、或被引入原核细胞或真核细胞的基因组DNA中的重组DNA。此外，分离的核酸可包括人造核酸，例如作为杂交或融合核酸的一部分的重组DNA分子。与在(例如)cDNA文库或基因组文库、或在凝胶切片中包含的基因组DNA限制性消化片段中存在的几百到几百万的其他核酸一起存在的核酸不认为是分离的核酸。

核酸可以是正义方向或是反义方向，也可以是与编码B7-DC多肽的参比序列互补的。参比序列包括(例如)图3中给出的人B7-DC的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)和图4中给出的小鼠B7-DC的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)，所述人B7-DC的核苷酸序列编码具有图1给出的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的全长未成熟的B7-DC，所述小鼠B7-DC的核苷酸序列编码具有图2给出的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的全长未成熟的B7-DC。

核酸可以是DNA、RNA或核酸类似物。核酸类似物可以在碱基部分、糖部分或磷酸酯骨架处被修饰。所述修饰能够提高(例如)核酸的稳定性、杂交性或溶解性。在碱基处修饰可包括将脱氧胸腺嘧啶核苷修饰为脱氧尿苷以及将脱氧胞嘧啶核苷修饰为5-甲基-2’-脱氧胞嘧啶核苷或5-溴-2’-脱氧胞嘧啶核苷。糖部分的修饰可包括将核糖的2’羟基进行修饰以形成2′-O-甲基糖或2′-O-烯丙基糖。脱氧核糖磷酸酯骨架能够被修饰以产生吗啉核酸(其中各碱基部分与六元吗啉环连接)或肽核酸(其中脱氧磷酸酯骨架被假肽骨架替代，但四种碱基仍被保留)。例如参见Summerton and Weller(1997)Antisense NucleicAcid Drug Dev.7：187-195、和Hyrup et al.(1996)Bioorgan.Med.Chem.4：5-23。此外，脱氧磷酸酯骨架能够被(例如)硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯骨架、亚磷酰胺(phosphoroamidite)、或烷基磷酸三酯骨架所替代。

C.载体和宿主细胞

核酸(例如上面所述核酸)能够被***到用于在细胞中进行表达的载体里。本文中使用的“载体”是指复制子(例如，质粒、噬菌体或粘粒)，可将另外的DNA片段***该载体中以使该***片段得以复制。此处所述的载体可以是表达载体。“表达载体”是指包含一个或多个表达控制序列的载体。“表达控制序列”是指控制和调节另外的DNA序列的转录和/或翻译的DNA序列。

可将载体中的核酸与一个或多个表达控制序列可操纵地连接。本文中使用的“可操作地连接”是指引入到基因构建体中，使得表达控制序列有效地控制目标编码序列的表达。表达控制序列的例子包括启动子、增强子和转录终止区。启动子是一种表达控制序列，由DNA分子的、通常是转录起始位点(一般接近于RNA聚合酶II起始位点)上游100个核苷酸以内的区域构成。为了将编码序列置于启动子的控制下，必需将多肽的翻译读码框的翻译起始位点置于启动子下游1到约50个核苷酸之内。增强子提供表达时间、位点和水平方面的特异性。与启动子不同，增强子当其位于离转录位点不同的距离处时都能够发挥功能。增强子还能够位于转录起始位点的下游。当RNA聚合酶能够将编码序列转录成mRNA，然后再被翻译为由编码序列编码的蛋白的情况下，该编码序列被认为在细胞中是“可操作地连接的”并且是“在表达控制序列的控制下”的。

合适的表达载体包括(但不限于)质粒和病毒载体，这些质粒和病毒载体源于(例如)噬菌体、棒状病毒、烟草花叶病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、逆转录酶病毒、牛痘病毒、腺病毒和腺相关病毒。许多病毒和表达***是可以自公司商购的，如Novagen公司(Madison，WI)、Clontech公司(Palo Alto，CA)、Stratagene公司(La Jolla，CA)和Invitrogen Life Technologies公司(Carlsbad，CA)。

表达载体可以包括标签序列。一般，标签序列以具有被编码的多肽的融合体形式而得以表达。上述标签可以***多肽中的任何地方，包括羧基或氨基末端。有用的标签的例子包括(不限于)绿色荧光蛋白(GFP)，谷胱甘肽硫转移酶(GST)、聚组氨酸、c-myc、血球凝集素、Flag^TM标记(Kodak，New Haven，CT)、麦芽糖E结合蛋白以及蛋白A。在一个实施方案中，B7-DC变体融合蛋白存在于包含编码Ig重链恒定区的一个或多个结构域的核酸的载体中，所述结构域优选具有对应于人免疫球蛋白Cγ1链的铰链区、C_H2区和C_H3区的氨基酸序列。

含有待表达的核酸的载体可以被转移到宿主细胞中。术语“宿主细胞”是指其中可以引入重组表达载体的原核和真核细胞。本文中使用的“转化”和“转染”包括通过各种技术将核酸分子(例如，载体)引入细胞。尽管不限于特定的技术，但是许多这样的技术是本领域已经建立的。原核细胞可以用核酸并通过(例如)电穿孔或氯化钙介导的转化进行转化。可以通过包括(例如)磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体转染法、电穿孔法或显微注射的技术将核酸转染到哺乳动物细胞中。宿主细胞(例如，原核细胞或真核细胞(如CHO细胞))可被用于制备本文所述的B7-DC变体多肽。在一些实施方案中，宿主细胞(例如抗原呈递细胞)可用于表达本文公开的B7-DC变体多肽以将其呈递至T细胞。

D.抗体

在Kohler and Milstein，Nature 256：495-497(1975)、美国专利No.4,376,110、Hartlow，E.et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1988)、Monoclonal Abtibodies and Hybridomas：A New Dimension inBiological Analyses，Plenum Press，New York，N.Y.(1980)、H.Zola，etal.，in Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications，CRC Press，(1982)中描述了单克隆抗体(mAb)及其制备方法和用途。

在Coligan，J.E.et al.，eds，Current Protocols in Immunology，Wiley-Interscience，New York 1991(或现在的版本)、Butt，W.R.(eds)Practical Immunoassay：The State of the Art，Dekker，N.Y.，1984、Bizollon，Ch.A.，eds，Monoclonal Antibodies and New Trends inImmunoassays，Elsevier，N.Y.，1984、Butler，J.E.，ELISA(29章)，In：van Oss，C.J.et al.，(eds)，IMMUNOCHEMISTRY，Marcel Dekker，Inc.，New York，1994，pp.759-803、Butler，J.E.(eds)，Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，1991、Weintraub，B.，Principles  of Radioimmunoassays，SeventhTraining Course on Radioligand Assay Techniques，The EndocrineSociety，March，1986、Work，T.S.et al.，Laboratory Techniques andBiochemistry in Molecular Biology，North Holland Publishing Company，NY，(1978)(Chapter by Chard，T.，“An Introduction to RadioimmuneAssay and Related Techniques”)中描述了免疫测定方法。

例如，在Idiotypy in Biology and Medicine，Academic Press，NewYork，1984；Immunological Reviews Volume 79，1984、ImmunologicalReviews Volume 90，1986、Curr.Top.Microbiol.，Immunol.Volume119，1985；Bona，C.et al.，CRC Crit.Rev.Immunol.，pp.33-81(1981)、Jerme，N K，Ann.Immunol.125C：373-389(1974)、Jerne，N K，In：Idiotypes-Antigens on the Inside，Westen-Schnurr，L，ed.，EditionesRoche，Basel，1982，Urbain，J.et al.，Ann.Immunol.133D：179-(1982)、Rajewsky，K.et al.，Ann.Rev.Immunol.1：569-607(1983)中描述了抗独特型抗体。

本文中公开了与B7-DC的新型抗原表位反应的单克隆和多克隆抗体，所述抗原表位是在已知的B7族蛋白中不存在的。抗体可能是异种基因型的、同种异型的、同型的、或它们的修饰的形式，如人源化抗体或嵌合抗体。本发明还包括抗独特型抗体，其对于独特型抗B7-DC抗体而言是特异性的。术语“抗体”是指包括含有抗原结合位点、并且能够和B7-DC抗原表位结合的完整分子及其片段。所述抗体包括Fab和F(ab’)₂片段，所述Fab和F(ab’)₂片段不包含完整抗体中的Fc片段，可更快地从体循环中清除，并可具有比完整抗体更低的非特异性组织结合性(Wahl et al.，J.Nuc.Med.24：316-325(1983))。本发明还包括Fv片段(Hochman，J.et al.(1973)Biochemistry12：1130-1135；Sharon，J.et al.(1976)Biochemistry 15：1591-1594)。上述各种片段是用常规技术制备的，例如蛋白酶裂解法或化学裂解法(参见，如Rousseaux et al.，Meth.Enzymol.，121：663-69(1986))。

多克隆抗体从免疫的动物(如兔、山羊、啮齿动物等)的血清中获取，其可不经过进一步处理而直接使用，或者可进行常规的富集或纯化方法，例如硫酸铵沉淀法、离子交换层析法和亲和层析法。

免疫原可包括完整B7-DC蛋白或其片段或其衍生物。优选的免疫原包括人B7-DC的胞外域(ECD)的全部或部分，其中所述这些残基包含在天然B7-DC中发现的翻译后修饰，例如糖基化。含有胞外域的免疫原通过本领域已知的许多方法来制备，例如利用传统的重组方法表达克隆基因、从原始细胞分离、采用表达高水平B7-DC的细胞群获得等。

单克隆抗体可使用常规的杂交瘤技术来制备，例如Kohler和Milstein提出的方法(Nature，256：495-97(1975))和该技术的改进方法(见上面的参考文献)。通过上述免疫原免疫使动物(优选小鼠)接触抗原，从而在已接触抗原的动物中产生所需的抗体应答。通常在促融剂(如聚乙二醇(PEG))的存在下，来自已接触抗原的动物的***、脾或外周血液中的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。下列多种小鼠骨髓瘤细胞系中的任何一种可用于所述用途：P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-k0Ag8.653、Sp2/0-Agl4或HL1-653骨髓瘤细胞系(可得自ATCC，Rockville，Md.)。接下来的步骤包括在选择性培养基中生长，使得未融合的亲本骨髓瘤细胞和供体淋巴球细胞最终死亡，而只有杂交瘤细胞存活。使它们克隆和生长，并例如通过使用B7-DC融合蛋白的免疫分析技术来筛选它们的上清以确定所述特异性的抗体的存在。阳性克隆通过(例如)有限稀释法而亚克隆，并且将单克隆抗体分离出来。

可以运用本领域已知的技术(通常参见Fink，et al.，Prog.Clin.Pathol.，9：121-22(1954))在体外或在体内(在腹腔积液中)来繁殖根据所述方法制备的杂交瘤。通常，在培养基中繁殖单独细胞系，可以通过倾析、过滤或离心来收获含有高浓度的单一一种单克隆抗体的培养液。

所述抗体可制备为单链抗体或scFv而不是通常的多聚体结构。单链抗体是完整Ig的尺寸的一部分，该单链抗体包括目标Ig的高变区并且再造了天然Ig的抗原结合位点(Skerra，A et al.(1988)Science，240：1038-1041；Pluckthun，A et al.(1989)Methods Enzymol 178：497-515；；Winter，G.et al.(1991)Nature，349：293-299)。在优选的实施方案中，通过使用传统分子生物学技术来制备抗体。

E免疫原性组合物

疫苗需要强的T细胞应答以消灭癌细胞和受感染的细胞。本文所述的B7-DC变体可以作为疫苗的组分来施用，从而对T细胞提供共刺激信号。本文中公开的疫苗包含抗原、B7-DC变体多肽源以及可任选的助剂和靶分子。B7-DC变体多肽源包括任何B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白、编码B7-DC变体多肽或B7-DC变体融合蛋白的核酸、或者含有能表达B7-DC多肽或B7-DC变体融合蛋白的载体的宿主细胞。

1.抗原

抗原可以是肽、蛋白、多糖、糖、脂类、核酸或其组合。所述抗原可以源自病毒、细菌、寄生虫、植物、原生动物、真菌、组织或转化的细胞(如癌细胞或白血病细胞)，并且可以是完整细胞或其免疫原性成分，例如其细胞壁成分或分子成分。

合适的抗原是本领域已知的，其可得自经营性的政府和科研机构。在一个实施方案中，抗原是完全灭活或减毒的生物体。这些生物体可以是传染性生物体，例如病毒、寄生虫和细菌。这些生物体还可以是肿瘤细胞。抗原可以是衍生自肿瘤、或病毒、或细菌的纯化或部分纯化的多肽。抗原可以是通过在异源表达体系中表达编码多肽抗原的DNA而制备的重组多肽。抗原可以是编码全部或部分抗原蛋白的DNA。所述DNA可以是载体DNA的形式，如质粒DNA。

抗原可以以单一一种抗原的形式来提供，也可以以组合形式提供。抗原还可以以多肽或核酸的复合混合物的形式来提供。

I.病毒抗原

病毒抗原可以从任何病毒中分离，所述病毒包括(但不限于)来自下列病毒科的任何病毒：沙粒病毒科、动脉炎病毒科、星状病毒科、杆状病毒科、杆状DNA病毒(badnavirus)科、杆菌状核糖核酸病毒科(barnaviridae)、双RNA病毒科、雀麦镶嵌病毒科、布尼亚病毒科、杯状病毒科、毛状病毒、香石竹潜病毒、花椰菜花叶病毒、圆环病毒科、线形病毒、豇豆花叶病毒科、冠状病毒科(例如冠状病毒，如严重急性呼吸综合症(SARS)病毒)、覆盖噬菌体科、囊状噬菌体科、δ病毒、石竹属病毒、耳突花叶病毒、丝状病毒科(例如，马尔堡病毒和埃博拉病毒(例如扎伊尔株、莱斯顿株、象牙海岸株、或苏丹株))、黄病毒科(例如丙型肝炎病毒、登革热病毒1型、登革热病毒2、登革病毒3和登革病毒4)、肝病毒科、疱疹病毒科(如人疱疹病毒1、3、4、5和6、以及巨细胞病毒)、低毒性病毒科、虹彩病毒科、光滑病毒科、脂毛噬菌体科、微小噬菌体科、正粘液病毒科(如流感病毒A、和B、和C)、乳多空病毒科、副粘病毒科(如麻疹、腮腺炎、和人呼吸道合胞病毒)、细小病毒科、正链RNA病毒科(如脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、嗜肝病毒和***病毒)、痘病毒科(如牛痘和天花病毒)、呼肠孤病毒科(如轮状病毒)、逆转录病毒科(例如慢病毒，如人免疫缺陷病毒(HIV)1和HIV 2)、炮弹病毒科(例如狂犬病病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒等)、披膜病毒科(例如风疹病毒、登革热病毒等)和全病毒科。合适的病毒抗原还包括登革热(Dengue)蛋白M、登革热蛋白E、登革热D1NS1、登革热D1NS2以及登革热D1NS3中的全部或一部分。

病毒抗原可衍生自特定病毒株，如***状瘤病毒、疱疹病毒(即单纯疱疹1和2)、肝炎病毒(例如，甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、δ丁肝病毒(HDV)、戊肝病毒(HEV)、和己肝病毒(HGV))、森林脑炎病毒、副流感病毒、带状疱疹、巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、轮状病毒、鼻病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、马脑炎病毒、日本脑炎病毒、黄热病病毒、裂谷热病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒。

ii.细菌抗原

细菌抗原可源自任何细菌，所述细菌包括(但不限于)：放线菌、项圈藻、芽孢杆菌、类杆菌、蛭弧菌、博德特氏菌属、包柔氏螺旋体菌、弯曲菌、柄杆菌、衣原体、绿菌属、着色菌、梭状芽胞杆菌、棒状杆菌、嗜纤维菌、异常球菌属、埃希氏菌属、弗朗西丝氏菌属、盐杆菌属、螺旋杆菌属、嗜血杆菌、B型嗜血流感杆菌(HIB)、生丝微菌属、军团菌、钩端螺旋体病细菌、李斯特菌、A、B和C型脑膜炎双球菌、产甲烷菌(Melhanobacterium)、小球菌、分枝杆菌属(Myobacterium)、支原体、粘细菌、奈瑟菌、硝化杆菌、颤蓝细菌、原绿藻(Prochloron)、变形杆菌、绿脓杆菌、红螺菌属(Phodospirillum)菌、立克次体、沙门氏菌、志贺氏菌、螺旋菌、螺旋体、金黄色葡萄球菌、链球菌、链霉菌、硫化叶菌、嗜热枝原体、硫杆菌、和密螺旋体、霍乱弧菌、和耶尔森氏菌。

iii.寄生虫抗原

寄生虫抗原可得自寄生虫，例如(但不限于)衍生自下列寄生虫的抗原：新型隐球菌、组织胞浆菌、白色念珠菌、热带念珠菌、星状诺卡氏菌、立氏立克次体(rickettsia rickettsii)、伤寒立氏立克次体、肺炎支原体、鹦鹉热衣原体、沙眼衣原体、恶性疟原虫、布氏锥虫、阿米巴、弓形虫、***毛滴虫和曼氏血吸虫。这些抗原包括孢子虫抗原、疟原虫抗原(如环子孢子蛋白的部分或全部)、孢子虫表面蛋白、肝期抗原、顶端膜相关蛋白、或裂殖子表面蛋白。

iv.过敏原和环境抗原

抗原可以是过敏原或环境抗原，例如(但不限于)源自天然存在的过敏原的抗原，例如花粉过敏原(树、药草、种子和禾本科草的花粉过敏原)、昆虫过敏原(吸入性、唾液和毒液过敏原)、动物毛发和皮屑过敏原和食物过敏原。来自树、禾本科草、和药草的重要的花粉过敏原源自分类学中的：壳斗目、洋橄榄目、松杉目和悬铃木科，包括(但不限于)桦木(白桦)、桤木(赤杨)、榛子(榛)、鹅耳枥(鹅耳枥属)和橄榄(油橄榄)、雪松(Cryptomeriaand刺柏)、法国梧桐(悬铃木属)；禾本目，包括(例如)稻禾科植物黑麦草、梯牧草、早熟禾、狗牙根、虉草属、裸麦和高粱；菊目和荨麻目，包括(但不限于)豚草属药草、艾属药草、和墙草属药草。其他可使用的过敏原抗原包括来自下列的过敏原：中尘螨属和欧尘螨属尘螨、仓储螨(例如Lepidoglyphys、Glycyphagus和Tyrophagus属仓储螨)、来自蟑螂、蚊和跳蚤(如小蠊属、大蠊属、黄色羽摇蚊和Ctenocepphalides)的过敏原、来自哺乳动物(如猫、狗、马、鸟)的过敏原、毒液过敏原(包括源于刺或叮咬昆虫的那些，例如分类学的膜翅目的那些，包括蜜蜂(总科，蜜蜂科)、黄蜂(总科，胡蜂科)和蚂蚁(总科，蚁总科))。其他可用的过敏原抗原包括来自真菌(例如链格孢菌菌属和枝孢霉菌属)的吸入型过敏原。

V.肿瘤抗原

抗原可以是肿瘤抗原，包括肿瘤相关或肿瘤特异性抗原，例如(但不限于)α-辅肌动蛋白-4、Bcr-Abl融合蛋白、Casp-8、β-连环素、cdc27、cdk4、cdkn2a、coa-1、dek-can融合蛋白、EF2、ETV6-AML1融合蛋白、LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-1、2和3、neo-PAP、I类阻凝蛋白、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PTPRK、K-ras、N-ras、磷酸甘油醛异构酶、Bage-1、Gage 3、4、5、6、7、GnTV、Herv-K-mel、Lage-1、Mage-A1、2、3、4、6、10、12、Mage-C2、NA-88、NY-Eso-1/Lage-2、SP17、SSX-2、TRP2-Int2、MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、CEA、RAGE、NY-ESO(LAGE)SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、Epstein Barr病毒抗原、EBNA、人***瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、α-甲胎蛋白、13HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP 1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB\70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C-相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。

2.靶分子

在抗原呈递细胞(B细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DC))的主要类型中，DC是最有效的，并且负责引起所有的抗原特异性免疫应答。因此，靶向DC提供了增强抗原和抗原应答的递送的机会。

树突状细胞表达许多细胞表面受体，这些受体可以介导结合的抗原的细胞内吞作用。将异源抗原靶向在全身分布的抗原呈递细胞上的表面分子能促进抗原的摄入，因而克服了免疫和疫苗接种中的主要限速步骤。

靶向树突状细胞的分子包括对树突状细胞表面上显示的抗原表位进行识别和结合的单克隆或多克隆抗体或它们的片段。靶向树突状细胞的分子还包括与树突状细胞上的细胞表面受体结合的配体。一个这样的受体是凝集素DEC-205，它已被在体外和在小鼠中使用，以将体液(基于抗体的)和细胞(CD8T细胞)的应答加强2-4个数量级(Hawiger，et al.，J.Exp.Med.，194(6)：769-79(2001)；Bonifaz，et al.，J.Exp.Med，196(12)：1627-38(2002)；Bonifaz，et al.，J.Exp.Med，199(6)：815-24(2004))。在这些实验中，抗原与抗DEC205重链融合，重组抗体分子被用于免疫。

许多其他的细胞内吞受体(包括甘露糖特异性凝集素(甘露糖受体)和IgG Fc受体也以这种方式靶向，并且类似地增强抗原呈递效率。能够被靶向的其他合适的受体包括(但不限于)DC-SIGN、33D1、SIGLEC-H、DCIR、CD11c、热激蛋白受体和清道夫受体。

其他能够被靶向的受体包括Toll样受体(TLR)。TLR对病原体相关的分子模式(PAMP)进行识别并结合。PAMP靶向树突状细胞表面上的TLR，继而向内部传递信号，从而有力地提高DC抗原摄入、T细胞的成熟和T细胞刺激能力。与微粒表面连接或共包囊的PAMP包括未甲基化CpG DNA(细菌)、双链RNA(病毒)、脂多糖(细菌)、肽聚糖(细菌)、人脂***甘露聚糖(细菌)、酵母聚糖(酵母菌)、支原体脂蛋白(如MALP-2(细菌))、鞭毛蛋白(细菌)、聚(肌酐胞苷)酸(细菌)、脂磷壁酸质(细菌)、或咪唑并喹啉类物质(合成的)。

3.佐剂

可任选地，本文公开的疫苗可包含佐剂。佐剂可以是(但不限于)下面物质中的一种或多种：油乳(例如弗氏佐剂)、皂苷制剂、病毒颗粒和病毒样颗粒、细菌和微生物衍生物、免疫刺激性寡核苷酸、ADP-核糖基毒素和解毒派生物、铝佐剂、BCG、含矿物质的组合物(例如无机盐，如铝盐和钙盐、氢氧化物、磷酸盐、硫酸盐等)、生物粘着剂和/或粘膜粘着剂、微粒、脂质体、聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂、聚磷腈、胞壁酰肽(murarnyl peptide)、咪唑并喹诺酮(imidazoquinolone)化合物、和表面活性物质(例如，溶血卵磷脂、聚醚多元醇、聚阴离子、多肽、油乳、钥孔血蓝蛋白、和二硝基酚)。

佐剂还可包括免疫调节物，例如细胞因子、白细胞介素(例如IL-I、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(例如γ-干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。除了B7-DC变体多肽以外，还可施用其他的共刺激性分子，包括B7族的其他多肽。这样的蛋白类佐剂可以以全长多肽或其活性片段、或者DNA的形式(如质粒DNA)的方式来提供。

F.药物组合物

本发明提供了包含B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白、编码B7-DC变体多肽和融合蛋白的核酸、含有这些核酸的载体的药物组合物。药物组合物可通过口服、肠胃外(肌肉、腹腔内、静脉内(IV)或皮下注射)、透皮(被动、或使用电离子透入疗法或电穿孔法)、透粘膜(鼻粘膜、***粘膜、直肠粘膜或舌下粘膜)的途径施用，或者使用生物侵蚀性嵌入物来施用，其可以被配制成适于各种施用途径的剂型。在优选的实施方案中，多肽以水溶液的形式、特别是肠胃外注射的形式施用。通常，提供的药物组合物包含：有效量的B7-DC变体多肽、融合蛋白、编码它们的核酸、或其衍生物；以及可药用的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。所述组合物包含：各种缓冲成分(例如，Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐)的稀释剂、pH和离子强度的稀释剂、添加剂(例如去垢剂和增溶剂(例如，吐温20、吐温80、聚山梨醇酯80))、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(硫柳汞、苯甲醇)和填充剂(例如乳糖、甘露醇)，将这些材料掺入聚合物(如聚乳酸、聚乙醇酸等)的微粒制剂或脂质体中。还可使用透明质酸。这样的组合物可影响本发明蛋白和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除率。例如参见，Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.(1990，MackPublishing Co.，Easton，Pa.18042)第1435-1712页。该组合物可制成液体形式或干粉(如冻干)形式。

1.口服递送

可配制B7-DC变体多肽、融合蛋白和编码它们的核酸以用于口服递送。口服固体剂型在Remington′s Pharmaceutical Sciences，18thEd.1990(Mack Publishing Co.Easton Pa.18042)第89章有一般性描述。固体剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、糖锭或锭剂、扁囊剂、小丸剂、粉剂或颗粒剂。此外，脂质体或类蛋白包囊可用于配制本发明组合物(例如美国专利No.4,925,673中记载的类蛋白微球)。可使用脂质体包囊，并且该脂质体可用各种聚合物衍生化(例如，美国专利No.5,013,556)。可用于治疗的固体剂型在Marshall，K.In：ModernPharmaceutics Edited by G.S.Banker and C.T.Rhodes第10章，1979.中有所描述。通常，制剂包含ABC运输配体(或其化学修饰的形式)、和惰性成分(其为生物活性物质提供抵抗胃部环境的保护、以及使之在肠道内释放)。

另一个实施方案提供口服施用的液体剂型，包括可药用的乳剂、溶液、悬浮剂和糖浆剂，所述液体剂型可包含其他成分，包括惰性稀释剂；助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、以及甜味剂、调味剂和香味剂)。

可对多肽拮抗剂进行化学修饰以使该衍生物的口服递送更加高效。通常，所考虑的化学修饰是将成分分子本身与至少一个部分连接，其中所述部分允许(a)抑制蛋白水解；和(b)从胃部和肠道吸收到血流。此外，合意的是，使一种或多种成分在体内的总稳定性增加和循环时间延长。聚乙二醇化对于药用而言是优选的化学修饰。其他的可使用的部分包括：丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚脯氨酸、聚-1，3-二氧戊环和聚-1，3，6-三氧戊环(例如参见，Abuchowski and Davis(1981)″Soluble Polymer-Enzyme Adducts，″in Enzymes as Drugs.Hocenbergand Roberts，eds.(Wiley-Interscience：New York，N.Y.)第367-383页；和Newmark，et al.(1982)J.Appl.Biochem.4：185-189)。

对于口服制剂，释放部位可以是胃部、小肠(十二指肠、空肠或回肠)、或大肠。本领域技术人员已经制得了这样一种制剂，该制剂不在胃中溶解，但在肠道的十二指肠或其他部位释放药物。优选地，通过对肽(或衍生物)进行修饰或在胃部环境外(如在肠道中)来释放肽(或衍生物)，从而避免胃部环境对药物的破坏作用。

为了确保完全的胃部耐受性，在至少pH 5.0情况下不渗透的包衣是必要的。用作肠溶包衣的更普通的惰性成分的例子有醋酸纤维素苯三酸酯(CAT)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、聚醋酸乙烯酯邻苯二甲酸酯(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、纤维素醋酸酯邻苯二甲酸酯(CAP)、Eudragit L、Eudragit S和虫胶。这些包衣可作为混合膜使用。

还可在那些没有就抵抗胃部作用而进行保护的片剂上使用包衣或包衣混合物。这可包括糖包衣或者使药片更易吞咽的包衣。胶囊由用于递送干燥治疗剂(例如粉末)的硬壳(例如明胶)、或由可用于递送液体形式治疗剂的软的明胶壳构成。扁囊剂的壳材料可以是粗淀粉或其他可食用纸。对于丸剂、锭剂、模制片或研制片剂而言，可以使用湿法成团技术。

B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白、或编码它们(或衍生物)的核酸可以以作为微细多颗粒的粒径为约1mm的颗粒或小丸的形式包含在制剂中。用于以胶囊剂施用的材料的制剂也可以是粉末、轻微压成的塞子、或甚至为片剂。这些治疗剂可通过压制来制备。

还可包含着色剂和/或矫味剂。例如，可(例如通过脂质体或微球体包囊)配制sH4拮抗剂(或衍生物)，然后进一步将之包含在可食用产品(例如含有着色剂和矫味剂的冷冻饮料)中。

人们可以使用惰性材料稀释B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白、或编码它们(或衍生物)的核酸或增大它们的体积。这些稀释剂可包括碳水化合物，特别是甘露醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、经修饰的葡聚糖和淀粉。某些无机盐也可作为填料，包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些市售稀释剂是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx1500、Emcompress和Avicell。

在治疗制剂中，固体剂型中可包含崩解剂。用作崩解剂的材料包括(但不限于)淀粉，包括基于淀粉的市售崩解剂Explotab。羟基乙酸淀粉钠、安伯来特(Amberlite)、羧甲基纤维素钠、ultramylopectin、海藻酸钠、明胶、橘皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和膨润土都可使用。崩解剂还可以是不溶性阳离子交换树脂。粉末状树胶可用作崩解剂和粘结剂，可包含的粉末状树胶例如为琼脂、次梧桐胶或黄芪胶。褐藻酸及其钠盐也可用作崩解剂。

粘结剂可用于将B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白、或编码它们(或衍生物)的核酸粘连到一起以形成硬的片剂，所述粘结剂包括来自天然产品的材料，如***树胶、黄芪胶、淀粉和明胶。其他的粘结剂包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)、以及羧甲基纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)均可用在醇溶液中以使肽(或衍生物)成粒状。

sH4拮抗剂(或衍生物)的制剂中可包含减摩剂以避免在配制过程中的粘连。润滑剂可用作肽(或衍生物)与模具壁之间的夹层，这些润滑剂可包括(但不限于)硬脂酸(包括其镁盐和钙盐)、聚四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。还可使用可溶性润滑剂，例如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁、各种分子量的聚乙二醇、Carbowax 4000和6000。

可以加入助流剂以改善在配制过程中药物的流动性能和在压制过程中帮助重新排列。助流剂可包括淀粉、滑石、煅制二氧化硅、以及水合硅铝酸盐。

为了帮助肽(或衍生物)溶解到水性环境中，可加入表面活性剂作为润湿剂。表面活性剂可包括阴离子去垢剂，例如十二烷基硫酸钠、丁二酸二辛基磺酸钠和二辛基磺酸钠。可使用阳离子去垢剂，其包括苯扎氯铵或苄索氯铵。可含在制剂中作为表面活性剂的潜在的非离子去垢剂有下列物质：聚桂醇400、聚氧基40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、甘油单硬脂酸酯、聚山梨酯20、40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可单独或作为混合物(不同配比的)存在于蛋白或衍生物制剂中。

能有力增强B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白、或编码它们(或衍生物)的核酸的摄入的添加剂(例如)为脂肪酸，有：油酸、亚油酸和亚麻酸。

控释口服制剂是合乎人们需要的。可将B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白、或编码它们(或衍生物)的核酸掺入惰性基质(例如树胶)中，所述基质允许通过(例如)扩散或浸出机理来进行释放。也可将缓慢降解的基质加入制剂中。一些肠溶包衣也具有延迟释放的作用。控释的另一种形式是通过基于Oros治疗***(Alza公司)的方法，即药物被封装入半透膜中，由于渗透作用，所述半透膜允许水进入而将药物从单一的小孔挤出。

其他包衣也可用于制备制剂。这些包衣包括可在包衣锅中应用的各种糖类。B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白、或编码它们(或衍生物)的核酸也可以被制成薄膜包衣的片剂的形式，在这种情形下使用的材料分为两组。第一组是非肠溶材料，包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素钠、聚维酮和聚乙二醇。第二组为肠溶材料，其通常为邻苯二甲酸酯。

材料的混合物可用于提供最佳薄膜包衣。薄膜包衣可在包衣锅、或流化床、或通过压制包衣的方法来进行。

2.肠胃外递送

肠胃外施用的本发明的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液或乳液。非水溶剂或载体的例子为丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油和玉米油)、明胶和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。这种剂型还可包含助剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。它们可(例如)通过下列方式来灭菌：通过细菌截留性过滤器过滤、在组合物中加入灭菌剂、对组合物进行辐照、或加热组合物。还可在使用前用无菌水、或一些其他的无菌注射用介质来即刻制备它们。

3.粘膜递送

在直肠或***中施用的组合物优选为栓剂，除了有效成分外，其可包含(例如)可可油或栓剂蜡之类的赋形剂。在鼻腔或舌下施用的组合物也可使用本领域熟知的标准赋形剂来制备(见下文)。

4.肺部递送

本发明还涵盖sH4拮抗剂(或其衍生物)的肺部递送。通过吸入B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白或编码它们(或衍生物)的核酸被递送至哺乳动物的肺部，并穿过肺上皮层进入血流时(例如参见Adjei，et al.(1990)Pharmaceutical Research 7：565-569；Adjei，etal.(1990)Int.J.Pharmaceutics 63：135-144(乙酸亮丙瑞林)；Braquet，etal.(1989)J.Cardiovascular Pharmacology 13(sup5)：143-146(内皮素-1)；Hubbard，et al.(1989)Annals of Internal Medicine，Vol.Ill，pp.206-212(α1-抗胰蛋白酶)；Smith，et al.(1989)J.Clin.Invest.84：1145-1146(α1-蛋白酶)；Oswein，et al.(1990)″Aerosolization ofProteins″，Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery IIKeystone，Colorado(重组人生长激素)；Debs，et al.(1988)J.Immunol.140：3482-3488(γ-干扰素和α-肿瘤坏死因子)；和美国专利No.5,284,656(Platz，et al)(粒细胞集落刺激因子)。用于肺部递送药物以产生全身作用的方法和组合物在美国专利No.5,451,569(Wong，etal.)中有所描述。

可以使用许多为肺部递送治疗产品而设计的各种机械装置，包括(但不限于)雾化器、计量吸入器和粉末吸入器，上述所有这些都是本领域技术人员所熟悉的。适于实施本发明的市售装置的一些具体例子为Ultravent雾化器(Mallinckrodt Inc.，St.Louis，Mo.)、Acorn II雾化器(Marquest Medical Products，Englewood，Colo.)、Ventolin计量吸入器(Glaxo Inc.，Research Triangle Park，N.C.)和Spinhaler粉末吸入器(Fisons Corp.，Bedford，Mass.)。

所有这些装置需要使用适于分配B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白、或编码它们(或衍生物)的核酸的配方制剂。通常，每个配方对于所使用的装置类型而言是特定的，并且除了包括在治疗中有用的常用稀释剂、助剂和/或载体以外，还包括使用合适的喷射剂材料。此外，脂质体、微囊或微球、包合配合物、或其他类型的载体也涵盖在本发明中。根据化学修饰的类型或所用装置的类型，在不同制剂中还可配制化学修饰的肽。

适于(喷射或超声)雾化器的制剂通常包含溶于水的肽(或衍生物)，其浓度为约0.1到25mg的生物活性蛋白/毫升溶液。该制剂还可包含缓冲剂和单糖(例如用于蛋白的稳定和渗透压的调节)。雾化配方还可包含表面活性剂以减少或防止在形成气溶胶时由于溶液的雾化而引起的表面诱导性肽(或衍生物)聚集。

用于计量吸入装置的制剂通常包含微细粉末，其含有在表面活性剂帮助下悬浮在喷射剂中的肽(或衍生物)。喷射剂可以是任何为此目的使用的传统材料，例如氟氯化碳、氯氟烃、氢氟烃、或烃(包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇、1，1，1，2-四氟乙烷或其组合)。合适的表面活性剂包括失水山梨醇三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性剂。

用于从粉末吸入装置分配的制剂包括含有肽(或衍生物)的微细干粉，并且还包含疏松剂(例如乳糖、山梨醇、蔗糖或甘露糖)，其量足以促使粉末从装置中分散，例如为制剂的50重量％至90重量％。最有利的是，应将B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白、或编码它们(或衍生物)的核酸制成将它们最有效递送至肺末梢的微粒形式，其平均粒径为小于10mm(或微米)，最优选为0.5mm至5mm。

5.聚合物基质

尽管非生物降解性和生物降解性基质都可用于B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白、或编码它们(或其衍生物)的核酸的递送，但是生物降解性基质是优选的。该基质可以是天然或合成聚合物，但是由于合成聚合物具有更好的降解性和释放性，因此其是优选的。基于所希望的释放时间来选择聚合物。尽管在其他情况下脉冲式释放或“大量释放”可提供更多的有效的结果，但是在一些情况下，线性释放可能是最有用的。聚合物可以是水凝胶的形式(通常最多吸收约90重量％的水)，而且可以可任选地用多价离子或聚合物交联。

可用于递送的典型的合成聚合物包括聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烃、聚亚烷基二醇、聚亚烷基氧化物、聚亚烷基对苯二甲酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯、和它们的共聚物，烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸和甲基丙烯酸酯聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、丙酸纤维素、纤维素醋酸酯丁酸酯、纤维素醋酸酯邻苯二甲酸酯、羧乙基纤维素、三醋酸纤维素、纤维素硫酸钠盐、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸基酯)、聚(甲基丙烯酸十二烷基酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮。

非生物降解性聚合物的例子包括乙烯醋酸乙烯酯共聚物、聚(甲基)丙烯酸、聚酰胺、其共聚物以及混合物。生物降解性聚合物的例子包括：合成聚合物，如乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酸酐、聚(邻)酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)和聚(丙交酯-co-己内酯)；和天然聚合物，例如海藻酸和其他多糖，包括葡聚糖和纤维素、胶原蛋白、及其化学衍生物(化学基团(例如烷基、亚烷基)的取代、引入、羟基化、氧化和其他本领域技术人员常规使用的修饰)、白蛋白和其他亲水性蛋白、玉米醇溶蛋白和其他醇溶谷蛋白和疏水性水蛋白、以及其共聚物和混合物。通常，这些材料通过酶水解作用或在体内通过与水接触而引起的表面或主体消融而降解。

特别令人感兴趣的生物粘附性聚合物包括生物侵蚀性水凝胶(由H.S.Sawhney，C.P.Pathak and J.A.Hubell in Macromolecules，1993，26，581-587所述)、聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酸酐、聚丙烯酸、海藻酸、壳聚糖、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸十二烷基酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷基酯)。

所述基质可以是微粒的形式(例如微球或微囊的形式)，在所述微粒中肽分散于固体聚合物基质中，在所述微囊中核芯与聚合物壳的材料不同，肽分散或悬浮于核芯中，所述核芯本质上可以为液体或固体。本文中除非另有明确说明，否则微粒、微球和微囊可替换地使用。或者，可将聚合物浇铸为薄的片或膜(纳米至千厘米)，该聚合物也可以是通过研磨或其他标准技术制备的粉末，或者甚至可以是凝胶，如水凝胶。

可通过溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂萃取和其他本领域技术人员已知的方法来形成基质。

生物侵蚀性微球可使用这样的方法来制备，该方法为用于制备药物递送用微球而开发的方法中的任意一种，例如由Mathiowitz andLanger，J.Controlled Release 5，13-22(1987)、Mathiowitz，et al.，Reactive Polymers 6，275-283(1987)、和Mathiowitz，et al.，J.Appl.Polymer Sci.35，155-11A(1988)所述的方法。方法的选择取决于聚合物的选择、尺寸、外部形态和所需的结晶性，例如由Mathiowitz，et al.，Scanning Microscopy 4，329-340(1990)、Mathiowitz，et al.J.Appl.Polymer Sci 45，125-134(1992)、以及Benita，et al.，J.Pharm.Sci.73，1721-1724(1984)所述。在(例如)Mathiowitz，et al.，(1990)，Benita和美国专利No.4,272,398(Jaffe)所述的溶剂蒸发方法中，将聚合物溶解到挥发性有机溶剂中。向聚合物溶液中加入拮抗剂，所述拮抗剂为可溶性形式或分散为微粒的形式，然后所得该混合物在含有表面活性剂(如聚乙烯醇)的水相中悬浮。搅拌所得乳液，直到大多数有机溶剂蒸发并留下固体微球为止。通常，聚合物可溶于二氯甲烷。通过此方法(其用于相对稳定的聚合物，如聚酯和聚苯乙烯)，可获得不同尺寸(1-1000微米)和形态的微球。然而，不稳定聚合物(如聚酸酐)由于暴露于水而可能降解，对于这些聚合物，热熔包囊法和溶剂去除法可能是优选的。

在热熔包囊法中，将聚合物首先熔融，然后再和B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白、或编码它们(或衍生物)的核酸的固体微粒混合。将所得混合物混悬在不混溶的溶剂(如硅油)中，在不断搅拌下加热至比所述聚合物的熔点高5℃的温度。在乳液稳定后，将之冷却直到聚合物微粒固化为止。将微球用石油醚通过倾析来洗涤，从而得到自由流动的粉末。使用该方法可以获得直径在1至1000微米的微球。用此技术制备的球体的外表面通常是光滑的和致密的。该方法可用于对水不稳定的聚合物，但限于使用分子量在1000和50000之间的聚合物。溶剂去除法主要被设计用于聚酸酐。在该方法中，将B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白、或编码它们的核酸分散或溶解在所选聚合物溶于挥发性有机溶剂(如二氯甲烷)而得的溶液中。然后将该混合物悬浮在油(如硅油)中，通过搅拌以形成乳液。在24小时内所述溶剂扩散到油相中，并且乳液滴硬化成固体聚合物微球。不同于溶剂挥发法，这种方法可用于用具有高熔点和宽范围分子量的聚合物来制备微球。使用该方法可以获得直径为1-300微米的微球。该球体的外部形态高度依赖于所使用的聚合物类型。在喷雾干燥时，将聚合物溶解在二氯甲烷(0.04克/毫升)中。把已知量的活性药物悬浮(如果不溶)或共溶(如果可溶)在聚合物溶液中。然后将溶液或分散液进行喷雾干燥。根据美国专利No.4,861,627(Mathiowitz)可制备双层微球。

通过下列方式，可由凝胶型聚合物(例如海藻酸盐、或聚磷嗪、或其他二羧基聚合物)制备水凝胶微球：将聚合物溶解在水溶液中，然后将待掺入的材料混悬在混合物中，通过装有氮气喷嘴的微滴形成设备来将聚合物混合物挤出。将所得微球置于缓慢搅拌的离子型淬火浴中，例如按照由Salib，et al.，Pharmazeutische Industrie 40-11 A，1230(1978)所述方式。壳聚糖微球可通过将聚合物溶解在酸性溶液中并与三聚磷酸盐交联来制备。例如，羧甲基纤维素(CMC)微球通过将聚合物溶解在酸性溶液中并用铅离子来沉淀微球而制备。可制备海藻酸盐/聚乙烯酰亚胺(PEI)以减少海藻酸盐微囊上的羧基量。

可使用溶剂或熔体浇铸法、挤出法、以及制备复合物的标准方法来制备包括薄膜、包衣、小丸、薄片和装置在内的其他递送***。如梭尼等描述，可通过将单体和肽首先混合、然后使用紫外光使单体聚合来制备聚合物。聚合可在体外和体内进行。

II.制备方法

A.B7-DC变体多肽的制备方法

分离的B7-DC变体多肽可通过(例如)化学合成或在宿主细胞内的重组生产来获得。为了重组生产共刺激性多肽，可用含有编码多肽的核苷酸序列的核酸转化、转导、或转染细菌或真核宿主细胞(如昆虫、酵母菌或哺乳动物细胞)。一般来说，核酸构建体包含调控序列，该调控序列与编码共刺激性多肽的核苷酸序列可操纵地连接。调控序列(本文中也称为表达控制序列)通常不编码基因产物，而是影响与它们可操作地连接的核酸序列的表达。

用于表达和生产多肽的有用的原核和真核***是在本领域熟知的，例如包括大肠杆菌菌株(如BL-21)和培养的哺乳动物细胞(如CHO细胞)。

在真核宿主细胞中，许多基于病毒的表达***可用于表达B7-DC变体多肽。基于病毒的表达***是本领域熟知的，其包括(但不限于)杆状病毒、SV40、逆转录病毒、或者基于水痘病毒的病毒载体。

利用具有合适的调控元件和选择性标志物的表达载体，可以制备对共刺激性变体多肽进行稳定表达的哺乳动物细胞系。例如，真核细胞表达载体pCR3.1(Invitrogen Life Technologies)和p91023(B)(参见Wong，et al.(1985)Science 228：810-815)适于在(例如)中华鼠卵巢(CHO)细胞、COS-1细胞、人类胚胎肾293细胞、NIH3T3细胞、BHK21细胞、MDCK细胞、和人类血管内皮细胞(HUVEC)中表达共刺激性变体多肽。在通过电穿孔法、脂质体转染法、磷酸钙或氯化钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、或者其他合适的转染法来引入表达载体后，可选择稳定的细胞系(例如通过对G418、卡那霉素或潮霉素的抗生素耐受性来选择)。可对转染的细胞进行培养，使得目标多肽被表达，并且所述多肽可从(例如)细胞培养上清或裂解细胞中回收。或者，B7-DC变体多肽可通过下列方式制备：(a)将扩增序列连结到哺乳动物表达载体，如pcDNA3(Invitrogen Life Technologies)中，和(b)在体外用小麦胚芽提取物或兔网织红细胞裂解物来进行转录和翻译。

例如，使用层析法(如DEAE离子交换法、凝胶过滤法和羟基磷灰石层析法)，可以对共刺激性变体多肽进行分离。例如，细胞培养上清或细胞质提取物中的共刺激性多肽可以用蛋白G柱分离。在一些实施方案中，共刺激性变体多肽可以是“工程化的”以使其包含允许该多肽被亲和基质捕捉的氨基酸序列。例如，可以使用标签(如c-myc、红血球凝聚素、聚组氨酸或Flag^TM(Kodak))来帮助多肽的纯化。这些标签可被***多肽中的任何地方，包括羧基或者氨基末端。其他可用的融合体包括帮助检测多肽的酶，如碱性磷酸酶。免疫亲和层析法也可用于纯化共刺激性多肽。

B.分离的核酸分子的制备方法

分离的核酸分子可通过标准技术来制备，所述技术包括(但不限于)普通的分子克隆和核酸化学合成技术。例如聚合酶链式反应(PCR)技术可用于获得对共刺激性变体多肽进行编码的分离的核酸。PCR是酶法扩增目标核酸的技术。通常，目标区域末端或之外的序列信息可用于设计寡核苷酸引物，所述引物与待扩增的模板互补链的序列是一致的。PCR可用于扩增DNA和RNA中的特定序列，包括全部基因组DNA或全部细胞RNA中的序列。通常，引物长度为14个到40个核苷酸，但其长度可以是10个到几百个核苷酸。通用的PCR技术在(例如)PCR Primer：A Laboratory Manual，ed.byDieffenbach and Dveksler，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995中有所描述。当使用RNA作为模板来源时，反转录酶可用于合成互补DNA(cDNA)链。连接酶链式反应、链置换扩增法、自我维持序列复制法、或基于核酸序列的扩增法也可用于获得分离的核酸。例如参见Lewis(1992)Genetic Engineering News 12：1；Guatelli et al.(1990)Proc.Natl Acad.ScI USA 87：1874-1878和Weiss(1991)Science254：1292-1293。

分离的核酸可以是化学合成的单种核酸分子或者一系列寡核苷酸(例如使用亚磷酰胺法沿3’到5’方向自动合成DNA)。例如，可合成一对或多对包含所需序列的长链寡核苷酸(例如，＞100核苷酸)，其中每对包含互补性的短片段(例如约15个核苷酸)，使得在寡核苷酸对退火时形成双链。可用DNA聚合酶来延伸寡核苷酸，从而每个寡核苷酸对产生单链、双链核酸分子，然后可将其连接到载体上。分离的核酸还可通过诱变获得。可使用标准技术使编码B7-DC的核酸突变，所述技术包括通过PCR的寡核苷酸定向诱变和/或定点诱变。参见Short Protocols in Molecular Biology.Chapter 8，Green PublishingAssociates and John Wiley & Sons，Ausubel et al.1992。可被修饰的氨基酸位置的例子包括本文中所描述的那些。

III.使用方法

A.T细胞的共刺激

B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白、编码B7-DC变体多肽或B7-DC变体融合蛋白的核酸、或表达B7-DC变体多肽的细胞可用于T细胞的共刺激(即增强T细胞的抗原特异性增殖、增强T细胞产生细胞因子、刺激T细胞的分化和效应子功能、和/或促进T细胞的存活)。

B7-DC可与PD-1(程序化细胞死亡-1)结合，所述PD-1为CD28同系物，其具有免疫受体酪氨酸基抑制性模体(motifinits)细胞质结构域(Ishida et al.(1992)EMBO J.11：3887-3895)。PD-1在胸腺细胞亚群上表达，并且对T细胞、B细胞和骨髓细胞在其活化后具有上调作用(Agata，et al.，Int.Immunol.，8：765-772(1996))。PD-1在体内表现为免疫应答的负调节物。例如，具有C57BL/6背景的PD-1^-/-小鼠慢慢患上狼疮样肾小球性肾炎和进行性关节炎(Nishimura，et al.，Immunity，11：141-151(1999))。另外，具有BALB/c背景的PD-1^-/-小鼠迅速患上致命的自体免疫性扩张性心肌病(Nishimura，et al.，Science.291：319-322(2001))。然而，证据还表明B7-DC可以具有共刺激T细胞应答的功能。在次优TCR信号的存在下，B7-DC可以在体外刺激T细胞的增殖和增强细胞因子的产生。因此，看来B7-DC还与除了PD-1之外的其他T细胞受体结合。下面实施例中描述的实验说明了B7-DC和本文中所述的B7-DC变体的共刺激活性不受PD-1受体的介导。

与野生型B7-DC相比，本文所述B7-DC变体对于PD-1的亲和结合性降低，但仍保留共刺激T细胞的能力。因此，本文所述B7-DC变体保留了它们共刺激T细胞的能力，并具有降低的通过与PD-1结合来抑制T细胞活化的能力。因此就共刺激T细胞而言，这些B7-DC变体优于野生型B7-DC。本文公开了使用对PD-1的亲和性降低的B7-DC变体多肽和B7-DC变体融合蛋白来刺激T细胞应答的方法，该方法包括使分离的共刺激性变体多肽与T细胞接触。该接触可以在体外、离体或体内(例如，在哺乳动物中，如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪、非人灵长类、或人)接触。

接触可以在T细胞活化之前、之中、或之后进行。通常，共刺激性变体多肽与T细胞接触可以基本与活化同时进行。活化可以是(例如)使T细胞暴露于与T细胞受体(TCR)结合的抗体，或暴露于与TCR物理相关的CD3复合物多肽中的一个。可将T细胞暴露于(例如)APC[例如，交错树突状细胞(本文中称为树突状细胞)、巨噬细胞、单核细胞或B细胞]上的同种异体抗原(如MHC同种抗原)，或者暴露于抗原性肽，所述抗原性肽通过上述APC中的任意一种加工蛋白抗原，并且通过APC表面上的MHC分子呈递至T细胞而获得。T细胞可以是CD4⁺T细胞或CD8⁺T细胞。

在一些实施方案中，分离的共刺激性变体多肽可直接施用于T细胞。或者，可用包含编码共刺激性变体多肽的核苷酸序列的核酸所转化、转导或转染APC(例如，巨噬细胞、单核细胞、交错树突状细胞(本文中称为树突状细胞)或B细胞)。被转化、转导或转染的细胞可以是这样一种细胞或该细胞的后代，其中该细胞是在被转化、转导或转染之前从受试者(将被施用该被转化、转导或转染的细胞)或其他的受试者(例如，同种的其他的受试者)中获得的。

B7-DC变体多肽可以是本文所述的那些中的任意一者，包括所公开的氨基酸改变、多肽片段、融合蛋白及其组合中的任意一者。

如果在体外活化，B7-DC变体分子可结合到相关培养皿底部，例如塑料微量滴定板的孔底。

体外应用分离的共刺激性变体多肽(例如)在下列方面可以是有用的：免疫机理的基础科学研究，或者用于在T细胞功能的研究中使用的活化的T细胞的制备，或者(例如)被动免疫治疗。另外，可将B7-DC变体多肽添加到体外分析(例如T细胞增殖分析)中，其中所述分析被设计用来测试目标抗原在受试者(从其中获得T细胞)中的免疫性的。向这样的分析中加入共刺激性变体多肽期望产生更强、因此更易检测的体外应答。此外，B7-DC变体多肽或用编码该多肽的核酸转化、转导或转染的APC可以：(a)在分析中用作阳性对照以测试其他分子的共刺激活性；或者(b)用于对能抑制T细胞共刺激性的化合物(例如，具有治疗自体免疫性疾病或器官移植排斥的潜在用途的化合物)的筛选分析。

B.B7-DC变体的治疗用途

1.待治疗的病症

本文提供的B7-DC变体多肽通常可在体外和离体用作刺激免疫应答的治疗药物。通常，本文所述的组合物用于治疗这样的受试者，所述受试者具有或倾向于具有使受试者的免疫***产生免疫应答的任何疾病或病症。B7-DC变体多肽共刺激T细胞的能力使得所公开的组合物可用于刺激或增强T细胞参与的免疫应答。因此，在优选的实施方案中，待治疗或预防的疾病类型是恶性肿瘤或由侵入细胞内并受到(例如)细胞毒性T淋巴细胞攻击的细菌、病毒、原生动物、蠕虫、或其他微生物病原体引起的慢性传染病。使用本文所述的B7-DC变体组合物进行T细胞的共刺激对于治疗或预防以免疫抑制为特性的病症也是有利的。

i.病毒感染

因为病毒感染主要由T细胞清除，所以T细胞活性增强可用于治疗这样的情形，其中更快速或彻底地清除感染性病毒剂对于动物或人受试者而言是有益的。因此，可给受试者施用B7-DC变体多肽和B7-DC变体融合蛋白以治疗局部或全身性病毒感染，包括(但不限于)免疫缺陷性病毒(如HIV)、***瘤病毒(如HPV)、疱疹病毒(如HSV)、脑炎病毒、流感病毒(如人流感病毒A)和普通感冒病毒(如人鼻病毒)感染。例如，可局部施用由B7-DC组合物要素制成的药剂以治疗病毒性皮肤病，例如疱疹病变、或带状疱疹、或生殖器疣。还可施用由B7-DC变体组合物制成的药剂以治疗全身性病毒疾病，包括(但不限于)AIDS、流感、普通感冒或脑炎。

ii.癌症

B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白和编码它们的核酸可用于诱导对肿瘤的免疫。例如，可将肿瘤细胞进行工程改造以使其携带编码本文所述的B7-DC变体多肽或B7-DC变体融合蛋白的核酸、然后将该肿瘤细胞施用给受试者以规避(traverse)受试者中的肿瘤特异性耐受，其中所述肿瘤细胞包括(但不限于)肉瘤细胞、黑色素瘤细胞、淋巴瘤细胞、白血病细胞、神经母细胞瘤细胞、或癌细胞。特别地，B7-1在B7阴性小鼠肿瘤细胞中的异位表达，已显示出可诱导T细胞介导的特异免疫性，并且显示出在小鼠中伴随有对肿瘤排斥和对抵抗肿瘤攻击的保护延长(L.Chen et al.，见上文；S.Townsend etal.，见上文；S.Baskar et al.，见上文)。利用B7相关因子的肿瘤或癌细胞基因疗法的治疗方案，可在动物试验中进行模拟(参见K.Dunussi-Joannopoulos et al.(1997)J.Pediatr.Hematol.Oncol.19：356-340；K.Hiroishi et al.(1999)Gene Ther.6：19884994；B.K.Martin et al.(1999)J.Immunol.162：6663-6670；M.Kuiper et al.(2000)Adv.Exp.Med.Biol.465：381-390)，或在人I期临床试验中进行模拟(H.L.Kaufman et al.(2000)Hum.Gene Ther.11：1065-1082)，其中该I期临床试验利用B7-1或B7-2进行基因转移治疗。应理解这些方法可适用于各种肿瘤细胞或癌细胞。另外，通过施用直接刺激免疫细胞的B7-DC变体多肽或B7-DC变体融合蛋白，可完成肿瘤免疫。

可被治疗的恶性肿瘤在本文中根据组织(肿瘤衍生自该组织)的胚胎来源来进行分类。癌是源自内胚层或外胚层组织(例如皮肤或内部器官和腺体的上皮层)的肿瘤。不经常发生的肉瘤源于中胚层***，例如骨骼、脂肪和软骨。白血病和淋巴瘤是骨髓造血细胞的恶性肿瘤。白血病以单细胞形式增殖，而淋巴瘤趋向于以肿瘤团块形式生长。恶性肿瘤可在机体的很多器官或组织中出现并发展为癌症。

可用本发明所提供的组合物和方法治疗的癌症类型包括(但不限于)下面的癌：膀胱癌、脑癌、乳腺癌、子***、结肠直肠癌、食道癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、胰腺癌、***癌、皮肤癌、胃癌、子宫癌等。本发明组合物的施用不限于对已生成的肿瘤或感染性疾病的治疗，其还可用于预防或降低个体形成这类病症的风险，即用于预防用途。预防性免疫接种的可能候选人群包括高危患癌个体，即有某种类型癌症历史的个人或有家族史的个人。

iii.免疫抑制病症

B7-DC变体多肽和B7-DC变体融合蛋白可用于治疗以免疫抑制为特征的疾病病症，包括(但不限于)AIDS或AIDS相关综合症、其他病毒或环境诱导的病症、和某些先天性免疫缺陷。B7-DC变体多肽和B7-DC变体融合蛋白还可用于提高由于使用免疫抑制性药物(例如某些化疗剂)的放射疗法而削弱的免疫功能，因此当与所述药物或放射疗法结合使用时是特别有用的。

2.B7-DC变体在疫苗中的用途

B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白和/或编码它们的核酸可单独被施用，或与其他合适的治疗手段联合施用。在一个实施方案中，B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白和/或编码它们的核酸可与疫苗组合物联合施用或作为疫苗组合物的成分来施用。合适的疫苗组合物成分在下文描述。本文所述的B7-DC变体组合物可在疫苗施用前、同时、或之后施用。在一个实施方案中，B7-DC变体组合物在施用疫苗的同时施用。

本文所述的B7-DC变体组合物可与预防性疫苗联合施用，其使受试者在随后暴露于传染性物体时被赋予耐受性，或者与治疗性疫苗联合施用，其可用于引发或增强受试者对于预先存在的抗原(例如癌症受试者中的肿瘤抗原或感染病毒的受试者中的病毒抗原)的免疫应答。

预防性、治疗性或去敏性免疫应答的所需结果可根据疾病的不同、根据本领域熟知的原则而改变。例如，针对传染性物体的免疫应答可完全地预防传染性物体形成集落和复制、趋向“无菌免疫”和没有任何疾病症状。然而，如果抗传染性物体的疫苗减少了症状的数量、减轻症状的严重性或缩短了症状的持续时间；或者如果减少了具有症状的人群中的个体数量；或者减缓传染性物体的传播，那么其可被认为是有效的。类似地，针对癌症、过敏原或传染性物体的免疫应答可以是完全使疾病得以治疗，或者是减轻了症状，或者是使疾病在整个治疗干预中的一个方面得以治疗或减轻。例如，为了有效地治疗，针对癌症的免疫应答的刺激可与外科手术、化疗、放疗、激素和其他免疫手段结合。

C.B7-DC变体多肽的施用方法

在体内实施的一些方法中，将治疗有效量的B7-DC变体多肽或B7-DC变体融合蛋白本身施用于受试者。典型地，可将多肽悬浮于可药用的载体中。可药用的载体是生物相容性载体(例如，生理盐水)，其适于施用给人。治疗有效量是能够在治疗的动物中产生所需医学效果(即增强T细胞应答)的共刺激性变体多肽的量。B7-DC变体多肽和B7-DC变体融合蛋白可口服、或静脉滴注、或者皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、直肠内、***内、鼻内、胃肠道内、气管内、或肺内施用。可将共刺激性变体多肽直接递送至合适的淋巴组织(例如脾脏、***、或粘膜相关的淋巴组织)。

D.核酸和细胞的施用方法

可将编码B7-DC变体多肽或融合蛋白的核酸施用于需要的受试者。核酸递送包括将“外源”核酸引入到细胞、并使之最终进入活的动物中。几种通用的基因治疗的策略已有深入的研究和综述(Yang，N-S.，Crit.Rev.Biotechnol.12：335-356(1992)；Anderson，W.F.，Science 256：808-813(1992)；Miller，A.S.，Nature 357：455-460(1992)；Crystal，R.G.，Amer.J.Med.92(suppl 6A)：44S-52S(1992)；Zwiebel，J.A.et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.618：394-404(1991)；McLachlin，J.R.etal.，Prog.Nuc.Acid Res.Molec.Biol.38：91-135(1990)；Kohn，D.B.etal.，Cancer Invest.7：179-192(1989)。

一种途径包括将核酸转移到被培养的原代细胞中、接下来将离体转化的细胞或者全身性地自体移植到宿主中或自体移植到宿主的特定器官或组织中。在一个实施方案中，将包含编码B7-DC变体多肽的核酸的载体转染到待施用给需要的受试者的细胞中。在优选的实施方案中，含有所述载体(其含有编码B7-DC变体多肽的核酸)的细胞是抗体呈递细胞。

离体法可包括(例如)下列步骤：从受试者中收集细胞、培养细胞、用表达载体转导它们、并将细胞保持在适于本文提供的共刺激性变体多肽表达的条件下。这些方法在分子生物学领域中是已知的。转导步骤可通过用于离体基因治疗的任何的标准方式来完成，包括(例如)磷酸钙法、脂质体转染法、电穿孔法、病毒感染法、和基因枪转移法。此外，也可以使用脂质体或聚合物微粒。然后可选择已成功转导的细胞，例如以用于编码序列或耐药基因的表达。接着，可对所述细胞进行灭活照射(如果需要)并注射或移植入受试者中。

在一些离体方法中，外周血单核细胞(PBMC)可从患者或合适的供体中提取，并离体暴露于活化刺激物(见前)和共刺激性变体多肽(无论是可溶性形式还是依照标准法附着在市售承载体上)。接着，可将该包含PBMC的高度活化的T细胞引入同一或不同的患者中。

一个可选择的离体策略可包括用编码B7-DC变体多肽的核酸转染或转导得自受试者的细胞。然后，将被转染或转导的细胞输回到受试者中。虽然所述细胞通常是造血细胞(例如，骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞或B细胞)，但它们还可以是很多类型细胞中任意一种，包括(但不限于)成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞或肌肉细胞，其中它们起到B7-DC变体多肽源的作用，只要它们在受试者中存活即可。造血细胞(包括上述的APC)的使用可以是特别有用的，因为相比于其他细胞，通常认为这些细胞与淋巴组织(例如***或脾脏)是同源的，因此B7-DC变体多肽可在其发挥作用(即增强免疫应答)的位点处以较高浓度产生。此外，如果使用APC，则表达外源共刺激性变体分子的APC可与将同种抗原或抗原性肽呈递给相关T细胞的APC是相同的。B7-DC变体可由APC分泌或者在其表面上表达。

可通过在体内将功能活性DNA直接转移到哺乳动物体组织或器官中来完成核酸治疗。例如，可将编码B7-DC变体多肽的核酸直接施用于淋巴组织。或者，可使用淋巴组织特异性转录调控元件(TRE)(例如B淋巴细胞、T淋巴细胞或树突状细胞特异性TRE)来完成对淋巴组织特异性的靶向。淋巴组织特异性TRE包括(例如)本领域熟知的那些(例如参见Thompson et al.(1992)Mol Cell.Biol12：1043-1053；；Todd et al.(1993)J.Exp.Med 177：1663-1674；和Penixet al.(1993)J Exp.Med.178：1483-1496)。

DNA转移可使用下面描述的各种方法来完成。可通过使用可选择的标志物(例如，G418抗性标志物)在体外测试这些***是否进行成功表达，以选择出表达DNA的转染的克隆，接着以合适的免疫分析法使用产物的抗体来检测B7-H4表达产物的存在(在可诱导***的情况下在用诱导剂处理之后进行)。通过使用已知的方法将质粒DNA线性化和使用高分子量哺乳动物DNA作为“载体”进行共转染，可以提高工序的效率，包括DNA摄入、质粒整合和整合质粒的稳定性。

本领域报道的成功“基因转移”的例子包括：(a)将质粒DNA直接注射到小鼠肌肉组织中，这导致标志物基因无限期表达(Wolff，J.A.et al.，Science 247：1465(1990)；Acsadi，G.et al.，The NewBiologist 3：71(1991))；(b)逆转录病毒载体对于血管组织的体内和原位感染是有效的；(c)将逆转录病毒制剂通过门静脉注射和直接注射到肝脏，从而进行基因转移和在体内表达(Horzaglou，M.et al.，J.Biol.Chem.265：17285(1990)；Koleko，M.et al.，Human GeneTherapy 2：27(1991)；Ferry，N.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：8387(1991))；(d)将重组腺病毒通过气管内灌注而注入到肺组织中，这对外源基因在肺呼吸上皮细胞中的体内转移和延长表达是有效的(Rosenfeld，M.A.et al.，Science 252：431(1991)；(e)单纯疱疹病毒载体在体内基因转移到脑组织(Ahmad，F.et at，eds，Miami ShortReports-Advances in Gene Technology：The Molecular Biology ofHuman Genetic Disease，Vol 1，Boerringer Manneheim Biochemicals，USA，1991)。

人逆转录病毒介导疗法利用了复制缺陷型双嗜性逆转录病毒***(Temin，H.M.，Human Gene Therapy 1：111(1990)；Temin et al.，美国专利No.4,980,289；Temin et al.，美国专利No.4,650,764；Temin etal.，美国专利No.5,124,263；Wills，J.W.美国专利No.5,175,099；Miller，A.D.，美国专利No.4,861,719)。所述载体已被用于将功能性DNA引入人细胞或组织中，例如，将腺苷脱氨酶基因引入淋巴细胞中，将NPT-II和肿瘤坏死因子基因引入肿瘤浸润性淋巴细胞中。逆转录病毒介导的基因转移一般需要进行基因转移的靶向细胞能增殖(Miller，D.G.et al.，MoL Cell.Biol 10：4239(1990))。通过某些优选的靶向细胞(其中待引入本发明的DNA分子)、即主动生长的肿瘤细胞来满足该条件。通过使用各种方法中任意一种进行质粒转染和逆转录病毒载体的转染对囊肿性纤维化的基因治疗在美国专利No.5,240,846(Collins et al.)中有所描述。

可用包装细胞系将编码B7-DC变体多肽或融合蛋白的核酸分子包装到逆转录病毒载体中，所述包装细胞系产生复制缺陷型逆转录病毒，这在本领域是熟知的(例如参见Cone，R.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6349-6353(1984)；Mann，R.F.et al.，Cell 33：153-159(1983)；Miller，A.D.et al.，Molec.Cell.Biol.5：431-437(1985)，Sorge，J.，et al.，Molec.Cell.Biol.4：1730-1737(1984)；Hock，R.A.et al.，Nature320：257(1986)；Miller，A.D.et at，Molec.Cell.Biol.6：2895-2902(1986))。对于基因转移而言高效和安全的新型包装细胞系也已有描述(Bank et al.，美国专利No.5,278,056)。

该方法可以以位点特异性方式将逆转录病毒载体递送至所选择的组织或器官。因此，例如，可以使用导管递送***(Nabel，EG et al.，Science 244：1342(1989))。使用逆转录病毒载体或脂质体载体的这类方法特别适用于将待表达的核酸递送至血管壁，或肿瘤的血液循环中。

还可使用其他的病毒载体，包括用于神经细胞特异性递送和持久性递送的重组腺病毒(Horowitz，M.S.，In：Virology，Fields，BN etal.，eds，Raven Press，New York，1990，p.1679；Berkner，K.L.，Biotechniques 6：616919(1988)，Strauss，S.E.，In：The Adenoviruses，Ginsberg，HS，ed.，Plenum Press，New York，1984，chapter 11)、单纯疱疹病毒(HSV)。腺病毒载体在人基因治疗中的优势包括以下事实：重组是罕见的，没有人恶性肿瘤已知是与该病毒有关的，腺病毒基因组是双链DNA，其可***作以容纳大小最多为7.5kb的外源基因，并且活腺病毒是安全的人疫苗生物体。腺相关病毒也可用于人的治疗(Samulski，R.J.et al.，EMBO J.10：3941(1991))。

其他可表达本文所公开的DNA分子并且可在本发明的治疗方案、特别是人中使用的载体是呈现非复制性的牛痘病毒(美国专利No.5,225,336、5,204,243、5,155,020、4,769,330；Sutter，G et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89：10847-10851；Fuerst，T.R.et al.，Proc.NatlAcad.Sci USA(1989)86：2549-2553；Falkner F.G.et al.；Nucl.AcidsRes(1987)15：7192；Chakrabarti，S et at，Molec.Cell.Biol.(1985)5：3403-3409)。包含异源DNA的重组牛痘病毒和其他病毒以及它们在免疫和DNA治疗中的用途在下列文献中有所综述：Moss，B.，Curr.Opin.Genet.Dev.(1993)3：86-90；Moss，B.Biotechnology(1992)20：345-362；Moss，B.，Curr Top Microbiol Immunol(1992)158：25-38；Moss，B.，Science(1991)252：1662-1667；Piccini，A et al.，Adv.VirusRes.(1988)34：43-64；Moss，B.et al.，Gene Amplif Anal(1983)3：201-213。

除了裸露的DNA或RNA或病毒载体，还可以使用工程改造的细菌作为载体。有大量菌株，包括沙门氏菌、BCG和单核增生李斯特氏菌(LM)(Hoiseth&Stocker，Nature 291，238-239(1981)；Poirier，TP et al.J.Exp.Med.168，25-32(1988)；(Sadoff，J.C，et al.，Science240，336-338(1988)；Stover，C.K.，et al.，Nature 351，456-460(1991)；Aldovini，A.et al.，Nature 351，479-482(1991)；Schafer，R.，et al.，J.Immunol.149，53-59(1992)；Ikonomidis，G.et al.，J.Exp.Med.180，2209-2218(1994))。这些生物体表现出作为疫苗载体的两个有前途的特性：(1)肠道感染途径提供了疫苗口服递送的可能性；(2)对单核细胞/巨噬细胞感染，从而将抗原靶向专门的APC。

除了体内的由病毒介导的基因转移，本领域熟知的物理方法也可用于DNA直接转移，包括质粒DNA的施用(Wolff et al.，1990，见上文)和微粒轰击介导的基因转移(Yang，N.-S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：9568(1990)；Williams，R.S.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：2726(1991)；Zelenin，A.V.et al.，FEBS Lett.280：94(1991)；Zelenin，A.V.et al.，FEBS Lett.244：65(1989)；Johnston，S.A.et al.，In Vitro Cell.Dev.Biol.27：11(1991))。此外，熟知的是在体外将基因转移至细胞中的电穿孔法可用于将DNA分子转移到体内组织中(Titomirov，A.V.et al.，Biochim.Biophys.Acta 1088：131((1991))。

对“载体介导的基因转移”已有描述(Wu，C.H.et al.，J.Biol.Chem.264：16985(1989)；Wu，G.Y.et al.，J.Biol.Chem.263：14621(1988)；Soriano，P.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：7128(1983)；Wang，C-Y.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7851(1982)；Wilson，J.M.et al.，J.Biol.Chem.267：963(1992))。优选的载体为靶向脂质体(Nicolau，C.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：1068(1983)；Sorianoet al.，见上文)，如免疫脂质体，其可以使酰化的单克隆抗体整合到脂质双层中(Wang et al.，见上文)。可使用聚阳离子，例如唾液酸糖蛋白/聚赖氨酸(Wu et al.，1989，见上文)，其中偶联物包含能识别靶向组织的分子(例如，肝脱唾液酸血清类粘蛋白)和用于与待转染的DNA结合的DNA结合性化合物。聚赖氨酸是DNA结合性分子的例子，其与DNA连接但并不损伤它。然后该偶联物与质粒DNA络合。

用于转染或显微注射的质粒DNA可使用本领域熟知的方法(例如使用Quiagen方法(Quiagen))来制备，然后用已知的方法纯化DNA，如本文例举的方法。

E.剂量

对于B7-DC变体多肽、B7-DC变体融合蛋白以及编码B7-DC多肽和B7-DC变体融合蛋白的核酸，随着进一步研究的进行，将获得关于在各种患者中治疗各种病症的合适剂量水平的信息，而且考虑到接受治疗者的治疗内容、年龄和总体健康情况，普通技术人员能够确定合适的剂量。选择的剂量取决于所需的治疗效果、给药途径和所需治疗的持续时间。通常，每天以0.001至10毫克/公斤体重的剂量水平给药于哺乳动物。通常，静脉注射或输液的剂量可以较低。

实施例

通过参照下列非限制性实施例，可进一步理解本发明。

实施例1B7-DC的分子模型和三维序列分析

材料和方法

基于人CD80和CD86的X射线坐标，通过同源(或相当的)模型产生人B7-H1(hB7-H1)、小鼠B7-H1(mB7-H1)、人B7-DC(hB7-DC)和小鼠B7-DC(mB7-DC)的Ig V型结构域的分子模型，这可在CD80/CTLA-4和CD86/CTLA-4的复合物结构中见到。首先，将CD80和CD86的V-结构域最优地叠加，并基于该叠加对B7族成员序列进行比对。用MOE(Molecular Operating Environment，ChemicalComputing Group，Montreal，Quebec，Canada)的序列-结构比对功能完成该叠加和最初的比对。然后进行手动调整比对以相互符合Ig共有序列位置，并在靶序列上画出其他的保守疏水性残基，以在X射线结构中确定核心位置。因此，在比对序列中的相应的残基被预测具有大致等同的空间位置。如果一致性较低，如本发明的这种情况，与仅考虑序列一致性的比对校准相比，将这种结构信息纳入考虑范畴通常是更加可靠的比对标准。在比对的区域中，相对于两个结构模板CD80和CD86，被比较的B7序列仅有约16％的平均一致性。图5示出了结构取向的比对的最终版本，其提供了建模的基础。在比对后，四个模型的核心区域用来自所述结构模板的MOE自动组装，环区域中的***和缺失通过应用链段匹配程序来建模(Levitt，J Mol Biol.，226：507-533(1992)；Fechteler，et al.，J.Mol.Biol.，253：114-131(1995))。使用在高分辨率蛋白质结构数据库中的优选的旋转异构体构象来完成侧链的置换(Ponder and Richards，J.Mol Biol，193：775-791(1987)；Berman，et al.，Nucl.Acids Res.，28：235-242(2000))。在每一种情况下，产生二十个中间体模型，计算平均坐标，所得结构是在使用蛋白力场的情况下能量最小化的(Engh and Huber，Ada Cryst.，A47：392-400(1991))，直到各模型的分子内接触和立体化学是合理的为止。用InsightII(Accelrys，San Diego，California)进行模型的图形化分析，包括溶剂可及表面的计算(Connolly，J Appl Cryst，16：548-558(1983))和残基作图研究。

结果

CD 80和CD 86的V-区域仅具有有限的序列同一性(约20％)，但通过独立晶体学研究揭示出它们的三维结构非常相似。在CD80/CD86中见到的许多核或Ig超家族共有序列残基位置，在其他B7族成员(包括B7-H1和B7-DC)中也还是保守的或保守置换的(图5)。

构建小鼠和人的B7-H1和B7-DC分子的分子模型。这些模型揭示了在V-区域中，与整个B7族的平均同一性相比，B7-H1和B7-DC具有的同一性高约34％。因为B7-H1和B7-DC均与PD-1结合，所以残基保守性对于形成受体结合性结构可能是有显著意义的。因此，该模型被用于对暴露于蛋白表面上的保守残基的推定分布进行比较。对这些分子模型的并排比较揭示了B7-H1和B7-DC的BED面上的表面残基具有明显的保守性，人蛋白比小鼠蛋白更保守。相反，反面的A′GFCC ′C″面没有显示出显著的残基保守性。所述结果是有些出乎意料的，因为CD80和CD86相应的A′GFCC′C″面均包含CD28/CTLA-4结合位点。

实施例2受体结合位点的诱变分析

方法和材料：

小鼠和细胞系：

雌性C57BL/6(B6)小鼠，购自国立癌症研究所(Frederick，MD)。PD-1缺失(PD-1^-/-)型小鼠通过前人所述方法产生(Nishimura，et al.Int.Immunol，10：1563-1572(1998))。分泌融合蛋白的稳定转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞克隆在添加有1％透析胎牛血清(FBS；HyClone，Logan，UT)的CHO-SF II培养基(Invitrogen Life Technologies)中培养。淋巴细胞和COS细胞在添加有10％FBS、25mM HEPES、2mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1％MEM非必需氨基酸、100U/mL青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM；Invitrogen Life Technologies)中生长。

定点诱变：

通过使用B7-DC Ig cDNA作为模板、利用两步PCR技术来构建B7-DC Ig的所有变体。合成了交叉重叠的寡核苷酸引物以编码所需的突变，设计了两侧的5′和3′引物用于分别容纳EcoRI和Bgl II限制位点。起初使用相应的交叉重叠引物和侧翼引物来扩增cDNA的合适区域。使用5′和3′侧翼引物，将具有交叉重叠的序列的片段融接在一起，并进行扩增。PCR产物用EcoR I和Bgl II消化并连接到经EcoRI/Bgl II消化的pHIg载体中。为了验证是否引入了所需突变，使用了ABI Prism 310基因分析仪对每个变体进行测序。将质粒转染到COS细胞中，收获无血清上清，并将其用于体外结合分析，或者在蛋白G柱上分离以用于BIAcore分析和功能性分析。

Ig融合蛋白：

用稳定转染的CHO细胞来制备含有小鼠PD-1的胞外域的融合蛋白，所述胞外域与小鼠IgG2a(PD-1Ig)的Fc部分连接，该融合蛋白通过上述蛋白G亲和柱层析分离(Wand，et al.见上文)。总RNA分离自小鼠脾脏细胞，B7-DC cDNA通过反转录PCR获得。通过用包含嵌合cDNA的质粒瞬时转染COS细胞来制备小鼠B7-DC Ig，其中所述嵌合cDNA包含在读码框中连接到人IgG1的CH2-CH3部分的小鼠B7-DC的胞外域。通过包含嵌合cDNA的质粒瞬时转染COS细胞来制备人B7-DC Ig，所述嵌合cDNA包含在读码框中连接到人IgG1的CH2-CH3部分的人B7-DC的胞外域。将转染的COS细胞在无血清的DMEM中培养，浓缩的上清被用作进行初始结合分析的Ig融合蛋白源。该Ig蛋白被进一步在蛋白G柱上分离以用于前人所述的BIAcore分析和功能性分析(Wand，et al.见上文)。

ELlSA：

建立了对B7-DCIg特异性夹心型ELlSA。将微量滴定板用2fig/ml的羊抗人IgG(Sigma，St.Louis，MO)进行包覆并在4℃下过夜。将孔用封闭液(含10％FBS的PBS)封闭1小时，然后用含有0.05％的吐温20的PBS(PBS-Tween)洗涤。加入COS细胞培养物上清，并在室温下温育2小时。还向各个板的单独孔中加入已知浓度的分离的B7-DCIg以建立标准曲线。在充分洗涤后，添加1∶2000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)-结合的羊抗人IgG(TAGO，Inc.，Burlingame，CA)，随后用TMB底物显色，然后添加0.5M H₂SO₄用于终止反应。用微量滴定板阅读器测量405mm处的吸光度。通过与B7-DC Ig标准曲线的线性范围内的部分进行比较，确定变体融合蛋白的浓度。收集了三重微孔的数据，平均值的标准偏差小于10％。实验重复至少三次。

使用捕获ELISA分析法来测定突变型和野生型B7-DCIg融合多肽结合PD-1的能力。用5μg/ml的重组型PD-1 Ig融合蛋白包覆微量滴定板，并在4℃下过夜。将板封闭和洗涤，添加COS细胞培养基，并在室温下温育2小时。在充分洗涤后，添加HRP-结合的羊抗人IgG，接着用TMB底物显色并测量405mm处的吸光度。

流式细胞术：

将人胚胎肾293细胞用PD-1GFP载体转染，所述载体是通过在读码框中将GFP(绿色荧光蛋白cDNA)融合到全长小鼠PD-1cDNA的C末端来构建的。在转染24小时后收获细胞，将其在FACS(荧光活化细胞分选)缓冲液(PBS、3％FBS、0.02％NaN₃)中与等量融合蛋白在冰上温育45分钟，所述融合蛋白已用野生型B7-DC Ig在COS细胞培养基中进行了滴定。包含人Ig的无关的融合蛋白被用作阴性对照。洗涤细胞，进一步与荧光素异硫氰酸(PE)-结合的羊抗人IgG(BioSource，Camarillo，CA)温育，并用FACScaliber(BectonDickinson，Mountain View，CA)的Cell Quest软件(Becton Dickinson)进行分析。GFP-阳性细胞被FL1屏蔽(gate)。

表面等离子体共振分析：

分离的野生型B7-DC多肽和B7-DC变体多肽的亲和性用BIAcore^TM 3000设备(Biacore AB，Uppsala，Sweden)分析。除融合蛋白外所有的试剂均购于BIAcore并预先过滤和脱气。所有的实验在25℃下使用0.1M HEPES、0.15M NaCl(pH 7.4)作为运行缓冲液来进行。简要地说，首先将PD-1Ig依照BIAcore手册通过胺偶联而固定到CM5传感器芯片(BIAcore)上。CM5芯片的流动池通过向其中注入1∶1EDC∶NHS[N-乙基-N′-(二乙基氨基丙基)碳化二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺]混合物7分钟、接着以10μl/min注入用10mM乙酸钠(pH4.5)稀释的20μg/ml PD-1Ig来衍生化。PD-1Ig在2000RU被固定。接着用1M氨基乙醇(pH 8.5)来封闭残留的活化羧基。用与上述类似的方法制备对照流动池，只是用运行缓冲液替换PD-1Ig。融合蛋白用运行缓冲液稀释为一系列的浓度：3.75、7.5、15、30和60μg/ml。在20μl/min的流速下注入蛋白3分钟，并为分离数据的目的，允许缓冲液溢出表面5分钟。用10mM NaOH的单一一次30秒的脉冲来使流动池再生。使用BIAevaluation软件包3.1(BIAcore)进行数据分析。

结果分析：

在分子模型的帮助下，逐一研究B7-DC的V结构域的重要残基。为了定点突变，在BED和A′GFCC′C″面上均选出保守和非保守残基。使小鼠分子中的残基突变以能够接下来对所选的突变蛋白进行功能性研究。对于与PD-1的结合，所得变体蛋白的结合特性通过特异性ELISA和FACS分析法来分析。准备和测试了17个mB7-DC变体。表1中概括了测试结果。如果mB7-DC内的特定残基的突变以FACS测量产生至少50％结合损失或以ELISA测量产生至少一个数量级的结合损失，那么其才将被认为对配体-受体交互作用而言是重要的。

约一半的这些残基的突变显著地破坏了与mPD-1的结合。特别是，mB7-DC的残基E71、I105、D111和K113被确定为对于与mPD1结合而言是重要的。通过ELISA测定发现，mB7-DC中的S58残基突变使之与mPD-1的结合增强。因此，此残基必须至少与受体-配体界面靠近，并且不仅对置换有耐受性，而且是结合性相互作用的潜在的最优配置。

还使用ELISA和FACS测试了人B7-DC变体与PD-1的结合。hB7-DC残基K114和D111的突变被确定为对于与mPD1的结合而言是重要的。FACS分析结果在图7中示出。

表1小鼠B7-DC变体的氨基酸置换和结合特性的概述

PD-1结合位点被作图定位于反面A′GFCC′C″面上的等同区域。结合位点区域的作图揭示了，其突变对PD-1结合带来负(正)影响的那些残基，可以在两个配体中形成粘合表面。重要残基和对结合而言并不重要的某些残基之间接近，再次说明所观察到的作用是特殊的，而且不是全部结构变化的结果。对重要残基位点的比较证实了在mB7-DC中的推定结合位点的位置与CD86和CD80中的CD28/CTLA-4结合位点密切对应。

野生型和突变型蛋白与PD-1结合的表面等离子体共振分析结果与FACS和ELISA分析结果非常相符。野生型B7-DC蛋白的R_max为227RU，而B7-DC变体K113根本没有与PD-1结合(图6)。这些数据说明了野生型B7-DC比变体K113对PD-1具有更稳定状态的亲和性。与野生型B7-DC相比，B7-DC K113变体显示了更慢的结合率和解离率，或者没有结合率和解离率。

实施例3B7-DC变体的共刺激功能

材料和方法：

T细胞增殖和细胞因子分析：

如前人所述(Wang，et al.见上文)，使用尼龙羊毛柱(RobbinsScientific Co，Sunnyvale，CA)来分离野生型B6小鼠或PD-1^-/-小鼠中的T细胞。将富集的T细胞在5μg/ml融合多肽或对照多肽存在下以每孔3×10⁵个细胞在96孔的平底微孔板中进行培养，所述微孔板已用抗CD3mAb(clone 145-2C11，Pharmingen，San Diego，CA)预包覆。T细胞的增殖由在3日培养的最后12小时中的1μCi/孔³H-TdR的掺入量来确定。使用MicroBeta Trilux液体闪烁计数器(Wallac，Finland)来计数³H-TdR的掺入量。为了检测细胞因子，在各个时间点收集培养基上清，按照厂商的指导手册(Pharmingen)通过夹心型ELISA法测定IFN-γ的浓度。

结果分析：

还测定了选定的变体的共刺激能力。B7-DC变体K113和D111被选择用于分析。在FACS和ELISA分析中K113和D111都具有与PD-1最小的结合性(表1)。如图8A和8B所示的，与野生型B7-DC相比，所述变体还能够共刺激T细胞增殖和IFN-y产生。

尽管B7-DC可能通过未知的受体来共刺激T细胞的生长，但是这些发现可被解释为未被识别的共刺激性受体和PD-1的整合刺激作用。因此，在PD-1缺乏型T细胞中测定了B7-DC变体的共刺激作用。野生型和变体型B7-DC多肽都共刺激PD-1^-/-T细胞的增殖，所述增殖相当于或优于PD-1^+/+细胞的增殖(图8A与图9相比)。因此，这些观察结果明显表明，B7-DC通过非PD-1受体共刺激T细胞的生长。

实施例4.野生型和变体型B7-DC在具有免疫活性的纯系小鼠和免疫缺陷型纯系小鼠中对于肿瘤细胞生长的作用

上述实施例表明与抑制性受体程序化死亡因子-1(PD-1)没有结合性的B7-DC变体保留了对T细胞的共刺激功能。这些结果表明B7-DC突变体可用于增强抗肿瘤的免疫应答。因此，检验了B7-DC和B7-DC变体在整个动物中刺激抗肿瘤免疫性的能力。将包含编码点突变的cDNA的质粒K113S B7-DC通过电穿孔法转染到小鼠肿瘤细胞系EG7中。建立了稳定表达K113S B7-DC的EG7细胞系。通过流式细胞术分析，使用对B7-DC特异性的单克隆抗体，来证实B7-DC在EG7转染子的亚系EG7/K113S的细胞表面上的表达。还用亲本质粒(空载体)转染EG7细胞作为阴性对照，或者用包含野生型B7-DC的质粒(EG7/Wt B7-DC)转染EG7细胞作为附加对照。空载体EG7转染的细胞不表达可检测的B7-DC，而野生型B7-DC稳定转染子表达B7-DC的水平与用K113S B7-DC稳定转染的细胞水平相当。

将EG7/K113S细胞皮下接种到10只具有免疫活性的C57BL/6纯系小鼠中，诱导肿瘤细胞暂时生长成小瘤。然而，这些肿瘤迅速地消退。20天后，所有的肿瘤全部消失。相反，接种空载体EG7细胞系则诱导肿瘤日益生长，并最终在30-40天时导致小鼠死亡。接种野生型B7-DC细胞系的小鼠也诱导肿瘤日益生长。然而，它们的生长比接种空载体EG7细胞系的要慢许多(图10)

虽然这些结果说明K113S B7-DC在肿瘤细胞上的表达在具有免疫活性的小鼠中诱导肿瘤消退，但是还不清楚这些作用是否受到免疫***介导。为了确认这一点，将K113S B7-DC细胞皮下接种到免疫缺陷型裸鼠中。结果表明EG7/K113S细胞的生长率与空载体细胞系和野生型B7-DC细胞系的生长率类似，而且肿瘤没有消退(图11)。因此所述结果证明肿瘤消退是受免疫***介导的并且K113S B7-DC的表达刺激了强有力的免疫应答。

为了证明K113S B7-DC刺激抗肿瘤免疫性并不限于EG7肿瘤细胞，使用稳定转染的小鼠P815肥大细胞瘤细胞进行类似的实验。K113S B7-DC、亲本质粒和含野生型B7-DC的质粒也被转染以建立对照细胞系。在使用上述特异性抗体的流式细胞术分析后，挑选表达相当水平的B7-DC的肿瘤细胞亚系。与EG7/K11S肿瘤细胞系类似，将P815/K113S细胞皮下接种到10只具有免疫活性的DBA/2纯系小鼠中，诱导肿瘤暂时生长，而且所有肿瘤迅速地消退。接种空载体转染的P815细胞则诱导肿瘤日益生长，而注射P815/野生型B7-DC细胞也诱导肿瘤日益生长。然而，它们的生长比接种空载体P815细胞系的要慢很多(图12)。将这些肿瘤细胞系接种到免疫缺失型nu/nu小鼠中，则诱导肿瘤以类似的速率生长(图13)，这些结果支持免疫***在B7-DC转染子的抗肿瘤生长方面发挥作用。

实施例5.B7-DCIg在小鼠中对于肿瘤生长的治疗作用

为了测定B7-DC蛋白对于肿瘤生长的治疗作用，对长有在免疫活性小鼠中建立的P815肿瘤的小鼠，用B7-DCIg融合蛋白进行治疗。将野生型P815细胞接种到小鼠中，诱导肿瘤日益生长。在第3天和第8天给小鼠腹腔内注射0.1mg B7-DCIg，抑制肿瘤生长(图14)。

除非另有规定，否则本文中使用的所有技术和科技术语与本发明所属技术领域的技术人员通常所理解的意义相同。

本领域技术人员仅通过常规实验就会认识到或能够确定本文所述的本发明具体实施方案的许多等同方式。这些等同方式也被认为包括在所附权利要求中。

序列表

<110>约翰霍普金斯大学

<120>B7-DC变体

<130>VI-091719-59：57

<160>12

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>273

<212>PRT

<213>Homo Sapien

<400>1

Met Ile Phe Leu Leu Leu Met Leu Ser Leu Glu Leu Gln Leu His Gln

1               5                   10                  15

Ile Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Leu Tyr Ile Ile

            20                   25                 30

Glu His Gly Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn Phe Asp Thr Gly Ser

        35                   40                 45

His Val Asn Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn

    50                   55                 60

Asp Thr Ser Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu

65                   70                 75                  80

Pro Leu Gly Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln Val Gln Val Arg Asp

                85                  90                  95

Glu Gly Gln Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr

            100                 105                 110

Lys Tyr Leu Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys Ile Asn Thr

        115                 120                 125

His Ile Leu Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val Glu Leu Thr Cys Gln

    130                 135                 140

Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Pro Asn Val Ser Val

145                 150                 155                 160

Pro Ala Asn Thr Ser His Ser Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val

                165                 170                 175

Thr Ser Val Leu Arg Leu Lys Pro Pro Pro Gly Arg Asn Phe Ser Cys

            180                 185                 190

Val Phe Trp Asn Thr His Val Arg Glu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Asp

        195                 200                 205

Leu Gln Ser Gln Met Glu Pro Arg Thr His Pro Thr Trp Leu Leu His

    210                 215                 220

Ile Phe Ile Pro Ser Cys Ile Ile Ala Phe Ile Phe Ile Ala Thr Val

225                 230                 235                 240

Ile Ala Leu Arg Lys Gln Leu Cys Gln Lys Leu Tyr Ser Ser Lys Asp

                245                 250                 255

Thr Thr Lys Arg Pro Val Thr Thr Thr Lys Arg Glu Val Asn Ser Ala

            260                 265                 270

Ile

<210>2

<211>247

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>2

Met Leu Leu Leu Leu Pro Ile Leu Asn Leu Ser Leu Gln Leu His Pro

1               5                   10                  15

Val Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Ala Pro Lys Glu Val Tyr Thr Val

            20                  25                  30

Asp Val Gly Ser Ser Val Ser Leu Glu Cys Asp Phe Asp Arg Arg Glu

        35                  40                  45

Cys Thr Glu Leu Glu GlyIle Arg Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn

    50                  55                  60

Asp Thr Ser Leu Gln Ser Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu

65                  70                  75                  80

Pro Leu Gly Lys Ala Leu Phe His Ile Pro Ser Val Gln Val Arg Asp

                85                  90                  95

Ser Gly Gln Tyr Arg Cys Leu Val Ile Cys Gly Ala Ala Trp Asp Tyr

            100                 105                 110

Lys Tyr Leu Thr Val Lys Val Lys Ala Ser Tyr Met Arg Ile Asp Thr

        115                 120                 125

Arg Ile Leu Glu Val Pro Gly Thr Gly Glu Val Gln Leu Thr Cys Gln

    130                 135                 140

Ala Arg Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp Gln Asn Val Ser Val

145                 150                 155                 160

Pro Ala Asn Thr Ser His Ile Arg Thr Pro Glu Gly Leu Tyr Gln Val

                165                 170                 175

Thr Ser Val Leu Arg Leu Lys Pro G1n Pro Ser Arg Asn Phe Ser Cys

            180                 185                 190

Met Phe Trp Asn Ala His Met Lys Glu Leu Thr Ser Ala Ile Ile Asp

        195                 200                 205

Pro Leu Ser Arg Met Glu Pro Lys Val Pro Arg Thr Trp Pro Leu His

    210                 215                 220

Val Phe Ile Pro Ala Cys Thr Ile Ala Leu Ile Phe Leu Ala Ile Val

225                 230                 235                 240

IleIle Gln Arg Lys Arg Ile

               245

<210>3

<211>822

<212>DNA

<213>Homo Sapiens

<400>3

atgatcttcc tcctgctaat gttgagcctg gaattgcagc ttcaccagat agcagcttta     60

ttcacagtga cagtccctaa ggaactgtac ataatagagc atggcagcaa tgtgaccctg    120

gaatgcaact ttgacactgg aagtcatgtg aaccttggag caataacagc cagtttgcaa    180

aaggtggaaa atgatacatc cccacaccgt gaaagagcca ctttgctgga ggagcagctg    240

cccctaggga aggcctcgtt ccacatacct caagtccaag tgagggacga aggacagtac    300

caatgcataa tcatctatgg ggtcgcctgg gactacaagt acctgactct gaaagtcaaa    360

gcttcctaca ggaaaataaa cactcacatc ctaaaggttc cagaaacaga tgaggtagag    420

ctcacctgcc aggctacagg ttatcctctg gcagaagtat cctggccaaa cgtcagcgtt    480

cctgccaaca ccagccactc caggacccct gaaggcctct accaggtcac cagtgttctg    540

cgcctaaagc caccccctgg cagaaacttc agctgtgtgt tctggaatac tcacgtgagg    600

gaacttactt tggccagcat tgaccttcaa agtcagatgg aacccaggac ccatccaact    660

tggctgcttc acattttcat cccctcctgc atcattgctt tcattttcat agccacagtg    720

atagccctaa gaaaacaact ctgtcaaaag ctgtattctt caaaagacac aacaaaaaga    780

cctgtcacca caacaaagag ggaagtgaac agtgctatct ga                       822

<210>4

<211>744

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>4

atgctgctcc tgctgccgat actgaacctg agcttacaac ttcatcctgt agcagcttta     60

ttcaccgtga cagcccctaa agaagtgtac accgtagacg tcggcagcag tgtgagcctg    120

gagtgcgatt ttgaccgcag agaatgcact gaactggaag ggataagagc cagtttgcag    180

aaggtagaaa atgatacgtc tctgcaaagt gaaagagcca ccctgctgga ggagcagctg    240

cccctgggaa aggctttgtt ccacatccct agtgtccaag tgagagattc cgggcagtac    300

cgttgcctgg tcatctgcgg ggccgcctgg gactacaagt acctgacggt gaaagtcaaa    360

gcttcttaca tgaggataga cactaggatc ctggaggttc caggtacagg ggaggtgcag    420

cttacctgcc aggctagagg ttatccccta gcagaagtgt cctggcaaaa tgtcagtgtt    480

cctgccaaca ccagccacat caggaccccc gaaggcctct accaggtcac cagtgttctg    540

cgcctcaagc ctcagcctag cagaaacttc agctgcatgt tctggaatgc tcacatgaag    600

gagctgactt cagccatcat tgaccctctg agtcggatgg aacccaaagt ccccagaacg    660

tggccacttc atgttttcat cccggcctgc accatcgctt tgatcttcct ggccatagtg    720

ataatccaga gaaagaggat ctag                                           744

<210>5

<211>109

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>5

Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln

1               5                   10                  15

Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp

            20                  25                  30

Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val Tyr Leu Gly Lys Glu

        35                  40                  45

Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met Gly Arg Thr Ser Phe Asp

    50                  55                  60

Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn Leu Gln Ile Lys Asp Lys

65                  70                  75                  80

Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys Lys Pro Thr Cys Met Ile

                85                  90                  95

Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser Val Leu Ala

            100                 105

<210>6

<211>105

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>6

Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly

1               5                   10                  15

His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp Gln

            20                  25                  30

Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met AsnIle

        35                  40                  45

Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg ThrIle Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu

    50                  55                  60

Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu

65                  70                  75                  80

Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His Leu

                85                  90                  95

Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala

            100                 105

<210>7

<211>113

<212>PRT

<213>homo sapiens

<400>7

Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys

1               5                   10                  15

Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp

            20                  25                  30

Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp

        35                  40                  45

Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys

    50                  55                  60

Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala Leu GlnIle Thr Asp Val Lys

65                  70                  75                  80

Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys MetIle Ser Tyr Gly Gly Ala

                85                  90                  95

Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn LysIle

            100                 105                 110

Asn

<210>8

<211>113

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>8

Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser Asn Val Thr Met Glu Cys Arg

1               5                   10                  15

Phe Pro Val Glu Arg Glu Leu Asp Leu Leu Ala Leu Val Val Tyr Trp

            20                  25                  30

Glu Lys Glu Asp Glu Gln Val Ile Gln Phe Val Ala Gly Glu Glu Asp

        35                  40                  45

Leu Lys Pro Gln His Ser Asn Phe Arg Gly Arg Ala Ser Leu Pro Lys

    50                  55                  60

Asp Gln Leu Leu Lys Gly Asn Ala Ala Leu GlnIle Thr Asp Val Lys

65                  70                  75                  80

Leu Asp Asp Ala Gly Val Tyr Cys CysIle Ile Ser Tyr Gly Gly Ala

                85                  90                  95

Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Leu Lys Val Asn Ala Pro Tyr Arg Lys Ile

            100                 105                 110

Asn

<210>9

<211>114

<212>PRT

<213>homo sapiens

<400>9

Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp Val Glu Leu Ser Cys Ala

1               5                   10                  15

Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn Asp Val Tyr Val Tyr Trp

            20                  25                  30

Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr Tyr His Ile Pro Gln Asn

        35                  40                  45

Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr Arg Asn Arg Ala Leu Met

    50                  55                  60

Ser Pro Ala Gly Leu Met Arg Gly Asp Phe Ser Leu Arg Leu Phe Asn

65                  70                  75                  80

Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His Cys Leu Val Leu Ser Gln

                85                  90                  95

Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val Glu Val Thr Leu His Val

            100                 105                 110

Ala Ala

<210>10

<211>110

<212>PRT

<213>homo sapiens

<400>10

Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Cys Cys Ser

1               5                   10                  15

Pro Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp

            20                  25                  30

Gln Leu Thr Asp Thr Gln Leu Val His Ser Phe Ala Glu Gly Gln Asp

        35                  40                  45

Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu

    50                  55                  60

Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp

65                  70                  75                  80

Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala

                85                  90                  95

Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser

            100                 105                 110

<210>11

<211>98

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>11

Glu Leu Tyr Ile Ile Glu His Gly Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn

1               5                   10                  15

Phe Asp Thr Gly Ser His Val Asn Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu

            20                  25                  30

Gln Lys Val Glu Asn Asp Thr Ser Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu

        35                  40                  45

Leu Glu Glu Gln Leu Pro Leu Gly Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln

    50                  55                  60

Val Gln Val Arg Asp Glu Gly Gln Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly

65                  70                  75                  80

Val Ala Trp Asp Tyr Lys Tyr Leu Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr

                85                  90                  95

Arg Lys

<210>12

<211>98

<212>PRT

<213>Mus Musculus

<400>12

Glu Val Tyr Thr Val Asp Val Gly Ser Ser Val Ser Leu Glu Cys Asp

1               5                   10                  15

Phe Asp Arg Arg Glu Cys Thr Glu Leu Glu Gly Ile Arg Ala Ser Leu

            20                  25                  30

Gln Lys Val Glu Asn Asp Thr Ser Leu Gln Ser Glu Arg Ala Thr Leu

        35                  40                  45

Leu Glu Glu Gln Leu Pro Leu Gly Lys Ala Leu Phe His Ile Pro Ser

    50                  55                  60

Val Gln Val Arg Asp Ser Gly Gln Tyr Arg Cys Leu Val Ile Cys Gly

65                  70                  75                  80

Ala Ala Trp Asp Tyr Lys Tyr Leu Thr Val Lys Val Lys Ala Ser Tyr

                85                  90                  95

Met Arg

Claims (16)

1.一种用于诱导针对肿瘤的免疫应答的免疫原性组合物，包含：

(a)一种或多种肿瘤抗原，和

(b)B7-DC变体多肽、包含所述B7-DC变体多肽的B7-DC变体融合蛋白、编码B7-DC变体多肽或编码B7-DC变体融合蛋白的核酸、或含有表达B7-DC变体多肽或B7-DC变体融合蛋白的载体的宿主细胞，

其中所述B7-DC变体多肽含有IgV结构域，其中所述B7-DC变体多肽为野生型B7-DC多肽的变体，由用丝氨酸残基对氨基酸残基的替换构成，该被替换的氨基酸残基对应于野生型鼠B7-DC的SEQ ID NO：2或野生型人B7-DC的SEQ ID NO：1中从起始甲硫氨酸开始编号的第111位的氨基酸。

2.一种用于诱导针对肿瘤的免疫应答的免疫原性组合物，包含：

(a)一种或多种肿瘤抗原，和

(b)B7-DC变体多肽、包含所述B7-DC变体多肽的B7-DC变体融合蛋白、编码B7-DC变体多肽或编码B7-DC变体融合蛋白的核酸、或含有表达B7-DC变体多肽或B7-DC变体融合蛋白的载体的宿主细胞，

其中所述B7-DC变体多肽含有IgV结构域，其中所述B7-DC变体多肽为野生型B7-DC多肽的变体，由用丝氨酸残基对氨基酸残基的替换构成，该被替换的氨基酸残基对应于野生型鼠B7-DC的SEQ ID NO：2或野生型人B7-DC的SEQ ID NO：1中从起始甲硫氨酸开始编号的第113位的氨基酸。

3.一种用于诱导针对肿瘤的免疫应答的免疫原性组合物，包含：

(a)一种或多种肿瘤抗原，和

(b)B7-DC变体多肽、包含所述B7-DC变体多肽的B7-DC变体融合蛋白、编码B7-DC变体多肽或编码B7-DC变体融合蛋白的核酸、或含有表达B7-DC变体多肽或B7-DC变体融合蛋白的载体的宿主细胞，

其中所述B7-DC变体多肽含有IgV结构域，其中所述B7-DC变体多肽为野生型B7-DC多肽的变体，由用丝氨酸残基对氨基酸残基的替换构成，该被替换的氨基酸残基对应于野生型鼠B7-DC的SEQ ID NO：2或野生型人B7-DC的SEQ ID NO：1中从起始甲硫氨酸开始编号的第56位的氨基酸。

4.一种用于诱导针对肿瘤的免疫应答的免疫原性组合物，包含：

(a)一种或多种肿瘤抗原，和

(b)B7-DC变体多肽、包含所述B7-DC变体多肽的B7-DC变体融合蛋白、编码B7-DC变体多肽或编码B7-DC变体融合蛋白的核酸、或含有表达B7-DC变体多肽或B7-DC变体融合蛋白的载体的宿主细胞，

其中所述B7-DC变体多肽含有IgV结构域，其中所述B7-DC变体多肽为野生型B7-DC多肽的变体，由用酪氨酸残基对氨基酸残基的替换构成，该被替换的氨基酸残基对应于野生型鼠B7-DC的SEQ ID NO：2或野生型人B7-DC的SEQ ID NO：1中从起始甲硫氨酸开始编号的第67位的氨基酸。

5.一种用于诱导针对肿瘤的免疫应答的免疫原性组合物，包含：

(a)一种或多种肿瘤抗原，和

(b)B7-DC变体多肽、包含所述B7-DC变体多肽的B7-DC变体融合蛋白、编码B7-DC变体多肽或编码B7-DC变体融合蛋白的核酸、或含有表达B7-DC变体多肽或B7-DC变体融合蛋白的载体的宿主细胞，

其中所述B7-DC变体多肽含有IgV结构域，其中所述B7-DC变体多肽为野生型B7-DC多肽的变体，由用丝氨酸残基对氨基酸残基的替换构成，该被替换的氨基酸残基对应于野生型鼠B7-DC的SEQ ID NO：2或野生型人B7-DC的SEQ ID NO：1中从起始甲硫氨酸开始编号的第71位的氨基酸。

6.一种用于诱导针对肿瘤的免疫应答的免疫原性组合物，包含：

(a)一种或多种肿瘤抗原，和

(b)B7-DC变体多肽、包含所述B7-DC变体多肽的B7-DC变体融合蛋白、编码B7-DC变体多肽或编码B7-DC变体融合蛋白的核酸、或含有表达B7-DC变体多肽或B7-DC变体融合蛋白的载体的宿主细胞，

其中所述B7-DC变体多肽含有IgV结构域，其中所述B7-DC变体多肽为野生型B7-DC多肽的变体，由用丝氨酸残基对氨基酸残基的替换构成，该被替换的氨基酸残基对应于野生型鼠B7-DC的SEQ ID NO：2或野生型人B7-DC的SEQ ID NO：1中从起始甲硫氨酸开始编号的第101位的氨基酸。

7.一种用于诱导针对肿瘤的免疫应答的免疫原性组合物，包含：

(a)一种或多种肿瘤抗原，和

(b)B7-DC变体多肽、包含所述B7-DC变体多肽的B7-DC变体融合蛋白、编码B7-DC变体多肽或编码B7-DC变体融合蛋白的核酸、或含有表达B7-DC变体多肽或B7-DC变体融合蛋白的载体的宿主细胞，

其中所述B7-DC变体多肽含有IgV结构域，其中所述B7-DC变体多肽为野生型B7-DC多肽的变体，由用丙氨酸残基对氨基酸残基的替换构成，该被替换的氨基酸残基对应于野生型鼠B7-DC的SEQ ID NO：2或野生型人B7-DC的SEQ ID NO：1中从起始甲硫氨酸开始编号的第105位的氨基酸。

8.权利要求1-7任一项所述的免疫原性组合物，其中所述B7-DC变体多肽是分离的鼠或人B7-DC变体多肽。

9.权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含B7-DC变体融合蛋白，所述B7-DC变体融合蛋白包含：

a)作为第一融合伴侣的权利要求1至7中任意一项所述的B7-DC变体多肽；和

b)作为第二融合伴侣的Ig重链恒定区的一个或多个结构域。

10.权利要求9所述的免疫原性组合物，其中所述B7-DC变体融合蛋白的所述第二融合伴侣包含对应于人免疫球蛋白链的铰链区、C_H2区和C_H3区的氨基酸序列。

11.权利要求1-7任一项所述的免疫原性组合物，其中所述抗原是选自由下列物质组成的组中的肿瘤抗原：α-辅肌动蛋白-4、Bcr-Abl融合蛋白、Casp-8、β-连环素、cdc27、cdk4、cdkn2a、coa-1、dek-can融合蛋白、EF2、ETV6-AML1融合蛋白、LDLR、岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-1、2和3、neo-PAP、I类阻凝蛋白、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PTPRK、K-ras、N-ras、磷酸甘油醛异构酶、Bage-1、Gage3、4、5、6、7、GnTV、Herv-K-mel、Lage-1、Mage-A1、2、3、4、6、10、12、Mage-C2、NA-88、NY-Eso-l／Lage-2、SP17、SSX-2、和TRP2-Int2、MelanA／MART-I、gp100／Pmel17、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15，p58、CEA、RAGE、NY-ESO，LAGE、SCP-1、Hom／Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2／neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、Epstein Barr病毒抗原、EBNA、人***瘤病毒抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、α-甲胎蛋白、13HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3，CA27.29／BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68＼KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733／EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB＼70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90／Mac-2结合蛋白／亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。

12.权利要求8所述的免疫原性组合物，其中所述抗原是选自由下列物质组成的组中的肿瘤抗原：α-辅肌动蛋白-4、Bcr-Abl融合蛋白、Casp-8、β-连环素、cdc27、cdk4、cdkn2a、coa-1、dek-can融合蛋白、EF2、ETV6-AML1融合蛋白、LDLR、岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-1、2和3、neo-PAP、I类阻凝蛋白、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PTPRK、K-ras、N-ras、磷酸甘油醛异构酶、Bage-1、Gage3、4、5、6、7、GnTV、Herv-K-mel、Lage-1、Mage-A1、2、3、4、6、10、12、Mage-C2、NA-88、NY-Eso-l／Lage-2、SP17、SSX-2、和TRP2-Int2、MelanA／MART-I、gp100／Pmel17、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15，p58、CEA、RAGE、NY-ESO，LAGE、SCP-1、Hom／Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2／neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、Epstein Barr病毒抗原、EBNA、人***瘤病毒抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、α-甲胎蛋白、13HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3，CA27.29／BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68＼KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733／EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB＼70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90／Mac-2结合蛋白／亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。

13.权利要求9所述的免疫原性组合物，其中所述抗原是选自由下列物质组成的组中的肿瘤抗原：α-辅肌动蛋白-4、Bcr-Abl融合蛋白、Casp-8、β-连环素、cdc27、cdk4、cdkn2a、coa-1、dek-can融合蛋白、EF2、ETV6-AML1融合蛋白、LDLR、岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-1、2和3、neo-PAP、I类阻凝蛋白、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PTPRK、K-ras、N-ras、磷酸甘油醛异构酶、Bage-1、Gage3、4、5、6、7、GnTV、Herv-K-mel、Lage-1、Mage-A1、2、3、4、6、10、12、Mage-C2、NA-88、NY-Eso-l／Lage-2、SP17、SSX-2、和TRP2-Int2、MelanA／MART-I、gp100／Pmel17、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15，p58、CEA、RAGE、NY-ESO，LAGE、SCP-1、Hom／Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2／neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、Epstein Barr病毒抗原、EBNA、人***瘤病毒抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、α-甲胎蛋白、13HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3，CA27.29／BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68＼KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733／EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB＼70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90／Mac-2结合蛋白／亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。

14.权利要求10所述的免疫原性组合物，其中所述抗原是选自由下列物质组成的组中的肿瘤抗原：α-辅肌动蛋白-4、Bcr-Abl融合蛋白、Casp-8、β-连环素、cdc27、cdk4、cdkn2a、coa-1、dek-can融合蛋白、EF2、ETV6-AML1融合蛋白、LDLR、岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-1、2和3、neo-PAP、I类阻凝蛋白、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PTPRK、K-ras、N-ras、磷酸甘油醛异构酶、Bage-1、Gage3、4、5、6、7、GnTV、Herv-K-mel、Lage-1、Mage-A1、2、3、4、6、10、12、Mage-C2、NA-88、NY-Eso-l／Lage-2、SP17、SSX-2、和TRP2-Int2、MelanA／MART-I、gp100／Pmel17、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15，p58、CEA、RAGE、NY-ESO，LAGE、SCP-1、Hom／Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2／neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、Epstein Barr病毒抗原、EBNA、人***瘤病毒抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA19-9、CA72-4、CAM17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、α-甲胎蛋白、13HCG、BCA225、BTAA、CA125、CA15-3，CA27.29／BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68＼KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733／EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB＼70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90／Mac-2结合蛋白／亲环蛋白C-相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。

15.权利要求1至14中任意一项所述的免疫原性组合物在制备用于在哺乳动物个体中加强针对肿瘤的免疫应答的药物中的用途。

16.权利要求1至14中任意一项所述的免疫原性组合物在制备用于在哺乳动物个体中加强针对肿瘤的免疫应答的药物中的用途，其中所述组合物用于诱导针对肿瘤的免疫应答。

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