CN101748159B - 一种发酵培养桦褐孔菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵培养桦褐孔菌的方法。本发明发酵培养桦褐孔菌的方法是向桦褐孔菌的培养液中添加无菌的链格孢霉菌细胞壁碎片；所述链格孢霉菌细胞壁碎片是将链格孢霉菌菌丝体破碎后离心得到的。本发明通过向桦褐孔菌的发酵培养的发酵液中加入链格孢霉菌细胞壁碎片来培养桦褐孔菌，获得的桦褐孔菌胞内和胞外的酚类化合物的积累和抗氧化活性明显提高。本发明发酵培养桦褐孔菌的方法中链格孢霉菌细胞壁碎片用量少，制备方法简单，成本低廉，具有广泛的实用价值和经济价值。

Description

一种发酵培养桦褐孔菌的方法

技术领域

本发明涉及一种发酵培养桦褐孔菌的方法。

背景技术

桦褐孔菌(Inonotus obliquus)属担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属的一种药用真菌，寄生于桦树的树干上，子实体小，黑色块状，***。野外采集到的通常是菌丝体形成的黑色瘤状物，是该真菌的药用部分。桦褐孔菌主要分布于俄罗斯北部、北欧、日本(北海道)以及我国的长白山和大兴安岭等北纬40°-50°的地区(黄年来.俄罗斯神秘的民间药用真菌—桦褐孔菌.中国食用菌，2002，21：7.)。桦褐孔菌在俄罗斯、北欧、日本、美国及韩国被广泛用来治疗恶性肿瘤(Glowacki，Tomaszewski J.Attempted therapy of inoperablecancer of the female genitalia with Inonotus obliquus.Extract Ginekol Pol.1962，33：445.)、糖尿病、心血管疾病、肝病(Wasser SP，Weis AL.Therapeuticeffect of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms：a modernperspective.Critical Review of Immunology，1999，19：65.)及艾滋病(SakumaK.Aids virus multiplication inhibitor and method of culturing activeingredient thereof.JP：93/159，946，1993-07-07.)等。对多种肿瘤细胞(***癌、唇癌、胃癌、耳下腺癌、肺癌、皮肤癌、直肠癌和霍金斯淋巴癌)有明显的抑制作用；能有效地防止癌细胞转移、复发，增强免疫能力并且可用于配合恶性肿瘤患者的放疗、化疗，增强病人的耐受性，减轻毒副作用(Mizuno T，Zhuang C，AbeK，et al.Antitumor and hypoglycemic activities of polysaccharides from thesclerotia and mycelia of Inonotus obliquus(Pers.Fr.)Pil.InternationalJournal of Mushrooms，1999，1：301-316.)。桦褐孔菌作为抗肿瘤天然药物在俄罗斯已有一百多年的应用历史，是具有显著药理活性而对人体没有任何毒副作用的药用真菌(林壁贤，李华，毛景华等，药用真菌桦褐孔菌.海峡药学，2004，16：74.)。研究表明，芳香类(丹宁、黄酮)、地花菌素类、黑色素类等酚类化合物构成桦褐孔菌的次生代谢产物的主体，具有抗氧化、诱导肿瘤细胞调亡等重要药理活性，是桦褐孔菌抗氧化、抗肿瘤活性的有效成分(何坚，冯孝章.桦褐孔菌化学成分的研究.中草药，2001，32：4.Babitskaya VG，Scherba VV，Ilonnikova NV，et al.Melanin complex from medicinal mushroom Inonotus obliquus(Pers.：Fr.)Pilat(Chaga)(Aphyllophoromycetideae).International Journal ofMedicinal Mushrooms，2001，4：139-145.Cui Y，Kim DS，Park KC.Antioxidanteffect of Inono tus obliquus.Journal of Ethnopharmacology，2005，96：79-85.Park，Y.K.，Lee，H.B.，Jeon，E.J.，Jung，H.S.，Kang，M.H.，2004.Chagamushroom extract inhibits oxidative DNA damage in human lymphocytes asassessed by comet assy.BioFactors 21：109-112.Burczyk J，Gawron A，Slotwinska M et al..Anitmitotic activity of aqueous extracts of Inonotusobliquus.Bollettino Chimico Farmaceutico，1996，135：306-309.)。由于桦褐孔菌分布于高寒地区，生长极为缓慢。有研究表明，生长在活桦树的野生桦褐孔菌10-15年才具有较好的药用价值(陈艳秋，李玉.桦褐孔菌的研究进展.微生物通报，2005，32：124-127.)。因此野生桦褐孔菌资源已远远不能满足日益增长的市场需求。野生桦褐孔菌生长在高海拔的寒冷地区，昼夜温差大。冬季受高强紫外线照射，夏季受病原微生物和昆虫的入侵。病原菌感染、紫外辐射以及昆虫吞噬压力诱导酚类化合物合成代谢关键酶基因的启动，表达诸如查耳酮合成酶和酪氨酸酶，从而在菌体内积累大量的酚类化合物(如黄酮类和黑色素等植物防御素)以平衡生存的环境压力。因此，酚类化合物的大量积累是桦褐孔菌在特定的环境压力下实现的。由于人工培养环境缺少细菌和霉菌入侵以及昆虫吞噬的压力，导致桦褐孔菌酚类化合物积累甚微，从而使人工培养的桦褐孔菌药理学活性大大下降(Zheng W，Zhao Y，Zhang M，Yin Z，Chen C，Wei Z.Phenolic compounds from Inonotusobliquus and their immune-stimulating effects.Mycosystema 2008，27：39-47.)。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵培养桦褐孔菌的方法。

本发明所提供的发酵培养桦褐孔菌的方法，是向桦褐孔菌的培养液中添加无菌的链格孢霉菌细胞壁碎片；所述链格孢霉菌细胞壁碎片是将链格孢霉菌菌丝体破碎后离心得到的。

其中，所述链格孢霉菌细胞壁碎片可用多种方法制备，所述链格孢霉菌细胞壁碎片具体是用超声破碎链格孢霉菌菌丝体，然后在4800-10000×g下离心获得的，所述超声破碎的条件具体可为250-300w、5000-7000次/分钟、30-45分钟。所述桦褐孔菌的培养液是发酵72-120小时的发酵液。所述桦褐孔菌的培养液中所述链格孢霉菌细胞壁碎片的浓度为20-60微克/升，所述的浓度是按照链格孢霉菌细胞壁碎片的干重计算的。所述发酵培养中，通气量为0.3-0.5立方米/分钟，搅拌速度为200-300转/分钟，温度为25-28℃。所述链格孢霉菌具体可为Alternariaalternarata或A.augustiouoidea或A.arborescens或A.argyranthemi或A.arbusti或A.blumeae或A.brassicicola。

本发明通过向桦褐孔菌的发酵培养的发酵液中加入链格孢霉菌细胞壁碎片来培养桦褐孔菌，获得的桦褐孔菌胞内和胞外的酚类化合物的积累和抗氧化活性明显提高。本发明的桦褐孔菌的发酵培养方法中链格孢霉菌细胞壁碎片用量少，制备方法简单，成本低廉，具有广泛的实用价值和经济价值。

附图说明

图1为桦褐孔菌生物量积累曲线。

图2为桦褐孔菌胞外总酚积累曲线。

图3为桦褐孔菌胞内总酚积累的曲线。

图4为桦褐孔菌胞内总酚清除DPPH自由基能力的曲线。

图5为桦褐孔菌胞内总酚清除超氧阴离子自由基能力的曲线。

图6为桦褐孔菌胞内总酚清除羟基自由基能力的曲线。

具体实施方式

实施例1、桦褐孔菌的发酵培养

1)链格孢霉菌细胞壁碎片的制备

链格孢霉菌细胞壁碎片(ACW)按如下方法制备：

将链格孢霉购自中国科学院北京微生物研究所中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC 3.5373)接入含有200毫升链格孢霉培养基的500毫升的三角瓶中，在26℃、140转/分的恒温振荡器中培养3-4天。链格孢霉培养基为：葡萄糖2g/100ml，蛋白胨0.5g/100ml，MgSO₄ 0.01g/100ml，KH₂PO₄ 0.001g/100ml，pH6.0。3-4天后将链格孢霉培养液过滤，得到的菌丝体以超纯水洗涤三次，之后在超纯水中用功率为250w的超声波破碎30分钟。将超声破碎的链孢霉菌丝体在4800xg重力条件下离心20分钟，弃上清液，以纯水洗涤2-3次，在同等条件下离心后60-80℃烘干。将得到的链格孢霉菌细胞壁碎片称重，用纯净水按1毫克/毫升定容，在120℃的消毒锅中灭菌30分钟。

2)桦褐孔菌深层发酵

将桦褐孔菌(Zheng Weifa，Zhao Yanxia，Zhang Meimei，Yin Zhaojuan，ChenCaifa，Wei Zhiwen.Phenolic compounds from Inonotus obliquus and theirimmune-stimulating effects.Mycosystema2008，27(4)：574-581)(徐州师范大学)无菌接入事先灭菌的液体培养基，培养基的成分为：葡萄糖2克/100ml，蛋白胨0.5克/100ml，硫酸镁0.05g/100ml，磷酸二氢纳0.01g/100ml，pH 6.0；然后在26℃、转速为140转/分钟的振荡培养箱中培养3—4天，之后用灭菌的匀浆探头对培养的菌球以4500-6000转/分匀浆8—10秒，继续培养24-48小时，得液体菌种。摇瓶培养的液体菌种按0.1克/升接入装有灭菌的7升豆粉玉米汁培养基的10升发酵罐，豆粉玉米汁培养基为：蔗糖4g/100ml，豆粉5g/100ml，玉米粉3g/100ml，硫酸镁0.05g/100ml，磷酸二氢纳0.01g/100ml，pH6.0。发酵罐通气量为0.3立方米/分钟，搅拌速度为200转/分钟，培养温度为26℃。在接种后的第三天，向发酵罐中加入链格孢霉菌细胞壁碎片，使其终浓度为20、40和60微克/升，继续培养12天。以不添加链格孢霉菌细胞壁碎片，其他深层发酵培养条件相同的桦褐孔菌为对照。

3)桦褐孔菌深层发酵菌丝体生物量和总酚积累

取步骤2)的加入链格孢霉菌细胞壁碎片(20、40和60微克/升)发酵0-12天的发酵液及对照发酵液50毫升，按如下文献的的方法进行生物量的测定：ZhengW，Zhang M，Zhao Y，Wang Y，Miao K，Wei Z.Accumulation of antioxidantphenolic constituents in submerged cultures of Inonotus obliquus.Bioresource Technology 2008，doi：10.1016/j.biortech.2008.05.002。

取步骤2)的加入链格孢霉菌细胞壁碎片(20、40和60微克/升)发酵0-12天的发酵液及对照发酵液0.5毫升，过滤，收集滤液，Folin-Ciocalteu法测定滤液中总酚的含量，即为桦褐孔菌胞外总酚含量。Folin-Ciocalteu法参照如下文献：Singleton，V.L.，Rossi，J.A.J.，1965.Colorimetry of total phenolics withphosphomolybdic phosphotunstic acid reagents.American Journal of Enologyand Vit iculture 16，144-158。

取步骤2)的加入链格孢霉菌细胞壁碎片(20、40和60微克/升)发酵0-12天的发酵液及对照发酵液0.5毫升，过滤，收集菌丝体，菌丝体用纯净水洗涤3次，70％丙酮超声冰浴提取30分钟，然后在4800×g重力条件下离心20分钟，上清液真空浓缩，定容，按Fol in-Ciocalteu法测定胞内总酚含量。桦褐孔菌生物量的测定方法同上。

生物量的测定结果如图1所示，表明链格孢霉菌细胞壁碎片对桦褐孔菌菌丝体生物量没有显著的影响，培养结束后菌丝体生物量都在8—11克/升。

桦褐孔菌胞外总酚含量的测定结果如图2所示，表明20、40和60微克/升的链格孢霉菌细胞壁碎片能显著提高桦褐孔菌胞外酚类化合物的含量。其中，加入40和60微克/升的链格孢霉菌细胞壁碎片的桦褐孔菌发酵液中总酚含量在第11天达到最大值，分别是211和321毫克/升，20微克/升链格孢霉菌细胞壁碎片的桦褐孔菌发酵液中总酚含量在第10天达到最大值174毫克/升。

桦褐孔菌胞内总酚含量的测定结果如图3所示，表明20、40和60微克/升的链格孢霉菌细胞壁碎片能显著提高桦褐孔菌胞内总酚的含量。在加入20、40和60微克/升的链格孢霉菌细胞壁碎片后第11天桦褐孔菌胞内总酚的含量达到最大值，分别为40.44毫克/克菌丝体碎片、68.54毫克/克菌丝体碎片和53.54毫克/克菌丝体碎片。

4)桦褐孔菌胞内总酚清除2，2-联苯-1-三硝基苯肼自由基的能力

2，2-联苯-1-三硝基苯肼(DPPH)比色法测定桦褐孔菌胞内总酚清除2，2-联苯-1-三硝基苯肼自由基的能力。

2，2-联苯-1-三硝基苯肼(DPPH)比色法的步骤如下：

2ml0.1mM DPPH溶液和0.9ml 0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)混合后，分别加入不同培养时间的添加不同浓度链格孢霉菌细胞壁碎片获得的桦褐孔菌胞内总酚0.1ml，准确反应30min，在517nm处测吸光值。对DDPH自由基的清除率(％)＝[(空白吸光度-样品吸光度)/空白吸光度]×100/毫克总酚。以加入0.1ml甲醇作为空白。

DPPH比色法的测定结果如图4所示，表明链格孢细胞壁碎片能显著提高桦褐孔菌总酚对DPPH自由基的清除率，加入40微克/升链格孢细胞壁碎片能显著提高桦褐孔菌胞内总酚对DPPH自由基的清除率，在添加后的第十二天，对DPPH的清除率达到250％左右。

5)桦褐孔菌胞内总酚清除超氧阴离子自由基的能力

用如下方法测定桦褐孔菌胞内总酚清除超氧阴离子自由基的能力：取1.5ml pH8.2的50mmol/L Tris-HCl缓冲液，2.7ml蒸馏水，分别加入不同培养时间的添加不同浓度链格孢霉菌细胞壁碎片获得的桦褐孔菌胞内总酚0.1ml，混匀后于25℃水浴20min，取出后立即加入0.1ml25℃预热的3mmol/L的邻苯三酚，于420nm处测定吸光度，记为V_样，以Tris-HCl缓冲液为空白，记为V_空。桦褐孔菌胞内总酚对超氧阴离子自由基的清除率按每毫克胞内总酚对超氧阴离子清除率计算，即清除率％＝(V_空-V_样)/V_空×100％/毫克总酚。

桦褐孔菌胞内总酚清除超氧阴离子自由基的能力的测定结果如图5所示，表明链格孢霉菌细胞壁碎片能显著提高桦褐孔菌总酚对超氧阴离子自由基的清除率。

6)桦褐孔菌胞内总酚清除清除羟基自由基的能力

用如下方法测定桦褐孔菌胞内总酚清除羟基自由基的能力：

取1ml 150mmol/L的磷酸缓冲液和1ml蒸馏水，混匀后作为空白；取1ml150mmol/L磷酸缓冲液、0.2ml 7.5mmol/L的邻二氮菲、0.2ml 7.5mmol/L的FeSO₄、0.6ml蒸馏水混匀后作为未损伤管；取1.0ml磷酸缓冲液、0.2ml邻二氮菲、0.2ml FeSO₄、0.4ml蒸馏水和0.2ml H₂0₂(0.1％)混匀后作为损伤管；取1.3ml 150mmol/L磷酸缓冲液、0.2ml邻二氮菲、0.2ml FeSO₄、0.2ml H₂O₂混匀，分别加入不同培养时间的添加不同浓度链格孢霉菌细胞壁碎片获得的桦褐孔菌胞内总酚0.1ml，混匀后作为样品管。桦褐孔菌胞内总酚对羟基自由基的清除率按每毫克胞内总酚对0.2ml7.5mmol/L的邻二氮菲所产生的自由基的清除率计算，即清除率％＝(样品管吸光度-损伤管吸光度)/(未损管吸光度-损伤管吸光度)×100％/毫克总酚。

桦褐孔菌胞内总酚清除羟基自由基的能力的测定结果如图6所示，表明链格孢霉菌细胞壁碎片能显著提高桦褐孔菌总酚对超氧阴离子自由基的清除率。其中加入40微克/升链格孢霉菌细胞壁碎片对桦褐孔菌胞内总酚清除羟基自由基的能力有显著的提高，在加入链格孢霉菌细胞壁碎片第十一天达到最大值240％，加入20和60微克/升的链格孢霉菌细胞壁碎片的对桦褐孔菌胞内总酚清除羟基自由基的能力略有提高。

Claims (4)

1.一种培养桦褐孔菌的方法，是向桦褐孔菌的培养液中添加无菌的链格孢霉菌细胞壁碎片；所述链格孢霉菌细胞壁碎片是将链格孢霉菌菌丝体破碎后离心得到的；所述链格孢霉菌细胞壁碎片是用超声破碎链格孢霉菌菌丝体，然后在4800-10000×g下离心获得的，所述超声破碎的条件为250-300w、5000-7000次/分钟、30-45分钟；所述桦褐孔菌的培养液是发酵72-120小时的发酵液；所述桦褐孔菌的培养液中所述链格孢霉菌细胞壁碎片的浓度为20-60微克/升。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述桦褐孔菌的培养液是发酵72-96小时的发酵液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵培养中，通气量为0.3-0.5立方米/分钟，搅拌速度为200-300转/分钟，温度为25-28℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述链格孢霉为链格孢(Alternaria alternata)或Alternaria augustiouoidea或Alternariaarborescens或Alternaria argyranthemi或Alternaria arbusti或Alternariablumeae或Alternaria brassicicola。

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