CN101775056A - 一种从黄芪中提取、分离和纯化黄芪甲苷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从常用中药黄芪中提取、分离和纯化功能性有效成分黄芪甲苷的方法，目的是提供一种简便、安全、经济、有效地从黄芪中提取、分离和纯化高***芪甲苷的方法，所采取的技术方案是：以中药黄芪为原料，采用独创性的匀浆萃取-混合酶诱导生物转化技术、负压空化混旋提取技术、皂苷衍生物水解转化技术、液液萃取技术、大孔吸附树脂富集技术、正相硅胶中压柱层析技术以及低温析晶和重结晶技术等一系列高效提取、分离和纯化技术手段，得到高得率、高纯度的黄芪甲苷，其得率可达0.08％以上，纯度可达95％以上。本发明所用原料为我国常用中药黄芪，资源丰富，黄芪甲苷的生产工艺简单易行，目标化合物得率高、纯度高。适合工业化生产和应用，产品附加值高，具有良好的市场应用前景。

Description

一种从黄芪中提取、分离和纯化黄芪甲苷的方法

技术领域

本发明涉及从植物中提取、分离和纯化功能性有效成分的一种方法，具体是从常用中药材黄芪中提取、分离和纯化黄芪甲苷的方法。

背景技术

黄芪素以“补气诸药之最”著称，是一种名贵的中药材，首载于我国古代第一部本草著作《神农本草经》，为豆科多年生草本植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bunge var.mongholicus(Bunge)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge的干燥根。蒙古黄芪分布于东北和华北部分省区；膜荚黄芪分布于华北、西北、东北及西南部分省区。黄芪在我国主要分布在温带和暖温带地区，为深根性植物。在北方地区，普遍生长于东北的东部山区(长白山、小兴安岭、完达山脉和辽宁东部山区)及大兴安岭，在部分平原地区亦可见到。此外河北、山西、山东、内蒙古、陕西、甘肃、宁夏、青海、新疆等省区均有。朝鲜、蒙古、苏联也有分布。黄芪喜凉爽气候，有较强的抗旱、耐寒能力，不耐热，不耐涝。气温过高，常抑制植株生长，土壤湿度过大，常引起根部腐烂。宜在土层深厚、肥沃、疏松、排水良好的砂质土壤生长，在粘土上则根多，生长缓慢。多生于林缘、灌丛、林间或干旱向阳山坡草地、疏林下及草甸等处。虽然我国黄芪药材资源丰富，但是其药用部分是根，一旦根部被刨取，整个植株不再存活，黄芪的野生资源在大量采挖的情况下日渐稀少。因此，合理开发利用黄芪资源已经成为亟待解决的重大问题，符合时代发展的步伐。

黄芪是名贵中药材，根据药典记载有黄芪味甘，性微温，具有增强机体非特异性、改善心功能、扩张冠状动脉、利尿消肿、益卫固表、托疮生肌、抗菌、抗病毒、抗疲劳、抗衰老、促进造血功能、保护肝脏等功效。常用于气虚乏力、食少便溏、中气下陷、久泄脱肛、便血崩漏、表虚自汗、气虚水肿、久溃不敛、慢性肾炎、蛋白尿、糖尿病等症。由于黄芪疗效显著，应用广泛，近年来黄芪年消耗量十分庞大，而且相关研究报道也很多，目前已经从中分离出皂苷、异黄酮、多糖、蛋白质、维生素P、氨基酸、微量元素、酚性化合物等物质，这些活性成分均与其药效相关。其中，黄芪皂苷为黄芪的主要天然活性物质，并以黄芪甲苷为主，是目前评价黄芪质量和黄芪制剂质量的重要指标成分。但黄芪甲苷在黄芪中的含量很低，约为0.04％，且提取分离十分困难(张宇，吕哲，李鑫昶等，黄芪总皂甙水解为黄芪甲苷的工艺研究)。随着研究的不断深入，有关黄芪甲苷的研究和开发将成为倍受人们关注的新热点。

中国专利申请号200510020977.0公开了一种黄芪甲苷纯品的制备方法，是以中药黄芪为原料，包括提取、富集、除去杂质、碱水解转化、溶剂萃取和纯化精制。但此方法步骤较多，制备方法麻烦，黄芪甲苷纯度不高。中国专利申请号200610012687.6公开了一种黄芪甲苷的制备方法，采用提取，乙醇脱色、碱水解等步骤得到黄芪甲苷，简化了中间步骤，但是得率不高。中国专利申请号200710043678.8公开了黄芪甲苷的制备方法，是以中药黄芪为原料，包括水提取、碱处理、大孔吸附树脂吸附、水洗、稀醇液洗、较高浓度醇液洗脱黄芪甲苷、浓缩及结晶。但此步骤黄芪甲苷回收率低，所得黄芪甲苷纯度不高。

综上所述，传统的制备黄芪甲苷的工艺不能达到高效利用黄芪资源和获得高得率、高***芪甲苷的目的。因此，有必要对黄芪中有效成分黄芪甲苷进行进一步提取、分离和纯化的工艺研究，寻找一种简便、安全、经济、高效的提取、分离和纯化黄芪甲苷的方法，为促进我国黄芪资源的深度开发和利用提供科学依据，以及为开发新药提供有利条件。本发明旨在建立一种通过生物诱导、水解转化等高效提取技术与分离、纯化技术相结合的方法，实现简单快速、高得率的提取、高纯度分离纯化黄芪甲苷的方法。

发明内容

针对黄芪甲苷在植物中的含量很低(约为0.04％)、分离纯化相当困难的问题，本发明的目的是提供一种以中药黄芪为原料，通过独创性的匀浆萃取-混合酶诱导生物转化技术、负压空化混旋提取技术、皂苷衍生物水解转化技术、液液萃取技术、大孔吸附树脂富集技术、正相硅胶中压柱层析技术以及低温析晶和重结晶技术等一系列具有自主知识产权的高效提取、分离和纯化技术手段，从而简单、快速获得高得率、高***芪甲苷的方法。为了达到本发明的目的，所采用的技术方案如下：中药黄芪用蒸馏水浸泡，经过匀浆萃取体系诱导和混合酶溶液生物诱导转化，提高黄芪甲苷的含量。然后经过70～80％乙醇负压空化混旋提取和皂苷衍生物水解转化，经过正丁醇液液萃取、大孔吸附树脂富集和一次正相硅胶中压柱层析后得到黄芪甲苷的产品，纯度大于90％，经过低温析晶和重结晶得到黄芪甲苷晶体，其得率大于0.08％，纯度大于95％。

具体方案如下：

(1)匀浆破碎酶解：将中药黄芪和配制好的酶溶液按固液比1∶10～20(g∶mL)混合，连续匀浆萃取1～3次，每次0.5～2min。

(2)恒温酶解：将匀浆液放入恒温摇床中，在25～40℃酶解12～24h，转速120～150rpm。

(3)负压空化提取：将酶解液抽滤，滤渣加入70～80％乙醇溶液，压力为0.04～0.06Mpa，固液比为1∶10～20(g∶mL)，室温提取1～3次，每次30～90min。

(4)皂苷衍生物水解转化：将抽滤后的酶解液和提取液合并，减压浓缩至干后用蒸馏水溶解，用氨水调节pH值为8～9，水解转化12～24h。在碱性条件下，可以使其它类型的黄芪皂苷发生脱乙酰化反应转化为黄芪甲苷，从而大大提高黄芪甲苷的含量。

(5)溶剂抽提除杂：将得到的水解液，以体积比1∶1～1∶3的正丁醇为萃取溶剂，萃取3～5次，减压浓缩至干得到固形物。

(6)大孔吸附树脂富集精制：合并正丁醇萃取液，浓缩至干，得到精制的富含皂苷类活性成分的黄芪提取物。大孔吸附树脂采用湿法装柱，保留液面，将液液萃取所得到的固形物用蒸馏水溶解后，通过大孔吸附树脂柱进行吸附，上样量为0.5～1BV，流速为0.5～1BV/h。吸附后用10～40％乙醇3～5BV洗杂质，然后用50～60％乙醇10～15BV解吸。收集解吸液，浓缩至干，所得固形物为粗目标产物。

(7)正相硅胶中压柱层析技术：所用样品为树脂富集后所得粗目标产物，所用硅胶为300～400目。预先称取质量为样品量的5～10倍的硅胶，采用湿法装柱，所用溶剂包括三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇。将样品用少量有机溶剂溶解，加入与浸膏质量比为1∶1.2(w/w)的层析硅胶拌匀，甲醇溶解后在水浴锅上炒样至干，装入预先装好的硅胶柱中。先后以10～20BV乙酸乙酯(三氯甲烷)、乙酸乙酯(三氯甲烷)∶甲醇、甲醇连续中压洗脱，收集洗脱液，每份1/40～1/20BV。用硅胶薄层1，用10％硫酸染色后烤板。

(8)低温析晶和重结晶：得到黄芪甲苷溶液，低温析晶得到产品，重结晶后得到纯度大于95％的黄芪甲苷。

上述的黄芪中黄芪甲苷的提取纯化方法所用的大孔吸附树脂分别为D101、AB-8、AL-1、AL-2、ADS-5、ADS-8、ADS-17、ADS-31、D3520、HPD100、HPD500、HPD826、SA-1、SA-2和SA-3型等。

上述的重结晶所用的溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷和甲醇，重结晶所用溶剂比例为乙酸乙酯(二氯甲烷、三氯甲烷)∶甲醇＝20∶1～1∶1，低温析晶温度为-10～25℃。

传统的提取方法如煎煮法、浸渍法、渗漉法、回流提取、超声提取和索式提取过程都是在完整植物细胞的情况下，通过浸润与渗透、使溶剂进入组织细胞、溶解细胞内物质并使其扩散至溶剂主体，这使溶剂提取细胞内生物活性成分成为可能。但由于细胞壁的屏障作用，决定了中药材有效成分的提取效率有一定限度，所以传统提取方法存在提取温度过高，提取率低，成本高，不安全等问题。

酶诱导是在提取的基础上，利用混合酶(如纤维素酶、果胶酶、β-葡萄糖苷酶等)将细胞壁的成分水解或降解，破坏细胞壁结构，使有效成分充分暴露出来，溶解、混悬或胶溶于提取溶剂中，加速有效成分的释放，从而提高提取效率。

所谓空化(cavitation)，一般是指液体内部局部压力降低时，液体内部或液固交界面上蒸汽或气体的空穴(空泡)的形成、发展和溃灭的过程。当溃灭发生在固体表面附近时，由于空泡瞬间(微秒级)溃灭产生极高的瞬时压强，极高压强的反复作用，从而破坏固体表面。因此，负压空化提取技术是利用负压空化气泡产生强烈的空化效应和机械振动，造成样品颗粒细胞壁快速破裂，加速了胞内物质向介质释放、扩散和溶解，从而促进提取。

本发明的优点：

1.本发明对黄芪资源进行高效合理的利用，产品的附加值高。

2.本发明采用匀浆萃取-混合酶诱导生物转化技术、负压空化混旋提取技术、皂苷衍生物水解转化技术、液液萃取技术、大孔吸附树脂富集技术、正相硅胶中压柱层析技术以及低温析晶和重结晶技术等一系列具有自主知识产权的高效提取、分离和纯化技术手段，所得产品得率高、纯度高。

3.与传统提取方法相比，该方法简单易行，操作条件温和，提取温度低，提取率高，周期短，耗能低，降低了生产成本，可实现黄芪甲苷大规模的产业化生产。

附图说明

图1为黄芪甲苷的结构

图2为黄芪甲苷的二级质谱图

图3为黄芪甲苷的LC-MS/MS色谱图

(A)黄芪甲苷标准品LC-MS/MS色谱图；

(B)黄芪甲苷样品LC-MS/MS色谱图

具体实施方案

实施例1

精密称取中药黄芪1000g，取0.2％固形物重量的混合酶(纤维素酶、果胶酶、β-葡萄糖苷酶)溶解于10倍体积温水中，连续匀浆萃取3次，每次1min。将匀浆液放入30℃恒温摇床中恒温酶解12h，酶诱导液抽滤后，滤渣加入70％乙醇负压空化提取，压力为0.05Mpa，固液比为1∶10(g∶mL)，室温提取3次，每次45min，将抽滤后的酶解液和提取液合并，减压浓缩至干后用水溶解，用氨水调节pH值为8，水解转化12h，所得的水解液以等体积的正丁醇为溶剂，萃取3次，减压浓缩至干得到固形物。固形物用水溶解后，通过AB-8大孔吸附树脂柱进行吸附，上样量为0.5BV，流速为1BV/h。吸附后用10％和30％乙醇各3BV洗杂质，然后用50％乙醇10BV解吸。收集解吸液，浓缩至干后用少量甲醇溶解，加入与浸膏质量比为1∶1.2(w/w)的目数为300～400的层析硅胶炒样。预先称取质量为样品量的5～10倍的硅胶，用乙酸乙酯湿法装柱，将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后以TLC监测收集洗脱液，浓缩得到黄芪甲苷，低温析晶得到产品，重结晶后得到化合物，经MS确定为黄芪甲苷，质量为0.863mg，得率为0.0863％，纯度为95％。

实施例2

精密称取中药黄芪1000g，取0.5％固形物重量的混合酶(纤维素酶、果胶酶、β-葡萄糖苷酶)溶解于15倍体积温水中，连续匀浆萃取3次，每次2min。将匀浆液放入30℃恒温摇床中恒温酶解24h，酶诱导液抽滤后，滤渣加入80％乙醇负压空化提取，压力为0.06Mpa，固液比为1∶15(g∶mL)，室温提取3次，每次60min，将抽滤后的酶解液和提取液合并，减压浓缩至干后用水溶解，用氨水调节pH值为9，水解转化24h，所得的水解液以等体积的正丁醇为溶剂，萃取4次，减压浓缩至干得到固形物。固形物用水溶解后，通过AL-2大孔吸附树脂柱进行吸附，上样量为1BV，流速为0.5BV/h。吸附后用10％和30％乙醇各5BV洗杂质，然后用50％乙醇15BV解吸。收集解吸液，浓缩至干后用少量甲醇溶解，加入与浸膏质量比为1∶1.2(w/w)的目数为300～400的层析硅胶炒样。预先称取质量为样品量的5～10倍的硅胶，用乙酸乙酯湿法装柱，将拌好样品的硅胶装入中压柱内，然后以TLC监测收集洗脱液，浓缩得到黄芪甲苷，低温析晶得到产品，重结晶后得到化合物，经MS确定为黄芪甲苷，质量为0.935mg，得率为0.0935％，纯度为95％。

Claims (8)

1.一种从黄芪中提取、分离和纯化黄芪甲苷的方法，其主要特征在于：中药黄芪匀浆萃取后经混合酶生物转化以增加目标化合物黄芪甲苷的含量，固形物使用70～80％乙醇负压空化提取1～3次，酶解液和提取液合并减压浓缩至干后，加入蒸馏水溶解，用氨水调节pH值为8～9，水解转化12～24h，所得水解液经正丁醇液液萃取后，采用大孔吸附树脂富集和一次正相硅胶中压柱层析得到黄芪甲苷的产品，经过低温析晶和重结晶得到纯度大于95％的纯品。

2.按照权利要求1所述的匀浆萃取-混合酶诱导生物转化技术，其特征在于：匀浆萃取所用的溶剂为配制好的酶溶液，按固液比1∶10～20(g∶mL)混合，连续萃取1～3次，每次0.5～2min。将匀浆液放入恒温摇床中，在25～40℃酶解12～24h，转速120～150rpm。匀浆过程产生的强大剪切力，兼具打破细胞壁、使植物组织细胞与酶充分接触以及瞬时刺激诱发内源性酶活性的作用，使目标化合物从细胞内向溶剂中充分释放，增加目标成分的含量。经过匀浆破碎酶解的匀浆液，在恒温条件下继续进行生物转化，利用酶反应的高效性、专一性等特性，将细胞壁的主要成分纤维素和果胶水解或降解，使有效成分黄芪甲苷充分的暴露出来，溶解、混悬或胶溶于提取液中，从而使细胞内有效成分含量显著提高，所用的混合酶为纤维素酶、果胶酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、漆酶、淀粉酶、木聚糖酶等。在匀浆机械胁迫萃取和混合酶的生物转化的双重作用下可提高黄芪甲苷的含量。

3.按照权利要求1所述的负压空化混旋提取技术，其特征在于：固形物加入70～80％乙醇溶液，压力为0.04～0.06Mpa，固液比为1∶10～20(g∶mL)，室温提取1～3次，每次30～90min。负压空化混旋提取方法是以负压为动力，利用气泡产生的空化效应、湍流效应而产生的高速传质液固提取工艺。

4.按照权利要求1所述的皂苷衍生物水解转化技术，其特征在于：将抽滤后的酶解液和提取液合并，减压浓缩至干后用水溶解，用氨水调节pH值为8～9，水解转化12～24h。在碱性条件下，可以使其它类型的黄芪皂苷发生脱乙酰化反应转化为黄芪甲苷，从而大大提高黄芪甲苷的含量。

5.按照权利要求1所述的正丁醇液液萃取技术，其特征在于：将得到的水解液，以体积比1∶1～1∶3的正丁醇为萃取溶剂，萃取3～5次，减压浓缩至干得到固形物。

6.按照权利要求1所述的大孔吸附树脂富集技术，其特征在于：所用树脂包括D101、AB-8、AL-1、AL-2、ADS-5、ADS-8、ADS-17、ADS-31、D3520、HPD100、HPD500和HPD826等广谱性大孔吸附树脂和SA-1、SA-2和SA-3皂苷类大孔吸附树脂。该方法中大孔吸附树脂采用湿法装柱，保留液面，将液液萃取所得到的固形物用蒸馏水溶解后，通过大孔吸附树脂柱进行吸附，上样量为0.5～1BV，流速为0.5～1BV/h。吸附后用10～40％乙醇3～5BV洗杂质，然后用50～60％乙醇10～15BV解吸。收集解吸液，浓缩至干，所得固形物为粗目标产物。

7.按照权利要求1所述的正相硅胶中压柱层析技术，其特征在于：所用样品为树脂富集后所得粗目标产物，所用硅胶为300～400目。预先称取质量为样品量的5～10倍的硅胶，采用湿法装柱，所用溶剂包括三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇。将样品用少量有机溶剂溶解，加入与浸膏质量比为1∶1.2(w/w)的层析硅胶拌匀，甲醇溶解后在水浴锅上炒样至干，装入预先装好的硅胶柱中。先后以10～20BV乙酸乙酯(三氯甲烷)、乙酸乙酯(三氯甲烷)∶甲醇、甲醇连续中压洗脱，收集洗脱液，每份1/40～1/20BV。用硅胶薄层层析检测洗脱液成分，合并相同部分，展开剂为乙酸乙酯(三氯甲烷)∶甲醇＝20∶1～1∶1，用10％硫酸染色后烤板。正相硅胶中压柱流动相包括乙酸乙酯(三氯甲烷)∶甲醇的不同比例梯度。

8.按照权利要求1所述的低温析晶和重结晶技术，其特征在于：重结晶所用的溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷和甲醇，重结晶所用溶剂比例为乙酸乙酯(二氯甲烷、三氯甲烷)∶甲醇＝20∶1～1∶1，低温析晶温度为-10～25℃。

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