CN101736045B - 一种小球藻功能成分连续提取的方法 - Google Patents

Abstract

一种小球藻功能成分连续提取的方法，通过膜分离技术将小球藻进行富集，得到浓缩的小球藻浆液，在液相体系中加入适当的酶进行破壁，破壁以后的小球藻溶液利用溶剂萃取叶绿素，可以得到功能性色素产品，并降低后续产品的色值； 经过脱色的小球藻，在水相首先进行酶解，然后用溶剂萃取功能性油脂，得到的脱脂小球藻用酸法提取活性多糖后其余部分进行干燥获得小球藻粗蛋白。主要的产品包括叶绿素、小球藻活性多糖、小球藻功能性油脂、小球藻蛋白等，在确保小球藻功能成分的活性基础上，对工艺进行优化，以获得较高得率并降低生产成本。

Description

一种小球藻功能成分连续提取的方法

技术领域

本发明属于海洋生物技术领域，特别涉及一种小球藻功能成分连续提取的方法。

背景技术

小球藻是普生性单细胞绿藻，属绿藻纲绿球目卵囊藻科小球藻属，在自然界分布广泛，能利用光能自养，也能在异养条件下利用有机碳源进行生长、繁殖。现在世界上的小球藻有15种左右，加上变种有上百种之多。小球藻具有丰富全面的营养成分和生物活性物质。通常小球藻蛋白质含量较高(55％～67％)，含有较多的糖类(15％～20％)和脂类(5％～10％)，含有生物活性多糖、生长因子、糖蛋白、糖脂蛋白、膳食纤维等。其所含蛋白质中氨基酸种类齐全，包含人体必需的八种氨基酸且组成平衡。由于小球藻营养价值高，兼具保健功能，在一些国家和地区已有很大程度的开发和利用，先后开发成蛋白源饲料、食品、饮料、医药制品等。

小球藻中含有功能性油脂。目前，EPA(二十碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)的开发应用已受到世界各国的关注和重视，在保健品和医药方面的应用开发已十分引人注目，研究和开发EPA和DHA产品具有广阔的应用前景和巨大的经济价值。其唯一的商业来源——鱼油作为EPA和DHA的来源已难以满足人们生活的需要，需寻找EPA和DHA更为广阔、稳定的来源。小球藻中含有丰富的EPA和DHA，且海藻油脂与鱼油相比，具有脂肪酸组成稳定，不含胆固醇，没有难闻的鱼腥味和重金属元素的污染，藻类可以通过简单生长营养素的培养，有生长周期短、收获快等优点，而且还可以通过生物工程方法和培养条件的控制来提高EPA和DHA的含量。因此，利用小球藻作为生产EPA和DHA的又一来源具有很大潜力。

CN1018071B介绍了一种小球藻的生态采收方法，但操作周期过长，产率低，且影响小球藻正常的生长。CN1302013C介绍了一种活性小球藻多糖的制备方法，通过超声波破壁，再用热浸提并除杂，获得的提取物具有强的免疫调节活性，具有增强机体免疫力、抗肿瘤、预防心脑血管疾病等功能，但其得率较低，且浪费了小球藻其他功能成分。CN101053577A公开了小球藻压力破壁及核苷酸、蛋白质、多糖、藻干粉的制取方法，对小球藻采用常温压力破壁，但制备产品的过程中需要-20℃冷冻，其能耗非常高。CN 11359270公开了一种小球藻提取液的制备方法，得到的是一种混合物，且产率较低。CN11647620发明了一种小球藻生长因子提取方法，包括温浴、破壁、酶解、分离、残渣利用等步骤。同样存在产物不明确，产率低且浪费严重的现象。

发明内容

本发明的目的是提供一种小球藻功能成分连续提取的方法，主要的产品包括叶绿素、小球藻活性多糖、小球藻功能性油脂和小球藻蛋白。在确保小球藻功能成分的活性基础上，对工艺进行优化，以获得较高得率并降低生产成本。

本发明的技术方案：通过膜分离技术将小球藻进行富集，得到浓缩的小球藻浆液，在液相体系中加入适当的酶进行破壁，破壁以后的小球藻溶液利用溶剂萃取叶绿素，可以得到功能性色素产品，并降低后续产品的色值；经过脱色的小球藻，在水相首先进行酶解，然后用溶剂萃取功能性油脂，得到的脱脂小球藻用酸法提取活性多糖后其余部分进行干燥获得小球藻粗蛋白。

具体工艺为：

1)膜分离

利用微孔滤膜浓缩小球藻培养液至原体积的0.5～1％，膜分离参数：错流速度为2.4～5cm/s，操作压力为0.02～0.08MPa，温度为20℃～40℃；

2)酶解破壁

利用复合酶水解浓缩小球藻液中小球藻的细胞壁，所述的复合酶为纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶，酶解工艺参数为温度40℃～60℃，每种酶添加量为小球藻浓缩液中干物质质量的0.1～0.5％，酶解时间为1～5h；

3)色素制备

采用乙醇做为提取剂，从破壁小球藻液中提取叶绿素，提取浓度50～70％，提取温度为，50℃～60℃，提取时间为2～6h，然后离心得到乙醇提取液和脱色小球藻，乙醇提取液再经减压浓缩得叶绿素；

4)酶解提油

采用酶法结合有机溶剂从脱色小球藻中提取油脂，有机溶剂是石油醚、正己烷或环己烷，脱色小球藻与有机溶液的料液体积比为1∶5～1∶10，中性蛋白酶的添加量为脱色小球藻质量的2.5～8.5‰，温度为50℃～60℃，中性蛋白酶酶解结合有机溶剂萃取时间为3～7h；离心得到有机溶剂相和脱脂小球藻；

5)酸法提取小球藻多糖

采用酸法从脱脂小球藻中提取小球藻活性多糖，酸的pH值为3～5，提取温度为50～80℃，提取时间为2～4h；离心得到水相和沉淀，水相经减压浓缩后进行乙醇沉淀；

6)干燥制备小球藻蛋白

将提取多糖后的沉淀物在减压条件下进行干燥，真空度为0.01～0.03Mpa，温度为40℃～50℃，得小球藻粗蛋白。

本发明与传统方法相比具有以下有益效果：

1、传统的小球藻富集方法采用离心沉降，但其能耗过高，生产效率极低。膜分离具有分子级分离、无相变、无溶剂污染、容易保持生物分子的活性、操作简单可靠等其他浓缩纯化方式不具有的特点。由于小球藻培养液中小球藻浓度非常低，通过膜分离可提高其浓度以利于后续开发。

2、小球藻的功能性成分均处于细胞内，在提取分离之前，需要破碎细胞的细胞壁、细胞膜，使活性成分以溶解的状态释放出来，并保持其活性。细胞破碎程度越高，活性成分的得率也越高。本发明通过研究小球藻细胞壁的组成，利用复合酶水解胞壁，可显著提高小球藻的破壁率，如表1所示。

表1酶法破壁与传统破壁的效果对比

方法	反复四次冻融法	超声波破壁	复合酶法破壁
				破壁率	70.32±3.27％	74.26±1.25％	91.54±2.83％

3、自养小球藻颜色深绿，叶绿素是其主要显色成分，本身具有抗胃溃疡作用、抗***反应作用、抗脑血管性疾病作用，是优异的健康食品、功能性食品、医药原材料。同时又对其他产品的感官有不利影响，所以需要将其提取分离出来。本发明利用乙醇将其萃取分离出来，可做为功能配料同时减少后续产品的色值，如表2所示。

表2乙醇萃取前后小球藻浓缩液色值的变化

萃取时间	0.5h	1h	3h
				色值降低率	25.3±1.25％	56.24±2.85％	86.45±4.51％

4、本发明采用酶法辅助有机溶剂提取小球藻油脂，可显著提高小球藻油脂的提取率，且提取条件较温和，不会对油脂品质造成不利影响，小球藻油的提取率及EPA含量如表3所示。

表3小球藻油脂的提取率及EPA含量

提取方法	单纯有机溶剂萃取	酶法辅助萃取
			提取率(占小球藻重百分比)	3.36±2.21％	5.24±1.58％
EPA含量(占藻油百分比)	2.63±1.29％	2.53±0.32％

附图说明

图1是本发明的工艺流程图。

具体实施方式

实施例1

用泵将小球藻培养液导入以聚砜(或陶瓷或聚醚)为膜材料的膜分离***进行微孔膜过滤，控制膜分离工艺参数为：错流速度为2.4cm/s，操作压力为0.02MPa，温度为20℃，将小球藻浓缩至原体积的0.5％，得到小球藻浓缩液。在浓缩液中加入纤维素酶0.1％、果胶酶0.1％、木聚糖酶0.1％(酶添加量为占小球藻浓缩液中干物质质量的百分比)，温度40℃，酶解1h进行破壁。得到破壁小球藻浓缩液，在破壁的小球藻浓缩液中加入乙醇，使其浓度为50％，温度为50℃，提取2h。然后离心(3000r/min)，得到乙醇提取液和脱色小球藻，乙醇提取液进行减压浓缩回收乙醇，并浓缩得粘稠状叶绿素，提取率为0.3％。脱色小球藻按料液体积比1∶5加入石油醚，并加入中性蛋白酶2.5‰(占脱色小球藻质量的百分比)，酶解萃取时间为3h，温度为50℃。酶解时间结束后离心(3000r/min)，得有机溶剂相和脱脂小球藻，有机溶剂相减压浓缩、回收石油醚，然后过滤得小球藻油脂，得率为5.3％。脱脂小球藻按料液体积比1∶8加入pH为3的稀盐酸溶液，温度为50℃，提取2h。然后进行离心(3000r/min)，得水相和沉淀，水相经减压浓缩后醇沉、干燥得小球藻多糖，得率为2.6％。将提取多糖后的沉淀物经真空干燥，真空度为0.02MPa，温度为40℃，得小球藻粗蛋白，得率为68.3％。

实施例2

用泵将小球藻培养液导入以聚砜(或陶瓷或聚醚)为膜材料的膜分离***进行微孔膜过滤，控制膜分离工艺参数为：错流速度为5cm/s，操作压力为0.04MPa，温度为30℃，将小球藻浓缩至原体积的0.8％，得小球藻浓缩液。在浓缩液中加入纤维素酶0.2％、果胶酶0.3％、木聚糖酶0.4％(酶添加量为占小球藻浓缩液中干物质质量的百分比)，温度50℃，酶解2h进行破壁，得到破壁小球藻浓缩液。在破壁的小球藻浓缩液中加入乙醇，使其浓度为60％，温度为55℃，提取3h。然后离心(3000r/min)，得到乙醇提取液和脱色小球藻，乙醇提取液进行减压浓缩回收乙醇，并浓缩得粘稠状叶绿素，提取率为0.32％。脱色小球藻按料液体积比1∶8加入石油醚，并加入中性蛋白酶3.5‰(占脱色小球藻质量的百分比)，酶解萃取时间为3h，温度为55℃。酶解时间结束后离心(3000r/min)，得有机溶剂相和脱脂小球藻，有机溶剂相减压浓缩、回收石油醚，然后过滤得小球藻油脂，得率为5.4％。脱脂小球藻按料液体积比1∶8加入pH为4的稀硫酸溶液，温度为55℃，提取4h。然后进行离心(3000r/min)，得水相和沉淀，水相经减压浓缩后醇沉、干燥得小球藻多糖，得率为2.7％。将提取多糖后的沉淀物经真空干燥，真空度为0.02MPa，温度为40℃，得小球藻粗蛋白，得率为67.2％。

实施例3

用泵将小球藻培养液导入以聚砜(或陶瓷或聚醚)为膜材料的膜分离***进行微孔膜过滤，控制膜分离工艺参数为：错流速度为4cm/s，操作压力为0.08MPa，温度为40℃，将小球藻浓缩至原体积的1％，得小球藻浓缩液。在浓缩液中加入纤维素酶0.3％、果胶酶0.3％、木聚糖酶0.3％(酶添加量为占小球藻浓缩液中干物质质量的百分比)，温度60℃，酶解5h进行破壁，得到破壁小球藻浓缩液。在破壁的小球藻浓缩液中加入乙醇，使其浓度为70％，温度为50℃，提取6h。然后离心(3000r/min)，得到乙醇提取液和脱色小球藻，乙醇提取液进行减压浓缩回收乙醇，并浓缩得粘稠状叶绿素，提取率为0.35％。脱色小球藻按料液体积比1∶10加入石油醚，并加入中性蛋白酶8.5‰(占脱色小球藻质量的百分比)，酶解萃取时间为7h，温度为60℃。酶解时间结束后离心(3000r/min)，得有机溶剂相和脱脂小球藻，有机溶剂相减压浓缩、回收石油醚，然后过滤得小球藻油脂，得率为5.8％。脱脂小球藻按料液体积比1∶8加入pH为3的稀醋酸溶液，温度为80℃，提取4h。然后进行离心(3000r/min)，得水相和沉淀，水相经减压浓缩后醇沉、干燥得小球藻多糖，得率为2.9％。将提取多糖后剩余的沉淀物经真空干燥，真空度为0.02MPa，温度为40℃，得小球藻粗蛋白，得率为65.0％。

实施例4

用泵将小球藻培养液导入以聚砜(或陶瓷或聚醚)为膜材料的膜分离***进行微孔膜过滤，控制膜分离工艺参数为：错流速度为3.5cm/s，操作压力为0.05MPa，温度为30℃，将小球藻浓缩至原体积的0.6％，得小球藻浓缩液。在浓缩液中加入纤维素酶0.5％、果胶酶0.5％、木聚糖酶0.5％(酶添加量为占小球藻浓缩液中干物质质量的百分比)，温度60℃，酶解5h进行破壁，得到破壁小球藻浓缩液。在破壁的小球藻浓缩液中加入乙醇，使其浓度为60％，温度为60℃，提取4h。然后离心(3000r/min)，得到乙醇提取液和脱色小球藻，乙醇提取液进行减压浓缩回收乙醇，并浓缩得粘稠状叶绿素，提取率为0.33％。脱色小球藻按料液体积比1∶6加入石油醚，并加入中性蛋白酶7.5‰(占脱色小球藻质量的百分比)，酶解萃取时间为5h，温度为55℃。酶解时间结束后离心(3000r/min)，得有机溶剂相和脱脂小球藻，有机溶剂相减压浓缩、回收石油醚，然后过滤得小球藻油脂，得率为5.8％。脱脂小球藻按料液体积比1∶8加入pH为5的稀盐酸溶液，温度为80℃，提取3h。然后进行离心(3000r/min)，得水相和沉淀，水相经减压浓缩后醇沉、干燥得小球藻多糖，得率为2.65％。将提取多糖后的沉淀物经真空干燥，真空度为0.02MPa，温度为40℃，得小球藻粗蛋白，得率为66.1％。

上述实施例1-实施例4中的酸可以为盐酸、硫酸、草酸或醋酸。

上述实施例1-实施例4中石油醚可用正己烷或环己烷替代。

Claims (1)

1.一种小球藻功能成分连续提取的方法，其特征是：

1.1)膜分离

利用微孔滤膜浓缩小球藻培养液至原体积的0.5～1％，膜分离参数：错流速度为2.4～5cm/s，操作压力为0.02～0.08MPa，温度为20℃～40℃；

1.2)酶解破壁

利用复合酶水解浓缩小球藻液中小球藻的细胞壁，所述的复合酶为纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶，酶解工艺参数为：温度40℃～60℃，每种酶添加量为小球藻浓缩液中干物质质量的0.1～0.5％，酶解时间为1～5h；

1.3)色素制备

采用乙醇做为提取剂，从破壁小球藻液中提取叶绿素，提取浓度50～70％，提取温度为，50℃～60℃，提取时间为2～6h，然后离心得到乙醇提取液和脱色小球藻，乙醇提取液再经减压浓缩得叶绿素；

1.4)酶解提油

采用酶法结合有机溶剂从脱色小球藻中提取油脂，有机溶剂是石油醚、正己烷或环己烷，脱色小球藻与有机溶液的料液体积比为1∶5～1∶10，中性蛋白酶的添加量为脱色小球藻质量的2.5～8.5‰，温度为50℃～60℃，中性蛋白酶酶解结合有机溶剂萃取时间为3～7h；离心得到有机溶剂相和脱脂小球藻；

1.5)酸法提取小球藻多糖

采用酸法从脱脂小球藻中提取小球藻活性多糖，酸的pH值为3～5，提取温度为50～80℃，提取时间为2～4h；离心得到水相和沉淀，水相经减压浓缩后进行乙醇沉淀；

1.6)干燥制备小球藻蛋白

将提取多糖后的沉淀物在减压条件下进行干燥，真空度为0.01～0.03Mpa，温度为40℃～50℃，得小球藻粗蛋白。

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